GR20220100698A - Μεθοδος βελτιωσης της ανιχνευσιμοτητας των δοκιμων που βασιζονται σε ταινιες ξηρων αντιδραστηριων - Google Patents

Abstract

Στην παρούσα εφεύρεση παρουσιάζεται μέθοδος βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας των ταχυδοκιμών που πραγματοποιούνται με τη χρήση ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων, αξιοποιώντας παράγοντες που δημιουργούν μακρομοριακό συνωστισμό, oι οποίοι κατά τη διάρκεια της ροής του διαλύματος/δείγματος μέσω των πόρων της ταινίας δημιουργούν ένα μικροπεριβάλλον που διευκολύνει τις αλληλεπιδράσεις και προάγει τις αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα για την αναγνώριση του αναλυτή και την παραγωγή σήματος στην ταχυδοκιμή. Η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας επιτυγχάνεται δίχως να περιορίζονται τα ευρέως γνωστά πλεονεκτήματα των ταχυδοκιμών, δηλαδή η απλότητα και η πρακτικότητα στην εκτέλεσή τους από τον χρήστη και η καταλληλότητά τους για επιτόπιες αναλύσεις (π.χ. ταχυδοκιμές πεδίου, αναλύσεις κατ΄ οίκον, παρακλίνιεςαναλύσεις κλπ). Η προσθήκη μακρομοριακών παραγόντων συνωστισμού δεν αντικαθιστά αλλά είναι συμπληρωματική με άλλες στρατηγικές βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, όπως ο σχεδιασμός νέων ιχνηθετών, η εισαγωγή ενίσχυσης σήματος και η εισαγωγή νέων μεταλλακτών. Αναμένουμε ότι η προτεινόμενη διαμόρφωση θα επεκταθεί σε πολυάριθμους αναλυτές με ποικιλία ιχνηθετών και σε ποικίλες διαμορφώσεις των ταχυδοκιμών πλάγιας ροής.

Description

ΤΙΤΛΟΣ (Ελληνικά)

Μέθοδος βελτίωσης της ανίχνευσίμότητας των δοκιμών που βασίζονται σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων

ΤΙΤΛΟΣ (Αγγλικά)

Method for improving the detectability of tests based on dry reagent strips

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

Η εφεύρεση αφορά σας ταχυδοκιμές (ταχυαναλύσεις) με χρήση ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων, οι οποίες έχουν βρει πληθώρα εφαρμογών σε τομείς όπως η υγεία, τα τρόφιμα και το περιβάλλον γιατί παρέχουν τη δυνατότητα ταχέων επιτόπιων αναλύσεων (π.χ. παρακλίνιες αναλύσεις) με χαμηλό κόστος, χωρίς την ανάγκη ειδικού εξοπλισμού και δίχως να απαιτείται προσωπικό υψηλής εξειδίκευσης. Όλα (ή τα περισσότερα) αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ανάλυση είναι ήδη αποτεθειμένα, σε ξηρή μορφή, ή ακίνητοποίημένα πάνω στην ταινία. Συνήθως, ο χρήστης εφαρμόζει απλά το δείγμα χωρίς καμία άλλη παρέμβαση από την εφαρμογή του δείγματος μέχρι καί τα αποτελέσματα της ανάλυσης. Oι δοκιμές με χρήση ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση/προσδιορισμό πρωτεϊνών (π.χ. παθογόνων, αλλεργιογόνων), DNA, RNA, μικρομορίων (π.χ. φαρμακευτικών ή τοξικών ουσιών), μεγαλομορίων, κλπ. σε ποικιλία δειγμάτων. Μεγάλος αριθμός (πολλά εκατομμύρια) τέτοιων ταχυδοκιμών εκτελούνται σε καθημερινή βάση. Στο πεδίο της ανάπτυξης ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων αποτελεί πιεστική πρόκληση, και συνεχή επιδίωξη, η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας, χωρίς να διακυβεύεται η απλότητα και η πρακτικότητα της ανάλυσης. Για παράδειγμα, η ανιχνευσιμότητα αυτών των δοκιμών συνδέεται άμεσα με την έγκαιρη και ταχεία διάγνωση μίας μολυσματικής νόσου και με τη δυνατότητα σχεδιασμού και εφαρμογής μέτρων περιορισμού ή εξάλειψης της μετάδοσης της νόσου. Στόχος της παρούσας εφεύρεσης είναι η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας χωρίς να διακυβεύεται η απλότητα και η πρακτικότητά αυτών των αναλύσεων.

Στις αναλύσεις που πραγματοποιούνται με τη χρήση ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων, το δείγμα εφαρμόζεται στην ταινία με τη μορφή διαλύματος, που στη συνέχεια διατρέχει την ταινία, λόγω δράσης τριχοειδών δυνάμεων, διαλυτοποιώντας χημικά αντιδραστήρια, τα οποία είναι αποτεθειμένα σε ξηρή μορφή στην ταινία. Ενώ το διάλυμα κινείται κατά μήκος της ταινίας, η υπό ανίχνευση ουσία (αναλύτης) υφίσταταί αλληλεπιδράσεις (δέσμευση, συμπλοκοποίηση) με ειδικά αντιδραστήρια που είτε βρίσκονται στο διάλυμα είτε είναι ακίνητοποίημένα στη μεμβράνη της ταινίας. Η ανίχνευση/ταυτοποίηση του αναλύτη πραγματοποιείται με συζεύγματα μορίων ή/και σωματιδίων, τα οποία έχουν την ιδιότητα αφενός να αναγνωρίζουν τον αναλύτη και αφετέρου να παράγουν αναλυτικό σήμα (π.χ., χαρακτηριστικό χρώμα ή εκπομπή φωτός ή ηλεκτρικό σήμα). Η ταινία διαθέτει ειδική περιοχή (π.χ., ζώνη ή κηλίδα), στην οποία η εμφάνιση σήματος δηλώνει την παρουσία του αναλύτη (περιοχή δοκιμής). Συνήθως, στην ταινία υπάρχει και δεύτερη περιοχή (περιοχή ελέγχου) όπου παράγεται διακριτό αναλυτικό σήμα, το οποίο επιβεβαιώνει τη λειτουργικότητα της ταινίας. Η συνεχής ροή του διαλύματος, λόγω φαινομένου τριχοειδών, κατά μήκος της ταινίας απομακρύνει την περίσσεια των χημικών αντιδραστηρίων από τις περιοχές δοκιμής και ελέγχου. Το αναλυτικό σήμα, είτε είναι ορατό δία γυμνού οφθαλμού ή δύναται να μετρηθεί με κατάλληλο μεταλλάκτη. Υπάρχει ποικιλία ιχνηθετών και μεταλλακτών. Προτιμώνται ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων, σας οποίες η ανίχνευση πραγματοποιείται δία γυμνού οφθαλμού ή με όργανα χαμηλού κόστους. Συνήθως, οι ταινίες εφαρμόζονται σε ποιοτικές αναλύσεις, δηλαδή για την επιβεβαίωση της παρουσίας ή μη του αναλύτη στο δείγμα. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονη δραστηριότητα στην κατεύθυνση της αξιοποίησης των ταινιών και για ποσοτικές αναλύσεις μέσω της συσχέτισης της έντασης του παραγόμενου σήματος με την ποσότητα ή τη συγκέντρωση του αναλύτη στο δείγμα [Wang et al., Small Methods 2022, 6, 2101143],

Oι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων πλάγιας ροής (Lateral Flow Assays) αποτελούν την 'καρδιά' των 'δοκιμών δέσμευσης' (binding assays) που ονομάζονται και 'δοκιμές συγγένειας' (affinity assays) όπου για την αναγνώριση και ανίχνευση του αναλύτη αξιοποιείται η αλληλεπίδραση με δεσμευτικά μόρια/σωματίδια, όπως δεσμευτικές πρωτεΐνες, π.χ. αντισώματα, υποδοχείς (φυσικοί ή συνθετικοί), (στρεπτ)αβιδίνη κλπ, ή συνδυασμός αυτών. Στο πλαίσιο αυτό, μεγάλη ποικιλία εφαρμογών έχουν οι ταχείες ανοσοδοκιμές (ανοσοαναλύσεις) πλάγιας ροής (Lateral Flow Immunoassays) (Di Nardo et al., Sensors, 2021, 21, 5185; Calabria et al., Sensors, 2021, 21, 3358; Boehringer et al., Clin. Chem. 2022, 68, 52), στις οποίες η μοριακή αναγνώριση του αναλύτη πραγματοποιείται μέσω της αλληλεπίδρασής του με ειδικά αντισώματα, ενώ για την παραγωγή σήματος χρησιμοποιούνται συζεύγματα νανοσωματιδίων (π.χ. νανοσωματιδία χρυσού, φθορίζοντες νανοκρύσταλλοι, κλ.π) ή μικροσωματιδίων (π.χ. έγχρωμα σωματίδια latex, κλπ) ή (βιο)μορίων (π.χ. ένζυμα). Πρόκειται για ετερογενείς ανοσοδοκιμές όπου τα σχηματιζόμενα ανοσοσύμπλοκα μεταξύ αντισώματος και αναλύτη διαχωρίζονται από τα άλλα αντιδραστήρια ή συστατικά του δείγματος μέσω ακινητοποίησης σε ειδική περιοχή της ταινίας. Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των ανοσοδοκίμών πλάγιας ροής που βασίζονται στη χρήση ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων είναι ότι, μετά την εφαρμογή του δείγματος, εξασφαλίζεται συνεχής ροή διαλύματος κατά μήκος της ταινίας λόγω δράσης τριχοειδών. Η ροή αυτή επιτρέπει τη διαλυτοποίηση/διασπορά ήδη εναποτεθέντων (σε ξηρή μορφή) βιοσυζευγμάτων, την ανάμιξη και την αλληλεπίδραση του αναλύτη-στόχου με τα αντιδραστήρια ανίχνευσης, την επακόλουθη δέσμευση του ανοσοσυ μπλόκου σε καθορισμένη περιοχή της ταινίας (ζώνη ή κηλίδα) και την απομάκρυνση της περίσσειας των αντιδραστηρίων. Ο τρόπος εφαρμογής του δείγματος ποικίλει. Για παράδειγμα, σε μερικές περιπτώσεις, το δείγμα, είτε ως έχει είτε μετά από ανάμειξη με κατάλληλο διάλυμα (π.χ., διάλυμα εκχύλισης, διάλυμα δοκιμής), εφαρμόζεται σε ορισμένη θέση της ταινίας, η οποία στη συνέχεια αφήνεται για μερικά λεπτά για την παραγωγή σήματος. Εναλλακτικά, το δείγμα εφαρμόζεται στην ταινία, η οποία στη συνέχεια βυθίζεται σε κατάλληλο διάλυμα. Σε άλλες περιπτώσεις, η ταινία βυθίζεται απευθείας στο δείγμα.

Στις ανοσοδοκιμές πλάγιας ροής τύπου 'sandwich' (ανοσοδοκιμές 'μη ανταγωνιστικού τύπου'), χρησιμοποιούνται αντισώματα που αλληλεπίδρούν με διαφορετικούς επίτοπους του αναλύτη. Ένα αντίσωμα είναι ακινητοποίημένο (άμεσα ή έμμεσα) στην ταινία και δεσμεύει τον αναλύτη που διέρχεται από τη θέση ακίνητοποίησης, ενώ άλλο αντίσωμα χρησιμεύει για την ανίχνευση του δεσμευμένου αναλύτη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα ανοσοδοκίμών τύπου 'sandwich' είναι το τεστ κυήσεως (ανίχνευση ανθρώπινης χοριακής γοναδοτροπίνης, HCG), το ταχύ διαγνωστικό τεστ για COVID-19 (ανίχνευση του αντιγόνου 'nucleocapsid protein' του κορωνοϊού SARS-CoV-2), η ανίχνευση του αντιγόνου του Streptococcus pyogenes (Strep-A), η ανίχνευση αλλεργιογόνων σε τρόφιμα και η ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών σε τρόφιμα [Li et al., J. Food Comp. Anal. 2022, 114, 104776], Στις ανοσοδοκιμές πλάγιας ροής 'ανταγωνιστικού τύπου', έχουμε, συνήθως, δύο περιπτώσεις: (α) Στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων είναι ακινητοποιημένη μικρή ποσότητα αντισώματος έναντι του αναλύτη. Ο αναλύτης που περιέχεται στο δείγμα ανταγωνίζεται με ιχνηθετημένο αναλύτη για την κατάληψη των περιορισμένων θέσεων δέσμευσης στο ακινητοποιημένο αντίσωμα, (β) Στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων έχουν ακινητοποιηθεί μόρια του αναλύτη. Ο αναλύτης που περιέχεται στο δείγμα ανταγωνίζεται με τον ακινητοποιημένο αναλύτη για δέσμευση σε περιορισμένο αριθμό θέσεων ιχνηθετημένου αντισώματος που περιέχεται στο ρέον διάλυμα αντιδραστηρίων. Οι ανοσοδοκιμές πλάγιας ροής ανταγωνιστικού τύπου εφαρμόζονται συνήθως για την ανίχνευση αναλυτών μικρής μοριακής μάζας, όπως για παράδειγμα οι διάφορες μυκοτοξίνες, τα φυτοφάρμακα κ.λ.π. [Jara et al., Env. Sci. Poll. Res. 2022, 6, 46487], Στο ίδιο πλαίσιο ('sandwich' ή ανταγωνιστικού τύπου), λειτουργούν και οι 'δοκιμές δέσμευσης' όπου για την αναγνώριση του αναλύτη μπορούν να χρησιμοποιηθούν, αντί για αντισώματα ή σε συνδυασμό με αντισώματα, άλλα δεσμευτικά μόρια/σωματίδια, όπως δεσμευτικές πρωτεΐνες, π.χ. υποδοχείς, (στρεπτ)αβιδίνη, απταμερή κ.λ.π., οπότε στις ταινίες αυτές η αναγνώριση του αναλύτη πραγματοποιείται μέσω δέσμευσης (αλληλεπίδρασης) με ειδικό δεσμευτή.

Η ανίχνευση μορίων μονόκλωνου (ssDNA) ή δίκλωνου DNA (dsDNA) ή RNA δύναται να πραγματοποιηθεί με ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων όπως περιγράφηκε παραπάνω για τις ανοσοδοκίμές, κυριώς με δοκιμή τύπου 'sandwich', δηλαδή δέσμευση σε ακινητοποιημένο στην ταινία (άμεσα ή έμμεσα) αντίσωμα, (στρεπτ)αβιδίνη ή άλλο δεσμευτικό μόριο/σωματίδιο και ανίχνευση με επισημασμένο αντίσωμα, (στρεπτ)αβιδίνη ή άλλο δεσμευτικό μόριο/σωματίδιο. Για παράδειγμα, κατά την εκθετική ενίσχυση αλληλουχιών DNA ή RNA (π.χ., με τις τεχνικές PCR, LAMP κ.λ.π.) ενσωματώνονται, στα προϊόντα της αντίδρασης ενίσχυσης, μικρομόρια (π.χ. απτένια ή/και βιοτίνη). Το προϊόν της ενίσχυσης ανιχνεύεται με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με δοκιμή τύπου 'sandwich', δηλαδή δέσμευση σε ακινητοποιημένο στην ταινία αντίσωμα ή (στρεπτ)αβίδίνη καί ανίχνευση με επισημασμένο αντίσωμα ή με επίσημασμένη (στρεπτ)αβίδίνη [Chua et al., Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3825; Wang et al., Frontiers Microbiol. 2017, 8, 192], Σε άλλη εκδοχή αυτών των δοκιμών, επισημασμένο DNA (π.χ. με απτένιο ή βιοτίνη) υβριδοποιείται με επισημασμένο (π.χ. με απτένιο ή βιοτίνη) μοριακό ανιχνευτή και εφαρμόζεται στην ταινία όπου πάλι ανιχνεύεται μέσω ανοσοδοκιμής τύπου 'sandwich' [Loose et al. PlosOne 2020, 15, e0241420]. Σε άλλη εκδοχή, μέσω αντιδράσεων γονοτύπησης δημιουργούνται διπλά επισημασμένες αλυσίδες DNA (με απτένια, βιοτίνη, χαρακτηριστική νουκλεοτιδική αλληλουχία, κ.λ.π.), οι οποίες ανίχνεύονταί με ανοσοδοκίμή τύπου 'sandwich' στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων [Toubanaki et al. Anal. Chem. 2009, 81, 218],

Oι πιο ευρέως ακολουθούμενες στρατηγικές για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των δοκιμών δέσμευσης (συμπεριλαμβανομένων των ανοσοδοκίμών) που βασίζονται σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων επικεντρώνονται στην επινόηση νέων, πιο ανιχνεύσιμων ιχνηθετών, και μεθόδων ιχνηθέτησης, και στην εισαγωγή νέων τύπων μεταλλακτών, οι οποίοι παρέχουν καλύτερη ανιχνευσιμότητα κατά τη διαδικασία μετατροπής της μοριακής αναγνώρισης του αναλύτη σε μετρούμενο σήμα. Για παράδειγμα, εισάγονται νέα νανοσωματίδια και νέα ένζυμα (συμπεριλαμβανομένων των νανο-ενζύμων, δηλαδή νανοσωματιδίων με καταλυτικές ιδιότητες) σε συνδυασμό με ποικιλία υποστρωμάτων και. νέων ανιχνευτών-μεταλλακτών για τη μέτρηση του αναλυτικού σήματος [Di Nardo et al., Sensors, 2021, 21, 5185; Calabria et al., Sensors, 2021, 21, 3358; Boehringer et al., Clin. Chem. 2022, 68, 52],

Η παρούσα εφεύρεση αξίοποιεί, για πρώτη φορά, το φαινόμενο του μακρομοριακού συνωστισμού για να επιτύχει σημαντική βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των ταχυδοκιμών που βασίζονται στις ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων πλάγιας ροής. Ο μακρομοριακός συνωστισμός είναι φαινόμενο που συναντάται. ευρύτατα στους ζώντες οργανισμούς. Το κύτταρο περιέχει μεγάλη ποικιλία μακρομορίων, δηλαδή υδατανθράκων, λιπιδίων, πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, τα οποία επιτελούν συγκεκριμένες λειτουργίες. Ο μακρομορίακός συνωστισμός οφείλεται στο γεγονός ότι, αθροιστικά, τα μακρομόρία καταλαμβάνουν σημαντικό μέρος του συνολικού όγκου των κυττάρων (περίπου 20-30%), με συνέπεια τη μείωση του κλάσματος του συνολικού όγκου, καθώς και του όγκου του διαλύτη (νερό), που είναι προσβάσίμος στα άλλα μόρια, ιδιαίτερα στα μεγαλομόρια και στα σωματίδια [Rivas et al., Trends Biochem. Sci., 2016, 41, 970; Zhou et al., Annu. Rev. Biophys., 2008, 37, 375], Ο διαλύτης και τα μικρομόρια διεισδύουν εύκολα στο χώρο μεταξύ των μακρομορίων. Όμως, καθώς αυξάνεται το μοριακό μέγεθος των διαλυμένων ουσιών, ο διαθέσιμος για αυτές όγκος μειώνεται κατά πολύ. Αν και αρκετές πτυχές αναφορικά με τον μηχανισμό και τις επιπτώσεις του μακρομορίακού συνωστισμού δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί, έχει αποδειχθεί ότι, σε αυτό το πολυσύχναστο μικροπεριβάλλον, η αποτελεσματική συγκέντρωση (δηλαδή, η θερμοδυναμική ενεργότητα) οίωνδήποτε αντιδρώντων μακρομορίων είναι πολύ υψηλότερη από την αναμενόμενη μορίακότητά τους, δηλαδή την υπολογιζόμενη με βάση τον συνολικό όγκο. Για παράδειγμα, λόγω του μακρομοριακού συνωστισμού, η θερμοδυναμική ενεργότητα της αιμοσφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα είναι 100 φορές μεγαλύτερη από τη συγκέντρωσή της που υπολογίζεται με βάση τον ολικό όγκο. Επιπλέον, οι συντελεστές διάχυσης των μακρομορίων μειώνονται καθώς αυξάνεται η έκταση του συνωστισμού. Πειραματικές και θεωρητικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο μακρομοριακός συνωστισμός επηρεάζει είτε ευνοϊκά είτε παρεμποδιστικά τις αλληλεπιδράσεις μακρομορίων [Kuznetsova et al., Int. J. Mol. Sci., 2014, 15, 23090; Kim et al., J. Chem. Phys., 2010, 133, 205101], τον πολυμερίσμό μακρομορίων [Shahid et al., Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 2017, 1861, 178], την αναδίπλωση πρωτεϊνών [Christiansen et al., Biophys. Rev., 2013, 5, 137; Mukherjee et al., J. Phys. Chem. B, 2015, 119, 14145; Hoppe et al., Biophys. J., 2015, 108, 957] και την αναδίπλωση RNA [Harve et al., Nucleic Acids Res., 2010, 38, 172; Gao et al., Angewandte Chem. Int. Ed., 2016, 55, 3224], Η κατεύθυνση και το μέγεθος της επίδρασης εκτιμώνται πειραματικά.

Τομείς εφαρμογών του φαινομένου του μακρομοριακού συνωστισμού περιλαμβάνουν τη μηχανική ιστών [Satyam et al., Adv. Mater., 2014, 26, 3024], την ανάπτυξη θεραπευτικών αντισωμάτων, την τεχνολογία κυτταροκαλλιεργειών και τη δημιουργία in vitro μοντέλων για διάφορες νόσους [Raghunath et al., Trends Biochem. Sci., 2021, 46, 805], Για τη χωροχρονική παρακολούθηση και τον χαρακτηρισμό του μοριακού συνωστισμού έχουν αναπτυχθεί μοριακοί αισθητήρες, βασισμένοι στη μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού [Takahashi et al., Anal. Chem., 2019, 91, 2586; Boersma et al., Nat. Methods, 2015, 12, 227; Murade et al., ACS Sens., 2019, 4, 1835; Miyagi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2021, 583, 29], Ωστόσο, η αξιοποίηση του μακρομοριακού συνωστισμού για την ανάπτυξη ή/και τη βελτίωση αναλυτικών μεθόδων και αναλυτικών διατάξεων/συσκευών είναι εξαιρετικά περιορισμένη. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι ένας ηλεκτρολύτης που περιέχει πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), ως παράγοντα μακρομοριακού συνωστισμού, βελτιώνει την αποτελεσματικότητα ενός νανο-πόρου στερεάς κατάστασης για την ανίχνευση κυκλικού και γραμμικού πλασμιδιακού DNA και πρωτεϊνών [Chau et al., Nano. Lett., 2020, 20, 5553; Yao et al., Anal. Chem., 2020, 92, 3827], Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι ο μακρομοριακός συνωστισμός σε οργανικούς διαλύτες (π.χ. με πολυστυρόλιο ως παράγοντα συνωστισμού), προάγει τη σύνθεση τεχνητών 'υποδοχέων' για φυτοφάρμακα, με τη μέθοδο της μοριακής αποτύπωσης. Οι τεχνητοί 'υποδοχείς' χρησιμοποιήθηκαν ως στατική φάση για τη χρωματογραφία συγγένειας [Matsui et al., Anal. Chem., 2007, 79, 1749], Επίσης αξιοποιώντας τον μοριακό συνωστισμό παρασκευάστηκαν μονολιθικές χειρόμορφες χρωματογραφικές στήλες με βελτιωμένη χρωματογραφική αποτελεσματικότητα στον διαχωρισμό εναντιομερών φαρμακευτικών ουσιών [Wang et al., Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409, 201],

Στην παρούσα εφεύρεση παρουσιάζεται μέθοδος βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας των ταχυδοκιμών που πραγματοποιούνται με τη χρήση ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων αξιοποιώντας παράγοντες που δημιουργούν μακρομοριακό συνωστισμό, οι οποίοι κατά τη διάρκεια της ροής του διαλύματος/δείγματος μέσω των πόρων της ταινίας δημιουργούν ένα μικροπεριβάλλον που διευκολύνει τις αλληλεπιδράσεις καί προάγει τις αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα για την αναγνώριση του αναλύτη και την παραγωγή σήματος στην ταχύ δοκιμή. Η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας επιτυγχάνεται δίχως να περιορίζονται τα ευρέως γνωστά πλεονεκτήματα των ταχυδοκίμών, δηλαδή η απλότητα και η πρακτικότητα στην εκτέλεσή τους από το χρήστη και η καταλληλότητά τους για επιτόπιες αναλύσεις (π.χ. ταχυδοκιμές πεδίου, αναλύσεις κατ' οίκον, παρακλίνιες αναλύσεις κλπ). Η προσθήκη μακρομοριακών παραγόντων συνωστισμού δεν αντικαθιστά αλλά είναι συμπληρωματική με άλλες στρατηγικές βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, όπως ο σχεδιασμός νέων ιχνηθετών, η εισαγωγή ενίσχυσης σήματος και η εισαγωγή νέων μεταλλακτών. Αναμένουμε ότι η προτεινόμενη διαμόρφωση θα επεκταθεί σε πολυάριθμους αναλύτες με ποικιλία ιχνηθετών και σε ποίκιλες διαμορφώσεις των ταχυδοκιμών πλάγιας ροής.

Ως παραδείγματα για την αποτελεσματικότητα της εφεύρεσης παρουσιάζονται οι ταχείες ανοσοδοκιμές με ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων πλάγιας ροής, για την πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου του ιού SARS-CoV-2, ο οποίος είναι υπεύθυνος για τη νόσο COVID-19, καί για το αντιγόνο του Streptococcus pyogenes (Strep-A), ο οποίος προκαλεί φαρυγγίτίδα καί άλλες νόσους [Pavia et al., J. Microbiol. Immunol. Infect., 2021, 54, 776; Bacura et al., Biochem. Med., 2021, 31, 020601],

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ

Για την εφαρμογή και την επίδειξη των δυνατοτήτων της παρούσας επινόησης χρησιμοποιήσαμε δύο από τις πιο ευρέως καθιερωμένες παγκοσμίως ανοσοδοκιμές πλάγιας ροής τύπου 'sandwich', δηλαδή την ανίχνευση του αντιγόνου ΝΡ (πρωτεΐνη νουκλεοκαψίδίου, Nucleocapsid Protein) του κορωνοϊού SARS-CoV-2 που προκαλεί τη νόσο COVID-19 καί την ανίχνευση του αντιγόνου Strep-A του Streptococcus pyogenes που προκαλεί φαρυγγίτίδα.

Για την άμεση επίδειξη της βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, εργαστήκαμε απευθείας σε εμπορικά διαθέσιμες ταχυαναλυτικές ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων που είναι ήδη βελτιστοποιημένες από τους κατασκευαστές όσον αφορά στα αντιδραστήρια και τις συνθήκες της δοκιμής. Ο μακρομοριακός συνωστισμός δημιουργήθηκε με προσθήκη της κατάλληλης ουσίας απευθείας στο διάλυμα της ανάλυσης που παρέχεται από τον κατασκευαστή του kit.

Παράδειγμα 1. Ο μακρομορίακός συνωστισμός βελτιώνει την ανιχνευσιμότητα της ταχείας ανοσοδοκιμής για τον κορωνοϊό SARS-CoV-2

Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με την ταχεία ανοσοδοκιμή (Lateral Flow Immunoassay, LFIA) VivaDiag Pro SARS-CoV-2 antigen rapid test, τύπου 'sandwich', για το αντιγόνο NP (Nucleocapsid Protein) του κορωνοϊού με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ως δείγμα χρησιμοποιήθηκε είτε καθαρή ΝΡ, αραιωμένη στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης που παρέχεται από τον κατασκευαστή του kit, είτε ρινικό επίχρισμα που ελήφθη με τον στυλεό του kit και εκχυλίστηκε με το διάλυμα εκχύλισης που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Η δοκιμή διεξήχθη μεταφέροντας, με πιπέτα, όγκο 60 uL του δείγματος στην περιοχή εφαρμογής δείγματος της συσκευής και καταγράφοντας τα αποτελέσματα μετά την παρέλευση 20-30 min.

Στο συγκεκριμένο παράδειγμα, ως παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομοριακό συνωστισμό χρησιμοποιήθηκε η φικόλλη (ficoll) μοριακής μάζας 400000 (F-400), η οποία προστέθηκε απευθείας, σε στερεά μορφή, στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης του αντιγόνου (που περιέχεται στο kit), για να αποφευχθεί η αραίωση αυτών των διαλυμάτων. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίστηκε ότι οι συγκεντρώσεις όλων των άλλων αντιδραστηρίων διατηρήθηκαν σταθερές.

Για να μελετηθεί η επίδραση του παράγοντα μακρομοριακού συνωστισμού F-400 στο σήμα που ελήφθη από την ανοσοδοκιμή της πρωτεΐνης ΝΡ, παρασκευάσθηκαν διαλύματα διαφόρων συγκεντρώσεων ΝΡ με αραίωση της πρωτεΐνης. Ως αραιωτικό χρησιμοποιήθηκε είτε το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης ως έχει (συμβατική δοκιμασία, conventional assay) ή το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης στο οποίο είχε προστεθεί 4% F-400 (βελτιωμένη δοκιμασία, enhanced assay). Στο Σχήμα 1, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των δοκιμών για συγκεντρώσεις ΝΡ 0, 10, 30, 100 και 300 pmol/L. Παρατηρούμε σημαντική αύξηση στο σήμα (τουλάχιστον 5 φορές) όταν υπάρχει ο παράγοντας φικόλλη (F-400) που δημιουργεί μακρομοριακό συνωστισμό.

Πραγματοποιήθηκαν και δοκιμές κλινικών δειγμάτων για SARS-CoV-2. Δείγματα ρινικού επιχρίσματος συλλέχθηκαν από διάφορα άτομα που πραγματοποίησαν το self-test σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (με τον ίδιο στυλεό και για τα δύο ρουθούνια). Ο στυλεός στη συνέχεια εισήχθη στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης ακολουθώντας τις οδηγίες του kit και το δείγμα αναλύθηκε απευθείας ή διατηρήθηκε στους -20 °C μέχρι τη χρήση. Σε ένα δείγμα 100-uL του μείγματος, προστέθηκαν 4 mg F-400 για να προκύψει το ενισχυμένο (Enhanced) ρυθμιστικό διάλυμα. Στη συνέχεια, η δοκιμή πραγματοποιήθηκε είτε με 60 uL του συμβατικού (Conventional) ρυθμιστικού διαλύματος του κατασκευαστή είτε με 60 uL του ενισχυμένου ρυθμιστικού διαλύματος (Enhanced). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα κλινικά δείγματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Για κάθε ζεύγος, η αριστερή ταινία δείχνει το αποτέλεσμα της δοκιμής με το συμβατικό διάλυμα (συμβολισμός με C), ενώ η δεξιά ταινία δείχνει το αποτέλεσμα της δοκιμής με το ενισχυμένο διάλυμα (συμβολισμός με Ε). Το δείγμα 1 ήταν αρνητικό για τον SARS-CoV-2. Αυτό επιβεβαιώθηκε καί από τα αποτελέσματα τόσο με το συμβατικό διάλυμα εκχύλισης (1C) όσο και με το ενισχυμένο διάλυμα (ΙΕ). Το δείγμα 2 ήταν θετικό για τον SARS-CoV-2. Παρατηρούμε ότι η κόκκινη γραμμή στη ζώνη δοκιμής της συμβατικής ταινίας (2C) είναι οριακά ανιχνεύσιμη, ενώ η χρήση του ενισχυμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης στο (2Ε) παρέχει κόκκινη γραμμή με πολύ ισχυρότερη ένταση σήματος, επομένως ένα αναμφίβολα θετικό αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα για τα υπόλοιπα δείγματα δείχνουν επίσης σημαντικά βελτιωμένο σήμα σε χαμηλά επίπεδα πρωτεΐνης ΝΡ παρουσία F-400. Η βελτίωση του σήματος, παρουσία του μακρομορι,ακού παράγοντα συνωστισμού, είναι ιδιαίτερα σημαντική για τα δείγματα που δίνουν οριακά θετικό αποτέλεσμα με το συμβατικό ρυθμιστικό διάλυμα (δηλαδή δίνουν μία αμυδρή ζώνη δοκιμής) ενώ η ζώνη δοκιμής είναι καθαρά ορατή όταν χρησιμοποιηθεί το ενισχυμένο διάλυμα διευκολύνοντας έτσι τη διάγνωση καί κυρίως την πιο έγκαιρη διάγνωση. Η απόκτηση ενός σαφούς, αδιαμφισβήτητου αποτελέσματος είναι εξαιρετικά επιθυμητή για την έγκαιρη διάγνωση, τη θεραπευτική αντιμετώπιση του ασθενούς καί τη λήψη μέτρων περιορισμού της διασποράς της νόσου.

Παράδειγμα 2. Ο μακρομοριακός συνωστισμός βελτιώνει την ανιχνευσιμότητα της ταχείας ανοσοδοκιμής για το αντιγόνο Strep-A (S. pyogenes )

Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με την ταχεία ανοσοδοκιμή CiTEST Strep A Rapid Test Cassette (Throat Swab), τύπου 'sandwich', για το αντιγόνο του S. pyogenes με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή.

To kit περιέχει τα αντιδραστήρια εκχύλισης 1 και 2 (ER1 και ER2), έναν θετικό μάρτυρα και έναν αρνητικό μάρτυρα. Πρώτα αναμίχθηκε το ER1 με το ER2 σε αναλογία όγκων ER1/ER2 = 3/2. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν διάφορες αραιώσεις του θετικού μάρτυρα χρησιμοποιώντας το μίγμα ER1/ER2 ως αραιωτικό.

Η ανοσοδοκίμή Strep-A πραγματοποιήθηκε προσθέτοντας 1 όγκο δείγματος (αρνητικός μάρτυρας ή αραίωση του θετικού μάρτυρα) σε 10 όγκους μίγματος ER1/ER2 καί εφαρμόζοντας 100 uL του προκύπτοντος διαλύματος στην περιοχή εφαρμογής του δείγματος της συσκευής.

Στο συγκεκριμένο παράδειγμα, ως παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομορίακό συνωστισμό χρησιμοποιήθηκε η φικόλλη (ficoll) μοριακής μάζας 70000 (F-70), η οποία προστέθηκε απευθείας, σε στερεά μορφή, στο μείγμα ER1/ER2 για να αποφευχθεί η αραίωση του μείγματος. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίστηκε ότι οι συγκεντρώσεις όλων των άλλων αντιδραστηρίων διατηρήθηκαν σταθερές.

Για να μελετηθεί η επίδραση του μακρομοριακού παράγοντα συνωστισμού F-70 στο σήμα που ελήφθη από την ανοσοδοκιμή πλευρικής ροής διαφόρων συγκεντρώσεων αντιγόνου Strep Α, το διάλυμα θετικού ελέγχου, που περιλαμβάνεται στο kit, αραιώθηκε διαδοχικά χρησιμοποιώντας, ως αραιωτικό, είτε το αντιδραστήριο εκχύλισης ως έχει (συμβατική δοκιμασία, conventional assay) ή το αντιδραστήριο εκχύλισης στο οποίο είχε προστεθεί 4% F-70 (βελτιωμένη δοκιμασία, enhanced assay). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Σε όλα τα επίπεδα συγκέντρωσης, παρατηρείται σημαντική αύξηση στο σήμα παρουσία του παράγοντα μακρομοριακού συνωστισμού. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις Strep Α το σήμα βελτιώνεται 5-10 φορές παρουσία του παράγοντα μακρομορίακού συνωστισμού, χωρίς να επηρεάζεται η μη ειδική δέσμευση των αντιδραστηρίων στη ζώνη ελέγχου.

Claims (15)

ΑΞΙΩΣΕΙΣ

1. Ταχεία δοκιμή που βασίζεται σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πλάγιας ροής για ανίχνευση ή/και ποσοτικό προσδιορισμό του αναλύτη και χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι στα αντιδραστήρια της δοκιμής περιέχεται ένας ή περισσότεροι παράγοντες των οποίων η δομή, οι ιδιότητες, η μοριακή μάζα και η συγκέντρωση δημιουργούν μακρομοριακό συνωστισμό για βελτίωση της ανίχνευσιμότητας.

2. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 1, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομοριακό συνωστισμό αποτελεί συστατικό του διαλύματος με το οποίο λαμβάνεταί το δείγμα καί το οποίο τελικά εφαρμόζεται πάνω στην ταινία.

3. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 1, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομοριακό συνωστισμό αποτελεί συστατικό του διαλύματος, στο οποίο βυθίζεται η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων τύπου πλάγιας ροής.

4. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 1, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομοριακό συνωστισμό ευρίσκεται σε ξηρή μορφή πάνω στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων καί δίαλυτοποιείται από το ρέον υγρό.

5. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 1, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο παράγοντας που δημιουργεί τον μακρομοριακό συνωστισμό είναι συνθετικό ή φυσικό πολυμερές.

6. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με μία οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-5, χαρακτηριζόμενη από το ότι ένας ή περισσότεροι παράγοντες που δημιουργούν μακρομοριακό συνωστισμό περιλαμβάνουν τη φικόλλη, την πολυαιθυλενογλυκόλη, τη δεξτράνη, την πολυβινυλοαλκοόλη, την πολυβινυλοπυρρολιδόνη και, κατά προτίμηση, η ολική συγκέντρωση των παραγόντων μακρομοριακού συνωστισμού, μετά τη διαλυτοποίησή τους στο ρέον διάλυμα, να είναι τουλάχιστον 3.5 % μάζα κατ' όγκον.

7. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 6, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο παράγοντας που δημιουργεί μακρομοριακό συνωστισμό είναι ο υδρόφιλος πολυσακχαρίτης φικόλλη με μοριακή μάζα (Mr), κατά προτίμηση, στην περιοχή 20000 < Μοριακή Μάζα < 500000, καί σε περιεκτικότητα, κατά προτίμηση, μεγαλύτερη του 3.5 % και μικρότερη του 18 % μάζα κατ' όγκον.

8. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μια οποίαδήποτε από τις αξιώσεις 1-7, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης ανιχνεύεται/ποσοτικοποιείται μέσω ανοσοδοκιμής 'μη ανταγωνιστικού τύπου', δηλαδή ανοσοδοκιμής τύπου 'sandwich', κατά την οποία χρησιμοποιούνται αντισώματα που αλληλεπιδρούν με δύο τουλάχιστον θέσεις του αναλύτη, ένα αντίσωμα είναι ακινητοποίημένο στην ταινία και δεσμεύει τον αναλύτη που διέρχεται από τη θέση ακίνητοποίησης, ενώ άλλο αντίσωμα είναι επισημασμένο και χρησιμεύει για την ανίχνευση του δεσμευμένου αναλύτη.

9. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μία οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-7, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης ανιχνεύεται/ποσοτικοποιείται μέσω ανοσοδοκιμής 'ανταγωνιστικού τύπου' όπου έχουμε τις εξής περιπτώσεις: (α) στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων είναι ακινητοποιημένη ποσότητα αντισώματος έναντι του αναλύτη, ο αναλύτης που περιέχεται στο δείγμα ανταγωνίζεται με ιχνηθετημένο αναλύτη για την κατάληψη των περιορισμένων θέσεων δέσμευσης στο ακινητοποιημένο αντίσωμα, (β) στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων έχουν ακίνητοποιηθεί μόρια του αναλύτη και ο αναλύτης που περιέχεται στο δείγμα ανταγωνίζεται με τον ακινητοποιημένο αναλύτη για δέσμευση στο ιχνηθετημένο αντίσωμα που υπάρχει στο ρέον διάλυμα αντιδραστηρίων.

10. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μία οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 8 και 9, χαρακτηριζόμενη από το ότι, στις ταινίες αυτές, για την αναγνώριση του αναλύτη χρησιμοποιούνται είτε δεσμευτικά μόρια/σωματίδια, όπως δεσμευτικές πρωτεΐνες, π.χ. υποδοχείς, (στρεπτ)αβιδίνη, απταμερή είτε συνδυασμός των εν λόγω δεσμευτικών μορίων/σωματιδίων με αντισώματα.

11. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μία οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-10, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης είναι αλληλουχία DNA ή RNA επισημασμένη με μικρομόριο ή μικρομόρια, π.χ. απτένιο ή/και βιοτίνη, ώστε να μπορεί να δεσμευτεί σε ακινητοποιημένο στην ταινία αντίσωμα, (στρεπτ)αβιδίνη ή άλλο δεσμευτικό μόριο/σωματίδιο και να ανιχνευθεί με ίχνηθετημένο αντίσωμα, (στρεπτ)αβιδίνη ή άλλο δεσμευτικό μόριο/σωματίδιο .

12. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με την αξίωση 11, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης είναι προϊόν εκθετικής ενίσχυσης DNA ή RNA επισημασμένο με απτένιο ή/και βιοτίνη.

13. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μία οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 11 και 12, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης είναι DNA ή RNA υβριδοποιημένο με τουλάχιστον έναν μοριακό ανιχνευτή, π.χ. ολιγονουκλεοτίδιο, επίσημασμένο με απτένιο ή/και βίοτινη.

14. Ταχεία δοκιμή πλάγιας ροής σύμφωνα με μία οποίαδήποτε από τις αξιώσεις 11-13, χαρακτηριζόμενη από το ότι ο αναλύτης είναι DNA ή RNA, προϊόν αντίδρασης γονοτύπησης επίσημασμένο με δύο τουλάχιστον μικρομόρια, π.χ. απτένια ή/και βιοτίνη, ή/και φέρον χαρακτηριστική νουκλεοτιδική αλληλουχία.

15. Ταχεία δοκιμή σύμφωνα με την αξίωση 1, χαρακτηριζόμενη από το ότι η δομή, οι ιδιότητες, η μοριακή μάζα και η συγκέντρωση του παράγοντα που δημιουργεί μακρομοριακό συνωστισμό έχουν επιλεγεί έτσι ώστε να δημιουργείται μακρομοριακός συνωστισμός και ταυτόχρονα: (α) να μην εμποδίζεται η διαλυτοποιηση/διασπορά των αντιδραστηρίων που περιέχονται σε ξηρή μορφή στην ταινία, (β) να διασφαλίζεται ότι η δοκιμή εξακολουθεί να είναι ταχεία, δηλαδή να ολοκληρώνεται εντός 30 min από την εφαρμογή του δείγματος, (γ) να επιτυγχάνεται ομαλή ροή/μετακίνηση του διαλύματος των αντιδραστηρίων στην ταινία κατά τη διάρκεια της ανάλυσης και ικανοποιητική διαύγαση της ταινίας στο τέλος της δοκιμής, δηλαδή να υπάρχει συμβατότητα με το πορώδες της ταινίας και (δ) ο μακρομοριακός συνωστισμός να μην επιφέρει αύξηση της μη ειδικής δέσμευσης των αντιδραστηρίων ανίχνευσης καθώς αυτά διέρχονται από την περιοχή, δηλαδή ζώνη ή κηλίδα, όπου παρατηρείται το αποτέλεσμα της δοκιμής, δηλαδή το σήμα.