HK40091237A - 新型抗cd47抗体及其用途 - Google Patents

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HK40091237A
HK40091237A HK62023079420.3A HK62023079420A HK40091237A HK 40091237 A HK40091237 A HK 40091237A HK 62023079420 A HK62023079420 A HK 62023079420A HK 40091237 A HK40091237 A HK 40091237A
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王正毅
曹巍
郭炳诗
徐聪
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天境生物科技(上海)有限公司
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新型抗CD47抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月14日提交的国际申请号PCT/CN2020/120869和2020年10月20日提交的国际申请号PCT/CN2020/122188的优先权权益，其内容整体援引加入本文。
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以下以ASCII文本文件提交的内容整体援引加入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：233002000241SEQLIST.TXT，记录日期：2021年10月12日，大小：31,455字节)。
技术领域
本申请涉及抗CD47抗体，制备这类抗体的方法以及这类抗体在治疗与CD47相关的疾病和病症中的用途。
背景技术
CD47(分化簇47)在20世纪80年代首次鉴定为人卵巢癌的肿瘤抗原。从那时起，已发现CD47在多种人肿瘤类型上表达，包括急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其他实体瘤。高水平的CD47允许癌细胞避免吞噬作用，尽管有更高水平的钙网蛋白–主要的促吞噬信号。
CD47也称作整联蛋白相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh相关抗原和MER6，是一种属于免疫球蛋白超家族的多跨膜受体。它的表达和活性与许多疾病和病症有关。它是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，具有单一的Ig样结构域和五个跨膜区域，作为SIRPα的细胞配体，通过信号调节蛋白α(SIRPα)的NH2-末端V样结构域介导结合。SIRPα主要在髓系细胞上表达，包括巨噬细胞、粒细胞、髓系树突细胞(DC)、肥大细胞及其前体，包括造血干细胞。
巨噬细胞通过吞噬作用从血流清除病原体以及受损或衰老的细胞。细胞表面CD47与其在巨噬细胞上的受体SIRPα相互作用，抑制正常、健康细胞的吞噬作用。SIRPα抑制巨噬细胞对宿主细胞的吞噬作用，其中通过宿主靶细胞上表达的CD47连接巨噬细胞上的SIRPα会产生由SHP-1介导的抑制信号，负向调节吞噬作用。
与CD47抑制正常细胞吞噬的作用一致，有证据表明在造血干细胞(HSC)和祖细胞迁移前和迁移过程中，CD47会短暂上调，并且这些细胞上CD47的水平决定了它们在体内被吞噬的概率。
CD47还在许多癌症中组成性上调，包括髓系白血病。髓系白血病系上CD47的过量表达通过使其逃避吞噬作用而增加其致病性。已经得出结论，CD47上调是在炎症介导的动员过程中为正常HSC提供保护的重要机制，而白血病祖细胞共同采用这种能力以逃避巨噬细胞的杀伤。
已经证明某些CD47抗体恢复吞噬作用和预防动脉粥样硬化。参见，例如，Kojimaet al.,Nature,Vol.36,86-90(Aug.4,2016)。本发明提供新型CD47抗体或其免疫学活性片段，其在人中具有低免疫原性，并且引起低水平或无水平的红细胞耗竭。正如本领域技术人员公知的，这类抗体可以互换地称为“抗CD47抗体”。
发明内容
本文提供一种特异性地结合人CD47(hCD47)的抗体或其免疫学活性片段，其包含：(a)重链可变(VH)结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含RAWMN(SEQ IDNO:5)的CDR-H1；(3)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH结构域的N-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H1，VH结构域的C-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H113。在一些实施方案中，VH结构域的N-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H1，VH结构域的C-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H113。在一些实施方案中，VH结构域的N-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H1，VH结构域的C-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H128。在一些实施方案中，VH结构域的N-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1，VH结构域的C-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸118。在一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:1具有至少95％相同性的氨基酸序列，VL包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:1，VL包含SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段包含Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域。在一些实施方案中，人IgG Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在一些实施方案中，抗CD47抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗CD47抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:55，所述轻链包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，抗CD47抗体的免疫学活性片段是Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链Fv(scFv)、Fv片段或线性抗体。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段是嵌合的或人源化的。
在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段与癌细胞表面上表达的hCD47结合。在一些实施方案中，癌细胞是SK-OV-3细胞、Toledo细胞、K562细胞、HCC827细胞、Jurkat细胞、U937细胞、TF-1细胞、Raji细胞、SU-DHL-4细胞、MDA-MB-231细胞、A375细胞或SK-MES-1细胞。在一些实施方案中，癌细胞是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段不与血细胞表面上表达的hCD47结合。在一些实施方案中，血细胞是红细胞。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段与hCD47的结合防止hCD47与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用。在一些实施方案中，SIRPα是人SIRPα(hSIRPα)。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段与癌细胞表面上表达的hCD47的结合促进巨噬细胞介导的对癌细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，癌细胞是SK-OV-3细胞、Toledo细胞、K562细胞、HCC827细胞、Jurkat细胞、U937细胞、TF-1细胞、Raji细胞、SU-DHL-4细胞、MDA-MB-231细胞、A375细胞或SK-MES-1细胞。在一些实施方案中，癌细胞是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，向受试者给药抗CD47抗体或其免疫学活性片段不会引起受试者中显著水平的血凝或受试者的红细胞耗竭。
本文提供编码本文所述的抗CD47抗体或其免疫学活性片段的核酸。本文还提供包含这类核酸的载体。此外，本文提供包含本文所述的核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，CHO细胞是CHO-K1细胞。在一个相关方面，本文提供制备抗CD47抗体或其免疫学活性片段的方法，其包括：a)在有效引起抗CD47抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收宿主细胞表达的抗CD47抗体或其免疫学活性片段。
本文提供包含抗CD47抗体或其免疫学活性片段以及药学上可接受的载剂的药物组合物。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者给药有效量的抗CD47抗体，其中所述抗CD47抗体包含(a)重链可变结构域(VH)，其包含(1)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(2)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；和(3)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是肺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肉瘤肿瘤、头颈肿瘤、胃肿瘤、肾肿瘤或皮肤肿瘤。在一些实施方案中，实体瘤是复发和/或难治性实体瘤。
在一些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且所述方法进一步包括向受试者给药有效量的利妥昔单抗。在一些实施方案中，NHL是滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在一些实施方案中，NHL是复发/难治性NHL。在一些实施方案中，受试者接受过至少一次NHL的先前治疗。在一些实施方案中，受试者接受过2-10次NHL的先前治疗。在一些实施方案中，受试者接受过靶向CD20的药剂的NHL先前治疗。在一些实施方案中，受试者在靶向CD20的药剂的先前治疗期间或之后出现进展。
在本文提供的任何治疗方法的一些实施方案中，抗CD47抗体包含人IgG4恒定区或其变体，所述变体包含S233P突变(其中编号根据EU索引)。在一些实施方案中，将抗CD47抗体以10mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗CD47抗体以20mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗CD47抗体以30mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗CD47抗体每周一次(qw)向受试者给药。在一些实施方案中，其中将抗CD47抗体通过静脉内(IV)输注向受试者给药。在治疗NHL的方法的一些实施方案中，利妥昔单抗在前五周每周一次(qw)以375mg/m2的剂量给药，在前五周之后每4周一次(q4w)以375mg/m2的剂量给药。
在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而出现明显的血液学毒性。在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而出现任何血液学毒性。在一些实施方案中，血液学毒性包括贫血、血细胞减少和/或血凝。在一些实施方案中，抗CD47抗体的VH包含SEQ ID NO:1，并且抗CD47抗体的VL包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:55，并且抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。
本文还提供治疗癌症的试剂盒，其包含本文所述的抗CD47抗体或药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒根据本文提供的治疗方法使用。
应当理解，本文描述的各种实施方案的一个、一些或全部特征可以结合以形成本发明的其他实施方案。对于本领域的技术人员来说，本发明的这些和其他方面会变得明显。本发明的这些和其他实施方案通过下面的详细描述进一步描述。
附图说明
图1示出抗CD47抗体B2B、5F9和2A1与单体CD47-ECD(胞外域)结合的剂量依赖性反应。
图2示出抗CD47抗体B2B、5F9和2A1阻断CD47与SIRPα结合的剂量依赖性反应。
图3示出抗CD47抗体B2B、5F9和2A1与CD47+Raji细胞结合的剂量依赖性反应。
图4示出通过表面等离子共振(BiaCore)分析测量的CD47抗体对肿瘤细胞的结合。
图5示出抗CD47抗体B2B与Raji细胞上表达的CD47的结合促进人巨噬细胞对Raji细胞的吞噬作用。
图6示出抗CD47抗体B2B与各种人肿瘤细胞系上表达的CD47的结合促进人巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
图7示出CD47抗体对急性髓系白血病(AML)细胞的结合。
图8示出CD47抗体对急性髓系白血病(AML)细胞的吞噬作用。
图9A和9B示出抗CD47抗体B2B导致与红细胞(RBC)的结合最少，没有RBC凝集。具体而言，图9A示出抗CD47抗体B2B对RBC的结合最少，图9B示出抗CD47抗体B2B没有RBC凝集作用。
图10A-10B示出抗CD47抗体B2B在给药后没有诱导食蟹猴的明显血液学变化。图10A说明与5F9的处理相比，B2B的单剂量处理对RBC和血红蛋白水平的影响最小。图10B说明与媒介物对照相比，不同剂量B2B的重复处理对雄性和雌性食蟹猴的RBC没有显著影响。
图11示出在小鼠的萤光素酶-Raji异种移植模型中用CD47抗体B2B处理的体内效力。
图12A分别示出给药抗CD47抗体B2B后血红蛋白计数的时间过程。图12B分别示出给药抗CD47抗体B2B后网织红细胞计数的时间过程。
图13A和13B示出单剂量和多剂量后抗CD47抗体B2B Q1W的血清药代动力学(PK)。具体而言，图13A示出单剂量后抗CD47抗体B2B Q1W的血清PK，图13B示出多剂量后抗CD47抗体B2B Q1W的血清PK。
图14示出每周给药各种浓度的CD47抗体B2B后外周T细胞上的CD47受体占有率(RO)。
图15示出抗CD47抗体B2B和C3C的氨基酸序列。
图16A示出第10天由Acti-pro培养基产生的B2B抗体和C3C抗体的滴度。图16B示出由Acti-pro培养基产生的B2B抗体和C3C抗体的最终滴度。
图17提供实施例21中描述的I期研究的研究设计。
图18A示出参与实施例21中描述的I期研究的所有20名患者的血红蛋白和网织红细胞水平的时间过程。图18B示出在实施例21中描述的I期研究中接受最高剂量的抗CD47抗体(30mg/kg)的患者的血红蛋白和网织红细胞水平的时间过程。
图19A示出单剂量后患者的抗CD47抗体来佐利单抗的血清药代动力学。图19B示出多剂量后患者的抗CD47抗体来佐利单抗qw的血清药代动力学。
图20示出在接受每周20或30mg/kg抗体给药的患者中，外周T细胞上抗CD47抗体来佐利单抗对CD47的％受体占有率。
图21示出实施例21中接受抗CD47抗体治疗的黑素瘤患者的反应性肝转移。
具体实施方式
定义
在详细描述实施方案之前，应当理解本公开并不限于特定组合物或生物系统，当然可以变化。还应当理解本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制。
如本说明书和所附权利要求书所用，单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。因此，例如，在本文中提到“一个分子”任选地包括两个或更多这样的分子的组合，等等。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各数值的通常误差范围。在本文中提到“约”值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
应当理解本公开的各个方面和实施方案包括“包含”各个方面和实施方案、“由各个方面和实施方案组成”和“基本上由各个方面和实施方案组成”。
术语“CD47”(也称作整联蛋白相关蛋白(IAP)、抗原表面决定簇蛋白OA3、OA3、CD47抗原、Rh相关抗原、整联蛋白相关信号转导蛋白、单克隆抗体1D8识别的抗原、CD47糖蛋白)优选是指人CD47，特别是包含以下氨基酸序列的蛋白：
或者所述氨基酸序列的变体。术语“CD47”还指任何翻译后修饰的变体和构象变体。
如本文所用，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整抗体(例如，全长抗体)、抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、双抗体、scFv、scFv-Fc、单链抗体、单重链抗体和单轻链抗体)、单克隆抗体和多克隆抗体，只要它们表现出期望的生物学活性(例如，表位结合)。“抗体”(或“Ab”)和“免疫球蛋白”(或“Ig”)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定抗原表现出结合特异性，但是免疫球蛋白包括缺乏抗原特异性的抗体和其他抗体样分子。例如，后一种的多肽在低水平由淋巴系统产生，在增加的水平由骨髓瘤产生。
如本文所用，术语“分离的”抗体可以指基本上不含其它细胞物质的抗体。在一实施方案中，分离的抗体基本上不含来自同一物种的其他蛋白。在另一实施方案中，分离的抗体由来自不同物种的细胞表达，并且基本上不含来自不同物种的其他蛋白。在一些实施方案中，“分离的”抗体是已经鉴定并从其自然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。通过使用本领域公知的蛋白纯化技术进行分离，可以使抗体基本上不含天然相关的组分(或与用来产生抗体的细胞表达系统相关的组分)。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)如通过Lowry法确定的，大于抗体的75重量％，最优选大于80重量％、90重量％、95重量％或99重量％，或者(2)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE纯化至均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在抗体自然环境的至少一种组分。但是，通常分离的抗体通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文所用，术语“表位”表示抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，术语“天然抗体和免疫球蛋白”通常是包含两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连(也称为“VH/VL对”)，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一端都有一个可变结构域(VH)，后面是许多恒定区。每条轻链的一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域；轻链恒定结构域与重链第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。参见，例如，Chothiaet al.,J.Mol.Biol.,186:651(1985)；Novotny and Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:4592(1985)。
如本文所用，术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域的某些部分的序列在抗体之间有很大的差异，并其用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个区段，称为互补决定区(CDR)或高变区。可变结构域的更高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，形成环连接，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧紧保持在一起，以及与来自其他链的保持在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应物功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。所关注的可变区序列包括本文其他地方详细描述的CD47抗体的人源化可变区序列。
术语“高变区(HVR)”或“互补决定区(CDR)”可以指VH和VL结构域的子区域，其特征在于增强的序列变异性和/或形成确定的环。这些包括VH结构域中的三个CDR(H1、H2和H3)和VL结构域中的三个CDR(L1、L2和L3)。据信H3在赋予良好的结合特异性方面至关重要，L3和H3表现出最高水平的多样性。参见Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。
许多CDR/HVR划定是已知的。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性，并且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia代指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，由Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR是基于可用的复合物晶体结构的分析。下面指出了这些HVR/CDR中每个的残基。“框架”或“FR”残基是除HVR/CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“延长的”HVR也是已知的：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)(Kabat编号)。
“根据Kabat的编号”可以指上文Kabat等人中用于抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。对于给定抗体，残基的Kabat编号可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定。通常，当提到可变结构域(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)的残基时使用Kabat编号，而当提到重链恒定区中的残基时一般使用EU编号系统或索引(例如，如Kabat中的EU索引，根据EU IgG1的编号)。
如本文所用，“单克隆”抗体是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，例如，基本上相同但允许少量的背景突变和/或修饰。“单克隆”表示抗体的基本上同质的特征，并且不需要通过任何特定方法产生抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是根据其HVR、VH和/或VL序列和/或结合特性来选择的，例如，选自克隆池(例如，重组、杂交瘤或噬菌体衍生的)。可以将单克隆抗体工程化以包括一个或多个突变，例如，影响抗体的结合亲和力或其他特性，产生人源化或嵌合抗体，提高抗体生产和/或同质性，工程化多特异性抗体，所产生的抗体在本质上仍认为是单克隆的。单克隆抗体群体可以与多克隆抗体区分开来，因为该群体的单个单克隆抗体识别相同的抗原位点。产生单克隆抗体的各种技术是已知的；参见，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhuet al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee etal.,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)，以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或类人抗体的技术(参见，例如，WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
“嵌合”抗体可以指这样的抗体，其重链和/或轻链的一部分来自特定同种型、类别或生物体，另一部分来自另一同种型、类别或生物体。在一些实施方案中，可变区来自一个来源或生物体，而恒定区来自另一个来源或生物体。
“人源化抗体”可以指主要具有人序列和少量非人(例如，小鼠或鸡)序列的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个HVR序列(带有所关注的结合特异性)，来自非人(例如，小鼠或鸡)生物体的抗体，嫁接到人受体抗体框架(FR)上。在一些实施方案中，将非人残基进一步嫁接到人框架上(在来源抗体或受体抗体中都不存在)，例如，以改善抗体特性。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人”抗体可以指这样的抗体，其具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用如本文公开的制备人抗体的任何技术制备。可以使用本领域已知的各种技术制备人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Markset al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)；如Cole et al.,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)所述制备人单克隆抗体；以及通过向转基因动物施用抗原，所述转基因动物已改造为在应对抗原攻击时产生这类抗体，但是其内源性基因座已被禁用，例如，免疫的异种小鼠(参见，例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)或具有人免疫球蛋白序列的鸡(参见，例如，WO2012162422、WO2011019844和WO2013059159)。
有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为若干亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
如本文所用，术语“抗体片段”及其所有语法变体定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分，在某些情况下，该部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3、和/或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，其为具有由一个连续氨基酸残基的不间断序列组成的一级结构的多肽(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子，(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，没有相关的重链部分，以及(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽或其含有重链可变区的三个CDR的片段，没有相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，重链可以含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如IgG同种型中的CH1)，和/或可以含有任何在完整抗体中发现的铰链区序列，和/或可以含有与重链的铰链区序列或恒定结构域序列融合的或位于其中的亮氨酸拉链序列。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单一抗原结合位点，以及残余的“Fc”片段，其名字反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原。“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv种类(scFv)中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构结合。在这个构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或者仅包含抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)仍具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。参见，例如，Pluckthun,in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初制备为Fab’片段对，所述Fab’片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂或赋形剂”是指用于制备药物组合物或制剂的载剂或赋形剂，它一般是安全、无毒的，在生物或其他方面都不是不期望的。采用的载剂或赋形剂通常是适合向人受试者或其他哺乳动物给药的载剂或赋形剂。在制备组合物时，通常将活性成分与载剂或稀释剂混合，通过载剂或稀释剂稀释，或者用载剂或稀释剂包裹。当载剂或赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料，作为抗体活性成分的媒介物、载剂或介质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指获得自基本上同质的抗体群体的抗体，即包含该群体的各抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每个mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处是它们可以通过杂交瘤培养合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以在永生化B细胞或其杂交瘤中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
本文中的单克隆抗体包括通过剪接CD47抗体的可变(包括高变)结构域与恒定结构域(例如“人源化”抗体)，或轻链与重链，或来自一个物种的链与来自另一个物种的链而产生的杂交和重组抗体，或者与异源蛋白的融合物，无论来源的物种或者免疫球蛋白类别或亚类名称，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它们表现出期望的生物学活性。
本文中的单克隆抗体具体包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性。
如本文所用，术语“表位标记的”是指与“表位标签”融合的CD47抗体。表位标签多肽具有足够的残基来提供可以制备抗体的表位，但又足够短，以至于它不会干扰CD47抗体的活性。表位标签优选足够独特，从而使对表位具有特异性的抗体基本上不与其他表位发生交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少6个氨基酸残基，并且通常约8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。实例包括c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(参见，例如，Evan et al.,Mol.Cell.Biol.,5(12):3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(参见，例如，Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553(1990))。
如本文所用，术语“标记”是指直接或间接与抗体缀合的可检测化合物或组合物。标记自身可以通过其自身检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
如本文所用，术语“治疗”是指在临床病理过程中旨在改变治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望效果包括降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果与癌症相关的一个或多个症状得到缓解或消除，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖，减少疾病引起的症状，提高疾病患者的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的生存期，则成功“治疗”了个体。
如本文所用，“延迟疾病的进展”表示推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延缓疾病(如癌症)的发展。这种延迟可以有不同的时间长度，取决于疾病的历史和/或治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，即个体不发展疾病。例如，可以推迟晚期癌症，如转移的发展。
示例性癌症包括但不限于卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞性白血病、B-细胞衍生的白血病、T-细胞衍生的白血病、B-细胞衍生的淋巴瘤、T-细胞衍生的淋巴瘤和实体瘤。纤维化疾病可以是例如心肌梗死、绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘、囊性纤维化、支气管炎或哮喘。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”包括延迟和/或阻断疾病状况、病症或疾病的发生和/或其伴随症状的方法；防止受试者获得疾病状况、病症或疾病；或者减少受试者获得疾病状况、病症或疾病的风险。
如本文所用，为了治疗的目的，术语“受试者”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均整体援引加入本文。
综述
本文提供的是新型抗CD47抗体，其阻止人CD47(hCD47)与SIRPα(例如，人SIRPα或“hSIRPα”)相互作用。在一些实施方案中，抗CD47抗体促进巨噬细胞介导的对表达CD47的细胞(例如，表达hCD47的细胞，如癌细胞)的吞噬作用。开发治疗性抗CD47抗体的挑战之一是靶向性、组织外毒性。红细胞也表达CD47以防止它们被免疫系统破坏，而CD47疗法已遇到剂量限制性的血液学毒性。
本文所述的抗CD47抗体与许多其他已知的抗CD47抗体高度不同在于本文所述的抗CD47抗体结合CD47上的一个独特表位，该表位被红细胞上的糖基化屏蔽，导致与例如肿瘤细胞表面上表达的CD47的结合增加。有利的是，本文提供的抗CD47抗体在向受试者(例如，人或非人灵长类)给药后不会引起(例如，不会引起显著或明显的水平)的血凝或红细胞的耗竭。
此外，申请人意外地发现，从表达编码本文所述CD47抗体的核酸的宿主细胞，比从相同条件下培养、但表达编码高度相似的抗CD47抗体的核酸的宿主细胞获得更高的抗体滴度。具体而言，本文提供的抗CD47抗体包含VH结构域，所述VH结构域在其N-末端包含谷氨酸(E)，在其C-末端包含丝氨酸(S)。这类抗体可以由哺乳动物宿主细胞(例如，CHO细胞，如CHO-K1细胞)产生，其产量高于包含VH结构域的抗CD47抗体，所述VH结构域包含相同CDR，但是在其N-末端具有谷氨酸(E)以外的氨基酸，在其C-末端具有丝氨酸(S)以外的氨基酸。
抗CD47抗体
抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)是与CD47(例如，人CD47或“hCD47”)结合的抗体，具有足够的亲和力和特异性。如本文所用，抗体的“免疫学活性片段”是指所述抗体的抗原结合片段。术语“免疫学活性片段”和“抗原结合片段”在本文中可互换使用。例如，本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)可以作为治疗剂用于靶向和干扰与反常/异常的CD47表达和/或活性有关的疾病或疾病状况。在一些实施方案中，抗CD47抗体是嵌合(如人源化)单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD47抗体包含下文所述的重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含(a)VH结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(3)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)VL结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQID NO:10)的CDR-L3。在一些实施方案中，根据Kabat定义CDR序列(参见，例如，(Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含(a)VH结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含GLTFERA(SEQ ID NO:21)的CDR-H1；(3)包含KRKTDGET(SEQ ID NO:22)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)VL结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:24)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQID NO:25)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:26)的CDR-L3。在一些实施方案中，根据Chothia编号方案定义CDR序列(参见，例如，Chothia and Lesk(1986)EMBO J.5(4):823-6and Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273:927-948)。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含(a)VH结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含GLTFERAW(SEQ ID NO:27)的CDR-H1；(3)包含IKRKTDGETT(SEQ ID NO:28)的CDR-H2；(4)包含AGSNRAFDI(SEQ ID NO:29)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)VL结构域，其包含(1)包含QSVLYAGNNRNY(SEQ ID NO:30)的CDR-L1；(2)包含QA(SEQ ID NO:31)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:32)的CDR-L3。在一些实施方案中，根据IMGT编号方案定义CDR序列(参见，例如，Lefranc MP.(2013)IMGT Unique Numbering.In:Dubitzky W.,Wolkenhauer O.,Cho KH.,Yokota H.(eds)Encyclopedia of SystemsBiology.Springer,New York,NY；https://doi.org/10.1007/978-1-4419-9863-7_127)。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含(a)VH结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含GLTFERAWMN(SEQ ID NO:33)的CDR-H1；(3)包含RIKRKTDGETTD(SEQ ID NO:34)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:35)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)VL结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ IDNO:36)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:37)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ IDNO:38)的CDR-L3。在一些实施方案中，根据AbM编号方案定义CDR序列(参见，例如，Abhinandan R.K.,Martin A.C.Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains.Mol.Immunol.2008；45:3832–3839.doi:10.1016/j.molimm.2008.05.022)。
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含(a)VH结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含ERAWMN(SEQ ID NO:39)的CDR-H1；(3)包含WVGRIKRKTDGETTD(SEQ ID NO:40)的CDR-H2；(4)包含AGSNRAFD(SEQ ID NO:41)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)VL结构域，其包含(1)包含LYAGNNRNYLAWY(SEQ IDNO:42)的CDR-L1；(2)包含LLINQASTRA(SEQ ID NO:43)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPL(SEQID NO:44)的CDR-L3。在一些实施方案中，根据Contact编号方案定义CDR序列(参见，例如，McCallum et al.(1996)J Mol Biol.262(5):732-45；doi:10.1006/jmbi.1996.0548)。
为了便于参考，下文表A提供了SEQ ID NO:5-10的氨基酸序列。
表A
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的N-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H1，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的C-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H113。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的N-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H1，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的C-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H113。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的N-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H1，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的C-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H128。在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的N-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的VH结构域的C-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸118。
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列，只要VH结构域的N-末端氨基酸是E且VH结构域的C-末端氨基酸是S，以及任选存在的轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。下面提供SEQID NO:1和2的氨基酸序列：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGLTFE RAWMNWVRQA PGKGLEWVGR IKRKTDGETTDYAAPVKGRF SISRDDSKNT LYLQMNSLKT EDTAVYYCAG SNRAFDIWGQ GTMVTVSS(SEQ ID NO:1)
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YAGNNRNYLA WYQQKPGQPP KLLINQASTRASGVPDRFSG SGSGTEFTLI ISSLQAEDVA IYYCQQYYTP PLAFGGGTKL EIK(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含VH结构域的3个CDR，所述VH结构域包含SEQ ID NO:1，只要所述VH结构域的N-末端氨基酸是E且所述VH结构域的C-末端氨基酸是S。额外地或可选地，在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含VL结构域的3个CDR，所述VL结构域包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，VH结构域的3个CDR是根据Kabat、Chothia、AbM或Contact编号方案的CDR。额外地或可选地，在一些实施方案中，VL结构域的3个CDR是根据Kabat、Chothia、AbM或Contact编号方案的CDR。在一些实施方案中，抗CD47抗体的VH结构域包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列，只要VH结构域的N-末端氨基酸是E且VH结构域的C-末端氨基酸是S。额外地或可选地，在一些实施方案中，抗CD47抗体的VL结构域包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD47抗体包含VH和VL，所述VH包含SEQID NO:1，所述VL包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，抗CD47抗体是全长抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸SEQ ID NO:3，所述轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD47抗体是全长抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸SEQ IDNO:55，所述轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)与来自至少两个不同物种的CD47结合(例如，交叉反应)。在一些实施方案中，例如，抗CD47抗体(或抗体变体)与hCD47蛋白(或其胞外域)和来自非人灵长类(如食蟹猴或恒河猴)的CD47(或其胞外域)结合。在一些实施方案中，抗CD47抗体可以对人CD47是完全特异性的，并且可以不表现出物种或其他类型的非人交叉反应性。
与hCD47特异性结合的抗CD47抗体可以是如上文定义的各种类型的抗体，但是在某些实施方案中，是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗CD47抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗CD47是人源化抗体或包含人抗体恒定结构域(例如，人Fc结构域，如人IgGFc结构域，例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3或IgG4 Fc结构域)。在一些实施方案中，本公开的抗体是嵌合抗体。参见，例如，美国专利号4,816,567和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自鸡、小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换”的抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。可以将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来说，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体(例如，鸡抗体)，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR或CDR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其制备方法例如在Almagroand Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述。
用于对人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区；人体细胞突变的框架区或人种系框架区；以及筛选FR文库得到的框架区。参见，例如，Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993)；Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta etal.J.Immunol.,151:2623(1993)；Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)；和Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)。
在一些实施方案中，本公开的抗CD47抗体是人抗体。人抗体可以利用本领域已知的各种技术制备。在一些实施方案中，人抗体是由非人动物产生的，如本文描述的遗传工程化的鸡(参见，例如，美国专利号8,592,644；和9,380,769)和/或小鼠。人抗体的一般描述见Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
在一些实施方案中，本公开的抗CD47抗体是抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv或scFv片段，或者单结构域、单重链或单轻链抗体。抗体片段可以例如通过酶促消化或重组技术产生。在一些实施方案中，完整抗体的蛋白酶消化用于产生抗体片段，例如，如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan et al.,Science,229:81(1985)所述。在一些实施方案中，抗体片段是由重组宿主细胞产生的。例如，Fab、Fv和ScFv抗体片段是由大肠杆菌(E.coli)表达和分泌的。或者，抗体片段可以分离自抗体噬菌体文库。
Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌回收并化学偶联以形成F(ab')2片段。参见Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)。F(ab')2片段还可以直接分离自重组细胞培养物。美国专利号5,869,046中描述了体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段，其包含补救受体结合表位残基。
在一些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185以及美国专利号5,571,894和5,587,458。可以构建scFv融合蛋白以产生在scFv的氨基或羧基末端的效应蛋白的融合物。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870所述。这类线性抗体可以是单特异性或双特异性的。
在一些实施方案中，抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)特异性地识别(如结合)细胞表面上表达的hCD47。在一些实施方案中，抗CD47抗体特异性地识别癌细胞表面上表达的hCD47。在一些实施方案中，抗CD47抗体特异性地识别癌细胞系的细胞表面上表达的hCD47，癌细胞系包括但不限于例如SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375和SK-MES-1细胞系。在一些实施方案中，抗CD47抗体特异性地识别受试者中癌细胞的细胞表面上表达的hCD47(例如，肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肉瘤癌细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、皮肤癌细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞)。在一些实施方案中，本文所述抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)与hCD47(例如，细胞表面上表达的hCD47)的结合防止hCD47与信号调节蛋白α(SIRPα)如人SIRPα(“hSIRPα”)的相互作用。在一些实施方案中，本文所述抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)与癌细胞表面上表达的hCD47的结合促进巨噬细胞介导的对癌细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，抗CD47抗体或其免疫学活性片段不与血细胞表面上表达的hCD47结合。在一些实施方案中，向受试者(例如，人或非人灵长类)给药本文所述的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)不诱导或引起受试者中显著的血液学毒性(例如，贫血、血细胞减少或血凝)或受试者红细胞的显著耗竭。在一些实施方案中，向受试者(例如，人或非人灵长类)给药本文所述的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)不诱导或引起受试者中的血液学毒性(例如，贫血、血细胞减少或血凝)或受试者红细胞的耗竭。
编码抗CD47抗体的核酸
还考虑编码本文所述抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸分子。在一些实施方案中，提供编码抗CD47抗体的核酸(或一组核酸)，包括本文所述的任何抗CD47抗体。在一些实施方案中，已将编码抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸序列(如DNA序列)优化(如进一步优化)，以最大化由所述核酸转录的RNA的翻译和稳定性，例如，为了在制造过程中提高抗CD47抗体的产量。示例性优化包括但不限于例如去除重复序列，去除杀手基序和剪接位点，减少GC含量(鸟嘌呤-胞嘧啶含量)，去除/替换可能形成mRNA二级结构或不稳定基序的序列，和/或优化给定宿主细胞(例如，CHO细胞，如CHO-K1细胞)中的密码子使用。密码子优化是通过适应宿主生物体的密码子偏好和tRNA频率来改进基因表达和提高所关注的核酸的翻译效率的过程。在一些实施方案中，编码本文所述抗CD47抗体的核酸已经过密码子优化，例如，为在CHO细胞(如CHO-K1细胞)中表达进行密码子优化。
在一些实施方案中，编码本文提供的抗CD47抗体的VH结构域的核酸包含与SEQ IDNO:45具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸，只要所述核酸编码的VH结构域的氨基酸序列包含N-末端氨基E和C-末端S。在一些实施方案中，编码本文提供的抗CD47抗体的VL结构域的核酸包含与SEQ ID NO:46具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸。下文提供SEQ ID NO:45和46：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTCGTGAAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTCCGGCCTCACCTTCGAGCGGGCTTGGATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGGCCGGATCAAGAGGAAAACAGATGGCGAGACCACCGATTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTTAGCATCTCCAGGGACGACTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTGGCAGCAACAGGGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACAGTGTCCTCC(SEQ ID NO:45)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCGTGCTGTACGCCGGCAACAACCGGAACTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCAACCAGGCTAGCACCAGGGCTTCCGGCGTGCCTGATAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGAGTTTACCCTGATCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCATCTACTACTGCCAGCAGTACTACACCCCTCCTCTGGCCTTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:46)
在一些实施方案中，编码本文所述抗CD47抗体的核酸(或核酸组)可以进一步包含编码肽标签(如蛋白纯化标签，例如，His-标签、HA标签)的核酸序列。在一些实施方案中，编码抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸(或核酸组)包含前导序列。在一些实施方案中，提供包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列在至少中等严格的杂交条件下与编码本文所述抗CD47抗体的核酸序列杂交。
本文还提供其中插入本文所述核酸的载体。
简而言之，通过编码抗CD47抗体(或其抗原结合片段)的天然或合成核酸表达抗CD47抗体(或其抗原结合片段)可以这样实现，将所述核酸插入适当的表达载体，使所述核酸可操作地连接至5’和3’调节元件，包括例如启动子(例如，组成型、可调控、组织特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)。载体可以适合在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节期望核酸序列表达的启动子。
可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆至载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术是本领域公知的，并且例如在Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体含有至少在一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种选择标记(参见，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以在体内或离体分离重组病毒并将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合并在子细胞中增殖。慢病毒载体比源自癌逆转录病毒如小鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110碱基对(bp)的区域中，尽管最近已显示许多启动子也含有位于起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，从而当元件相互倒置或移动时，仍保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。
合适启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适启动子的另一实例是延长生长因子-1α(EF-1α)。但是，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当期望这种表达时，能够开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方案中，编码抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸的表达是可诱导的。在一些实施方案中，将编码抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸可操作地连接至诱导型启动子，包括本领域已知的任何诱导型启动子。在一些实施方案中，将编码本文所述抗CD47抗体的核酸工程化以编码表位标签，例如，以促进抗体的纯化或检测。示例性表位标签包括但不限于例如6x His(也称作His-标签或六组氨酸标签)、FLAG、HA、Myc、V5、GFP(绿色荧光蛋白，例如，增强型绿色荧光蛋白或EGFP)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、β-GAL(β-半乳糖苷酶)、萤光素酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)、RFP(红色荧光蛋白)和VSV-G(水疱性口炎病毒糖蛋白)。
抗体制备方法
本公开的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)可以通过本领域已知的任何方式制备。下文描述了抗体制备的示例性技术；然而，这些示例性技术只是为了说明目的而提供的，并不打算加以限制。此外，进一步描述了考虑用于本文所述抗体的示例性抗体特性。
为了制备抗原，可以从天然来源纯化或以其他方式获得抗原，或者可以使用重组技术表达抗原。在一些实施方案中，抗原可以作为可溶性蛋白使用。在一些实施方案中，抗原可以与另一多肽或其他部分缀合，例如，以增加其免疫原性。例如，本文所述的抗原可以与Fc区偶联。在一些实施方案中，在其细胞表面上表达抗原的细胞可以用作抗原。
多克隆抗体可以通过多次皮下(sc)或腹腔内(ip)注射抗原和佐剂在动物体内产生。例如，本文描述的鸡免疫的说明。在一些实施方案中，使用双官能或衍生剂将抗原与免疫原性蛋白缀合，例如，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。本文提供了鸡免疫的示例性方法。适用于各种其他生物体如哺乳动物的相关方法是本领域公知的。
如上所述，可以通过各种方法制备单克隆抗体。在一些实施方案中，本公开的单克隆抗体是使用杂交瘤方法制备的，该方法首先由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述，并且在Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；和Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中进一步描述。Vollmers and Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers and Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中描述了人杂交瘤技术。可以例如通过体外结合测定、免疫沉淀、ELISA、RIA等筛选杂交瘤生长的培养基中所关注的抗体的存在；并且可以例如通过Scatchard分析确定结合亲和力。产生具有期望结合特性的抗体的杂交瘤可以使用已知的培养技术进行亚克隆和生长，作为动物的腹水瘤在体内生长，等等。
在一些实施方案中，使用文库方法如噬菌体展示文库制备单克隆抗体。参见，例如，Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)。在一些实施方案中，通过聚合酶链反应(PCR)克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后筛选抗原结合噬菌体，例如，如Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。或者，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)所述，可以克隆幼稚库(例如，从人)，在不进行任何免疫的情况下，为广泛的非自身和自身抗原提供单一来源的抗体。最后，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，还可以通过从干细胞克隆未排列的V-基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，合成制备幼稚文库。
可以使用重组方法制备抗体。对于抗抗原抗体的重组产生，分离编码抗体的核酸并将其插入可复制的载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或表达。可以使用常规方法容易地分离和测序编码抗体的DNA(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可用的。载体组分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本公开的抗体可以作为与异源多肽的融合多肽重组产生，例如，在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽。所选异源信号序列可以是被宿主细胞识别和加工(例如，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被所选原核信号序列取代，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可以被例如酵母转化酶前导序列，因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列等取代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如，单纯疱疹gD信号，是可用的。
表达和克隆载体都含有核酸序列，使载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制，例如，允许载体独立于宿主染色体DNA进行复制。这个序列可以包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母和病毒来说，这类序列是公知的。一般来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(可以使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。
表达和克隆载体可以含有选择基因或可选择标记。典型的选择基因编码的蛋白(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)补充营养缺陷的不足，或者(c)提供不可从复合培养基获得的关键营养物质。优势选择的实例使用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。适合哺乳动物细胞的可选择标记的另一实例包括那些能够识别有能力吸收抗体编码核酸的细胞，如DHFR，谷氨酰胺合成酶(GS)，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。例如，通过在含有DHFR竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养，鉴定了用DHFR基因转化的内源性DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，用编码所关注的抗体、野生型DHFR基因和另一可选择标记如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有可选择标记的选择剂如氨基糖苷抗生素(例如，卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的细胞生长来选择。
表达和克隆载体一般含有宿主生物体识别的启动子，并且可操作地连接至编码抗体的核酸。适合用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统以及混合启动子如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。真核生物的启动子序列是已知的。酵母启动子是本领域公知的，可以包括由生长条件调节的诱导型启动子/增强子。几乎所有的真核生物基因都有一个AT富集区，位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。实例包括但不限于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体转录可以例如由获得自病毒基因组的启动子控制。SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段方便地获得，该片段也含有SV40病毒的复制起点。人巨细胞病毒的即刻早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得。或者，劳斯肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。
高等真核生物对编码本发明抗体的DNA的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常情况下，会使用来自真核细胞病毒的增强子。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还会含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞包括上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科如埃希氏菌(Escherichia)，例如大肠杆菌，肠杆菌(Enterobacter)，欧文氏菌(Erwinia)，克雷伯菌(Klebsiella)，变形杆菌(Proteus)，沙门氏菌(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，以及志贺氏菌(Shigella)等。除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通面包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的。可以选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见，例如，Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Leninaceae)、紫花苜蓿(蒺藜苜蓿(M.truncatula))和烟草也可以用作宿主。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定许多杆状病毒株和变体以及来自宿主如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)的相应允许昆虫宿主细胞。
脊椎动物细胞可以用作宿主，脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾系(亚克隆在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham et al.,J.GenVirol.36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如NS0和Sp2/0。关于某些适合抗体生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki and Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.255-268。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO-K1细胞。CHO-K1细胞系是CHO细胞系的亚克隆(参见，例如，www(dot)phe-culturecollections(dot)org(dot)uk/media/128263/chok1-cell-line-profile(dot)pdf和web(dot)expasy(dot)org/cellosaurus/CVCL_0214)。
本公开的宿主细胞(例如，CHO-K1细胞)可以在各种培养基中培养。可商购的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小基本培养基(Minimal Essential Medium.MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's MediumDMEM),Sigma)都适合培养宿主细胞。此外，Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes etal.,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充物也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在其中。培养条件如温度、pH等是以前用于选择用来表达的宿主细胞的那些，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或者直接分泌至培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，去除颗粒碎片，宿主细胞或裂解片段，例如，通过离心或超滤。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。
从细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法进行纯化，其中亲和色谱法是典型的优选纯化步骤之一。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体包含表位标签(例如，通过可切割接头连接至抗体的标签)以促进纯化。示例性表位标签包括但不限于例如6x His(也称作His-标签或六组氨酸标签)、FLAG、HA、Myc、V5、GFP(绿色荧光蛋白，例如，增强型绿色荧光蛋白或EGFP)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、β-GAL(β-半乳糖苷酶)、萤光素酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)、RFP(红色荧光蛋白)和VSV-G(水疱性口炎病毒糖蛋白)。
因此，在一些实施方案中，提供一种制备抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的方法，所述抗CD47抗体包含：(a)重链可变(VH)结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(3)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA (SEQ ID NO:10)的CDR-L3，所述方法包括：a)在有效导致抗体(或片段)表达的条件下培养包含编码抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的核酸的宿主细胞(如CHO细胞)；以及b)回收由宿主细胞表达的抗CD47抗体(或其片段)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括c)纯化抗体的步骤。在一些实施方案中，纯化抗CD47抗体包括至少一个色谱步骤，如A蛋白或L蛋白色谱步骤。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞，例如，CHO-K1细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个编码抗CD47抗体的载体。在一些实施方案中，已用编码抗CD47抗体的核酸转染(例如，瞬时转染或稳定转染)宿主细胞。在一些实施方案中，制备抗CD47抗体的方法是制造规模的生产过程(如发酵过程)。在一些实施方案中，制备抗CD47抗体的“制造规模”生产过程(例如，发酵过程)需要在约400L至约80,000L(如约400L至约25,000L，例如，约4,000L、约6,000L、约8,000L、约10,000L、约12,000L、约14,000L或约16,000L中的任何一个)的培养体积中培养和生长宿主细胞。
糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)以增加或减少抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的糖基化程度。在抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)上添加或删除糖基化位点可以通过改变抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)或其多肽部分的氨基酸序列来方便地完成，从而产生或去除一个或多个糖基化位点。
当抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)包含Fc区时，可以改变其上连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角(biantennary)寡糖，该寡糖一般通过N-连接附着至Fc区CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。所述寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至双触角寡糖结构“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本文的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改进特性的抗CD47抗体变体(或其包含Fc区的免疫学活性片段)。
连接至Fc的CH2结构域的聚糖是异质的。通过岩藻糖基转移酶活性将CHO细胞中产生的抗体或Fc融合蛋白岩藻糖基化。参见Shoji-Hosaka et al.,J.Biochem.2006,140:777-83。通常，在人血清中可以检测到低百分比的天然存在的非岩藻糖基化(afucosylated)的IgG。Fc的N-糖基化对与FcγR的结合很重要；而N-聚糖的非岩藻糖基化增加Fc与FcγRIIIa的结合能力。增加的FcγRIIIa结合可以增强ADCC，这在某些期望有细胞毒性的抗体治疗应用中是有利的。
在一些实施方案中，当不期望Fc介导的细胞毒性时，增强的效应子功能可能是有害的。在一些实施方案中，Fc片段或CH2结构域没有糖基化。在一些实施方案中，将CH2结构域中的N-糖基化位点突变以防止糖基化。
在一些实施方案中，提供抗CD47抗体变体(或其免疫学活性片段)，其包含Fc区，其中连接至Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。
免疫缀合物和共价修饰
本发明还涉及包含与第二部分缀合的抗体的免疫缀合物。在一些实施方案中，第二部分是细胞毒性剂如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯(tricothecene)。各种放射性核素可用于放射性缀合抗体的生产。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。本文其他地方描述了在这类免疫缀合物的产生中有用的示例性化疗剂。
在某些实施方案中，将本文提供的人源化抗CD47抗体(或其抗原结合片段)与美登素、美登醇(maytansinoid)或卡奇霉素缀合。在某些实施方案中，将本文提供的人源化抗CD47抗体(或其抗原结合片段)与美登醇DM1缀合。
使用各种双官能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如己二亚氨二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双-(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯(tolyene)2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体与细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta et al.,Science,238:1098(1987)所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性螯合剂，用于放射性核苷酸与抗体的缀合。参见，WO94/11026。
在另一实施方案中，可以将抗体与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)缀合用于肿瘤预靶向，其中向患者给药抗体-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，然后给药与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
本文还提供异源缀合抗体，其包含与至少一种其他抗体共价连接的本文所述的人源化抗CD47抗体。例如，已提出异源缀合抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染。包含本文所述人源化抗CD47抗体的异源缀合抗体可以在体外使用合成蛋白化学中已知的方法制备，包括涉及交联剂的那些方法。例如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适用于此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及例如美国专利号4,676,980中公开的那些试剂。
还提供包含至少一种共价修饰的人源化抗CD47抗体。共价修饰的一种类型包括使人源化抗CD47的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应，所述有机衍生剂能够与抗体的所选侧链或者N-或C-末端残基反应。常用的交联剂包括但不限于例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸的酯，同双官能酰亚胺酯，包括双琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯)，双官能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷和试剂如3-[(p-叠氮苯基)-二硫代]丙酰亚胺甲酯(methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]propioimidate)。
其他修饰包括谷氨酰胺基和天冬酰胺基残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化[T.E.Creighton,Proteins:Structure andMolecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983)]，N-末端胺的乙酰化，以及任何C-末端羧基的酰胺化。
共价修饰的另一种类型包括将本文提供的人源化抗CD47抗体(或其抗原结合片段)与各种非蛋白聚合物中的一种连接，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯烃，以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中示出的方式。
半胱氨酸工程化变体
在一些实施方案中，产生半胱氨酸工程化抗CD47抗体可以是期望的，其中用半胱氨酸残基取代一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，取代的残基出现在抗CD47抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位在抗CD47抗体的可及位点，并且可以用于将抗CD47抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生抗CD47免疫缀合物，如本文进一步所述。半胱氨酸工程化抗CD47抗体可以按照例如美国专利号7,521,541所述产生。
效应子功能工程化
在效应子功能方面修饰本文提供的抗CD47抗体可以是期望的，以便增强例如抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区域中形成链间二硫键。这样产生的同源二聚体抗体可以具有提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见，Caron et al.,J.Exp.Med.,176:1191-1195(1992)and Shapes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。还可以如Wolff et al.,CancerResearch,53:2560-2565(1993)所述，使用异源双官能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。或者，可以将抗体工程化以包含通常的Fc区，从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见，Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design3:219-230(1989)。
可以对Fc区序列进行突变或改变，以提高FcR结合(例如，与FcγR、FcRn结合)。在一些实施方案中，本文提供的抗CD47抗体包括至少一种改变的效应子功能，例如，与天然IgG或亲本抗体相比改变的ADCC、CDC和/或FcRn结合。在一些实施方案中，包含突变或改变的抗体的效应子功能相对于亲本抗体增加。在一些实施方案中，包含突变或改变的抗体的效应子功能相对于亲本抗体下降。几个可用的特异性突变的实例在例如Shields,RL etal.(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta,L.G.,(2002)Biochemical SocietyTransactions 30(4):487-490；和WO 00/42072中描述。
在一些实施方案中，本文提供的抗CD47抗体包含Fc受体突变，例如，在Fc区的至少一个位置的取代突变。这样的取代突变可以对Fc结构域中的氨基酸位置进行，包括但不限于例如238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号根据EU编号系统。在一些实施方案中，抗CD47抗体包含人IgG4 Fc区，所述人IgG4 Fc区包含两个人IgG4 Fc结构域单体，其中每个单体包含S228P取代(其中残基的编号根据EU编号系统)。其他合适的突变是本领域公知的。例如，美国专利号7,332,581中示出了示例性突变。
药物制剂及其给药
本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)可以与药学上可接受的载剂或赋形剂一起配制，以便它们适合向有此需要的受试者(例如，哺乳动物如人)给药。抗体的合适制剂是通过将具有期望纯度的抗体(或其免疫学活性片段)与任选存在的药学上可接受的载剂、缓冲剂、赋形剂或稳定剂混合来获得的(Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干制剂或含水溶液的形式。药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)还可以配制为免疫脂质体。通过本领域已知的方法制备含有抗体的脂质体，如Epstein et al.,PNAS USA,82:3688(1985)；Hwang et al.,PNAS USA,77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545所述。美国专利号5,013,556中公开了具有增加的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。可以将脂质体挤压通过定义孔径的过滤器以产生具有期望直径的脂质体。可以如Martinet al.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述通过二硫键交换反应将本发明的抗体的Fab’片段与脂质体缀合。抗肿瘤剂、生长抑制剂或化疗剂(多柔比星)也任选地包含在脂质体内。参见，Gabizon et al.,J.National CancerInst.,81(19):1484(1989)。
含有CD47抗体的活性成分还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，分别例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或者在粗乳剂(macroemulsion)中。Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中公开了这类技术。
包含本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的药物制剂还可以根据治疗的特定适应症的需要包含一种以上的活性化合物，优选那些具有不会相互不利影响的互补活性的化合物。例如，除了本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)，还可以期望提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化疗剂。这类分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。这类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、疾病或病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、疾病或病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些药剂一般以如本文所述的相同剂量和给药途径使用，或者约为以往采用剂量的1-99％。
在一些实施方案中，本公开的抗体是冻干的。这类冻干制剂可以用合适的稀释剂重建为高蛋白浓度，并且重建的制剂可以向哺乳动物(如人)给药。
在某些实施方案中，用于体内给药的药物制剂是无菌的。这很容易实现，例如，通过无菌过滤膜过滤包含本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的溶液。
本文所述抗CD47抗体的治疗剂量可以配制为至少约0.01μg/kg体重、至少约0.05μg/kg体重；至少约0.1μg/kg体重、至少约0.5μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约2.5μg/kg体重、至少约5μg/kg体重和不超过约100μg/kg体重的剂量。本领域技术人员会理解，这类准则会根据活性剂的分子量进行调整，例如在抗体片段的使用中，或在抗体缀合物的使用中。对于局部给药，例如鼻内、吸入等，或者对于全身给药，例如，腹腔内(I.P.)、静脉内(I.V.)、皮内(I.D.)、肌肉内(I.M.)等，剂量也可以变化。
本发明的CD47抗体或药物组合物可以通过任何合适的方式给药，包括肠胃外、皮下、腹腔内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下给药。此外，抗CD47抗体适合通过脉冲输注给药，特别是用递减剂量的抗体。
对于疾病的预防或治疗，抗体的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型，如上文所定义的，疾病的严重程度和病程，是否为了预防目的而给药抗体，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。抗体适合一次性或在一系列治疗中向患者给药。
检测和/或诊断的方法
本文提供的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)可以用于检测和诊断的方法。来自受试者的样品(例如，生物学样品，如组织样品)中CD47(例如，hCD47)蛋白的存在和/或量可以使用本文所述的抗体定性和/或定量确定。在某些实施方案中，检测CD47蛋白的存在和/或量的方法包括在允许抗体与CD47结合的条件下使生物学样品与本文所述的抗CD47抗体接触，并且检测在抗体和CD47之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一实施方案中，所述方法用于选择有资格接受抗CD47抗体治疗的受试者。在一些实施方案中，在受试者接受抗CD47抗体治疗之前从受试者获得样品。在一些实施方案中，将组织样品福尔马林固定和石蜡包埋，存档，新鲜或冷冻。在一些实施方案中，与第二样品中CD47的存在和/或量相比，第一样品中CD47的存在和/或量增加或升高。在某些实施方案中，与第二样品中CD47的存在和/或量相比，第一样品中CD47的存在和/或量减少或降低。在某些实施方案中，第二样品是参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织。样品中CD47的存在和/或量可以通过多种方法进行分析，其中许多方法是本领域已知的，并且是技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(FACS)、MassARRAY、蛋白质组学、生化酶活性测定。还可以使用多重免疫测定，如可获得自Rules Based Medicine or Meso Scale Discovery(“MSD”)的那些。检测来自受试者的样品(例如，生物学样品，如组织样品)中CD47(例如，hCD47)蛋白的存在和/或量可以与其他技术结合进行，如形态学染色和/或荧光原位杂交。
在一些实施方案中，在肿瘤上或在肿瘤样品中评价CD47表达，例如，相对于非癌性组织的样品。如本文所用，肿瘤或肿瘤样品可以涵盖肿瘤细胞占据的部分或全部肿瘤区域。在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤样品可以进一步涵盖肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质(例如，连续的瘤周促纤维增生性基质)占据的肿瘤区域。在一些实施方案中，在肿瘤细胞上评价CD47表达。在一些实施方案中，样品是临床样品。在一些实施方案中，样品用于诊断测定。在一些实施方案中，样品获得自原发性或转移性肿瘤。组织活检常用于获得肿瘤组织代表性的片。或者，肿瘤细胞可以通过已知或认为含有所关注的肿瘤细胞的组织或流体的形式间接获得。例如，用于本文所述检测方法的样品可以通过切除、支气管镜检查、细针抽吸、支气管刷取，或者从痰、胸水、脑脊液、血液、血清和尿液中获得，但不限于此。上文讨论的用于检测癌变样品中的靶基因或基因产物的相同技术可以应用于其他身体样品。癌细胞可能从癌症病灶脱落并出现在这类身体样品中。在一些实施方案中，通过筛选这类身体样品中CD47蛋白的存在和/或量，可以实现早期癌症诊断。在一些实施方案中，通过检测这类身体样品中CD47蛋白的存在和/或量，可以更容易地监测治疗(例如，用抗CD47抗体治疗)的进展。
治疗方法
本文提供一种治疗与异常CD47表达(例如，CD47过量表达)相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药有效量的本文所述的抗CD47抗体。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。
实体瘤的治疗
在一些实施方案中，提供一种治疗受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的抗CD47抗体，其中所述抗CD47抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含(1)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(2)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；和(3)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH进一步包含在其N-末端的谷氨酸残基(E)和在其C-末端的丝氨酸(S)。在一些实施方案中，抗CD47进一步包含人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，实体瘤是复发性实体瘤(例如，在先前的实体瘤治疗期间或之后复发)和/或难治性实体瘤(例如，对先前的实体瘤治疗难治或无反应)。在一些实施方案中，“先前治疗”是指包括给药一种或多种治疗剂的治疗方案。也就是说，实体瘤的“先前治疗”可以包括用单一治疗剂的治疗或用组合治疗剂的治疗。在一些实施方案中，实体瘤是肺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肉瘤肿瘤、头颈肿瘤、胃肿瘤、肾肿瘤或皮肤肿瘤(例如，黑素瘤)。在一些实施方案中，实体瘤是转移性实体瘤。
在一些实施方案中，抗CD47抗体以约10mg/kg至约30mg/mg的剂量向受试者给药，包括约10mg/kg、约20mg/kg和约30mg/kg中的任何一个。在一些实施方案中，将抗CD47抗体每周一次(即，qw或q1w)向受试者给药。在一些实施方案中，抗CD47抗体通过静脉内(IV)输注给药。在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历任何治疗相关的不良反应(TRAE)。在一些实施方案中，受试者不经历任何大于1级或2级的TRAE。在一些实施方案中，TRAE根据不良事件的通用术语标准(CTCAE)v 5.0中列出的标准进行分级。参见，例如，ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quic k_Reference_5x7(dot)pdf。
在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历显著的血液学毒性。在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历任何血液学毒性。在一些实施方案中，血液学毒性包括贫血、血细胞减少和/或血凝。在一些实施方案中，受试者在用抗CD47抗体治疗期间不需要治疗血液学毒性。
在一些实施方案中，抗CD47抗体的VH包含SEQ ID NO:1，并且抗CD47抗体的VL包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:3，并且抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:55，并且抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗
在一些实施方案中，提供一种治疗受试者的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的方法，所述方法包括向受试者给药有效量的抗CD47抗体和任选存在的有效量的利妥昔单抗，其中所述抗CD47抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含(1)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(2)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；和(3)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH进一步包含在其N-末端的谷氨酸残基(E)和在其C-末端的丝氨酸(S)。
在一些实施方案中，抗CD47进一步包含人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，NHL是滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在一些实施方案中，NHL是复发性NHL(例如，在先前的NHL治疗期间或之后复发)和/或难治性NHL(例如，对先前的NHL治疗难治或无反应)。在一些实施方案中，受试者接受过至少一次NHL的先前治疗(例如，2-10次先前治疗)。在一些实施方案中，“先前治疗”是指包括给药一种或多种治疗剂的治疗方案。也就是说，NHL的“先前治疗”可以包括用单一治疗剂的治疗或用组合治疗剂的治疗。在一些实施方案中，受试者接受过包括抗CD20剂的NHL先前治疗。在一些实施方案中，抗CD20剂是抗CD20抗体(例如但不限于利妥昔单抗、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)和/或奥法木单抗)。在一些实施方案中，受试者在用抗CD20剂(例如，作为单一药剂或者与一种或多种治疗剂组合)治疗期间或之后出现进展(例如，证实的NHL疾病进展)。
在一些实施方案中，将抗CD47抗体每周一次(即，qw或q1w)向受试者给药。在一些实施方案中，将抗CD47抗体每7天一次向受试者给药。在一些实施方案中，抗CD47抗体通过静脉内(IV)输注给药。
在一些实施方案中，利妥昔单抗通过IV输注向受试者给药，剂量为375mg/m2，每周一次(qw或q1w)，持续5周，并且5周后以375mg/m2的剂量每4周一次(例如，q4w、q28d或每月)。在一些实施方案中，利妥昔单抗根据处方标签的指导给药(参见，例如，www(dot)accessdata(dot)fda(dot)gov/drugsatfda_docs/label/2018/103705s5450lbl(dot)pdfand EMA prescribing label at www(dot)ema(dot)europa(dot)eu/en/documents/overview/mabthera-epar-medicine-overview_en.pdf的FDA处方标签)。
在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历任何治疗相关的不良反应(TRAE)。在一些实施方案中，受试者不经历任何大于1级或2级的TRAE。在一些实施方案中，TRAE根据不良事件的通用术语标准(CTCAE)v 5.0中列出的标准进行分级。参见，例如，ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quic k_Reference_5x7(dot)pdf。
在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历显著的血液学毒性。在一些实施方案中，受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历任何血液学毒性。在一些实施方案中，血液学毒性包括贫血、血细胞减少和/或血凝。在一些实施方案中，受试者在用抗CD47抗体治疗期间不需要治疗血液学毒性。
在一些实施方案中，抗CD47抗体的VH包含SEQ ID NO:1，并且抗CD47抗体的VL包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:3，并且抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:55，并且抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，抗CD47抗体是来佐利单抗(lemzoparlimab)。
制品和试剂盒
提供一种制品(article of manufacture)，其包含可用于治疗CD47相关疾病的材料，例如，表达CD47(如CD47过量表达)的癌症，例如，实体瘤癌症(如肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌等)或血液癌症，例如，非霍奇金淋巴瘤(如弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)等)。在某些实施方案中，制品或试剂盒包含容器，所述容器含有本文所述的一种或多种抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)或组合物。在某些实施方案中，制品或试剂盒包含容器，所述容器含有编码本文所述的一种或多种抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)或组合物的核酸。在一些实施方案中，试剂盒包括产生如本文所述的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)的细胞系的细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个阳性对照，例如CD47(或其片段)或CD47+细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括阴性对照，例如基本上不含CD47的表面或溶液，或者不表达CD47的细胞。
在某些实施方案中，制品或试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相伴的标签或包装插页。合适的容器包括但不限于瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋、试管等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料形成。容器盛放组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合，有效用于治疗、预防和/或诊断CD47相关的疾病或病症，例如，癌症，如实体瘤癌症(例如，肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌等)或血液癌症(例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)如弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)等)。容器可以具有无菌接入端口(例如，容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种药剂是本文所述的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)。在一些实施方案中，标签或包装插页表明该组合物用于治疗CD47相关的疾病或病症(例如，癌症，如实体瘤癌症(例如，肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌等)或血液癌症(例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)如弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)等)。在一些实施方案中，标签或包装插页表明该组合物用于治疗实体瘤，如复发和/或难治性实体瘤(例如，肺、卵巢、结肠直肠、胰腺、肉瘤、头颈、胃、肾或皮肤肿瘤)。在一些实施方案中，标签或包装插页表明该组合物与利妥昔单抗联合使用，用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如受试者的复发和/或难治性NHL，例如，已接受过至少一次NHL先前治疗的受试者，如用抗CD20剂治疗。
此外，制品或试剂盒可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的抗CD47抗体(或其免疫学活性片段)；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含进一步的细胞毒性或其他治疗剂(例如，利妥昔单抗，其中所述试剂盒用于治疗NHL)。此外，制品可以进一步包含额外的容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度来看可取的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
还提供可用于各种目的的试剂盒，例如，用于分离或检测CD47，例如，在获得自受试者的组织样品中，任选地与制品组合。对于CD47的分离和纯化，试剂盒可以含有与珠(例如，琼脂糖珠)偶联的抗CD47抗体(或其片段)。可以提供含有抗体(或其片段)的试剂盒，用于在体外和定量CD47，例如，在ELISA或蛋白印迹中。与制品一样，试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相伴的标签或包装插页。例如，容器盛放包含本文提供的至少一种抗CD47抗体的组合物。可以包括额外的容器，其含有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。当用酶标记抗体时，试剂盒包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。各种试剂的相对量可以广泛变化以提供充分优化测定灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以以干粉，通常是冻干粉末的形式提供，其包括在溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。标签或包装插页可以提供对组合物的描述，以及预期的体外或诊断用途(例如，检测CD47，诊断CD47相关疾病或病症)，或者监测CD47相关疾病或病症的治疗进展的说明。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请援引加入本文，如同具体并单独地表明每个单独的出版物或专利申请援引加入本文。
实施例
提供以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，而不是为了限制发明人认为是其发明的范围，也不是为了表示以下实验是所有或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
材料和方法
噬菌体文库的建立
CD47是50kDa的膜受体，具有胞外N-端IgV结构域、5个跨膜结构域和短的C-端胞内尾巴。与人Fc缀合的人CD47-IgV结构域或生物素化的人CD47-IgV结构域(ACROBiosystems)用作噬菌体文库淘选的抗原。
使用噬粒载体构建噬菌体文库，其由扩增自>50个健康人受试者的脾或骨髓的抗体基因片段组成。抗体形式为单链可变片段(scFv，VH+接头+VL)。文库大小为1.1x1010，序列多样性分析如下。对于从文库挑取并进一步测序的62个克隆，16个序列是截短的，有移码突变或琥珀密码子；46个序列有全长scFv，其中所有HCDR3序列都是独特的。在46个全长scFv中，13个序列具有λ轻链，33个序列具有κ轻链。
噬菌体淘选和克隆选择
为了获得与人CD47-IgV结构域特异性结合的噬菌体克隆，使用两种噬菌体淘选(panning)的方法。
1.针对人CD47-IgV的噬菌体文库免疫管淘选
在这种方法中，将如上所述开发的噬菌体文库首先在酪蛋白包被的免疫管中温育2小时。人CD47-IgV-Fc融合蛋白用于第一轮淘选。通过用PBST洗涤5-20次去除未结合的噬菌体。用新鲜制备的100mM三乙胺溶液洗脱结合的噬菌体，并且通过添加Tris-HCl缓冲液进行中和，成为第一输出噬菌体池。通过感染大肠杆菌TG-1细胞进行扩增来拯救这个第一输出噬菌体池，随后使用生物素化的人CD47-IgV作为抗原进行第二轮淘选。以相同的过程洗脱结合的噬菌体，成为第二输出噬菌体池，然后拯救，随后使用人CD47-IgV-Fc融合蛋白作为抗原进行第三轮淘选。然后结合的噬菌体成为第三输出噬菌体池，使用生物素化的人CD47-IgV进行第四轮淘选。
2.针对人CD47-IgV的噬菌体文库溶液淘选
在这第二种方法中，首先将噬菌体文库在酪蛋白包被的100μL链霉抗生物素蛋白-磁珠温育以耗尽链霉抗生物素蛋白珠结合物。链霉抗生物素蛋白-磁珠和AG0084-huIgG1/k用于阴性耗尽。拯救耗尽的文库，随后用生物素化的人CD47-IgV作为抗原进行第二轮淘选，并且进一步用酪蛋白封闭的链霉抗生物素蛋白-磁珠进行阴性耗尽。通过用PBST洗涤5-20次去除未结合的噬菌体。用新鲜制备的100mM三乙胺溶液洗脱结合的噬菌体，通过添加Tris-HCl缓冲液进行中和，然后拯救，随后使用人CD47-IgV-Fc融合蛋白进行第三轮淘选并用AG0084-huIgG1/k进行耗尽。然后结合的噬菌体成为第三输出噬菌体池，使用生物素化的人CD47-IgV进行第四轮淘选，并且用酪蛋白封闭的链霉抗生物素蛋白-磁珠进行阴性耗尽。
经过这个过程，获得了多个与人CD47-IgV结构域特异性结合的噬菌体克隆并进行了富集。然后将噬菌体克隆稀释并平板接种，在37℃下生长8小时并通过抗κ抗体包被的过滤器捕获过夜。将生物素化的人CD47-IgV(50nM)和NeutrAvidin-AP缀合物(1:1000稀释)应用于过滤器以检测阳性结合的噬菌体克隆。挑取阳性噬菌体噬斑并洗脱至100μL噬菌体洗脱缓冲液中。约10-15μL洗脱的噬菌体用来感染1mL XL1蓝细胞以制备高滴度噬菌体(HT)用于噬菌体单点ELISA(SPE)。从过滤器挑取的阳性单克隆接受人CD47-IgV-Fc融合蛋白和生物素化的人CD47-IgV结构域蛋白的结合。还对这些阳性单克隆进行VH和VL基因测序。将所有具有独特VH和VL基因的阳性命中克隆至表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk(轻链，InvivoGen,Cat No.pfuse2ss-hclk)和pFUSEss-CHIg-hG1(重链，InvivoGen,Cat No.pfusess-hchg1)中。在HEK293细胞中表达抗体并通过Protein A Plus Agarose纯化。
抗CD47抗体的亲和力成熟
如上所述获得的CD47抗体的结合亲和力可以通过体外亲和力成熟来提高，例如，通过位点特异性随机突变，这导致也在本发明范围内的突变序列。
例如，基于BiaCore分析，对CD47抗体的重链和轻链的CDR序列的分析可以鉴定HCDR1和LCDR1区中可以随机化/突变的几个残基。因此，可以构建随机诱变文库并引入特定的残基，以产生各种新序列。在平衡条件下，使用生物化的可溶性CD47 ECD在溶液相中淘选CDR诱变文库。经过多轮降低抗原浓度的淘选后，选择富集的输出结合物用于结合ELISA测试，随后转化为完整的IgG，进行BiaCore分析以特异性选择解离速率提高的序列。通过这个筛选过程，可以构建本发明的额外抗体分子，以获得临床应用的整体最佳特性。
实施例1.与重组CD47-ECD(胞外域)结合的噬菌体克隆的ELISA筛选
将重组人CD47 IgV-Fc融合蛋白(Acrobiosystems)在磷酸缓冲盐水(PBS)中以2μg/mL包被在微量滴定板上，在室温(RT)下保持2小时。包被抗原后，将孔用含1％ BSA的PBS/0.05％ Tween(PBST)在RT下封闭1小时。用PBST洗涤孔后，将来自单克隆的纯化噬菌体加入孔中，并且在RT下温育1小时。为了检测结合的噬菌体克隆，添加辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗M13的二抗(Jackson Immuno Research)，然后添加荧光底物(Roche)。在所有温育步骤之间，将平板的孔用PBST洗涤三次。在TECAN Spectrafluor酶标仪中测量荧光。选择阳性噬菌体克隆进行重链和轻链基因测序。
如上所述获得的CD47抗体对重组人CD47 IgV-Fc融合蛋白表现出良好的结合活性。
实施例2.阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体的ELISA分析
将重组人CD47 IgV/小鼠Fc融合蛋白或生物素化的CD47 IgV蛋白(Acrobiosystems)在PBS中以1μg/mL包被在微量滴定板上，在RT下保持2小时。用抗原包被后，将孔用含1％ BSA的PBS/0.05％ Tween(PBST)在RT下封闭1小时。用PBST洗涤孔后，将PBS中稀释的抗体加入孔中(5μg/mL)，并且在RT下温育1小时。为了检测抗体的结合，添加HRP缀合的抗人Fc的二抗(Jackson Immuno Research)，然后添加荧光底物(Roche)。在所有温育步骤之间，将平板的孔用PBST洗涤三次。在TECAN Spectrafluor酶标仪中测量荧光。
CD47抗体A1A和B2B)对重组人CD47-Fc融合蛋白和生物素化的CD47蛋白表现出良好的结合活性。
实施例3.阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体的ELISA分析
将重组hCD47 IgV-Fc融合蛋白(Acrobiosystems)在PBS中以1μg/mL包被在微量滴定板上，在4℃下保持16小时。用PBST中的1％ BSA在RT下封闭1小时后，在不存在或存在抗CD47抗体(10μg/mL)的情况下添加1μg/ml的SIRPα-His蛋白，在RT下保持1小时。随后将板洗涤三次，用HRP缀合的抗His二抗在RT下温育1小时。洗涤之后，将TMB溶液加入每个孔中保持30分钟，用2.0M H2SO4终止反应，并且在490nm处测量OD。
CD47抗体A1A和B2B有效地阻断CD47与SIRPα的结合。B2B和A1A的VH结构域、VL结构域、重链和轻链的氨基酸序列在图15中示出。
实施例4.抗CD47抗体与单体CD47-ECD结合的剂量依赖性反应
经过直接结合和竞争筛选后，选择抗CD47抗体B2B用于这个试验，与两种已知的参考抗CD47抗体，即F59和2A1进行比较。将生物素化的CD47蛋白(Acrobiosystems)在PBS中以1μg/mL包被在微量滴定板上，在RT下保持2小时。包被抗原后，将孔用含1％ BSA的PBS/0.05％ Tween(PBST)在RT下封闭1小时。用PBST洗涤孔后，将不同浓度的抗CD47抗体加入孔中，并且在RT下温育1小时。为了检测抗体与CD47的结合，添加HRP缀合的抗人Fc的二抗(Jackson Immuno Research)，然后添加荧光底物(Roche)。在所有温育步骤之间，将平板的孔用PBST洗涤三次。在TECAN Spectrafluor酶标仪中测量荧光。
根据Stanford University,Inhibrx LLC和Celgene Corp.的研究人员公开的Hu5F9和CC-90002的序列制备参考抗体5F9和2A1(参见，例如，美国专利号9,017,675B2、美国专利号9,382,320、美国专利号9,221,908、美国专利申请公开号2014/0140989和WO2016/109415)并用于相同研究。
如图1所示，抗CD47抗体B2B与单体CD47-ECD的结合活性优于5F9和2A1。B2B的EC50为0.09nm，低于5F9(0.11nM)和2A1(0.25nM)的EC50。
实施例5.抗CD47抗体与二聚体CD47-ECD结合的剂量依赖性反应
实施例4中鉴定的两种抗CD47抗体(即，A1A和B2B)也用于这个研究。
将CD47 IgV/小鼠Fc融合蛋白(Acrobiosystems)在PBS中以1μg/ml包被在微量滴定板上，在RT下保持2小时。包被抗原后，将孔用含1％ BSA的PBS/0.05％ Tween(PBST)在RT下封闭1小时。用PBST洗涤孔后，将不同浓度的抗CD47抗体加入孔中，并且在RT下温育1。为了检测结合的抗体，添加HRP缀合的抗人Fc的二抗(Jackson Immuno Research)，然后添加荧光底物(Roche)。在所有温育步骤之间，将平板的孔用PBST洗涤三次。在TECANSpectrafluor酶标仪中测量荧光。
抗CD47抗体B2B以剂量依赖性方式表现出与二聚体CD47-ECD的结合活性。
实施例6.抗CD47抗体阻断CD47与SIRPα结合的剂量依赖性反应
将重组CD47-Fc融合蛋白(Acrobiosystems)在PBS中以1μg/ml包被在微量滴定板上，在4℃下保持16小时。用PBST中的1％ BSA在RT下封闭1小时后，在不存在或存在不同浓度的抗CD47抗体的情况下添加1μg/mL的SIRPα-His蛋白，在RT下进行1小时。随后将板洗涤三次，用HRP缀合的抗His二抗在RT下温育1小时。洗涤之后，将TMB溶液加入每个孔中保持30min，用2.0M H2SO4终止反应，并且在490nm处测量OD。
如图2所示，抗CD47抗体B2B表现出以剂量依赖性方式阻断CD47与SIRPα结合的活性，具有0.18nM的EC50。
实施例7A.抗CD47抗体与CD47+Raji细胞结合的剂量依赖性反应
将表面上内源性表达人CD47的Raji细胞用不同浓度的抗CD47抗体在4℃下染色30分钟。然后，将细胞用PBS洗涤三次，随后用APC标记的抗人Fc特异性抗体(Invitrogen)在4℃下温育30分钟。使用FACSCanto(Becton-Dickinson)测量结合。
如图3所示，抗CD47抗体B2B表现出与CD47+Raji细胞结合的活性，遵循相同的剂量依赖性模式，具有0.12nM的EC50。
实施例7B:抗CD47抗体与肿瘤细胞结合的剂量依赖性反应
为了评估本发明的抗体的结合强度，用一组12个肿瘤细胞系进行相似的研究，所述肿瘤细胞系跨越不同肿瘤谱系，包括白血病和实体瘤谱系。
如图4所示，抗CD47抗体B2B在测试的12个细胞系(即，SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375和SK-MES-1)上表现出与5F9可比的结合强度模式，这与下文讨论的B2B和5F9在相同肿瘤细胞系中的吞噬模式密切相关。
实施例8A.人巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用研究
从人血液分离外周血单核细胞(PBMC)，并且将单核细胞分化为巨噬细胞6天。刮取单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)，在24-孔板中重新铺板并让其粘附24小时。选择内源性表达CD47的Raji细胞作为靶细胞，用1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记10分钟，然后以5:1肿瘤细胞每吞噬细胞的比例加入单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)中。然后以不同剂量添加抗CD47抗体。温育3小时后，用PBS洗去未被吞噬的靶细胞，刮去剩余的吞噬细胞，用巨噬细胞标记CD14抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。通过对CD14+细胞进行门控，然后评估CFSE+细胞的百分比来测量吞噬作用。
如图5所示，抗CD47抗体B2B在促进人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞方面表现出与抗CD47抗体5F9和2A1相似的活性。
实施例8B.肿瘤细胞吞噬作用的进一步研究
为了评估本发明的抗体的吞噬作用强度，用一组12个肿瘤细胞系进行相似的研究，所述肿瘤细胞系跨越不同肿瘤谱系，包括白血病和实体瘤谱系。如图6所示，抗CD47抗体B2B在促进SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375和SK-MES-1细胞的吞噬作用方面表现出与抗CD47抗体5F9可比的活性。
实施例9.红细胞(RBC)凝集测定中的RBC保留(Sparing)特性
将人RBC在PBS中稀释至10％，在37℃下与滴定的抗CD47抗体在圆底96-孔板的孔中温育2小时，血凝的证据表现为存在非沉降的RBC，与非血凝的RBC的点状红点相比，表现为雾状。
抗CD47抗体B2B在高达30μg/μL或甚至高达150μg/mL的测试浓度下没有导致RBC凝集。
实施例10.RBC结合测定
通过流式细胞术检测CD47抗体与人RBC的结合。将人RBC与CD47抗体(10μg/mL)在4℃下温育1小时，然后添加别藻蓝蛋白(APC)缀合的二抗在4℃下温育30分钟。
如图9A所示，抗CD47抗体B2B在测试浓度下仅导致非常低的RBC结合(通常低于15％)，而参考抗CD47抗体5F9在相同浓度下表现出更高的RBC结合(通常在70-90％之间)。
实施例11.RBC凝集测定
从6名男性和6名女性健康个体收集RBC，通过添加CD47抗体分析RBC凝集。
如图9B所示，抗CD47抗体B2B没有表现出RBC凝集，但参考抗CD47抗体5F9和2A1引起显著凝集。
实施例12.血小板结合测定
通过流式细胞术检测本发明的CD47抗体与人血小板的结合。将人外周全血与本文所述的测试CD47抗体(10μg/mL)或SIRPα-Ig融合物温育，并且将CD61染色作为血小板的细胞表面标记。通过对CD61阳性群体(血小板)门控并进一步检查CD47或SIRPα-Ig融合物结合的百分比来测量抗CD47抗体或SIRPα-Ig融合物的结合。
抗CD47抗体B2B与人血小板没有明显的结合，而SIRPα-Ig融合蛋白却有。
实施例13.CD47抗体诱导的原代人急性髓系白血病细胞的吞噬作用
用1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记来自人急性髓系白血病(AML)患者的原代外周血单核细胞(PBMC)10分钟，然后以5:1肿瘤细胞每吞噬细胞的比例添加至单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)，并且添加不同浓度的所示CD47抗体。温育3小时后，用PBS洗去未被吞噬的靶细胞，刮去剩余的吞噬细胞，用CD14抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。通过对CD14+细胞进行门控，然后评估CFSE+细胞的百分比来测量吞噬作用。如前所述测量吞噬作用。
分别如图7和图8所示，抗CD47抗体B2B表现出显著的AML结合能力(大于95％)和吞噬能力(至少36％)，与参考抗CD47抗体5F9的活性可比。
实施例14.抗CD47抗体B2B在萤光素酶-Raji细胞系衍生的异种移植(CDX)模型中的体内效力
将NOD scid gamma(NSG)小鼠通过尾静脉注射移植Raji Luc-EGFP(增强型绿色荧光蛋白)，浓度为1×106个细胞/小鼠。移植后5天对小鼠进行体内成像以确定移植水平。使用抗CD47抗体B2B的处理从同一天开始，剂量不同。对照组给予媒介物。所有小鼠每隔一天通过腹腔内注射进行注射。在抗体处理后的第0、4、7、11、14、18和21天通过IVIS LuminaIII成像系统对小鼠进行体内成像。通过体内活体成像系统进行生物发光强度分析来测量小鼠中的肿瘤生长。
在Raji-异种移植研究的最后，将所有小鼠安乐死。分离B2B处理的小鼠和媒介物处理的小鼠的脾细胞，并且通过流式细胞术分析M1巨噬细胞(F4/80阳性巨噬细胞中CD80阳性的％)和M2巨噬细胞(F4/80阳性巨噬细胞中CD206阳性的％)的百分比。
图11显示用抗CD47抗体B2B处理的小鼠的发光强度在10mg/kg的处理后继续下降，但是在较低浓度的处理后仅略有增加。这证明B2B有效地诱导荷瘤小鼠中巨噬细胞的极化。
实施例15.食蟹猴的药理安全性研究
初步研究(Pilot)–单剂量：将幼稚的食蟹猴静脉内输注媒介物(n＝2)、抗CD47抗体B2B(n＝3，剂量＝15mg/kg)或抗CD47抗体5F9(n＝3，剂量＝15mg/kg)。在采血后24小时内，抗CD47抗体给药前两次以及在抗体给药后3、6、10、14和21天分析血液学(全血计数或“CBC”)。检查CBC参数，包括红细胞计数(也称作红细胞或“RBC”)、血红蛋白(或“HGB”)、绝对网织红细胞计数和血小板计数。
初步研究–重复剂量：相似地，将幼稚的食蟹猴(n＝2)静脉内注射抗CD47抗体B2B，剂量为20mg/kg。在不同时间点，通过静脉穿刺将每只猴的血液样品收集到没有抗凝剂的试管中。在抗体给药后的指定时间点检查血液学(CBC)参数。血液学参数包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板计数和淋巴细胞计数，在抗体给药后的指定时间点。
图10A和图10B显示抗CD47抗体B2B在给药后没有诱导食蟹猴的明显血液学变化。
在食蟹猴中进行符合良好实验室规范(GLP)的4周重复剂量静脉内(IV)毒性研究，如下。将幼稚的食蟹猴静脉内输注重复剂量(每周给药)的抗CD47抗体B2B，剂量为10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg。在指定时间点检查血液学(CBC)参数，包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板计数和淋巴细胞计数。图10A显示与5F9的处理相比，B2B的单剂量处理对RBC和血红蛋白水平的影响最小。图10B显示与媒介物对照相比，不同剂量B2B的重复处理对雄性和雌性食蟹猴的RBC没有显著影响。
实施例16.复发/难治性实体瘤和淋巴瘤患者的临床研究
在复发/难治性恶性肿瘤患者中用抗CD47抗体B2B进行了两部分临床研究。临床研究的第一部分由B2B剂量升级组成，第二部分是剂量扩大研究。在剂量升级(第一部分)过程中，向复发/难治性实体瘤患者给药B2B的静脉内每周剂量(1mg/kg-30mg/kg)，以基于实体瘤反应评价标准(RECIST v1.1)和iRECIST确定耐受性、安全性、药代动力学(PK)、药效学(PD)和抗肿瘤活性。(参见，例如，Eisenhauer et al.(2009)European J.Cancer.45:228-247和Seymour et al.(2017)Lancet Oncol.18(3):e143–e152。
更具体地，将20名复发/难治性实体瘤患者分配到5个B2B剂量升级队列(1、3、10、20和30mg/kg)中的一个。B2B毒性直到30mg/kg是可控的，没有观察到任何剂量限制性毒性(DLT)。最常见的治疗相关不良事件(TRAE)是贫血(30.0％,n＝6)、疲劳(25.0％,n＝5)、输液相关反应(20.0％,n＝4)和腹泻(15.0％,n＝3)。所有TRAE均为1级或2级。在所有队列中，在第一个周期中观察到血红蛋白短暂地、非剂量依赖性地平均减少1.5mg/dL(范围：0.4-2.6mg/dL)，与临床前良好实验室规范毒性研究的结果一致。在任何队列中均未观察到溶血的实验室或临床证据。初步结果表明，单剂量后B2B的药代动力学在中、高剂量水平上看起来是线性的。在20mg/kg及以上的峰值浓度下，CD47受体占有率显示在外周T细胞上完全饱和。
如图12-14所示，本发明的抗CD47抗体(即，B2B)在复发/难治性实体瘤患者中在高达30mg/kg下看来是安全的，具有良好的药代动力学(PK)和药效学(PD)特征。已观察到大于2级的TRAE。
实施例17.抗CD47抗体制备
合成编码抗体B2B的重链(SEQ ID NO.3)和轻链(SEQ ID NO.4)的cDNA，分别克隆到内部(in house)载体PIM4.0中。然后将包含所述cDNA的载体稳定地共转染至CHO-K1宿主细胞中用于抗体制备。平行开发参考细胞系，用包含编码抗体C3C重链(SEQ ID NO.7)和轻链(SEQ ID NO.8)的核酸的载体稳定转染。
在迷你池选择和一系列扩增之后，将表达B2B或C3C的CHO-K1细胞分别以5×105个细胞/mL的密度接种到50mL离心管中的ActiPro培养基中。每个抗体制备三批，每批的工作体积为20mL。Cell Boost7a(CB7a)和Cell Boost 7b(CB7b)(10:1)用作补料(feed)培养基。简单地说，在第3天、第6天、第8天、第10天和第12天添加0％～5.0％CB7a和0％～0.5％CB7a。基于生长和代谢谱调整补料百分比和补料日。还将葡萄糖添加至培养物中。将补料分批培养物在Kuhner摇床(36.5℃，75％湿度，6％ CO2，225RPM)中培养。(a)当活细胞密度(VCD)达到约16×106个细胞/mL或(b)第7天时，将培养温度调至31℃，无论哪个先到。
在第10天和第14天收获每个批次的补料分批培养物。通过蛋白A-HPLC测量来自收获培养物的上清液的滴度。每批的滴度如表1以及图16A和16B所示。
表1.补料分批培养物的生产滴度
将每个抗体的前两个池的补料分批培养物的上清液通过一步蛋白A纯化进一步纯化。然后通过如表2所示的大小排阻色谱(SEC)和如表3所示的毛细管电泳(CE)对蛋白A纯化的抗体进行质量分析。
表2.顶级稳定池的SEC谱
池ID 主峰(％) HMW峰(％) LMW峰(％)
B2B-批次3 97.5 2.4 0.1
B2B-批次2 97.7 2.2 0.1
C3C-批次1 97.8 1.6 0.6
C3C-批次2 98.2 1.3 0.5
表3.顶级稳定池的CE谱
池ID 主要Peak(％) LC+HC(％) LC(％) HC(％)
B2B-批次3 95.9 97.7 33.3 64.4
B2B-批次2 95.4 98.2 33.4 64.8
C3C-批次1 93.2 97.7 33.0 64.7
C3C-批次2 93.3 98.2 33.6 64.6
以上结果证明，与表达抗体C3C的CHO-K1细胞相比，表达抗体B2B的CHO-K1细胞在第10天和最后一天(例如，第14天)产生明显更高的抗体平均滴度。表1显示与抗体C3C相比，从CHO-K1细胞产生抗B2B抗体更优异。表2和3显示由CHO-K1细胞表达的抗体B2B的产物质量与由CHO-K1细胞表达的抗体C2C的产物质量相当。
实施例18：分化的抗CD47抗体来佐利单抗在复发/难治性恶性肿瘤受试者中的首次患者研究的初步单一疗法结果
背景
CD47在大多数癌症上表达。CD47和SIRPα之间相互作用的阻断导致“不要吃我”信号的抑制，并且导致表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用。抗CD47抗体作为一类药物已经成为一种有前途的癌症疗法，这得到了淋巴瘤(参见，例如，实施例22)和白血病患者的初步临床数据的支持。然而，CD47也在红细胞(RBC)上自然表达。初步的临床和临床前研究表明，各种治疗性抗CD47抗体可以引起血液学毒性，即严重贫血或血小板减少。
来佐利单抗(也称作TJ011133、TJC4或B2B)是IgG4同种型的新型全人CD47抗体。通过设计，它是唯一选择的，与RBC的相互作用最小，并且与同类的其他CD47抗体高度不同。来佐利单抗在食蟹猴中仅诱导RBC水平的最小和短暂降低(参见，例如，图9B)。来佐利单抗的RBC保留特性在机制上可归因于其对CD47的独特糖表位的识别，该表位在RBC上被糖基化屏蔽。来佐利单抗在(a)与各种肿瘤细胞类型结合，(b)体外肿瘤吞噬作用和(c)小鼠异种移植模型中的肿瘤根除方面保持强活性。
方法/研究设计
这个实施例提供1期研究的初步结果，该研究设计为评估来佐利单抗在晚期复发或难治性实体瘤和淋巴瘤受试者中的安全性、耐受性、最大耐受剂量(MAD)或最大给药剂量(MAD)、药代动力学(PK)和药效学(PD)以及推荐的2期剂量(RP2D)。在研究的第1部分中，采用标准3+3设计的单剂剂量升级。参见图17。在连续剂量队列(1、3、10、20和30mg/kg)中，将来佐利单抗以每周IV输注的方式向晚期复发或难治性实体瘤患者给药，没有任何启动(priming)剂量(例如在给药治疗性抗CD47抗体时常用的低(～1mg/kg)每周剂量)。
结果
基线特征
将20名晚期复发或难治性实体瘤(即，肺、卵巢、结肠直肠、胰腺、肉瘤、头颈、胃、肾和皮肤)患者纳入单一疗法剂量升级研究。患者的基线特征和给予1、3、10、20或30mg/kg来佐利单抗qw的患者数量在表4中示出：
表4：基线特征
安全性
在整个研究过程中未报告剂量限制性毒性(DLT)或药物相关的严重不良反应(SAE)。所有治疗相关的不良反应(TAAE)均为1级或2级，除了一个3级脂肪酶增加。参见表5(GR＝等级)。所有毒性均采用不良事件通用术语标准(CTCAE)v 5.0进行分级。参见，例如，ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quic k_Reference_5x7(dot)pdf。
表5：按队列的治疗相关不良事件(TRAE)
对血红蛋白和网织红细胞水平的影响
所有队列在第一周期(即，21天)期间都观察到血红蛋白水平的短暂降低。图18A显示所有20名患者的血红蛋白和网织红细胞水平的时间过程，图18B显示接受最高剂量(30mg/kg)来佐利单抗的患者血红蛋白和网织红细胞水平的时间过程。平均降幅为～10％，无剂量依赖性。这个发现与临床前良好实验室规范(GLP)毒性研究的结果一致。所有报告的药物相关贫血都不认为是严重的或溶血性的。
药代动力学(PK)
单剂量后来佐利单抗的PK曲线在高于10mg/kg的剂量下看起来是线性的，在1-10mg/kg的剂量范围内，其暴露量大于剂量比例，表明在较高剂量下，来佐利单抗可以克服CD47下沉效应。图19A显示单剂量后患者中来佐利单抗的血清PK，图19显示多剂量后患者来佐利单抗qw的血清PK。5名受试者在第一次治疗后确认为抗药抗体(ADA)阳性：3名来自1mg/kg，1名来自3mg/kg，1名来自1O mg/kg。没有观察到ADA对安全性或PK的影响。
药效学(PD)
每周给药来佐利单抗后，在20和30mg/kg下外周T细胞上的CD47(受体占有率RO)达到最大饱和。参见图20。
初步效力
在30mg/k单一疗法队列中观察到一个确认的部分反应(PR)(1/3)。完成30mg/kgqw单一疗法，进行了5个周期。患者患有转移性黑素瘤，并且之前接受过纳武单抗(nivolumab)(抗PD1抗体)和伊匹木单抗(抗CTLA抗体)的全身治疗。参见图21，其显示黑素瘤患者中的反应性肝转移。
结论
在没有启动剂量给药策略的情况下，来佐利单抗在每周一次高达30mg/kg下看来是安全和耐受性良好的。未观察到剂量限制性毒性，并且未达到最大耐受剂量。最常见的不良事件包括疲劳和短暂性贫血。没有发现治疗相关的严重不良事件。单剂量后，来佐利单抗PK在中、高剂量水平下看来是线性的，没有显著的下沉效应。在一名用检查点抑制剂的先前治疗失败的患者(在30mg/kg)中观察到单一疗法临床活性(部分反应)。
参考文献
Willingham et al.(2012)PNAS USA.109(17):6662-6667
Liu et al.(2015)PLOS One.10(9):e0137345
Sikic et al.(2019)J Clin Oncol.37:946-953.
实施例22：分化的抗CD47抗体来佐利单抗与利妥昔单抗联合在复发和难治性非霍奇金淋巴瘤中的初步临床结果
介绍
来佐利单抗(也称作TJ011133、TJC4和B2B)是靶向不同CD47表位的分化的CD47IgG4抗体，其赋予独特的红细胞保留特性，同时保留强大的抗肿瘤活性，这在实体瘤患者中得到证实。(参见实施例21)来佐利单抗不诱导显著的血液学毒性，并且可以在不需要其他CD47抗体所需的启动剂量(例如，～1mg/kg的每周低剂量)的情况下给药。在淋巴瘤动物模型中，来佐利单抗在与利妥昔单抗联合时表现出增强的治疗效果。
方法
这是一项1b期研究，招募患有CD20阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的复发和难治性(R/R)患者，他们有至少两个先前治疗线路。以3+3剂量升级设计向患者给药来佐利单抗，随后进行剂量扩展。将来佐利单抗以20mg/kg每周或30mg/kg每周的剂量与利妥昔单抗(375mg/m2每周，持续5个剂量，然后每月一次(q4w或每28天)，持续3个剂量)联合静脉内给药。评估基于Lugano标准(参见Cheson et al.(2014)Journal of Clinical Oncology.32:27,3059-3067和Van Heertum et al.(2017)Drug Des Devel Ther.11:1719–1728)的安全性、耐受性、药代动力学(PK)、药效学(PD)和抗肿瘤活性。
结果
将8名经过严重预治疗的复发/难治性非霍奇金淋巴瘤(R/R NHL)患者，已接受先前CD20靶向治疗，纳入20mg/kg(n＝6)和30mg/kg(n＝2)的来佐利单抗与利妥昔单抗联合的剂量队列。诊断包括弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)[n＝2]、套细胞淋巴瘤(MCL)[n＝1]和滤泡性淋巴瘤(FL)[n＝5]。患者的中位年龄为63岁(范围：43-83)，中位先前治疗次数为4次(范围：2-10)。
安全性和耐受性：最常见的治疗相关不良事件(TRAE)是输注相关反应(n＝4)、瘙痒(n＝3)、疲劳(n＝3)、皮疹(n＝2)、便秘(n＝2)和呼吸困难(n＝2)。所有TRAE均为1级或2级，除了一个例外，他报告了3级TRAE，包括胸腔积液、心动过速、咳嗽、瘙痒、疲劳、皮疹和呼吸困难，剂量水平为20mg/kg。观察到轻度血液学不良事件(AE)，分别为一次孤立的贫血和血小板减少，不需要治疗。
PK和PD：利妥昔单抗的共同给药不影响来佐利单抗的PK或免疫原性。平均而言，在来自20和30mg/kg剂量给药的患者的活检淋巴结中分别检测到80％和90％ CD47受体占有率，表明肿瘤靶向接触显著。
抗肿瘤活性：在7名可评价效力的患者中，观察到3名完全反应(CR)[1名转化的FL-DLBCL+2名FL]和1名部分反应的FL(ORR＝57％)，同时还有3名疾病稳定(SD持续时间3-6个月)。总体疾病控制率(DCR)为100％。在所有可评价的患者中均观察到肿瘤缩小。一名患者在第一周期退出研究后因临床疾病进展而无法评价治疗效力。对治疗产生初步应答的中位时间是2个月，并且所有应答者在数据截止时仍保持临床应答。在继续治疗期间，两名患者的反应有所改善。一名转化的FL-DLBCL患者从第2个月的PR改善到第8个月的CR，并且另一名FL患者从第2个月的SD改善到第4个月的PR。
结论
与单一疗法结果(参见实施例21)一致，以20–30mg/kg与利妥昔单抗联合给药的来佐利单抗在R/R NHL患者中是安全和耐受性良好的，不需要常用于其他治疗性抗CD47抗体的启动剂量。在两个剂量水平下均达到了高水平的肿瘤内靶标接触。联合疗法在严重预治疗的R/R NHL患者中表现出临床活性的证据，这些患者在先前CD20靶向疗法中已取得了进展。
本发明已根据本发明人发现或提出的特定实施方案进行了描述，以包含本发明实践的优选模式。本领域技术人员会理解，根据本公开，可以对示例的特定实施方案进行许多修改和变化而不背离本发明的预期范围。例如，由于密码子冗余性，可以在底层DNA序列中进行变化而不影响蛋白序列。此外，由于生物功能等同性的考虑，可以在蛋白结构中进行变化而不影响生物学作用的种类或量。所有这类修改均意图包括在所附权利要求书的范围内。
氨基酸和核酸序列
                                序列表
<110> 天境生物科技（上海）有限公司
<120> 新型抗CD47抗体及其用途
<130> 23300-20002.41
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> PCT/CN2020/122188
<151> 2020-10-20
<150> PCT/CN2020/120869
<151> 2020-10-14
<160> 55
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
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    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 4
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Arg Ala Trp Met Asn
1               5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser
1               5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1               5
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ala
        115
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 13
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 14
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Arg Ala Trp Met Asn
1               5
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser
1               5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1               5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
1               5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr
1               5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser
1               5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1               5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala Trp
1               5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr
1               5                   10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr
1               5                   10
<210> 31
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gln Ala
1
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1               5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala Trp Met Asn
1               5                   10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp
1               5                   10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile
1               5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser
1               5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1               5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Glu Arg Ala Trp Met Asn
1               5
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Trp Val Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp
1               5                   10                  15
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp
1               5
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
1               5                   10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala
1               5                   10
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu
1               5
<210> 45
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctcgtgaagc ctggaggaag cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggcct caccttcgag cgggcttgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggaaagg gcctggaatg ggtgggccgg atcaagagga aaacagatgg cgagaccacc 180
gattacgccg ctcccgtgaa gggccggttt agcatctcca gggacgactc caagaacacc 240
ctgtatctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgctggc 300
agcaacaggg cctttgatat ctggggccag ggcaccatgg tgacagtgtc ctcc       354
<210> 46
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
gacatcgtga tgacccagtc ccctgattcc ctggccgtga gcctgggcga aagggctacc 60
atcaactgca agtcctccca gagcgtgctg tacgccggca acaaccggaa ctatctggct 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tcaaccaggc tagcaccagg 180
gcttccggcg tgcctgatag gttcagcggc tccggctccg gcaccgagtt taccctgatc 240
atctcctccc tgcaggccga ggatgtggcc atctactact gccagcagta ctacacccct 300
cctctggcct ttggcggcgg caccaagctg gagatcaag                        339
<210> 47
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctcgtgaagc ctggaggaag cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggcct caccttcgag cgggcttgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggaaagg gcctggaatg ggtgggccgg atcaagagga aaacagatgg cgagaccacc 180
gattacgccg ctcccgtgaa gggccggttt agcatctcca gggacgactc caagaacacc 240
ctgtatctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgctggc 300
agcaacaggg cctttgatat ctggggccag ggcaccatgg tgacagtgtc ctccgcctcc 360
acaaagggac cttccgtgtt ccctctggcc ccttgttccc ggtccacctc cgaaagcacc 420
gctgctctgg gctgcctcgt caaggactac ttccctgagc ccgtgaccgt gagctggaac 480
tccggcgctc tgacaagcgg cgtgcatacc ttccctgccg tgctgcaaag cagcggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt gaccgtgcct agctcctccc tgggcaccaa aacctacacc 600
tgcaatgtgg accacaagcc ttccaacacc aaggtggaca agcgggtcga gtccaagtac 660
ggccctcctt gccctccctg ccccgctccc gagtttctgg gaggacccag cgtgttcctc 720
ttccccccta agcccaagga caccctgatg atcagccgga cacctgaggt cacctgcgtg 780
gtggtggatg tgagccaaga ggatcctgag gtccagttca actggtacgt ggacggagtg 840
gaggtgcata acgccaagac caagcctcgg gaggagcagt tcaactccac ctatagggtg 900
gtgagcgtgc tcacagtgct ccaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caaatgcaag 960
gtgtccaaca agggactccc cagcagcatc gaaaagacca tcagcaaggc caaaggccag 1020
cccagggaac cccaggtgta cacactgccc ccctcccaag aggaaatgac caagaatcag 1080
gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttt taccccagcg acatcgctgt cgagtgggag 1140
agcaacggcc agcctgagaa taactataag accacccccc ccgtgctgga tagcgacgga 1200
tccttcttcc tctactcccg gctgaccgtg gataagtccc ggtggcagga gggcaacgtg 1260
ttcagctgct ccgtcatgca cgaggccctg cataaccact acacccagaa gtccctgagc 1320
ctgtccctgg gcaagtga                                               1338
<210> 48
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
gacatcgtga tgacccagtc ccctgattcc ctggccgtga gcctgggcga aagggctacc 60
atcaactgca agtcctccca gagcgtgctg tacgccggca acaaccggaa ctatctggct 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tcaaccaggc tagcaccagg 180
gcttccggcg tgcctgatag gttcagcggc tccggctccg gcaccgagtt taccctgatc 240
atctcctccc tgcaggccga ggatgtggcc atctactact gccagcagta ctacacccct 300
cctctggcct ttggcggcgg caccaagctg gagatcaaga ggacagtggc cgccccctcc 360
gtgttcattt tccctccctc cgacgagcag ctgaagtccg gcaccgcctc cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc cagggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggact ccaaagacag cacatacagc 540
ctgtccagca ccctgaccct gtccaaggct gactatgaga agcacaaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggact gagctcccct gtgaccaagt ccttcaaccg gggagagtgc 660
tga                                                               663
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
cgggcttgga tgaac                                                  15
<210> 50
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
cggatcaaga ggaaaacaga tggcgagacc accgattacg ccgctcccgt gaagggc    57
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
agcaacaggg cctttgatat c                                           21
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
aagtcctccc agagcgtgct gtacgccggc aacaaccgga actatctggc t          51
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
caggctagca ccagggcttc c                                           21
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
cagcagtact acacccctcc tctggcc                                     27
<210> 55
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440

Claims (64)

1.一种与人CD47(hCD47)特异性结合的抗体或其免疫学活性片段，其包含：
(a)重链可变(VH)结构域，其包含(1)在其N-末端的谷氨酸残基(E)；(2)包含RAWMN(SEQID NO:5)的CDR-H1；(3)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；(4)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；和(5)在其C-末端的丝氨酸(S)；以及
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。
2.权利要求1的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH结构域的N-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H1，并且
所述VH结构域的C-末端氨基酸根据Kabat编号系统对应于位置H113。
3.权利要求1的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH结构域的N-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H1，并且
所述VH结构域的C-末端氨基酸根据Chothia编号系统对应于位置H113。
4.权利要求1的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH结构域的N-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H1，并且
所述VH结构域的C-末端氨基酸根据IMGT编号系统对应于位置H128。
5.权利要求1-4中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH结构域的N-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1，并且
所述VH结构域的C-末端氨基酸对应于SEQ ID NO:1的氨基酸118。
6.权利要求1-5中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH包含与SEQ ID NO:1具有至少95％相同性的氨基酸序列，并且
所述VL包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述VH包含SEQ ID NO:1，并且
所述VL包含SEQ ID NO:2。
8.权利要求1-7中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其包含Fc结构域。
9.权利要求8的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其包含人IgG Fc结构域。
10.权利要求9的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述人IgG Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
11.权利要求1-10中任一项的抗CD47抗体，其中
所述抗体是全长抗体。
12.权利要求1-11中任一项的抗CD47抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:55，所述轻链包含SEQ ID NO:4。
13.权利要求1-10中任一项的抗CD47抗体的免疫学活性片段，其中
所述片段是Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链Fv(scFv)、Fv片段或线性抗体。
14.权利要求1-13中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。
15.权利要求1-14中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或其片段是嵌合的或人源化的。
16.权利要求1-15中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或片段与癌细胞表面上表达的hCD47结合。
17.权利要求16的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是SK-OV-3细胞、Toledo细胞、K562细胞、HCC827细胞、Jurkat细胞、U937细胞、TF-1细胞、Raji细胞、SU-DHL-4细胞、MDA-MB-231细胞、A375细胞或SK-MES-1细胞。
18.权利要求16的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是实体瘤癌症。
19.权利要求18的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。
20.权利要求16的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是血液癌症。
21.权利要求20的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。
22.权利要求1-21中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或片段不与血细胞表面上表达的hCD47结合。
23.权利要求22的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述血细胞是红细胞。
24.权利要求1-23中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或其片段与hCD47的结合防止hCD47与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用。
25.权利要求24的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述SIRPα是人SIRPα(hSIRPα)。
26.权利要求1-25中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述抗体或其片段与癌细胞表面上表达的hCD47的结合促进癌细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。
27.权利要求26的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是SK-OV-3细胞、Toledo细胞、K562细胞、HCC827细胞、Jurkat细胞、U937细胞、TF-1细胞、Raji细胞、SU-DHL-4细胞、MDA-MB-231细胞、A375细胞或SK-MES-1细胞。
28.权利要求26的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是实体瘤癌症。
29.权利要求28的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。
30.权利要求26的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述癌细胞是血液癌症。
31.权利要求30的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
所述血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。
32.权利要求1-31中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段，其中
向受试者给药所述抗体或其片段不会引起所述受试者中显著水平的血凝或所述受试者红细胞的耗尽。
33.一种核酸，其编码权利要求1-32中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段。
34.一种载体，其包含权利要求33的核酸。
35.一种宿主细胞，其包含权利要求33的核酸，或权利要求34的载体。
36.权利要求35的宿主细胞，其中
所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
37.权利要求36的宿主细胞，其中
所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
38.权利要求37的宿主细胞，其中
所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
39.一种制备抗CD47抗体或其免疫学活性片段的方法，其包括：
a)在有效引起抗CD47抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养权利要求35-38中任一项的宿主细胞；以及
b)回收所述宿主细胞表达的抗CD47抗体或其免疫学活性片段。
40.一种药物组合物，其包含权利要求1-32中任一项的抗CD47抗体或其免疫学活性片段以及药学上可接受的载剂。
41.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者给药有效量的抗CD47抗体，其中所述抗CD47抗体包含
(a)重链可变结构域(VH)，其包含(1)包含RAWMN(SEQ ID NO:5)的CDR-H1；(2)包含RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:6)的CDR-H2；和(3)包含SNRAFDI(SEQ ID NO:7)的CDR-H3；
(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(1)包含KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(2)包含QASTRAS(SEQ ID NO:9)的CDR-L2；和(3)包含QQYYTPPLA(SEQ ID NO:10)的CDR-L3。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症是实体瘤。
43.权利要求42或43的方法，其中
所述实体瘤是肺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肉瘤肿瘤、头颈肿瘤、胃肿瘤、肾肿瘤或皮肤肿瘤。
44.权利要求42或43的方法，其中
所述实体瘤是复发和/或难治性实体瘤。
45.权利要求41的方法，其中
所述癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且其中所述方法进一步包括向所述受试者给药有效量的利妥昔单抗。
46.权利要求45的方法，其中
所述NHL是滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。
47.权利要求45或46的方法，其中
所述NHL是复发/难治性NHL。
48.权利要求45-47中任一项的方法，其中
所述受试者接受过至少一次NHL的先前治疗。
49.权利要求48的方法，其中
所述受试者接受过2-10次NHL的先前治疗。
50.权利要求48和49的方法，其中
所述受试者接受过靶向CD20的药剂的NHL先前治疗。
51.权利要求50的方法，其中
所述受试者在靶向CD20的药剂的先前治疗期间或之后出现进展。
52.权利要求41-51中任一项的方法，其中
所述抗CD47抗体包含人IgG4恒定区或其变体，所述变体包含S233P突变(其中编号根据EU索引)。
53.权利要求41-52中任一项的方法，其中
将所述抗CD47抗体以10mg/kg的剂量向所述受试者给药。
54.权利要求41-52中任一项的方法，其中
将所述抗CD47抗体以20mg/kg的剂量向所述受试者给药。
55.权利要求41-52中任一项的方法，其中
将所述抗CD47抗体以30mg/kg的剂量向所述受试者给药。
56.权利要求41-55中任一项的方法，其中
将所述抗CD47抗体每周一次(qw)向所述受试者给药。
57.权利要求41-56中任一项的方法，其中
将所述抗CD47抗体通过静脉内(IV)输注向所述受试者给药。
58.权利要求45-57中任一项的方法，其中
所述利妥昔单抗在前五周每周一次(qw)以375mg/m2的剂量给药，并且在前五周之后每4周一次(q4w)以375mg/m2的剂量给药。
59.权利要求41-58中任一项的方法，其中
所述受试者不因为抗CD47抗体治疗而经历明显的血液学毒性。
60.权利要求59的方法，其中
所述受试者不因为用抗CD47抗体治疗而经历任何血液学毒性。
61.权利要求59或60的方法，其中
所述血液学毒性包括贫血、血细胞减少和/或血凝。
62.权利要求41-61中任一项的方法，其中
所述抗CD47抗体的VH包含SEQ ID NO:1，并且
所述抗CD47抗体的VL包含SEQ ID NO:2。
63.权利要求41-62中任一项的方法，其中
所述抗CD47抗体的重链包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:55，并且
所述抗CD47抗体的轻链包含SEQ ID NO:4。
64.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含权利要求1-32中任一项的抗体或权利要求40的组合物。
HK62023079420.3A 2020-10-14 2021-10-14 新型抗cd47抗体及其用途 HK40091237A (zh)

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