HK40112911A

HK40112911A - 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途

Info

Publication number: HK40112911A
Application number: HK62024100885.8A
Authority: HK
Inventors: A·S·安德森; C·加拉格尔; J·谷; I·卡涅夫斯凯; J-H·金; J·K·莫兰; S·辛格; A·R·瓦尔塔克; Y·杨
Original assignee: 辉瑞公司
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2025-01-28

Description

包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途

技术领域

本发明涉及新的经缀合荚膜糖抗原(糖缀合物)、包含所述糖缀合物之免疫原性组合物及其用途。本发明之免疫原性组合物通常包含糖缀合物，其中糖来源于细菌荚膜多糖抗原，尤其为来源于病原性细菌之荚膜多糖。本发明还涉及使用所述糖缀合物对人类个体尤其婴儿及老年人进行疫苗接种以抵抗感染。

背景技术

革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均可能产生细胞外隔室，即荚膜，它覆盖细菌细胞且通常会阻止潜在的细胞表面抗原与其同源抗体发生反应。夹膜存在于数种具有医疗重要性之细菌中，尤其是肠道外及侵袭性菌株。细菌荚膜主要由多糖构成。多糖在细胞周围形成凝胶状物质。荚膜多糖为重要的免疫原，由此使得其成为疫苗设计中之重要组分。荚膜多糖已被证明可用于诱发免疫反应，尤其当与载体蛋白连接时。

数十年来，已成功地利用通过将弱免疫原性分子缀合至“载体”分子来提高这些弱免疫原性分子之免疫原性的方法(参见例如Goebel等人(1939)J.Exp.Med.69:53)。举例而言，已描述了许多免疫原性组合物，其中经纯化之荚膜聚合物已与载体蛋白缀合，以通过采用此“载体效应”来产生更高效的免疫原性组合物(Schneerson等人(1984)Infect.Immun.45:582-591)。还已证明，缀合可避免在用游离多糖进行免疫时通常在婴儿中观测到的不良抗体反应(Anderson等人(1985)J.Pediatr.107:346；Insel等人(1986)J.Exp.Med.158:294)。

已成功使用各种交联或偶联试剂，诸如同型双官能、异型双官能或零长度交联剂来产生缀合物。目前许多方法可供用于将免疫原性分子(诸如糖、蛋白质及肽)与肽或蛋白质载体偶联。大多数方法产生胺、酰胺、氨基甲酸乙酯、异硫脲或二硫键，或在一些情况下产生硫醚。使用将反应性位点引入载体及/或免疫原性分子上之反应性氨基酸分子之侧链中的交联剂或偶联剂的不足之处在于，反应性位点在未中和的情况下会在体外与任何非所需分子自由反应(因此可能不利地影响缀合物之功能性或稳定性)，或在体内与任何非所需分子自由反应(因此在用制剂进行免疫接种之个人或动物中引起不良事件的潜在风险)。可利用各种已知的化学反应来使此类过量的反应性位点发生反应或对其进行“封端”，以便使此等位点失活，但此等反应可能在其他方面破坏缀合物之功能性。

因此，仍需要新的经适当封端之糖缀合物及制备所述缀合物之方法，使得功能性得以保留且缀合物仍能够诱发所需免疫反应。

本发明人已发现用以产生糖缀合物的有效新方法。该方法允许产生游离糖含量极低且产率良好的缀合物。此外，本发明人已发现，一些肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型(例如35B及29多糖)由于其独特结构而在产生缀合物方面造成特定挑战。需要免疫原性肺炎链球菌血清型多糖-载体蛋白缀合物及其经改良的制备方法。

发明概述

在一方面中，本发明涉及一种制备荚膜糖糖缀合物之方法，其包含以下步骤：

(a)使经分离荚膜糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在非质子性溶剂中反应以产生经活化叠氮基糖，

(b)使载体蛋白与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应，其中NHS部分与氨基反应以形成酰胺键，从而获得经炔烃官能化载体蛋白，

(c)通过Cu⁺¹介导之叠氮化物-炔烃环加成反应使步骤(a)之经活化叠氮基糖与步骤(b)之经活化炔烃-载体蛋白发生反应以形成糖缀合物。

在一方面中，经分离糖在活化步骤(a)前系经尺寸设定。

在一方面中，碳酸衍生物系选自由以下组成的组：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)及N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯。

在一方面中，该叠氮基接头为式(I)化合物，

H₂N-X-N₃ (I)

其中X系选自由以下组成的组：CH₂(CH₂)_n、(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、NHCO(CH₂)_n、NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、OCH₂(CH₂)_n及O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂；其中n系选自1至10且m系选自1至4。

在一方面中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔烃之试剂。

在一方面中，步骤a)包含在非质子性溶剂中，使荚膜糖与碳酸衍生物反应，随后使经碳酸衍生物活化之荚膜糖与叠氮基接头反应，以产生经活化叠氮基荚膜糖。

在一方面中，缀合反应c)系在水性缓冲液中在作为催化剂之铜(I)存在下进行。

在一方面中，在步骤c)之后，该方法进一步包含用叠氮基封端剂对缀合物中保留之未反应叠氮基进行封端的步骤。

在一方面中，在步骤c)之后，该方法进一步包含用炔烃基封端剂对缀合物中保留之未反应炔烃基进行封端的步骤。

在一方面中，本发明涉及一种根据所述方法产生之荚膜糖糖缀合物。

在另一方面中，本发明涉及一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VII)：

其中X系选自由以下组成的组：CH₂(CH₂)_n'、(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、NHCO(CH₂)_n'、NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、OCH₂(CH₂)_n'及O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂；其中n'系选自1至10且m系选自1至4，

且其中X'系选自由以下组成的组：CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O、CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

在特定方面中，本发明涉及一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'为2，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”为1。

在一特定方面中，本发明涉及一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VIII)，

附图说明

图1展示肺炎链球菌血清型35B荚膜多糖之重复多糖结构。

图2展示肺炎链球菌血清型29荚膜多糖之重复多糖结构。

图3展示使用点击化学且使用3-叠氮基-1-丙胺作为叠氮基接头来制备的本发明之糖缀合物之通用制备流程。CP＝载体蛋白，CDI＝1,1'-羰基二咪唑。

发明详述

本发明人已研发出新的多糖-载体蛋白缀合物及制备此等缀合物之方法。已发现用以产生糖缀合物之方法允许生产游离糖含量极低且产率良好的糖缀合物。

此外，本发明人已发现肺炎链球菌血清型35B及29多糖在产生缀合物方面造成特定挑战。已发现肺炎链球菌血清型35B及29多糖在用高碘酸盐活化期间裂解，高碘酸盐为常用还原氨基化方法中使用的典型氧化剂。看起来，高碘酸盐氧化在血清型35B及29多糖之主链上发生且使甘露糖醇或核糖醇裂解，引起尺寸减小。此情形导致若干问题，包括难以获得某一尺寸之经活化之血清型35B及29多糖。用高碘酸盐进行活化导致多糖Mw减小，从而大幅度限制了有效活化范围。

WO 2020/247299提出，据称为了改良血清型35B缀合物属性，可减少高碘酸盐之量且使用某一温度范围来进行缀合反应。然而，已发现此类溶液会导致低产率及/或较高含量之游离糖。本发明人已研发出新的肺炎链球菌血清型35B及29多糖-载体蛋白缀合物及制备此等缀合物之经改良方法，其不具有此等缺陷。

1.本发明之糖缀合物

本发明部分针对经缀合细菌荚膜糖抗原(也称为糖缀合物)。出于本发明之目的，术语‘糖缀合物’指示与载体蛋白共价连接之荚膜糖(尤其细菌荚膜糖)。

1.1本发明之荚膜糖

在整个本说明书中，术语“糖”可指示多糖或寡糖且包括两者。在一个实施方案中，本发明之糖可为寡糖。寡糖具有低数目之重复单元(通常5至15个重复单元)且通常以合成方式或通过多糖之水解得到。然而优选地，本发明之所有糖及本发明之免疫原性组合物中之所有糖为多糖。高分子量多糖由于存在于抗原表面上之表位而能够诱导某些抗体免疫反应。优选地，考虑高分子量荚膜多糖之分离及纯化以用于本发明之缀合物、组合物及方法中。因此，在本发明之一个优选实施方案中，糖为多糖。

优选地，本发明中所使用之糖为细菌荚膜糖(本文中还称为‘荚膜糖’)。具有医疗重要性之若干细菌中存在荚膜。细菌荚膜主要由多糖构成。荚膜糖是通过本领域技术人员已知之标准技术制备的。

在本发明之一最优选实施方案中，糖为肺炎链球菌荚膜多糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为合成碳水化合物。

然而，在一个优选实施方案中，根据本发明之细菌荚膜糖来源可为细菌细胞。可用作荚膜糖来源之细菌菌株可获自现有培养物保藏中心(诸如来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas,VA USA)或链球菌参考实验室(疾病控制与预防中心，Atlanta,GA USA))或临床标本。

细菌荚膜糖可使用本领域技术人员已知之分离程序自细菌直接获得(参见例如US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340及US2008/0102498及WO2008/118752中所公开之方法)。其还可使用本领域技术人员已知之合成方案产生。

在细菌荚膜糖自细菌直接获得的情况下，细菌细胞可在培养基中生长。在产生荚膜糖之细菌细胞发酵之后，细菌细胞可溶解以产生细胞溶解产物。荚膜糖接着可使用本领域中已知之纯化技术自细胞溶解产物分离，包括使用离心、深层过滤、沉淀、超滤、用活性碳处理、渗滤及/或柱层析(参见例如US2006/0228380、US2006/0228381及WO2008/118752)。经纯化之荚膜糖随后可用于制备免疫原性缀合物。

通过纯化获得的经分离荚膜糖可通过不同参数表征，包括例如重量平均分子量(Mw)。多糖之分子量可通过大小排阻层析(SEC)与多角度激光散射检测器(MALLS)之组合来测量。

在一个实施方案中，制备本发明之糖缀合物或本发明之糖缀合物之一部分的方法中使用的荚膜糖为来自病原性细菌之荚膜糖。优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自病原性链球菌属(Streptococcus)、病原性葡萄球菌属(Staphylococcus)、病原性肠球菌属(Enterococcus)、病原性芽孢杆菌属(Bacillus)、病原性棒状杆菌属(Corynebacterium)、病原性利斯特菌属(Listeria)、病原性丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、病原性梭菌属(Clostridium)、病原性嗜血杆菌属(Haemophilus)、病原性奈瑟氏菌属(Neisseria)或病原性埃希氏菌属(Escherichia)之荚膜糖。更优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自病原性链球菌属、病原性奈瑟氏菌属或病原性埃希氏菌属之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自以下之荚膜糖：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及其他菌种；炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；梭菌属之产生肉毒杆菌(Botulinum)神经毒素之菌种；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)；马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)；猪布鲁氏菌(Brucella suis)；鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)(官方名称鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei))；类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(以前称为类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei))；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；艰难梭菌(Clostridium dificile)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；粗球孢子菌(Coccidioides immitis)；波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)；反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)(水胸病(Heartwater))；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；致泻性大肠杆菌(Enterovirulent Escherichia coli)群(EEC群)，诸如肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠病原性大肠杆菌(EPEC)、O157:H7肠出血性大肠杆菌(EHEC)及肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)；埃里希氏体属(Ehrlichia)菌种，诸如查菲埃里希氏体(Ehrlichiachajfeensis)；土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)；嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)；非洲柑橘黄龙病菌(Liberobacter africanus)；亚洲柑橘黄龙病菌(Liberobacter asiaticus)；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；其他肠道菌属(miscellaneous enterics)，诸如克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、变形杆菌属(Proteus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、产气杆菌属(Aerobacter)、普罗威登斯菌属(Providencia)及沙雷氏菌属(Serratia)；牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；山羊支原体(Mycoplasma capricolum)；蕈状支原体蕈状亚种(Mycoplasma mycoides ssp mycoides)；菲律宾露菌(Peronosclerosporaphilippinensis)；豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)；类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)；青枯雷尔氏菌生理小种3生物变种2(Ralstonia solanacearum race 3,biovar2)；普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii)；立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)；沙门氏菌属菌种(Salmonellaspp.)；玉米褐条霜霉病菌(Schlerophthora rayssiae var zeae)；志贺氏菌属菌种(Shigella spp.)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；链球菌；马铃薯癌肿病菌(Synchytrium endobioticum)；非01霍乱弧菌(Vibrio cholerae non-01)；01霍乱弧菌；副溶血性弧菌(Vibrio par ahaemo Iy ticus)及其他弧菌；创伤弧菌(Vibrio vulnificus)；水稻黄单孢菌(Xanthomonas oryzae)；苛求木杆菌(Xylella fastidiosa)(柑桔杂色褪绿病菌株(citrus variegated chlorosis strain))；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)及假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)；或鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或链球菌之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌、酿脓链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、C组及G组链球菌或大肠杆菌之荚膜糖。更优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、无乳链球菌或大肠杆菌之荚膜糖。甚至更优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌或无乳链球菌之荚膜糖。甚至更优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自金黄色葡萄球菌之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自金黄色葡萄球菌5型或金黄色葡萄球菌8型之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自粪肠球菌之荚膜糖。在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自流感嗜血杆菌b型之荚膜糖。

在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A(MenA)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群W135(MenW135)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群Y(MenY)、脑膜炎奈瑟氏菌血清群X(MenX)或脑膜炎奈瑟氏菌血清群C(MenC)之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A(MenA)之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群W135(MenW135)之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群Y(MenY)之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群C(MenC)之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群X(MenX)之荚膜糖。

在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌之荚膜糖。在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自粪肠球菌之荚膜糖。

在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自无乳链球菌(B组链球菌(GBS))之荚膜糖。在一些实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自GBS Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型之荚膜糖。在一些实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自GBSIa、Ib、II、III或V型之荚膜糖。

在另一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自致泻性大肠杆菌群(EEC群)，诸如肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠病原性大肠杆菌(EPEC)、O157:H7肠出血性大肠杆菌(EHEC)或肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)之大肠杆菌部分之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自泌尿道致病性大肠杆菌(UPEC)之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自选自由血清型O157:H7、O26:H11、O111:H-及O103:H2组成的组之大肠杆菌血清型的荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自选自由血清型O6:K2:H1及O18:K1:H7组成的组之大肠杆菌血清型的荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自选自由血清型O45:K1、O17:K52:H18、O19:H34及O7:K1组成的组之大肠杆菌血清型的荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌血清型O104:H4之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌血清型O1:K12:H7之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌血清型O127:H6之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌血清型O139:H28之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自大肠杆菌血清型O128:H2之荚膜糖。

在一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌之荚膜糖。优选地，本发明中所使用之荚膜糖为来自选自由以下组成的组之肺炎链球菌血清型的荚膜糖：血清型1、2、4、5、6A、6B、6C、7C、7F、8、9V、9N、10A、10B、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24B、24F、27、29、31、33B、33F、34、35B、35F、38、72及73。

在一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型1之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型2之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型4之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型5之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型6A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型6B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型7C之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型7F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型8之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型9V之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型9N之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型10A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型10B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型11A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型12F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型14之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型15A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型15B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型15C之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型16F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型17F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型18C之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型19A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型19F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型20之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型21之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型22A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型22F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23A之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型24B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型24F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型27之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型29之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型31之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型33B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型33F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型34之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型35B之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型35F之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型38之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型72之荚膜糖。在一个实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型73之荚膜糖。

在一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型35B之荚膜糖。在另一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型29之荚膜糖。

在一个优选实施方案中，本发明中所使用之(在进一步处理之前经纯化之)荚膜糖具有50kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖具有500kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。在另一个优选实施方案中，本发明中所使用之荚膜糖具有1000kDa与5000kDa之间的重量平均分子量。

考虑以上范围中之任一者内之任何全数整数作为本发明之一个实施方案。

优选地，为了产生具有有利可过滤性特性、免疫原性及/或产率之糖缀合物，糖在与载体蛋白缀合前，将尺寸设定为目标分子量范围。

有利地，经纯化荚膜糖之尺寸减小，同时保留多糖结构之关键特征。可采用机械或化学尺寸设定。

在一个实施方案中，经纯化荚膜糖之尺寸通过化学水解减小。化学水解可使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)进行。在一个实施方案中，化学水解系使用甲酸进行。在一个实施方案中，化学水解系使用丙酸进行。在一个优选实施方案中，化学水解系使用乙酸进行。化学水解还可使用经稀释之强酸(诸如稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸、稀硝酸或稀高氯酸)进行。在一个实施方案中，化学水解系使用稀盐酸进行。在一个实施方案中，化学水解系使用稀硫酸进行。在一个实施方案中，化学水解系使用稀磷酸进行。在一个实施方案中，化学水解系使用稀硝酸进行。在一个实施方案中，化学水解系使用稀高氯酸进行。

经纯化荚膜糖之尺寸还可通过机械均质化减小。在一个实施方案中，经纯化荚膜糖之尺寸通过高压均质化减小。高压均质化通过经由具有足够小尺寸之流道泵送工艺流来实现高剪切速率。剪切速率通过使用较大的所施加均质化压力而增加，且暴露时间可通过使进料流再循环通过均质器而增加。

高压均质化方法可适用于减小经纯化荚膜糖之尺寸，同时保留糖之结构特征。

在一个优选实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为10kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为50kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为50kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为50kDa与250kDa之间的重量平均分子量。

在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为250kDa与1000kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为250kDa与500kDa之间的重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为250kDa与400kDa之间的重量平均分子量。在一个优选实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为200kDa与800kDa之间的重量平均分子量。

在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约250kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约300kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约350kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约400kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约450kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约500kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约550kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约600kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约700kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约800kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约900kDa之重量平均分子量。在一个实施方案中，经分离荚膜糖之尺寸设定为约1000kDa之重量平均分子量。

在一个实施方案中，经分离荚膜糖未经尺寸设定。

上文所描述之经分离荚膜糖可经活化(例如经化学活化)，使得其能够(例如与接头)反应且随后并入糖缀合物中，如本文进一步所描述。

出于本发明之目的，术语‘糖缀合物’指示与载体蛋白共价连接之糖。

一般而言，糖与载体之共价缀合会增强糖之免疫原性，因为共价缀合将所述糖自T非依赖性抗原转化为T依赖性抗原，由此引起免疫记忆之引发。缀合尤其适用于儿童疫苗。

1.2本发明之荚膜糖糖缀合物

在一些实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该多糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在10kDa与2,000kDa之间。

糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)系指糖活化之前(还即在最终尺寸设定步骤之后但在糖与活化剂反应之前)的Mw。在本发明之上下文中，糖之Mw未由活化步骤实质上改变，且并入缀合物中的糖之Mw与活化之前测量的糖之Mw相似。在一个实施方案中，糖系用碳酸衍生物(例如CDI或CDT)与叠氮基接头之组合活化(参见下文部分1.3)。在一个实施方案中，糖系用CDI与叠氮基接头之组合活化(参见下文部分1.3)。在一个实施方案中，糖系用CDT与叠氮基接头之组合活化(参见下文部分1.3)。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在50kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与500kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与250kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与200kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与150kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在50kDa与100kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在75kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与500kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与250kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与200kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与150kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在75kDa与100kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在100kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与500kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与250kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与200kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在100kDa与150kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在150kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与500kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与250kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在150kDa与200kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在200kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与500kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与300kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在200kDa与250kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在500kDa与1,000kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与750kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与700kDa之间。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)在500kDa与600kDa之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物包含荚膜糖，其中该糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)为约1,000kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约750kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约700kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约600kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约500kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约400kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约300kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约200kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约150kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约125kDa。在一个实施方案中，重量平均分子量(Mw)为约100kDa。

在一些实施方案中，本发明之糖缀合物具有250kDa与20,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与15,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在又其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与7,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与2,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与1,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有500kDa与750kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与7,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与2,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有750kDa与1,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与7,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与2,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与2,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与1,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与10,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与7,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与4,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与3,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,000kDa与3,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有2,250kDa与3,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在优选实施方案中，本发明之糖缀合物具有1,000kDa与2,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约10,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约9,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约8,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约7,500kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约6,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约5,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约4,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约3,500kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约3,250kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约3,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约2,500kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约2,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约1,500kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约1,000kDa之重量平均分子量(Mw)。在另其他实施方案中，本发明之糖缀合物具有约750kDa之重量平均分子量(Mw)。

表征本发明之糖缀合物之另一方式为通过在载体蛋白(例如CRM₁₉₇或SCP)中变得与糖缀合之赖氨酸残基之数目来表征，此可表征为缀合之赖氨酸之范围(缀合程度)。载体蛋白由于与糖之共价连接而发生的赖氨酸修饰之证据可通过使用本领域技术人员已知之常规方法的氨基酸分析来获得。与用于产生缀合物物质之载体蛋白起始物质相比，缀合引起所回收之赖氨酸残基之数目减少。在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与15之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与13之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与10之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与8之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与6之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与5之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在2与4之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与15之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与13之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与10之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与8之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与6之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与5之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在3与4之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在5与15之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在5与10之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在8与15之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在8与12之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在10与15之间。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在10与12之间。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约2。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约3。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约4。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约5。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约6。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约7。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约8。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约9。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约10、约11。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约12。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约13。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约14。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度为约15。在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之缀合程度在4与7之间。在一些此类实施方案中，载体蛋白为CRM₁₉₇。在其他此类实施方案中，载体蛋白为SCP。

本发明之糖缀合物还可由糖与载体蛋白之比率(重量/重量)表征。在一些实施方案中，糖缀合物中糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.5与3.0之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.5与2.0之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.5与1.5之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.8与1.2之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.5与1.0之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在1.0与1.5之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在1.0与2.0之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.8与1.2之间。在一个优选实施方案中，缀合物中糖与载体蛋白之比率在0.9与1.1之间。

在一个实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约0.5。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约0.6。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约0.7。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约0.8。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约0.9。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.0。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.1。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.2。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.3。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.4。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.5。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.6。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.7。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.8。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约1.9。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约2.0。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约2.1。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约2.2。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约2.5。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约2.8。在其他实施方案中，糖与载体蛋白之比率(w/w)为约3.0。在一些此类实施方案中，载体蛋白为CRM₁₉₇。在其他此类实施方案中，载体蛋白为SCP。

本发明之糖缀合物还可通过载体蛋白与糖之间的共价连接之数目表征，其随糖之重复单元而变化。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每4个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。在另一个实施方案中，载体蛋白与糖之间的共价连接在糖之每10个糖重复单元中出现至少一次。在另一个实施方案中，载体蛋白与糖之间的共价连接在糖之每15个糖重复单元中出现至少一次。在另一个实施方案中，载体蛋白与糖之间的共价连接在糖之每25个糖重复单元中出现至少一次。在另一个实施方案中，载体蛋白与糖之间的共价连接在糖之每50个糖重复单元中出现至少一次。在又另一个实施方案中，载体蛋白与糖之间的共价连接在糖之每100个糖重复单元中出现至少一次。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每5至10个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每2至7个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每6至11个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每9至14个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每10至20个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在其他实施方案中，本发明之糖缀合物针对糖之每4至25个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

在常见实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在其他实施方案中，载体蛋白为SCP。

在一些实施方案中，载体蛋白为CRM₁₉₇，且CRM₁₉₇与糖之间的共价连接在糖之每4、10、15或25个糖重复单元中出现至少一次。在其他实施方案中，载体蛋白为SCP，且SCP与糖之间的共价连接在糖之每4、10、15或25个糖重复单元中出现至少一次。

本发明之糖缀合物及免疫原性组合物可含有并未与载体蛋白共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中之游离糖。游离糖可与糖缀合物非共价缔合(即，与糖缀合物非共价键结、吸附至糖缀合物、或者包覆于糖缀合物中或由糖缀合物包覆)。

在一个优选实施方案中，与该糖之总量相比，糖缀合物包含少于约50％之游离糖。在一个优选实施方案中，与该糖之总量相比，糖缀合物包含少于约40％之游离糖。在另一个优选实施方案中，与该糖之总量相比，糖缀合物包含少于约25％之游离糖。在一甚至更优选实施方案中，与该糖之总量相比，糖缀合物包含少于约20％之游离糖。在另一个优选实施方案中，与该糖之总量相比，糖缀合物包含少于约15％之游离糖。

糖缀合物还可由其分子尺寸分布(K_d)表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于测定缀合物之相对分子尺寸分布。在重力馈送柱(gravity fed column)中使用大小排阻层析(SEC)以得到缀合物之分子尺寸分布概况。自介质之孔中排阻之大分子比小分子洗脱得更快。使用级分收集器来收集柱洗脱液。通过糖分析级分进行比色测试。为了测定K_d，将柱进行校准，以确立分子被完全排阻之级分(V₀),(K_d＝0)及表示最大保留之级分(V_i),(K_d＝1)。达到指定样品属性之级分(V_e)通过表达式K_d＝(V_e-V₀)/(V_i-V₀)与K_d相关。

在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，至少30％的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，至少40％的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，至少60％的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，50％与80％之间的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。在一个优选实施方案中，在CL-4B柱中，65％与80％之间的本发明之糖缀合物具有小于或等于0.3之K_d。

1.3使用点击化学制备的本发明之荚膜糖糖缀合物

本发明之糖缀合物系使用点击化学制备。本发明还涉及制备如本文所公开之糖缀合物的方法。

根据本发明，点击化学包含三个步骤：(a)使经分离荚膜糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在非质子性溶剂中反应以产生经活化叠氮基糖(糖活化)，(b)使载体蛋白与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应，其中NHS部分与氨基反应以形成酰胺键，从而获得经炔烃官能化之载体蛋白(载体蛋白活化)，(c)通过Cu⁺¹介导之叠氮化物-炔烃环加成反应使步骤(a)之经活化叠氮基糖与步骤(b)之经活化炔烃-载体蛋白发生反应以形成糖缀合物。

在步骤(a)之后，糖被称为经活化的，且在本文中被称作“经活化糖”或“经活化叠氮基糖”。

在步骤(b)之后，载体被称为经活化的，且被称作“经活化载体”。

如上文所提及，糖在活化(a)前，将尺寸设定为目标分子量(MW)范围。因此，在一个实施方案中，经分离糖在用碳酸衍生物及叠氮基接头活化之前经尺寸设定。在一个实施方案中，经分离糖经尺寸设定为上文所定义之目标分子量(MW)范围中之任一者。

在一个实施方案中，该碳酸衍生物系选自由以下组成的组：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)及N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯。

在一个实施方案中，该碳酸衍生物为1,1'-羰基二咪唑(CDI)。在另一个实施方案中，该碳酸衍生物为1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。在另一个实施方案中，该碳酸衍生物为二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)。在又另一个实施方案中，该碳酸衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯。

在一个实施方案中，该碳酸衍生物为1,1'-羰基二咪唑(CDI)或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。优选地，该碳酸衍生物为1,1'-羰基二咪唑(CDI)。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，

H₂N-X-N₃ (I)

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为CH₂(CH₂)_n，且n系选自1至10。在一个实施方案中，n系选自1至5。在一个实施方案中，n系选自1至4。在一个实施方案中，n系选自1至3。在一个实施方案中，n系选自1至2。在一个特定实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在又另一个实施方案中，n为3。在又另一个实施方案中，n为4。在又另一个实施方案中，n为5。在又另一个实施方案中，n为6。在又另一个实施方案中，n为7。在又另一个实施方案中，n为8。在又另一个实施方案中，n为9。在又另一个实施方案中，n为10。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4。在一个实施方案中，m系选自1至3。在一个实施方案中，m系选自1至2。在一个特定实施方案中，m为1。在另一个实施方案中，m为2。在又另一个实施方案中，m为3。在又另一个实施方案中，m为4。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为NHCO(CH₂)_n，且n系选自1至10。在一个实施方案中，n系选自1至5。在一个实施方案中，n系选自1至4。在一个实施方案中，n系选自1至3。在一个实施方案中，n系选自1至2。在一个特定实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在又另一个实施方案中，n为3。在又另一个实施方案中，n为4。在又另一个实施方案中，n为5。在又另一个实施方案中，n为6。在又另一个实施方案中，n为7。在又另一个实施方案中，n为8。在又另一个实施方案中，n为9。在又另一个实施方案中，n为10。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4。在一个实施方案中，m系选自1至3。在一个实施方案中，m系选自1至2。在一个特定实施方案中，m为1。在另一个实施方案中，m为2。在又另一个实施方案中，m为3。在又另一个实施方案中，m为4。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为OCH₂(CH₂)_n，且n系选自1至10。在一个实施方案中，n系选自1至5。在一个实施方案中，n系选自1至4。在一个实施方案中，n系选自1至3。在一个实施方案中，n系选自1至2。在一个特定实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在又另一个实施方案中，n为3。在又另一个实施方案中，n为4。在又另一个实施方案中，n为5。在又另一个实施方案中，n为6。在又另一个实施方案中，n为7。在又另一个实施方案中，n为8。在又另一个实施方案中，n为9。在又另一个实施方案中，n为10。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(I)化合物，其中X为O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4。在一个实施方案中，m系选自1至3。在一个实施方案中，m系选自1至2。在一个特定实施方案中，m为1。在另一个实施方案中，m为2。在又另一个实施方案中，m为3。在又另一个实施方案中，m为4。

在一个实施方案中，该叠氮基接头为式(II)化合物，

在一个优选实施方案中，该叠氮基接头为3-叠氮基-丙胺。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔烃之试剂。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔烃之试剂。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(III)化合物，

其中X系选自由以下组成的组：CH₂O(CH₂)_nCH₂C＝O及CH₂O(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₂C＝O，其中n系选自0至10且m系选自0至4。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(III)化合物，其中X为CH₂O(CH₂)_nCH₂C＝O，其中n系选自0至10。在一个实施方案中，n系选自0至5。在一个实施方案中，n系选自0至4。在一个实施方案中，n系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至2。在一个特定实施方案中，n为0。在一个特定实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在又另一个实施方案中，n为3。在又另一个实施方案中，n为4。在又另一个实施方案中，n为5。在又另一个实施方案中，n为6。在又另一个实施方案中，n为7。在又另一个实施方案中，n为8。在又另一个实施方案中，n为9。在又另一个实施方案中，n为10。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(III)化合物，其中X为CH₂O(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₂C＝O，其中n系选自0至10且m系选自0至4。在一个实施方案中，n系选自0至5。在一个实施方案中，n系选自0至4。在一个实施方案中，n系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至2。在一个特定实施方案中，n为0。在一个特定实施方案中，n为1。在另一个实施方案中，n为2。在又另一个实施方案中，n为3。在又另一个实施方案中，n为4。在又另一个实施方案中，n为5。在又另一个实施方案中，n为6。在又另一个实施方案中，n为7。在又另一个实施方案中，n为8。在又另一个实施方案中，n为9。在又另一个实施方案中，n为10。在一个实施方案中，m系选自0至3。在一个实施方案中，m系选自0至2。在一个特定实施方案中，m为1。在一个特定实施方案中，m为1。在另一个实施方案中，m为2。在又另一个实施方案中，m为3。在又另一个实施方案中，m为4。

在一个实施方案中，n系选自0至5且m系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至5且m系选自0至2。

在一个实施方案中，n系选自0至4且m系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至4且m系选自0至2。

在一个实施方案中，n系选自0至3且m系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至3且m系选自0至2。

在一个实施方案中，n系选自0至2且m系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至2且m系选自0至2。

在一个实施方案中，n系选自0至1且m系选自0至3。在一个实施方案中，n系选自0至1且m系选自0至2。

在一个实施方案中，n为0且m为0。在一个实施方案中，n为1且m为0。在一个实施方案中，n为2且m为0。在一个实施方案中，n为3且m为0。在一个实施方案中，n为4且m为0。在一个实施方案中，n为5且m为0。在一个实施方案中，n为6且m为0。在一个实施方案中，n为7且m为0。在一个实施方案中，n为8且m为0。在一个实施方案中，n为9且m为0。在一个实施方案中，n为10且m为0。

在一个实施方案中，n为0且m为1。在一个实施方案中，n为1且m为1。在一个实施方案中，n为2且m为1。在一个实施方案中，n为3且m为1。在一个实施方案中，n为4且m为1。在一个实施方案中，n为5且m为1。在一个实施方案中，n为6且m为1。在一个实施方案中，n为7且m为1。在一个实施方案中，n为8且m为1。在一个实施方案中，n为9且m为1。在一个实施方案中，n为10且m为1。

在一个实施方案中，n为0且m为2。在一个实施方案中，n为1且m为2。在一个实施方案中，n为2且m为2。在一个实施方案中，n为3且m为2。在一个实施方案中，n为4且m为2。在一个实施方案中，n为5且m为2。在一个实施方案中，n为6且m为2。在一个实施方案中，n为7且m为2。在一个实施方案中，n为8且m为2。在一个实施方案中，n为9且m为2。在一个实施方案中，n为10且m为2。

在一个实施方案中，n为0且m为3。在一个实施方案中，n为1且m为3。在一个实施方案中，n为2且m为3。在一个实施方案中，n为3且m为3。在一个实施方案中，n为4且m为3。在一个实施方案中，n为5且m为3。在一个实施方案中，n为6且m为3。在一个实施方案中，n为7且m为3。在一个实施方案中，n为8且m为3。在一个实施方案中，n为9且m为3。在一个实施方案中，n为10且m为3。

在一个实施方案中，n为0且m为4。在一个实施方案中，n为1且m为4。在一个实施方案中，n为2且m为4。在一个实施方案中，n为3且m为4。在一个实施方案中，n为4且m为4。在一个实施方案中，n为5且m为4。在一个实施方案中，n为6且m为4。在一个实施方案中，n为7且m为4。在一个实施方案中，n为8且m为4。在一个实施方案中，n为9且m为4。在一个实施方案中，n为10且m为4。

在一个实施方案中，该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(IV)化合物：

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与碳酸衍生物反应，随后使经碳酸衍生物活化之糖与叠氮基接头在非质子性溶剂中反应以产生经活化叠氮基糖。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.5至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.8至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在1至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在2至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在3至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在5至10摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.5至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.8至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在1至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在2至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在3至5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.5至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.8至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在1至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在2至3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.5至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.8至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在1至2摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.5至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.8至1摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.4至0.5摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与一量之碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至0.4摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至0.4摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至0.4摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至0.4摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.3至0.4摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.01至0.3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.05至0.3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.1至0.3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量在0.2至0.3摩尔当量之间的量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.01摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.05摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.08摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.1摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.2摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.3摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.4摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约0.5摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约1摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约2摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约3摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约4摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约5摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约8摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，步骤a)包含使糖与相对于反应混合物中所存在之糖的量约10摩尔当量之量的碳酸衍生物反应。

在一个实施方案中，在步骤a)处，经分离糖与碳酸衍生物在非质子性溶剂中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)组成之溶液中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基甲酰胺(DMF)组成之溶液中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由二甲亚砜(DMSO)组成之溶液中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由二甲基乙酰胺组成之溶液中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由N-甲基-2-吡咯烷酮组成之溶液中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由六甲基磷酰胺(HMPA)组成之溶液中反应。

在一个优选实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在基本上由二甲亚砜(DMSO)组成之溶液中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在二甲基甲酰胺(DMF)中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在二甲亚砜(DMSO)中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在二甲基乙酰胺中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在N-甲基-2-吡咯烷酮中反应。在一个实施方案中，经分离糖与碳酸衍生物在六甲基磷酰胺(HMPA)中反应。

在一个优选实施方案中，经分离糖与CDI在二甲亚砜(DMSO)中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在无水DMSO中反应。

已出人意料地发现，使经分离糖与CDI在水分含量约0.1％至1％(v/v)之环境中反应能够避免副反应。因此，在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.8％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.5％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.4％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.3％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.2％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至1％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.8％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.5％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.4％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.3％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.8％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.5％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.4％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.1％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.2％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.3％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.4％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.5％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.6％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.7％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.8％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.9％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.8％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.5％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.4％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.3％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.1％至0.2％(v/v)水之DMSO中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至1％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.8％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.5％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.4％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.2％至0.3％(v/v)水之DMSO中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.8％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.5％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含0.3％至0.4％(v/v)水之DMSO中反应。

在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.1％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.2％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.3％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.4％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.5％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.6％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.7％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.8％(v/v)水之DMSO中反应。在一个实施方案中，经分离糖与CDI在包含约0.9％(v/v)水之DMSO中反应。

在一个实施方案中，在添加叠氮基接头之前通过添加水来淬灭游离碳酸衍生物。水可使游离CDI失活。因此，在一个实施方案中，在碳酸衍生物活化之后添加水。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1％至约10％(v/v)之间。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.2％至约8％(v/v)之间。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.5％至约5％(v/v)之间。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.5％至约3％(v/v)之间。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.5％至约2.5％(v/v)之间。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.2％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.4％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约1.5％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约2％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约2.5％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约3％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约5％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约7％(v/v)。在一个实施方案中，添加水以使混合物中之总水含量达到约10％(v/v)。

一旦糖已与碳酸衍生物反应且在最终用水淬灭碳酸衍生物之后，经碳酸衍生物活化之糖便与叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量(RU之摩尔当量)在0.01至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至2摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至0.5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.01至0.1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至2摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至0.5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至0.1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至2摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至0.5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至2摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至1摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至2摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在2至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在2至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在2至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在2至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在2至3摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在3至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在3至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在3至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在3至4摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在4至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在4至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在4至5摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在5至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在5至8摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量在8至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.01摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.05摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.1摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.5摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约1摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约2摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约3摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约4摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约5摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约8摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在一个实施方案中，步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之多糖重复单元的量约10摩尔当量之量的叠氮基接头反应。

在上述实施方案中，该碳酸衍生物优选为CDI。在另一个实施方案中，该碳酸衍生物为CDT。

在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在0.5％至50％之间。叠氮基糖之活化程度定义为与叠氮基接头连接之重复单元的百分比。

在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在1％至30％之间。在另一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在2％至25％之间。在另一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在3％至20％之间。

在另一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在3％至15％之间。在另一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在4％至15％之间。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在1％至6％之间。

在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在3％至6％之间。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度在10％至15％之间。

在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约1％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约2％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约3％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约4％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约5％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约6％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约7％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约8％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约9％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约10％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约11％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约12％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约13％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约14％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约15％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约16％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约17％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约18％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约19％。在一个实施方案中，步骤a)之后经活化糖之活化程度为约20％。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2.5至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸3至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸5至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸7.5至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2.5至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸3至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸5至7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2.5至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸3至5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2.5至3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸2至2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至2摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至2摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至2摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1.5至2摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至1.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至1.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸1至1.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至1摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.5至1摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至0.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约7.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约3摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约2.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约2摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约1.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约1摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约0.5摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸约0.1摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

在一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体之活化程度在1至50之间。经活化载体之活化程度定义为载体蛋白中变得与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂连接的赖氨酸残基之数目。

在一个实施方案中，载体蛋白为CRM₁₉₇，其含有39个赖氨酸残基。在该实施方案中，步骤b)之后经活化载体之活化程度可在1至30之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度在5至20之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度在9至18之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度在8至11之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度在15至20之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约5。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约6。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约7。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约8。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约9。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约10。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约11。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约12。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约13。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约14。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约15。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约16。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约17。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约18。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约19。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约20。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约21。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约22。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约23。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约24。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(CRM₁₉₇)之活化程度为约25。

在一个实施方案中，载体蛋白为SCP或其片段。在该实施方案中，步骤b)之后经活化载体之活化程度可在1至50之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在5至50之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在7至45之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在5至15之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在20至30之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在30至50之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在30至40之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度在10至40之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约5。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约7。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约10。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约13。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约15。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约20。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约26。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约30。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约35。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约37。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约40。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约45。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(SCP)之活化程度为约50。

在一个实施方案中，载体蛋白为TT或其片段。在该实施方案中，步骤b)之后经活化载体之活化程度可在1至30之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度在5至25之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度在7至25之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度在10至20之间。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约5。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约7。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约10。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约12。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约15。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约20。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约25。在另一个实施方案中，步骤b)之后经活化载体(TT)之活化程度为约30。

在一个实施方案中，缀合反应c)系在水性缓冲液中进行。在一个实施方案中，缀合反应c)系在水性缓冲液中于作为催化剂之铜(I)存在下进行。在一个实施方案中，缀合反应c)系在水性缓冲液中在氧化剂及作为催化剂之铜(I)存在下进行。在一个优选实施方案中，缀合反应c)系在水性缓冲液中于作为催化剂之铜(I)及作为氧化剂之抗坏血酸盐存在下进行。在一个实施方案中，可进一步添加THPTA(三(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍以防止蛋白质发生副反应。因此，在一个优选实施方案中，缀合反应c)系在水性缓冲液中在作为催化剂之铜(I)及作为氧化剂之抗坏血酸盐存在下进行，其中反应混合物进一步包含THPTA(三(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍。

在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)在0.1与3之间。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)在0.5与2之间。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)在0.6与1.5之间。在一个优选实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)在0.8与1之间。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约0.5。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约0.6。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约0.7。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约0.8。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约0.9。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.1。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.2。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.3。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.4。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.5。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.6。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.7。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.8。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约1.9。在一个实施方案中，步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)为约2。

在点击缀合反应之后，缀合物中可能保留有未反应叠氮基，可使用适合的叠氮基封端剂对此等未反应叠氮基进行封端。因此，在一个实施方案中，在步骤c)之后，使用适合的叠氮基封端剂对缀合物中之未反应叠氮基进行封端。在一个实施方案中，此叠氮基封端剂为带有炔烃基之试剂。在一个实施方案中，此叠氮基封端剂为带有末端炔烃之试剂。在一个实施方案中，此叠氮基封端剂为带有环炔烃之试剂。

在一个实施方案中，该叠氮基封端剂为式(V)化合物，

≡-X-OH (V)

其中X为(CH₂)_n，其中n系选自1至15。

在一个实施方案中，此叠氮基封端剂为炔丙醇。

因此，在一个实施方案中，在步骤c)之后，该方法进一步包含用叠氮基封端剂对缀合物中保留之未反应叠氮基进行封端的步骤。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至20摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至15摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至10摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至5摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至2摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至1摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至2摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.75至1.5摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约1摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约1.5摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.5摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约2摩尔当量之量的封端剂进行。

在点击缀合反应之后，未反应之炔烃基可仍存在于缀合物中，可使用适合的炔烃基封端剂对此等未反应之炔烃基进行封端。在一个实施方案中，此炔烃基封端剂为带有叠氮基之试剂。

在一个实施方案中，该炔烃基封端剂为式(VI)化合物，

N₃-X-OH (VI)

其中X为(CH₂)_n，其中n系选自1至15。

在一个实施方案中，此炔烃基封端剂为3-叠氮基-1-丙醇。

因此，在一个实施方案中，在步骤c)之后，该方法进一步包含用炔烃基封端剂对缀合物中保留之未反应炔烃基进行封端的步骤。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.05至20摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.1至15摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至10摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至5摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至2摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在0.5至1摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至5摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1至2摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量在1.5至2.5摩尔当量之间的量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约0.5摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约1摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约1.5摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约2摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约2.5摩尔当量之量的封端剂进行。

在一个实施方案中，未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之多糖重复单元的量约5摩尔当量之量的封端剂进行。

在与载体蛋白缀合之后，可通过技术人员已知之多种技术来纯化(就糖-蛋白缀合物之量而言富集)糖缀合物。此等技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水性相互作用层析)及深层过滤。因此，在一个实施方案中，用于产生本发明之糖缀合物的方法包含在产生糖缀合物之后对其进行纯化的步骤。

在一方面中，本发明提供一种根据本文所公开之方法中之任一者产生的糖缀合物。

在一方面中，本发明提供一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VII)：

且其中X'系选自由以下组成的组：CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O、CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。其中方括号中之结构表示荚膜糖之重复单元。

在一个实施方案中，荚膜糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

式(VII)为本发明之糖缀合物之示意性表示。不应理解为糖之每一重复单元(方括号中之结构)处均存在连接。实情为，大部分糖重复单元保持未经修饰，且少数糖重复单元处存在载体蛋白与糖之共价连接。另外，个别载体蛋白(CP)分子可连接至多于一个糖分子，且个体糖分子可连接至多于一个个别载体蛋白(CP)分子。方括号中之结构表示荚膜糖之重复单元。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'为2，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”为1。在一个实施方案中，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

因此，在一个优选实施方案中，本发明提供一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VIII)，

其中方括号中之结构表示荚膜糖之重复单元。

式(VIII)为本发明之优选糖缀合物之示意性表示。不应理解为糖之每一重复单元(方括号中之结构)处均存在连接。实情为，大部分糖重复单元保持未经修饰，且少数糖重复单元处存在载体蛋白与糖之共价连接。另外，个别载体蛋白(CP)分子可连接至多于一个糖分子，且个体糖分子可连接至多于一个个别载体蛋白(CP)分子。方括号中之结构为糖之重复单元的示意性表示。

在一个实施方案中，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5且n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5且n”系选自0至5。在一个实施方案中，n'系选自1至3且n”系选自0至3。在一个实施方案中，n'系选自1至2且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为0。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1且n”为6。在另一个实施方案中，n'为2且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为3且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为4且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为5且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为6且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X’是CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

在一个实施方案中，n'系选自1至5，m'系选自0至4，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5，m'系选自0至4，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，n'系选自1至3，m'系选自0至2，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，n'系选自1至2，m'系选自0至2，且n”系选自0至1。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为0。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为0。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为0。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为0。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为0。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为1。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为1。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为1。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为1。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为1。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为2。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为2。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为2。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为2。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为2。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为3。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为3。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为3。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为3。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为3。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为4。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为4。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为4。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为4。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为4。

在一个特定实施方案中，n'为1，m'为0，且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为1，且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为2，且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1，m'为3，且n”为5。

在另一个实施方案中，n'为2，m'为0，且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2，m'为1，且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2，m'为2，且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2，m'为3，且n”为5。

在又另一个实施方案中，n'为3，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3，m'为3，且n”为5。

在又另一个实施方案中，n'为4，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4，m'为3，且n”为5。

在又另一个实施方案中，n'为5，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5，m'为3，且n”为5。

优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为0。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为6。在另一个实施方案中，m为2，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

在一个实施方案中，m系选自1至3，m'系选自0至4，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至2，m'系选自0至4，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，m系选自1至2，m'系选自0至2，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，m系选自1至2，m'系选自0至2，且n”系选自0至1。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为0。在另一个实施方案中，m为1，m'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，m为1，m'为2，且n”为0。在另一个实施方案中，m为1，m'为3，且n”为0。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为0。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为0。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为0。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，m'为1，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，m'为2，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，m'为3，且n”为1。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为1。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为1。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为1。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，m'为1，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，m'为2，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，m'为3，且n”为2。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为2。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为2。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为2。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，m'为1，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，m'为2，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，m'为3，且n”为3。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为3。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为3。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为3。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，m'为1，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，m'为2，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，m'为3，且n”为4。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为4。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为4。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为4。

在一个特定实施方案中，m为1，m'为0，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，m'为1，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，m'为2，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，m'为3，且n”为5。

在另一个实施方案中，m为2，m'为0，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，m'为1，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，m'为2，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，m'为3，且n”为5。

在又另一个实施方案中，m为3，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，m'为3，且n”为5。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为5。

优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为NHCO(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，n'系选自1至3，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，n'系选自1至2，且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为0。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为6。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为NHCO(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X'为CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为0。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为6。在另一个实施方案中，m为2，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

在又另一个实施方案中，m为4，m'为0，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为1，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，m'为3，且n”为5。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为OCH₂(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。

在一个实施方案中，n'系选自1至5，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，n'系选自1至5，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，n'系选自1至3，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，n'系选自1至2，且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为0。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为0。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为0。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为1。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为1。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为1。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为2。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为2。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为2。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为3。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为3。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为3。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为4。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为4。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为4。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为5。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为5。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为5。在一个特定实施方案中，n'为1，且n”为6。在另一个实施方案中，n'为2，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为3，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为4，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为5，且n”为6。在又另一个实施方案中，n'为6，且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为OCH₂(CH₂)_n'，其中n'系选自1至10，且其中X'为CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10。

在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至10。在一个实施方案中，m系选自1至3，且n”系选自0至5。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至3。在一个实施方案中，m系选自1至2，且n”系选自0至2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为0。在另一个实施方案中，m为2，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为0。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为0。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为1。在另一个实施方案中，m为2，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为1。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为1。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为2。在另一个实施方案中，m为2，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为2。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为2。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为3。在另一个实施方案中，m为2，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为3。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为3。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为4。在另一个实施方案中，m为2，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为4。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为4。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为5。在另一个实施方案中，m为2，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为5。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为5。在一个特定实施方案中，m为1，且n”为6。在另一个实施方案中，m为2，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为3，且n”为6。在又另一个实施方案中，m为4，且n”为6。优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

在一个实施方案中，本发明提供一种糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之糖且具有通式(VII)，其中X为O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂，其中m系选自1至4，且其中X'为CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”系选自0至10且m'系选自0至4。

优选地，糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

优选地，本发明之糖缀合物之糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

1.5本发明之糖缀合物之载体蛋白

糖缀合物之组分为与糖缀合之载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”可在本文中互换使用。载体蛋白应适于标准缀合程序。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白系在由以下组成的组中选择：DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT之片段C、CRM₁₉₇(白喉毒素的无毒但抗原性相同的变体)、其他DT突变体(诸如CRM₁₇₆、CRM₂₂₈、CRM₄₅(Uchida等人(1973)J.Biol.Chem.218:3838-3844)、CRM₉、CRM₁₀₂、CRM₁₀₃或CRM₁₀₇；及Nicholls及Youle在Genetically EngineeredToxins,编:Frankel,Maecel Dekker Inc.(1992)中描述之其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser，及/或Ala 158缺失或突变为Gly，及美国专利第4,709,017号及第4,950,740号中所公开之其他突变；至少一或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突变，及美国专利第5,917,017号及第6,455,673号中所公开之其他突变；或美国专利第5,843,711号中所公开之片段，肺炎链球菌性肺炎链球菌溶血素(ply)(Kuo等人(1995)Infectlmmun 63:2706-2713)包括以某种方式解毒之ply，例如dPLY-GMBS(WO 2004/081515、WO2006/032499)或dPLY-formol、PhtX(包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列公开于WO 00/37105及WO 00/39299中)及Pht蛋白之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E(WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)、OMPC(脑膜炎球菌性外膜蛋白)(其通常提取自脑膜炎奈瑟氏菌血清群B(EP0372501))、PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如EP0594610 B)或其免疫功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、人工蛋白质，包含来自各种病原体衍生抗原之多种人类CD4+T细胞表位(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824)，诸如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect lmmun 72:4884-4887)、肺炎链球菌性表面蛋白PspA(WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、艰难梭菌之毒素A或B(WO00/61761)、转铁蛋白结合蛋白、肺炎链球菌性黏附蛋白(PsaA)、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(尤其其无毒突变体(诸如具有谷氨酸553处之取代的外毒素A(Douglas等人(1987)J.Bacteriol.169(11):4967-4971))。其他蛋白，诸如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素之纯化蛋白衍生物(PPD)还可用作载体蛋白。其他适合的载体蛋白包括失活的细菌毒素，诸如霍乱类毒素(例如如WO 2004/083251中所描述)；大肠杆菌LT；大肠杆菌ST；及来自铜绿假单胞菌之外毒素A。另一适合的载体蛋白为来自链球菌(SCP)之C5a肽酶。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为TT、DT、DT突变体(诸如CRM₁₉₇)或来自链球菌之C5a肽酶(SCP)。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为TT(破伤风类毒素)。

在另一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如EP0594610 B)。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为CRM₁₉₇或来自链球菌之C5a肽酶(SCP)。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为CRM₁₉₇。CRM₁₉₇蛋白为一种无毒形式之白喉毒素，但在免疫学上与白喉毒素无法区分。CRM₁₉₇系由受无毒噬菌体β197^tox-感染之白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生，该无毒噬菌体由产毒棒状杆菌噬菌体β之亚硝基胍诱变产生(Uchida等人(1971)Nature New Biology 233:8-11)。CRM₁₉₇蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但因结构基因中之单个碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)而与白喉毒素不同。此单个碱基变化引起成熟蛋白中之氨基酸取代(谷氨酸取代甘氨酸)，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM₁₉₇蛋白为糖之安全且有效的T细胞依赖性载体。关于CRM₁₉₇及其产生之其他细节可例如见于美国专利第5,614,382号中。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为CRM₁₉₇之A链(参见CN103495161)。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为经由通过基因重组之大肠杆菌进行表达而获得的CRM₁₉₇之A链(参见CN103495161)。

在其他优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为SCP(链球菌C5a肽酶)。β溶血性链球菌之两种重要菌种酿脓链球菌(A组链球菌，GAS)及无乳链球菌(B组链球菌，GBS)引起多种严重人类感染，自轻症咽炎及脓疱病至严重侵袭性疾病(诸如坏死性筋膜炎(GAS)及新生儿败血症(GBS))都有，已发展出击败这种免疫反应的方法。β溶血性链球菌(包括GAS及GBS)之所有人类分离株均产生特异性失活C5a的高度保守的细胞壁蛋白SCP(链球菌C5a肽酶)。来自GAS及GBS之scp基因编码含有1,134至1,181个氨基酸之多肽(Brown等人,PNAS,2005,第102卷,第51期,第18391-18396页)。前31个残基为输出信号前序列且在穿过细胞质膜时被移除。随后68个残基充当原序列且必须经移除以产生活性SCP。随后10个残基可经移除而不损失蛋白酶活性。在另一端，以Lys-1034开始为四个连续的17-残基基序，接着为细胞分选及细胞壁附着信号。此组合信号由含有LPTTND序列之20个残基亲水性序列、17个残基疏水性序列及短碱性羧基端构成。

SCP可分成结构域(参见Brown等人,PNAS,2005,第102卷,第51期第18391-18396页之图1B)。此等结构域为前结构域/后结构域(其包含输出信号前序列(通常为前31个残基)及原序列(通常为随后68个残基))、蛋白酶结构域(其分解为两部分(蛋白酶部分1，通常为残基89至333/334；及蛋白酶结构域部分2，且通常为残基467/468至583/584)、蛋白酶相关结构域(PA域)(通常为残基333/334至467/468)、三个纤连蛋白III型(Fn)结构域(Fn1，通常为残基583/584至712/713；Fn2，通常为残基712/713至928/929/930；通常Fn3，残基929/930至1029/1030/1031)及细胞壁锚定结构域(通常为残基1029/1030/1031至C端)。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为来自GBS之SCP(SCPB)。SCPB之实例提供于WO97/26008之SEQ ID.NO:3处。还参见WO00/34487之SEQ ID NO:3。

在另一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为来自GAS之SCP(SCPA)。SCPA之实例可见于WO97/26008之SEQ ID.No.1及SEQ ID.No.2。还参见WO00/34487之SEQ ID NO:1、2及23。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP。

在其他优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的来自GBS之SCP(SCPB)。

在另一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的来自GAS之SCP(SCPA)。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为SCP之片段。在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为SCPA之片段。优选地，本发明之糖缀合物之载体蛋白为SCPB之片段。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)以及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域中之两者，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段。在一个实施方案中，该无酶促活性的SCP之片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA之片段。在一个实施方案中，该无酶促活性的SCPA之片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

在一个优选实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB之片段。优选地，该无酶促活性的SCPB之片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域，但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

在一个实施方案中，SCP之酶促活性系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸而失活。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。数目指示根据WO00/34487之SEQ ID NO:1之编号的肽酶中之氨基酸残基位置。

因此，在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该不活化系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现。优选地，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该置换为D130A。在另一个实施方案中，该置换为H193A。在另一个实施方案中，该置换为N295A。在又另一个实施方案中，该置换为S512A。

在一个实施方案中，SCP之酶促活性系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸而失活。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

因此，在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现。优选地，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及H193A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为D130A及N295A。优选地，该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少两个氨基酸置换为N295A及S512A。

在一个实施方案中，SCP之酶促活性系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸而失活。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

因此，在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少三个氨基酸来实现。优选地，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及N295A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、H193A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为D130A、N295A及S512A。在一个实施方案中，该至少三个氨基酸置换为H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，SCP之酶促活性系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸而失活。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

因此，在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPA之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少一个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为无酶促活性的SCPB之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少四个氨基酸来实现。优选地，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分1中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换系在蛋白酶结构域之部分2中。在一个实施方案中，该至少四个氨基酸置换为D130A、H193A、N295A及S512A。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由SEQ ID NO:41组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由SEQ ID NO:42组成的无酶促活性的SCP之片段。

SEQ ID NO：41：

SEQ ID NO：41之长度为950个氨基酸。

SEQ ID NO：42：

SEQ ID NO：42之长度为949个氨基酸。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO：41具有至少90％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO：41具有至少95％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO：41具有至少99％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO：41具有至少99.5％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:41具有至少99.8％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:41具有至少99.85％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少90％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少95％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少99％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少99.5％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少99.8％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

在一个特定实施方案中，本发明之糖缀合物之载体蛋白为由与SEQ ID NO:42具有至少99.85％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

2免疫原性组合物

2.1本发明之糖缀合物之组合

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物(如上文部分1处所公开)。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含1至25种不同糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含1至25种来自不同肺炎链球菌血清型之糖缀合物(1至25种肺炎链球菌缀合物)。在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含来自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种不同肺炎链球菌血清型之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含来自16或20种不同肺炎链球菌血清型之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为14、15、16、17、18或19价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为16价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为19价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为20价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，免疫原性组合物为21、22、23、24或25价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为25价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为11价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为13价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为15价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为20价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且进一步包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为25价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含选自由以下组成的组的本发明之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含选自由以下组成的组的本发明之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为21价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含二十一种选自由以下组成的组之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为22价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含至少一种选自由以下组成的组之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含二十二种选自由以下组成的组之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含二十三种选自由以下组成的组之糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为24价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、15A、17F、20、23A、23B、24F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为10价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型2、9N、15A、17F、19A、19F、20、23A、23B、24F及35B之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为12价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为23价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含本发明之糖缀合物且包含来自肺炎链球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物为25价肺炎链球菌缀合物组合物。

在一个优选实施方案中，糖各自个别地与蛋白载体之不同分子缀合(蛋白载体之各分子仅具有与其缀合之一种类型的糖)。在该实施方案中，荚膜糖被称为个别地与载体蛋白缀合。优选地，上述免疫原性组合物之所有糖缀合物均个别地与载体蛋白缀合。

在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，本发明之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，本发明之糖缀合物与SCP缀合。

在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型15B之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型10A之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型11A之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型8之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、5及7F之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，来自肺炎链球菌血清型6A及19A之糖缀合物与CRM₁₉₇缀合。

在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，上述免疫原性组合物中之任一者之糖缀合物均个别地与CRM₁₉₇缀合。

在上述免疫原性组合物中之任一者之一个实施方案中，本发明之糖缀合物与SCP缀合且其他糖缀合物均个别地与CRM₁₉₇缀合。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物中之任一者之来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖缀合物个别地与PD缀合。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物中之任一者之来自肺炎链球菌血清型18C之糖缀合物与TT缀合。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物中之任一者之来自肺炎链球菌血清型19F之糖缀合物与DT缀合。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物中之任一者之来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖缀合物个别地与PD缀合，来自肺炎链球菌血清型18C之糖缀合物与TT缀合，且来自肺炎链球菌血清型19F之糖缀合物与DT缀合。

在一个实施方案中，上述免疫原性组合物包含8至25种不同肺炎链球菌血清型。

本发明之组合物可包括少量游离载体。当给定载体蛋白以游离及缀合形式存在于本发明之组合物中时，未缀合形式优选总体上不超过组合物中之载体蛋白之总量的5％，且更优选以少于2重量％存在。

2.2本发明之免疫原性组合物之剂量

各剂量中之糖缀合物之量经选择为诱导免疫保护性反应而无典型疫苗接种者中之明显不良副作用之量。此种量将视采用何种特定免疫原及其呈递方式而变化。

免疫原性组合物中之特定糖缀合物之量可基于该缀合物之总糖(缀合糖及未缀合糖)来计算。举例而言，在100μg糖剂量中，具有20％游离糖之糖缀合物将具有约80μg之缀合糖及约20μg之未缀合糖。糖缀合物之量可视细菌及细菌血清型而变化。可通过糖醛酸分析来测定糖浓度。

免疫原性组合物中之不同糖组分之“免疫原性量”可不同，且各自可包含约0.5μg、约0.75μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg或约100μg之任何特定糖抗原。

一般而言，各剂量将包含0.1μg至100μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含0.1μg至100μg之糖。在一个优选实施方案中，各剂量将包含0.5μg至20μg。在一个优选实施方案中，各剂量将包含1.0μg至10μg。在一甚至更优选实施方案中，各剂量将包含2.0μg至5.0μg之血清型3多糖。考虑以上范围中之任一者内之任何全数整数作为本发明之一个实施方案。

在一个实施方案中，各剂量将包含约0.5μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约0.55μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约0.75μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.0μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.1μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.5μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.0μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.2μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.5μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约3.0μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约3.5μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约4.0μg糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约4.4μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约5.0μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约5.5μg之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约6.0μg之糖。

一般而言，各剂量将包含0.1μg至100μg之针对给定细菌或血清型之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含0.1μg至100μg之针对给定细菌或血清型之糖。在一个优选实施方案中，各剂量将包含0.5μg至20μg。在一个优选实施方案中，各剂量将包含1.0μg至10μg。在一甚至更优选实施方案中，各剂量将包含2.0μg至5.0μg之针对给定细菌或血清型之糖。考虑以上范围中之任一者内之任何全数整数作为本发明之一个实施方案。

在一个实施方案中，各剂量将包含约0.5μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约0.55μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约0.75μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.1μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约1.5μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.2μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约2.5μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约3.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约3.5μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约4.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约4.4μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约5.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约5.5μg之用于各特定糖缀合物之糖。在一个实施方案中，各剂量将包含约6.0μg之用于各特定糖缀合物之糖。

2.3载体量

一般而言，各剂量将包含10μg至150μg之载体蛋白，尤其15μg至100μg之载体蛋白，更尤其25μg至75μg之载体蛋白，且甚至更尤其40μg至60μg之载体蛋白。在一个实施方案中，该载体蛋白为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，该载体蛋白为SCP。

在一个实施方案中，各剂量将包含约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg之载体蛋白。

在一个实施方案中，各剂量将包含约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg之载体蛋白。

在一个实施方案中，各剂量将包含约30μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约31μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约32μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约33μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约34μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约45μg之载体蛋白。

在一个实施方案中，各剂量将包含约40μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约41μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约42μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约43μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约44μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约45μg之载体蛋白。

在一个实施方案中，各剂量将包含约48μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约49μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约50μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约51μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约52μg之载体蛋白。在一个实施方案中，各剂量将包含约53μg之载体蛋白。

在一个实施方案中，该载体蛋白为CRM₁₉₇。

在一个实施方案中，该载体蛋白为SCP。

2.4其他抗原

本发明之免疫原性组合物包含缀合之糖抗原(糖缀合物)。其还可进一步包含来自其他病原体，尤其来自细菌及/或病毒之抗原。优选的其他抗原系选自：白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、百日咳抗原(P)(其通常为非细胞型(Pa))、乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、甲型肝炎病毒(HAV)抗原、缀合之流感嗜血杆菌b型荚膜糖(Hib)、失活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含D-T-Pa。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。

百日咳抗原：百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。疫苗中之百日咳抗原为细胞型(全细胞，呈失活的百日咳博德特氏菌细胞形式)或非细胞型的。细胞型百日咳抗原之制备已有完备记载(例如其可通过使百日咳博德特氏菌之I期培养物热灭活获得)。然而，优选地，本发明使用非细胞型抗原。在使用非细胞型抗原之情况下，优选使用以下抗原中之一者、两者或(优选地)三者：(1)脱毒之百日咳毒素(百日咳类毒素或PT)；(2)丝状血凝素(FHA)；(3)百日咳杆菌黏附素(pertactin)(也称为69千道尔顿外膜蛋白)。FHA及百日咳杆菌黏附素在根据本发明使用之前可用甲醛处理。PT优选通过用甲醛及/或戊二醛处理来解毒。非细胞型百日咳抗原优选吸附至一或多种铝盐佐剂上。作为替代方案，其可以未吸附状态添加。在添加百日咳杆菌黏附素之情况下，其优选已吸附至氢氧化铝佐剂上。PT及FHA可吸附至氢氧化铝佐剂或磷酸铝上。最优选地，PT、FHA及百日咳杆菌黏附素皆吸附至氢氧化铝。

失活的脊髓灰质炎病毒疫苗：脊髓灰质炎病毒引起脊髓灰质炎。本发明之优选实施方案使用IPV，而非使用口服脊髓灰质炎病毒疫苗。在向患者施用之前，脊髓灰质炎病毒必须为失活的，且此可通过用甲醛处理来实现。脊髓灰质炎可由三种类型之脊髓灰质炎病毒中之一者引起。三种类型类似且引起相同症状，但其在抗原上不同且一种类型之感染不会避免其他类型之感染。因此，优选使用本发明中之三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney病毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1病毒株)及3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett病毒株)。病毒优选分别生长、纯化及灭活，且接着合并，得到供本发明使用之主体三价混合物。

白喉类毒素：白喉棒状杆菌引起白喉。可对白喉毒素进行处理(例如使用福尔马林或甲醛)以去除毒性，同时保留在注射之后诱导特异性抗毒素抗体之能力。此等白喉类毒素用于白喉疫苗中。优选的白喉类毒素为通过甲醛处理制备的那些。白喉类毒素可通过使白喉棒状杆菌在生长培养基中生长，随后甲醛处理、超滤及沉淀来获得。接着可通过包含无菌过滤及/或透析之方法处理类毒素化物质。白喉类毒素优选吸附至氢氧化铝佐剂上。

破伤风类毒素：破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起破伤风。可对破伤风毒素进行处理以得到保护性类毒素。类毒素用于破伤风疫苗中。优选破伤风类毒素为通过甲醛处理制备的那些。破伤风类毒素可通过使破伤风梭菌在生长培养基中生长，随后甲醛处理、超滤及沉淀来获得。接着可通过包含无菌过滤及/或透析之方法处理物质。

甲型肝炎病毒抗原：甲型肝炎病毒(HAV)为引起病毒性肝炎之已知因子中之一者。优选HAV组分系基于失活病毒，且失活可通过福尔马林处理来实现。

乙型肝炎病毒(HBV)为引起病毒性肝炎之已知因子中之一者。衣壳之主要组分为被称为HBV表面抗原或更常被称为HBsAg之蛋白质，其通常为具有约24kDa之分子量的226-氨基酸多肽。所有现有乙型肝炎疫苗均含有HBsAg，且当此抗原向正常疫苗接种者施用时，其刺激避免HBV感染之抗HBsAg抗体之产生。

对于疫苗制造，HBsAg以两种方式制得：纯化来自慢性乙型肝炎携带者之血浆的呈微粒形式之抗原，或通过重组DNA方法表达蛋白质(例如，在酵母细胞中重组表达)。不同于天然HBsAg(即，如在血浆纯化产物中)，酵母表达之HBsAg通常未经糖基化，且此为用于本发明之最优选HBsAg形式。

缀合之流感嗜血杆菌b型抗原：流感嗜血杆菌b型(Hib)引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常系基于荚膜糖抗原，其制备已有完备记载。Hib糖可与载体蛋白缀合以增强其免疫原性，尤其在儿童中之免疫原性。典型载体蛋白为破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM₁₉₇、流感嗜血杆菌蛋白D及来自血清群B脑膜炎双球菌之外膜蛋白复合物。缀合物之糖部分可包含由Hib细菌制备之全长聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)及/或全长PRP之片段。Hib缀合物可吸附或可不吸附至铝盐佐剂。

2.5佐剂

在一些实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物可进一步包含至少一种、两种或三种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物可进一步包含至少一种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物可进一步包含一种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物可进一步包含两种佐剂。术语“佐剂”系指增强针对抗原之免疫反应的化合物或混合物。抗原可主要用作递送系统，主要用作免疫调节剂，或具有两者之强力特征。

适合的佐剂包括适用于哺乳动物(包括人类)的那些佐剂。已知可在人类中使用之适合的递送系统类型佐剂之实例包括(但不限于)明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳液(诸如MF59)(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween80)、0.5％w/v脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(诸如Montanide)及聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)微米粒子或纳米粒子。

在一个实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物包含作为佐剂之铝盐(明矾)(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一个优选实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物包含作为佐剂之磷酸铝或氢氧化铝。在一个优选实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物包含作为佐剂之磷酸铝。

增强如本文所公开之免疫原性组合物之有效性的其他例示性佐剂包括(但不限于)：(1)水包油乳液制剂(具有或不具有其他特定免疫刺激剂，诸如胞壁肽(参见下文)或细菌细胞壁组分)，诸如(a)SAF，其含有微流化成次微米级乳液或涡旋以产生较大粒径乳液之10％角鲨烯、0.4％ Tween 80、5％普流尼克嵌段聚合物L121及thr-MDP，及(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2％角鲨烯、0.2％ Tween 80及一或多种细菌细胞壁组分(诸如单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁骨架(CWS)，优选地MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)可使用皂素佐剂，诸如QS21、STIMULON^TM(CambridgeBioscience,Worcester,MA)、(Isconova,Sweden)或(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或自其产生之颗粒，诸如ISCOMs(免疫刺激复合物)，该ISCOMS可不含额外去污剂(例如WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐剂(CFA)及弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(例如WO 99/44636))、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰基脂质A(MPL)或3-O-去酰化MPL(3dMPL)(参见例如GB-2220221、EP0689454)，任选地在与肺炎链球菌糖一起使用时实质上不存在明矾(参见例如WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21及/或水包油乳液之组合(参见例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见例如WO 99/52549)；(8)与辛苯昔醇组合之聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(例如WO 01/21207)或与至少一种额外非离子表面活性剂(诸如辛苯昔醇)组合之聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(例如WO 01/21152)；(9)皂苷及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(例如WO 00/62800)；(10)免疫刺激剂及金属盐粒子(参见例如WO 00/23105)；(11)皂苷及水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(视情况+固醇)(例如WO 98/57659)；(13)充当增强组合物之功效之免疫刺激剂的其他物质。胞壁肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含作为佐剂之CpG寡核苷酸。如本文中所使用之CpG寡核苷酸系指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)，且因此除非另外指示，否则此等术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸含有一或多个免疫刺激性CpG基序，其为未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，视情况在某些优选的碱基背景内。CpG免疫刺激性基序之甲基化状态通常系指二核苷酸中之胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸为含有通过磷酸酯键与3'鸟嘌呤连接之5'未甲基化胞嘧啶且经由与Toll样受体9(TLR-9)结合而活化免疫系统的寡核苷酸。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多个甲基化CpG二核苷酸，其将经由TLR9活化免疫系统但不如CpG基序之未甲基化一样强烈。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多个回文序列，其还可包含CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已在多个发布专利、公开专利申请案及其他公开案中描述，包括美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号；及第6,339,068号。在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含WO 2010/125480之第3页第22行至第12页第36行所描述之CpG寡核苷酸中之任一者。

已鉴别出不同类别之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等被称为A、B、C及P类，且更详细地描述于WO 2010/125480之第3页第22行至第12页第36行。本发明之方法涵盖此等不同类别之CpG免疫刺激性寡核苷酸之用途。

在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含A类CpG寡核苷酸。优选地，本发明之“A类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5'GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'(SEQ ID NO:1)。A类寡核苷酸之一些非限制性实例包括：5'G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3'(SEQ ID NO:2)；其中“*”系指硫代磷酸酯键，且“_”系指磷酸二酯键。

在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含B类CpG寡核苷酸。在一个实施方案中，用于本发明中之CpG寡核苷酸为至少由下式表示之B类CpG寡核苷酸：5'X₁X₂CGX₃X₄3'，其中X1、X2、X3及X4为核苷酸。在一个实施方案中，X₂为腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，X₃为胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。

本发明之B类CpG寡核苷酸序列为上文大致描述以及以下文献中所公开的那些：WO96/02555、WO 98/18810及美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号及第6,339,068号。例示性序列包括(但不限于)此等后面申请案及专利中所公开的那些。

在一个实施方案中，本发明之“B类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：

5'TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(SEQ ID NO:3)，或

5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(SEQ ID NO:4)，或

5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID NO:5)，或

5'TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3'(SEQ ID NO:6)，或

5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3'(SEQ ID NO:7)。

在此等序列中之任一者中，所有连接可皆为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，在此等序列中之任一者中，连接中之一或多者可为磷酸二酯，优选在CpG基序之“C”与“G”之间，产生半软的CpG寡核苷酸。在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代之实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

B类寡核苷酸之一些非限制性实例包括：

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3'(SEQ ID NO:8)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3'(SEQ ID NO:9)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'(SEQ ID NO:10)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'(SEQ ID NO:11)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3'(SEQ ID NO:12)。

其中“*”系指硫代磷酸酯键。

在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含C类CpG寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明之“C类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：

5'TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:13)，或

5'TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:14)，或

5'TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:15)，或

5'TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:16)，或

5'TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:17)，或

5'TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:18)，或

5'TCGACGTTCGGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:19)，或

5'TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3'(SEQ ID NO:20)，或

5'TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:21)，或

5'TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:22)，或

5'TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3'(SEQ ID NO:23)，或

5'TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3'(SEQ ID NO:24)，或

5'TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3'(SEQ ID NO:25)。

在此等序列中之任一者中，所有连接可皆为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，在此等序列中之任一者中，连接中之一或多者可为磷酸二酯，优选在CpG基序之“C”与“G”之间，产生半软的CpG寡核苷酸。

C类寡核苷酸之一些非限制性实例包括：

5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'(SEQ ID NO:26)，或

5'T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:27)，或

5'T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:28)，或

5'T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:29)，或

5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:30)，或

5'T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:31)，或

5'T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:32)，或

5'T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:33)，或

5'T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3'(SEQ ID NO:34)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G3'(SEQ ID NO:35)，或

5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G3'(SEQ ID NO:36)，或

5'T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:37)，或

5'T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'(SEQ ID NO:38)

其中“*”系指硫代磷酸酯键，且“_”系指磷酸二酯键。

在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代之实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

在本发明之一个实施方案中，如本文所公开之免疫原性组合物包含P类CpG寡核苷酸。在一个实施方案中，用于本发明中之CpG寡核苷酸为P类CpG寡核苷酸，其含有5'TLR活化域及至少两个回文区域，一个回文区域为至少6个核苷酸长之5'回文区域且其直接或经由间隔子连接至至少8个核苷酸长之3'回文区域，其中寡核苷酸包括至少一个YpR二核苷酸。在一个实施方案中，该寡核苷酸不为T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:27)。在一个实施方案中，P类CpG寡核苷酸包括至少一个未甲基化CpG二核苷酸。在另一个实施方案中，TLR活化域为TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在又另一个实施方案中，TLR活化域在5'回文区域内。在另一个实施方案中，TLR活化域紧邻5'回文区域之5'。在一个实施方案中，本发明之“P类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5'TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3'(SEQ ID NO:39)。

在所述序列中，所有连接可皆为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，连接(linkage)中之一或多者可为磷酸二酯，优选在CpG基序之“C”与“G”之间，产生半软的CpG寡核苷酸。在此等序列中之任一者中，乙基-尿苷或卤素可取代5'T；卤素取代之实例包括(但不限于)溴-尿苷或碘-尿苷取代。

P类寡核苷酸之非限制性实例包括：

5'T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'(SEQ ID NO:40)

其中“*”系指硫代磷酸酯键，且“_”系指磷酸二酯键。

在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯连接。在另一个实施方案中，寡核苷酸之所有核苷酸间连接皆为硫代磷酸酯连接。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样连接。在另一个实施方案中，磷酸二酯样连接为磷酸二酯连接。在另一个实施方案中，亲脂性基团与寡核苷酸缀合。在一个实施方案中，亲脂性基团为胆固醇。

在一个实施方案中，本文所公开之CpG寡核苷酸之所有核苷酸间连接为磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如WO 2007/026190中所描述)。在另一个实施方案中，本发明之CpG寡核苷酸抗降解(例如为稳定的)。“稳定寡核苷酸”系指相对抗体内降解(例如经由核酸外切酶或核酸内切酶之体内降解)的寡核苷酸。核酸稳定性可经由主链修饰实现。具有硫代磷酸酯连接之寡核苷酸提供最大活性且防止寡核苷酸由细胞内核酸外切酶及核酸内切酶降解。

免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主链，其具有磷酸二酯连接与硫代磷酸酯连接之组合。出于本发明之目的，嵌合主链系指部分稳定主链，其中至少一个核苷酸间连接为磷酸二酯连接或磷酸二酯样连接，且其中至少一个其他核苷酸间连接为稳定的核苷酸间连接，其中至少一个磷酸二酯连接或磷酸二酯样连接与至少一个稳定连接不同。当磷酸二酯连接优先位于CpG基序内时，此类分子被称为“半软的”，如WO 2007/026190中所描述。

其他经修饰寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或对乙氧基连接之组合。

混合主链修饰之ODN可如WO 2007/026190中所描述合成。

CpG寡核苷酸之大小(还即，沿寡核苷酸之长度的核苷酸残基数目)还可促成寡核苷酸之刺激性活性。为了促进至细胞中之吸收，本发明之CpG寡核苷酸优选具有6个核苷酸残基之最小长度。若存在足够的免疫刺激性基序，则大于6个核苷酸之任何大小(甚至许多kb长)之寡核苷酸均能够诱导免疫反应，因为较大寡核苷酸会在细胞内部降解。在某些实施方案中，CpG寡核苷酸为6至100个核苷酸长，优选8至30个核苷酸长。在重要实施方案中，本发明之核酸及寡核苷酸不为质粒或表达载体。

在一个实施方案中，本文所公开之CpG寡核苷酸包含取代或修饰，诸如在如WO2007/026190之第134至147段所描述的碱基及/或糖之取代或修饰。

在一个实施方案中，本发明之CpG寡核苷酸经化学修饰。化学修饰之实例为技术人员已知的，且描述于例如Uhlmann等人(1990)Chem.Rev.90:543；S.Agrawal编,HumanaPress,Totowa,USA 1993；Crooke等人(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129；及Hunziker等人(1995)Mod.Synth.Methods 7:331-417中。根据本发明之寡核苷酸可具有一或多个修饰，其中与由天然DNA或RNA构成之具有相同序列之寡核苷酸相比，各修饰位于特定磷酸二酯核苷间桥处及/或特定β-D-核糖单元处及/或特定天然核苷碱基位置处。

在本发明之一些实施方案中，含CpG之核酸可根据本领域技术人员已知之方法简单地与免疫原性载体混合(参见例如WO 03/024480)。

在本发明之一个特定实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物中之任一者包含2μg至100mg之CpG寡核苷酸。在本发明之一个特定实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含0.1mg至50mg之CpG寡核苷酸，优选0.2mg至10mg之CpG寡核苷酸，更优选0.3mg至5mg之CpG寡核苷酸。在本发明之一个特定实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含0.3mg至5mg之CpG寡核苷酸。甚至优选地，本发明之免疫原性组合物可包含0.5至2mg之CpG寡核苷酸。最优选地，本发明之免疫原性组合物可包含0.75至1.5mg之CpG寡核苷酸。在一个优选实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物中之任一者可包含约1mg之CpG寡核苷酸。

3制剂

本发明之免疫原性组合物可配制成液体形式(还即溶液或悬浮液)或冻干形式。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物配制成液体形式。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物配制成冻干形式。液体制剂可有利地自其包装形式直接施用，且因此对于注射而言为理想的，其无需如本发明之冻干组合物那般在水性介质中复原。

本发明之免疫原性组合物之配制可使用本领域中公认的方法来实现。举例而言，可将个别多糖及/或缀合物与生理学上可接受之溶媒一起配制以制备组合物。此类溶媒之实例包括(但不限于)水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及右旋糖溶液。

本发明提供一种免疫原性组合物，其包含本文所公开之糖缀合物之任何组合及医药学上可接受之赋形剂、载体或稀释剂。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物呈液体形式，优选地呈水性液体形式。

本发明之免疫原性组合物可包含以下中之一或多者：缓冲液、盐、二价阳离子、非离子去污剂、低温保护剂(诸如糖)及抗氧化剂(诸如游离基清除剂或螯合剂)或其任何多个组合。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含缓冲剂。在一个实施方案中，该缓冲剂具有约3.5至约7.5之pKa。在一些实施方案中，缓冲剂为磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲剂为琥珀酸盐。在一些实施方案中，缓冲剂为组氨酸。在某些实施方案中，缓冲剂为1mM至10mM之最终浓度之琥珀酸盐。在一个特定实施方案中，琥珀酸盐缓冲剂之最终浓度为约5mM。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含盐。在一些实施方案中，盐系选自由以下组成的组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施方案中，盐为氯化钠。在一个特定实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含150mM之氯化钠。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物包含表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂系选自由以下组成的组：聚山梨醇酯20(TWEEN^TM20)、聚山梨醇酯40(TWEEN^TM40)、聚山梨醇酯60(TWEEN^TM60)、聚山梨醇酯65(TWEEN^TM65)、聚山梨醇酯80(TWEEN^TM80)、聚山梨醇酯85(TWEEN^TM85)、TRITON^TMN-101、TRITON^TMX-100、辛苯昔醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯80。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.02％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.01％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.03％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.04％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为0.05％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯80之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯80。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯20。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯20。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.02％(w/w)聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.01％(w/w)聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.03％(w/w)聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.04％(w/w)聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为0.05％(w/w)聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯20之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯20。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯40。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯40之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯40之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯40之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯40。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯40之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯40。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯40之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯40。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯60。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯60之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯60之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯60之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯60。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯60之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯60。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯60之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯60。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯65。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯65之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯65之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯65之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯65。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯65之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯65。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯65之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯65。

在一个特定实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯85。在一些该实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯85之最终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯85之最终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在一些所述实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯85之最终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)聚山梨醇酯85。在其他实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯85之最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)聚山梨醇酯85。在另一个实施方案中，制剂中之聚山梨醇酯85之最终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯85。

在某些实施方案中，本发明之免疫原性组合物具有5.5至7.5之pH，更优选5.6至7.0之pH，甚至更优选5.8至6.0之pH。

在一个实施方案中，本发明提供一种填充有本文所公开之免疫原性组合物中之任一者的容器。在一个实施方案中，容器系选自由以下组成的组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、袋子、广口瓶、安瓿、药筒及一次性笔。在某些实施方案中，容器为硅化的。

在一个实施方案中，本发明之容器系由玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)及/或聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)制成。在一个实施方案中，本发明之容器系由玻璃制成。

在一个实施方案中，本发明提供一种填充有本文所公开之免疫原性组合物中之任一者的注射器。在某些实施方案中，注射器为硅化的及/或系由玻璃制成。

用于注射之本发明之免疫原性组合物的典型剂量具有0.1mL至2mL之体积。在一个实施方案中，用于注射之本发明之免疫原性组合物具有0.2mL至1mL之体积，甚至更优选约0.5mL之体积。

4本发明之糖缀合物及免疫原性组合物之用途

本文所公开之糖缀合物可用作抗原。举例而言，其可为疫苗之一部分。

因此，在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物适用作药物。

在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物适用作疫苗。

因此，在一个实施方案中，本文所描述之免疫原性组合物适用于在个体中产生免疫反应。在一个方面中，个体为哺乳动物，诸如人类、非人类灵长类动物、猫、绵羊、猪、马、牛科动物或狗。在一个方面中，个体为人类。

本文所描述之免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善个体之细菌感染、疾病或病状之治疗性或预防性方法中。因此，在一个方面中，本发明提供一种预防、治疗或改善个体之与细菌感染相关之感染、疾病或病状的方法，其包含向该个体施用免疫有效量的本发明之免疫原性组合物。

本发明之免疫原性组合物可用于保护或治疗易受细菌感染影响之人类，其系藉助于经由全身或黏膜途径来施用该免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径施用。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射施用。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物通过肌肉内或皮下注射施用。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物通过肌肉内注射施用。在一个实施方案中，本发明之免疫原性组合物通过皮下注射施用。

5待用本发明之免疫原性组合物治疗的个体

如本文所公开，本文所描述之免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善个体之细菌感染、疾病或病状之各种治疗性或预防性方法中。

在一个优选实施方案中，该个体为人类。在一个最优选实施方案中，该个体为新生儿(还即低于三月龄)、婴儿(还即年龄在3个月至一岁)或幼儿(还即一岁至四岁)。

在一个实施方案中，本文所公开之免疫原性组合物适用作疫苗。

在此类实施方案中，待进行疫苗接种之个体可小于1岁。举例而言，待进行疫苗接种之个体可为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个月龄。在一个实施方案中，待进行疫苗接种之个体为约2、约4或约6个月龄。在另一个实施方案中，待进行疫苗接种之个体小于2岁。举例而言，待进行疫苗接种之个体可为约12个月龄至约15个月龄。在一些情况下，需要少至一次剂量之根据本发明之免疫原性组合物，但在一些情况下，可给予第二次、第三次或第四次剂量(参见下方部分8)。

在本发明之一个实施方案中，待进行疫苗接种之个体为50岁或更大之人类成人，更优选55岁或更大之人类成人。在一个实施方案中，待进行疫苗接种之个体为65岁或更大、70岁或更大、75岁或更大、或80岁或更大之人类成人。

在一个实施方案中，待进行疫苗接种之个体为免疫功能不全个体，尤其人类。免疫功能不全个体一般定义为呈现建立对于感染剂刺激之正常体液或细胞防御之能力减弱或降低的人。

在本发明之一个实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体罹患削弱免疫系统且引起不足以防止肺炎链球菌疾病或治疗肺炎链球菌疾病之抗体反应的疾病或病状。

在一个实施方案中，该疾病为原发性免疫缺乏病症。优选地，该原发性免疫缺乏病症系选自由以下组成的组：组合性T细胞及B细胞免疫缺乏症、抗体缺乏症、界定明确的综合征、免疫调节异常疾病、吞噬细胞病症、先天性免疫缺乏症、自体发炎性病症及补体缺乏症。在一个实施方案中，该原发性免疫缺乏病症系选自WO 2010/125480之第24页第11行至第25页第19行所公开之病症。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体罹患选自由以下组成的组之疾病：HIV感染、获得性免疫缺乏综合征(AIDS)、癌症、慢性心脏病或肺病、充血性心脏衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液渗漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障碍(诸如镰状细胞疾病)、脾功能缺乏(无脾症)、血液恶性疾病、白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、淋巴瘤、肾衰竭、肾病综合征及哮喘。

在本发明之一个实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体罹患营养不良。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体服用减少身体对于感染之抵抗的药物或进行减少身体对于感染之抵抗的治疗。在一个实施方案中，该药物系选自WO 2010/125480之第26页第33行至第26页第4行所公开之药物。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体为吸烟者。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体具有以下之白血球计数(白细胞计数)：低于5×10⁹个细胞/升、或低于4×10⁹个细胞/升、或低于3×10⁹个细胞/升、或低于2×10⁹个细胞/升、或低于1×10⁹个细胞/升、或低于0.5×10⁹个细胞/升、或低于0.3×10⁹个细胞/升、或低于0.1×10⁹个细胞/升。

白血球计数(白细胞计数)：血液中之白血球(WBC)之数目。WBC通常作为CBC(全血球计数)之一部分测量。白血球为血液中之感染对抗细胞，且不同于被称为红血球之红色(含氧)血细胞。存在不同类型的白血球，包括嗜中性粒细胞(多形核白细胞；PMN)、带状细胞(略微不成熟的嗜中性粒细胞)、T型淋巴细胞(T细胞)、B型淋巴细胞(B细胞)、单核细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。所有类型之白血球均在白血球计数中反映。白血球计数之正常范围通常在4,300与10,800个细胞/立方毫米血液之间。此还可被称作白细胞计数，且可以国际单位形式表述为4.3-10.8×10⁹个细胞/升。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体罹患嗜中性粒细胞减少症。在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体具有以下之嗜中性粒细胞计数：低于2×10⁹个细胞/升、或低于1×10⁹个细胞/升、或低于0.5×10⁹个细胞/升、或低于0.1×10⁹个细胞/升、或低于0.05×10⁹个细胞/升。

低白血球计数或“嗜中性粒细胞减少症”为特征在于在循环血液中异常低含量之嗜中性粒细胞的病状。嗜中性粒细胞为帮助预防及对抗感染之一种特定种类之白血球。癌症患者经历嗜中性粒细胞减少症之最常见原因为作为化学疗法之副作用。化学疗法诱发的嗜中性粒细胞减少症增加患者之感染风险且干扰癌症治疗。

在本发明之一个特定实施方案中，待进行疫苗接种之免疫功能不全个体具有低于500/mm³之CD4+细胞计数、或低于300/mm³之CD4+细胞计数、或低于200/mm³之CD4+细胞计数、低于100/mm³之CD4+细胞计数、低于75/mm³之CD4+细胞计数、或低于50/mm³之CD4+细胞计数。

CD4细胞测试通常报导为mm³中之细胞数目。正常CD4计数在500与1,600之间，且CD8计数在375与1,100之间。CD4计数在患有HIV之人中大大降低。

在本发明之一个实施方案中，本文所公开之免疫功能不全个体中之任一者为男性人类。在本发明之一个实施方案中，本文所公开之免疫功能不全个体中之任一者为女性人类。

6方案

在一些情况下，需要少至一次剂量之根据本发明之免疫原性组合物，但在一些情形下，诸如较高免疫缺乏之条件下，可给予第二次、第三次或第四次剂量。在初次疫苗接种之后，个体可接受经恰当间隔之一次或若干次加强免疫接种。

在一个实施方案中，根据本发明之免疫原性组合物之疫苗接种之时程为单次剂量。在一个特定实施方案中，该单次剂量时程系针对至少2岁之健康人群。

在一个实施方案中，根据本发明之免疫原性组合物之疫苗接种之时程为多剂量时程。在一个特定实施方案中，该多剂量时程由相隔约1个月至约2个月之时间间隔的一系列2次剂量组成。在一个特定实施方案中，该多剂量时程由相隔约1个月之时间间隔的一系列2次剂量组成，或由相隔约2个月之时间间隔的一系列2次剂量组成。

在另一个实施方案中，该多剂量时程由相隔约1个月至约2个月之时间间隔的一系列3次剂量组成。在另一个实施方案中，该多剂量时程由相隔约1个月之时间间隔的一系列3次剂量组成，或由相隔约2个月之时间间隔的一系列3次剂量组成。

在另一个实施方案中，该多剂量时程由以下组成：相隔约1个月至约2个月之时间间隔的一系列3次剂量，及随后在第一次剂量之后约10个月至约13个月之第四次剂量。在另一个实施方案中，该多剂量时程由以下组成：相隔约1个月之时间间隔的一系列3次剂量及随后在第一次剂量之后约10个月至约13个月之第四次剂量组成，或相隔约2个月之时间间隔的一系列3次剂量及随后在第一次剂量之后约10个月至约13个月之第四次剂量。

在一个实施方案中，多剂量时程由以下组成：在一岁中之至少一次剂量(例如1、2或3次剂量)及随后至少一次幼儿剂量。

在一个实施方案中，多剂量时程由以下组成：自2个月龄开始相隔约1个月至约2个月之时间间隔的一系列2或3次剂量(例如剂量之间相隔28至56天)，及随后在12至18个月龄时之幼儿剂量。在一个实施方案中，该多剂量时程由以下组成：自2个月龄开始相隔约1个月至约2个月之时间间隔的一系列3次剂量(例如剂量之间相隔28至56天)，及随后在12至15个月龄时之幼儿剂量。在另一个实施方案中，该多剂量时程由以下组成：自2个月龄开始相隔约2个月之时间间隔的一系列2次剂量，及随后在12至18个月龄时之幼儿剂量。

在一个实施方案中，该多剂量时程由在2、4、6及12至15个月龄时之4次剂量系列疫苗组成。

在一个实施方案中，在第0天给予初次剂量，且以在约2至约24周范围内之间隔，优选地以4至8周之给药间隔，给予一或多次加强剂量。

在一个实施方案中，在第0天给予初次剂量，且在约3个月后给予加强剂量。

7.本发明还提供如以下编号段落1至96中所定义之以下实施方案

1.一种制备荚膜糖糖缀合物之方法，其包含以下步骤：

(a)使经分离荚膜糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在非质子性溶剂中反应以产生经活化之叠氮基糖，

(b)使载体蛋白与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应，其中NHS部分与氨基反应以形成酰胺键，从而获得炔烃官能化之载体蛋白，

(c)通过Cu⁺¹介导之叠氮化物-炔烃环加成反应使步骤(a)之经活化之叠氮基糖与步骤(b)之经活化之炔烃-载体蛋白反应以形成糖缀合物。

2.如段落1之方法，其中经分离糖在活化步骤(a)之前经尺寸设定。

3.如段落2之方法，其中经分离荚膜糖经尺寸设定为200kDa与800kDa之间的重量平均分子量。

4.如段落1至3中任一者之方法，该碳酸衍生物系选自由以下组成的组：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)及N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯。

5.如段落1至3中任一者之方法，其中该碳酸衍生物为1,1'-羰基二咪唑(CDI)。

6.如段落1至3中任一者之方法，其中该碳酸衍生物为1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。

7.如段落1至6中任一者之方法，其中该叠氮基接头为式(I)化合物，

H₂N-X-N₃ (I)

8.如段落1至6中任一者之方法，其中该叠氮基接头为式(II)化合物，

9.如段落1至8中任一者之方法，其中该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔烃之试剂。

10.如段落1至8中任一者之方法，其中该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔烃之试剂。

11.如段落1至8中任一者之方法，其中该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(III)化合物，

12.如段落1至8中任一者之方法，其中该带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂为式(IV)化合物：

13.如段落1至12中任一者之方法，其中步骤a)包含在非质子性溶剂中，使荚膜糖与碳酸衍生物反应，随后使经碳酸衍生物活化之荚膜糖与叠氮基接头反应，以产生经活化之叠氮基荚膜糖。

14.如段落1至13中任一者之方法，其中在步骤a)处，经分离荚膜糖与该碳酸衍生物在非质子性溶剂中反应。

15.如段落1至13中任一者之方法，其中在步骤a)处，经分离荚膜糖与碳酸衍生物在基本上由二甲亚砜(DMSO)组成之溶液中反应。

16.如段落1至14中任一者之方法，其中在步骤a)处，经分离荚膜糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水之非质子性溶剂中反应。

17.如段落1至14中任一者之方法，其中在步骤a)处，经分离荚膜糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水之DMSO中反应。

18.如段落1至17中任一者之方法，其中在步骤a)处，在碳酸衍生物活化之后添加水。

19.如段落18之方法，其中添加水以使混合物中之总水含量达到约1％至约10％(v/v)之间。

20.如段落1至19中任一者之方法，其中步骤a)进一步包含使经碳酸衍生物活化之糖与相对于经活化糖之糖重复单元的量在0.01至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

21.如段落1至20中任一者之方法，其中步骤a)之后经活化糖之活化程度在0.5％至50％之间。

22.如段落1至21中任一者之方法，其中步骤b)包含使载体蛋白与相对于载体上之赖氨酸0.1至10摩尔当量之量的带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基之试剂反应。

23.如段落1至22中任一者之方法，其中步骤b)之后经活化载体之活化程度在1与50之间。

24.如段落1至23中任一者之方法，其中缀合反应c)系在水性缓冲液中在作为催化剂之铜(I)存在下进行。

25.如段落1至23中任一者之方法，其中缀合反应c)系在水性缓冲液中在氧化剂及作为催化剂之铜(I)存在下进行。

26.如段落1至23中任一者之方法，其中缀合反应c)系在水性缓冲液中在作为催化剂之铜(I)及作为氧化剂之抗坏血酸盐存在下进行，其中反应混合物进一步包含THPTA(三(3-羟丙基三唑基甲基)胺)及氨基胍。

27.如段落1至26中任一者之方法，其中步骤c)处之经活化叠氮基糖与经活化炔烃-载体之初始输入比率(重量/重量)在0.1与3之间。

28.如段落1至27中任一者之方法，其中在步骤c)之后，该方法进一步包含用叠氮基封端剂对缀合物中保留之未反应叠氮基进行封端的步骤。

29.如段落28之方法，其中该叠氮基封端剂为式(V)化合物，

≡-X-OH (V)

其中X为(CH₂)_n，其中n系选自1至15。

30.如段落28之方法，其中该叠氮基封端剂为炔丙醇。

31.如段落28至30中任一者之方法，其中未反应叠氮基之封端系用相对于经活化糖之糖重复单元的量在0.05至20摩尔当量之间的量的封端剂进行。

32.如段落1至31中任一者之方法，其中在步骤c)之后，该方法进一步包含用炔烃基封端剂对缀合物中保留之未反应炔烃基进行封端的步骤。

33.如段落32之方法，其中该炔烃基封端剂为带有叠氮基之试剂。

34.如段落33之方法，其中该炔烃基封端剂为式(VI)化合物，

N₃-X-OH (VI)

其中X为(CH₂)_n，其中n系选自1至15。

35.如段落32之方法，其中该炔烃基封端剂为3-叠氮基-1-丙醇。

36.如段落32至35中任一者之方法，其中未反应炔烃基之封端系用相对于经活化糖之糖重复单元的量在0.05至20摩尔当量之间的量的封端剂进行。

37.如段落1至36中任一者之方法，其中该方法进一步包含在产生糖缀合物之后对其进行纯化的步骤。

38.一种荚膜糖糖缀合物，其系根据如段落1至37之方法中之任一者产生。

39.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VII)：

40.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'为2，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”为1。

41.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合之荚膜糖且具有通式(VIII)，

42.如段落38至41中任一者之荚膜糖糖缀合物，其包含荚膜糖，其中该荚膜糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在10kDa与2,000kDa之间。

43.如段落38至41中任一者之荚膜糖糖缀合物，其包含荚膜糖，其中该荚膜糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在50kDa与1,000kDa之间。

44.如段落38至41中任一者之荚膜糖糖缀合物，其包含荚膜糖，其中该荚膜糖在缀合之前的重量平均分子量(Mw)在200kDa与750kDa之间。

45.如段落38至44中任一者之荚膜糖糖缀合物，其具有250kDa与20,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

46.如段落38至44中任一者之荚膜糖糖缀合物，其具有500kDa与5,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

47.如段落38至44中任一者之荚膜糖糖缀合物，其具有750kDa与2,500kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

48.如段落38至47中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中荚膜糖糖缀合物之缀合程度在2与15之间。

49.如段落38至48中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中糖缀合物中荚膜糖与载体蛋白之比率(w/w)在0.5与3.0之间。

50.如段落38至49中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖糖缀合物针对糖之每4个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

51.如段落38至49中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖糖缀合物针对糖之每25个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

52.如段落38至49中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖糖缀合物针对糖之每5至10个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

53.如段落38至56中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为CRM₁₉₇。

54.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为SCP。

55.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为无酶促活性的SCP。

56.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为无酶促活性的来自GBS之SCP(SCPB)。

57.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为SCPB之片段。

58.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

59.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其中该无酶促活性的SCP之片段包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域。

60.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少一个氨基酸来实现，且其中该置换系选自由D130A、H193A、N295A及S512A组成的组，其中数目指示根据WO00/34487之SEQ ID NO:1之编号的肽酶中之氨基酸残基位置。

61.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为无酶促活性的SCP之片段，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域(PA域)及三个纤连蛋白III型(Fn)结构域但不包含输出信号前序列、原序列及细胞壁锚定域，其中该失活系通过置换野生型序列之至少两个氨基酸来实现，其中该至少两个氨基酸置换为D130A及S512A，其中数目指示根据WO00/34487之SEQ ID NO:1之编号的肽酶中之氨基酸残基位置。

62.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为由与SEQ IDNO:41具有至少95％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

63.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为由与SEQ IDNO:42具有至少95％同一性之多肽组成的无酶促活性的SCP之片段。

64.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为由SEQ ID NO:41组成的无酶促活性的SCP之片段。

65.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为由SEQ ID NO:42组成的无酶促活性的SCP之片段。

66.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为DT(白喉类毒素)。

67.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为TT(破伤风类毒素)。

68.如段落38至53中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该载体蛋白为PD(流感嗜血杆菌蛋白D)。

69.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自病原性细菌之荚膜糖。

70.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自病原性链球菌属、病原性葡萄球菌属、病原性肠球菌属、病原性芽孢杆菌属、病原性棒状杆菌属、病原性利斯特菌属、病原性丹毒丝菌属、病原性梭菌属、病原性嗜血杆菌属、病原性奈瑟氏菌属或病原性埃希氏菌属之荚膜糖。

71.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或链球菌之荚膜糖。

72.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、C组及G组链球菌或大肠杆菌之荚膜糖。

73.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、无乳链球菌或大肠杆菌之荚膜糖。

74.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌或无乳链球菌之荚膜糖。

75.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌之荚膜糖。

76.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自金黄色葡萄球菌之荚膜糖。

77.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自粪肠球菌之荚膜糖。

78.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自流感嗜血杆菌b型之荚膜糖。

79.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自脑膜炎奈瑟氏菌之荚膜糖。

80.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自大肠杆菌之荚膜糖。

81.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自粪肠球菌之荚膜糖。

82.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自无乳链球菌(B组链球菌(GBS))之荚膜糖。

83.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自GBS Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型之荚膜糖。

84.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自选自由以下组成的组之肺炎链球菌血清型的荚膜糖：血清型1、2、4、5、6A、6B、6C、7C、7F、8、9V、9N、10A、10B、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24B、24F、27、29、31、33B、33F、34、35B、35F、38、72及73。

85.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型35B之荚膜糖。

86.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型29之荚膜糖。

87.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型15A之荚膜糖。

88.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型24F之荚膜糖。

89.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23A之荚膜糖。

90.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23B之荚膜糖。

91.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型6B之荚膜糖。

92.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型19A之荚膜糖。

93.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型19F之荚膜糖。

94.如段落1至37中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或如段落38至68中任一者之荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖为来自肺炎链球菌血清型23F之荚膜糖。

95.如段落1至94中任一者之制备荚膜糖糖缀合物之方法或荚膜糖糖缀合物，其中该荚膜糖不为来自肺炎链球菌血清型3之荚膜糖。

96.一种免疫原性组合物，其包含如段落38至95中任一者之荚膜糖糖缀合物。

如本文所使用，术语“约”意谓在值之统计学上有意义的范围内，诸如所陈述之浓度范围、时间范围、分子量、温度或pH。此类范围可在给定值或范围之一数量级内，通常在20％内，更通常在10％内，且甚至更通常在5％内或在1％内。有时，此类范围可能在用于测量及/或测定给定值或范围之标准方法的典型实验误差内。术语“约”所涵盖之容许偏差将取决于所研究之特定系统，且可由本领域技术人员容易地理解。每当在本申请案中叙述一个范围时，还考虑该范围内之每个数目作为本发明之一个实施方案。

本发明人预期，在各情况下，本文中之术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”及“包含(comprises)”视情况可分别替换为术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”、“基本上由…组成(consist essentially of)”、“基本上由…组成(consists essentially of)”、“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consist of)”及“由…组成(consists of)”。

“免疫原性量”、“免疫有效量”、“治疗有效量”、“预防有效量”或“剂量”中之各者在本文中可互换使用，通常系指通过本领域技术人员已知之标准分析所测量，足以诱发免疫反应，还即细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)反应或两种反应的抗原或免疫原性组合物之量。

考虑本文件之范围中之任一者内之任何全数整数作为本发明之一个实施方案。

在本专利说明书内引用之所有参考文献或专利申请案均以引用的方式并入本文中。

在随附实施例中说明本发明。除非另外详细描述，否则使用本领域技术人员所熟知且常用的标准技术进行以下实施例。实施例为说明性的，而非限制本发明。

实施例

实施例1：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型35B荚膜多糖(参见图3)

1.用叠氮基接头活化血清型35B荚膜多糖

将血清型35B荚膜多糖(200mg)与咪唑(600mg)混合，且随后冷冻并冻干。

在冻干3天之后，用无水DMSO(100mL)复原冻干之多糖。随后使反应混合物升温至45℃，且添加669μL(2MEq)之CDI(100mg/mL于DMSO中)。将反应混合物在45℃下搅拌2小时。在将反应混合物冷却至23℃之后，添加2mL(2％v/v)之WFI以淬灭游离CDI，且在23℃下搅拌30分钟。随后，添加41μL(2MEq)之3-叠氮基-1-丙胺，且随后在23℃下搅拌20小时。在反应20小时之后，用400mL含10mM磷酸钠缓冲液(SPB)之盐水(pH 7)将反应混合物稀释(5×，v/v)至冷却(5℃)。随后通过UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2Mini)相对于含10mM SPB之盐水(pH 7)(30×，v/v)纯化经稀释之反应混合物。

2.用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇

CRM₁₉₇之活化：

向CRM₁₉₇溶液(1000mg)中添加57mL WFI及50mL之0.5M磷酸钠缓冲液(pH 8.3)。在冷却至8℃之后，向反应混合物中逐滴添加3.8mL(相对于CRM₁₉₇上之赖氨酸0.5MEq)之3-炔丙氧基-丙酸NHS酯(POPS)(20mg/mL于DMSO中)，将反应温度维持在8±3℃。将反应混合物在8℃下搅拌2小时之后，通过UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2Mini)相对于含100mM磷酸钠缓冲液之盐水(pH 7.0)(30×渗滤体积)进行纯化。UF/DF之后，添加23g(15％v/v)蔗糖。

SCP之活化：

SCP之活化类似于CRM₁₉₇之活化，不同之处在于调节接头之量。接头之最终量为相对于SCP 0.5MEq(每SCP 0.092w/w接头)。

点击缀合：

经活化之叠氮基聚合物及炔烃CRM₁₉₇或SCP系通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合，该环加成反应被称为“点击反应”。

在23℃下，向用叠氮基接头活化之血清型35B荚膜多糖(参见上文步骤1)及炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP(参见上文步骤2)(于含100mM磷酸钠缓冲液(SPB)之盐水(pH 7.0)中)之混合物中添加5mM硫酸铜(CuSO₄)(1mL)及25mM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(1mL)之混合物，且接着添加100mM氨基胍(2mL)及100mM抗坏血酸钠(2mL)。将反应混合物在23℃下搅拌2小时之后，在23℃下用炔丙醇(1MEq)对未反应的叠氮基进行封端，持续2小时，且在第一次封端之后，在23℃下通过3-叠氮基-1-丙醇(2MEq)对未反应炔烃基进行封端，持续2小时。随后，通过UF/DF使用100K MWCO PES膜相对于含10mM EDTA+10mM SPB之盐水(pH 7.0)(30×渗滤体积)且接着相对于含5mM琥珀酸盐之盐水(pH 6.0)(30×渗滤体积)来纯化反应混合物。

表1.使用点击化学获得之Pn35B缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量极低且产率良好之35B缀合物。此外，其允许获得包含接近天然多糖之多糖的35B缀合物(与用高碘酸盐活化相反，在活化步骤期间未观测到尺寸减小，参见WO 2020/247299)。

实施例2：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型29荚膜多糖(参见图3)

1.用叠氮基接头活化血清型29荚膜多糖

将血清型29荚膜多糖(200mg)与咪唑(600mg)混合，且随后冷冻并冻干。

在冻干3天之后，用无水DMSO(100mL)复原冻干之多糖。随后使反应混合物升温至45℃，且添加1050μL(3MEq)之CDI(100mg/mL于DMSO中)。将反应混合物在45℃下搅拌(300rpm)3小时。在将反应混合物冷却至23℃之后，添加2mL(2％v/v)之WFI以淬灭游离CDI，且在23℃下搅拌30分钟。随后，添加42μL(2MEq)之3-叠氮基-1-丙胺，接着添加60μL三乙胺，且随后在23℃下搅拌20小时。在反应20小时之后，用400mL含10mM磷酸钠缓冲液(SPB)之盐水(pH 7)(5×，v/v)将反应混合物稀释至冷却(5℃)。随后通过UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2Mini)相对于含10mM SPB之盐水(pH 7)(30×，v/v)纯化经稀释之反应混合物。

2.用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇活化为炔烃-CRM₁₉₇

3.点击缀合：经活化之叠氮基聚合物及炔烃CRM₁₉₇系通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合，该环加成反应被称为“点击反应”

在23℃下，向用叠氮基接头活化之血清型29荚膜多糖(参见上文步骤1)及炔烃-CRM₁₉₇(参见上文步骤2)(于含100mM磷酸钠缓冲液(SPB)之盐水(pH 7.0)中)之混合物中添加5mM硫酸铜(CuSO₄)(1mL)及25mM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(1mL)之混合物，且接着添加100mM氨基胍(2mL)及100mM抗坏血酸钠(2mL)。将反应混合物在23℃下搅拌2小时之后，在23℃下用炔丙醇(1MEq)对未反应叠氮基进行封端，持续2小时，且在第一次封端之后，在23℃下通过3-叠氮基-1-丙醇(2MEq)对未反应炔烃基进行封端，持续2小时。随后，通过UF/DF使用100K MWCO PES膜相对于含10mM EDTA+10mM SPB之盐水(pH 7.0)(30×渗滤体积)且接着相对于含5mM琥珀酸盐之盐水(pH 6.0)(30×渗滤体积)来纯化反应混合物。

表2.使用点击化学获得之Pn29缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且产率良好之29缀合物。此外，其允许获得包含接近天然多糖之多糖的血清型29缀合物(与用高碘酸盐活化相反，在活化步骤期间未观测到尺寸减小，参见WO 2020/247299)。

实施例3.使用点击化学缀合之血清型35B缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇或SCP之血清型35B缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见表1处之属性)。

在第0周，经由皮下途径用0.01μg/动物、0.05μg/动物或0.1μg/动物之测试缀合物对6至8周龄雌性瑞士韦伯斯特(Swiss Webster)小鼠组进行免疫接种(250μL)。在第3周用相同剂量之缀合物对小鼠进行加强，且随后在第5周抽血。对第5周血清样品进行血清型特异性OPA。

结果呈现于表3处。

NA：‘未获得’

表3之数据指示所有血清型35B缀合物均在鼠类免疫原性模型中引起剂量依赖性OPA效价。

实施例4：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型23A及23B荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型23A及23B荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖23A及23B与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表4及5处。

表4.使用点击化学获得之Pn23A缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量极低且产率良好之23A缀合物。

表5.使用点击化学获得之Pn23B缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖百分比较低且产率良好之23B缀合物。

实施例5：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型15A荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型15A荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖15A与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表6处。

表6.使用点击化学获得之Pn15A缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且针对SPC之产率良好之15A缀合物。

实施例6：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型24F荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型24F荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖24F与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表7。

表7.使用点击化学获得之Pn24F缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且产率良好之24F缀合物。

实施例7：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型6B荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖6B与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表8处。

表8.使用点击化学获得之6B缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖及游离蛋白含量极低之6B缀合物。

实施例8：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型19A荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖19A与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表9处。

表9.使用点击化学获得之19A缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且游离蛋白含量极低之19A缀合物。

实施例9：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型19F荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型19F荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖19F与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表10处。

表10.使用点击化学获得之19F缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且游离蛋白含量极低之19F缀合物。

实施例10：使用点击化学缀合肺炎链球菌血清型23F荚膜多糖(参见图3)

使用用于血清型35B及29之类似方法(参见实施例1及2)，用叠氮基接头(3-叠氮基-1-丙胺)活化血清型23F荚膜多糖。使用实施例1及2之类似方法，用炔烃NHS酯将CRM₁₉₇及SCP活化为炔烃-CRM₁₉₇或炔烃-SCP，且将经活化之叠氮基多糖23F与炔烃CRM₁₉₇或SCP点击缀合(通过Cu+1介导之叠氮化物-炔烃环加成反应缀合)。

已获得之缀合物之属性呈现于表11处。

表11.使用点击化学获得之23F缀合物之属性

MW：分子量；SPR：糖与蛋白质之比率

点击化学允许产生游离糖含量较低且游离蛋白含量极低之23F缀合物。

实施例11.使用点击化学缀合之血清型19F缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇或SCP之血清型19F缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见实施例9表10处之属性)。

在第0周，经由皮下途径用0.05μg/动物或0.1μg/动物之测试缀合物对6至8周龄雌性瑞士韦伯斯特小鼠组进行免疫接种(250μL)。在第3周用相同剂量之缀合物对小鼠进行加强，且随后在第5周抽血。对第5周血清样品进行血清型特异性OPA。

结果呈现于表12处。

实施例12.使用点击化学缀合之血清型29缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇之血清型29缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见实施例2表2处之属性)。

在第0周，经由皮下途径用0.01μg/动物、0.05μg/动物或0.1μg/动物之测试缀合物对6至8周龄雌性瑞士韦伯斯特小鼠组进行免疫接种(250μL)。在第3周用相同剂量之缀合物对小鼠进行加强，且随后在第5周抽血。对第5周血清样品进行血清型特异性OPA。

结果呈现于表13处。

表13之数据指示血清型29缀合物在鼠类免疫原性模型中引起剂量依赖性OPA效价。

实施例13.使用点击化学缀合之血清型19A缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇或SCP之血清型19A缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见实施例8表9处之属性)。

结果呈现于表14处。

实施例14.使用点击化学缀合之血清型6B缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇或SCP之血清型6B缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见实施例7表8处之属性)。

在第0周，经由皮下途径用0.05μg/动物、0.1μg/动物或0.2μg/动物之测试缀合物对6至8周龄雌性瑞士韦伯斯特小鼠组进行免疫接种(250μL)。在第3周用相同剂量之缀合物对小鼠进行加强，且随后在第5周抽血。对第5周血清样品进行血清型特异性OPA。

结果呈现于表15处。

实施例15.使用点击化学缀合之血清型15A缀合物之免疫原性

在标准条件下测定与-CRM₁₉₇或SCP之血清型15A缀合物在小鼠中之调理吞噬活性(OPA)效价。使用点击化学(点击)来产生所测试之缀合物(参见实施例5表6处之属性)。

在第0周，经由皮下途径用0.01μg/动物、0.1μg/动物或1.0μg/动物之测试缀合物对6至8周龄雌性瑞士韦伯斯特小鼠组进行免疫接种(250μL)。在第3周用相同剂量之缀合物对小鼠进行加强，且随后在第5周抽血。对第5周血清样品进行血清型特异性OPA。

结果呈现于表16处。

本说明书中提及之所有出版物及专利申请指示本发明所属领域之技术人员的水平。所有出版物及专利申请均在此以引用之方式并入，如同各个别出版物或专利申请特定且单独地指示为以引用之方式并入一般。

尽管出于清晰理解的目的已经藉助于说明及实施例相当详细地描述了前述发明，但可在所附权利要求的范围内实施某些改变及修改。

Claims

1.一种制备荚膜糖糖缀合物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使经分离的荚膜糖与碳酸衍生物及叠氮基接头在非质子性溶剂中反应以产生经活化的叠氮基糖，

(b)使载体蛋白与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基的试剂反应，其中所述NHS部分与氨基反应以形成酰胺键，从而获得经炔烃官能化的载体蛋白，

(c)通过Cu⁺¹介导的叠氮化物-炔烃环加成反应使步骤(a)的经活化的叠氮基糖与步骤(b)的经活化炔烃-载体蛋白发生反应以形成糖缀合物。

2.权利要求2所述的方法，其中在活化步骤(a)之前，将所述分离的荚膜糖尺寸设定为200kDa与800kDa之间的重量平均分子量。

3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述碳酸衍生物选自由以下组成的组：1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)及N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述叠氮基接头为式(I)的化合物，

H,N—X—N。_(I)

其中X选自由以下组成的组：CH₂(CH₂)n、(CH₂CH₂O)mCH₂CH₂、NHCO(CH₂)n、NHCO(CH₂CH₂O)mCH₂CH₂、OCH₂(CH₂)n和O(CH₂CH₂O)mCH₂CH₂；其中n选自1至10且m选自1至4。

5.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述叠氮基接头为式(II)的化合物，

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基的试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及末端炔烃的试剂。

7.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基的试剂为带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及环炔烃的试剂。

8.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基的试剂为式(III)的化合物，

其中X选自由以下组成的组：CH₂O(CH₂)_nCH₂C＝O及CH₂O(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₂C＝O，其中n选自0至10且m选自0至4。

9.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)部分及炔烃基的试剂为式(IV)的化合物：

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中步骤a)包括在非质子性溶剂中，使荚膜糖与碳酸衍生物反应，随后使经碳酸衍生物活化的荚膜糖与叠氮基接头反应，以产生经活化的叠氮基荚膜糖。

11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中在步骤a)处，经分离的荚膜糖与CDI在包含0.1％至1％(v/v)水的非质子性溶剂中反应。

12.权利要求1-11任一项所述的方法，其中在步骤a)处，在碳酸衍生物活化之后添加水。

13.权利要求1-12任一项所述的方法，其中步骤a)进一步包括使经碳酸衍生物活化的糖与相对于经活化糖的糖重复单元的量在0.01至10摩尔当量之间的量的叠氮基接头反应。

14.权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述缀合反应c)在水性缓冲液中于作为催化剂的铜(I)的存在下进行。

15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在产生糖缀合物之后，纯化该糖缀合物的步骤。

16.一种荚膜糖糖缀合物，其根据权利要求1-15任一项所述的方法产生。

17.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合的荚膜糖且具有通式(VII)：

其中X选自由以下组成的组：CH₂(CH₂)_n'、(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、NHCO(CH₂)_n'、NHCO(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂、OCH₂(CH₂)_n'及O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂；其中n'选自1至10且m选自1至4，

且其中X'选自由以下组成的组：CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O、CH₂O(CH₂CH₂O)_m'(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n”选自0至10且m'选自0至4。

18.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合的荚膜糖且具有通式(VII)，其中X为CH₂(CH₂)_n'，其中n'为2，且其中X'为CH₂O(CH₂)_n”CH₂C＝O，其中n"为1。

19.一种荚膜糖糖缀合物，其包含经由间隔子与载体蛋白(CP)共价缀合的荚膜糖且具有通式(VIII)，

20.权利要求16至19任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其包含荚膜糖，其中所述荚膜糖在缀合前的重量平均分子量(Mw)在10kDa与2,000kDa之间。

21.权利要求16至20任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其具有250kDa与20,000kDa之间的重量平均分子量(Mw)。

22.权利要求16至21任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述荚膜糖糖缀合物的缀合程度在2与15之间。

23.权利要求16至22任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述糖缀合物中荚膜糖与载体蛋白的比率(w/w)在0.5与3.0之间。

24.权利要求16至23任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述荚膜糖糖缀合物针对糖的每5至10个糖重复单元，在载体蛋白与糖之间包含至少一个共价连接。

25.权利要求16至24任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述载体蛋白为CRM₁₉₇、SCP、DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)或PD(流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D)。

26.权利要求1至15中任一项所述的制备荚膜糖糖缀合物的方法或权利要求16至25中任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述荚膜糖为来自病原性细菌的荚膜糖。

27.权利要求1至15任一项所述的制备荚膜糖糖缀合物的方法或权利要求16至25中任一项所述的荚膜糖糖缀合物，其中所述荚膜糖为来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的荚膜糖。

28.权利要求1至27任一项所述的制备荚膜糖糖缀合物的方法或荚膜糖糖缀合物，其中所述荚膜糖不是来自肺炎链球菌血清型3的荚膜糖。

29.一种免疫原性组合物，其包含权利要求16至28任一项所述的荚膜糖糖缀合物。