HK40112929A - 使用pd-1 talen基因敲低生成til产物的方法 - Google Patents
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本申请要求2021年9月9日提交的美国临时申请第63/242,373号、2021年9月9日提交的美国临时申请第63/287,670号、2022年3月21日提交的美国临时申请第63/322,190号、2022年6月22日提交的美国临时申请第63/354,605号和2022年8月1日提交的美国临时申请第63/394,248号的优先权，所述临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明背景
使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性自体转移来治疗庞大的难治性癌症代表着用于治疗预后差的患者的有效方法。Gattinoni等人,Nat.Rev.Immunol.2006,6,383-393。TIL以T细胞为主，并且基于IL-2的TIL扩增后接“快速扩增过程”(REP)因其速度和效率而成为TIL扩增的优选方法。Dudley等人,Science 2002,298,850-54；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-57；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-39；Riddell等人,Science 1992,257,238-41；Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42。已探索了许多提高黑素瘤对TIL疗法的反应并且将TIL疗法扩展至其他肿瘤类型的方法，但成功有限，并且所述领域仍具有挑战性。Goff等人,J.Clin.Oncol.2016,34,2389-97；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-39；Rosenberg等人,Clin.Cancer Res.2011,17,4550-57。还描述了与单一免疫检查点抑制剂的组合研究，但正在进行进一步研究并且需要额外治疗方法(Kverneland等人,Oncotarget,2020,11(22),2092-2105)。
此外，当前的TIL制造和治疗过程受到长度、成本、无菌问题和本文中所述的其他因素的限制，使得对于检查点抑制剂疗法的难治性患者的治疗潜力受到严重限制。迫切需要提供基于此类过程的TIL制造过程和疗法，所述过程适用于治疗几乎没有或完全没有可行治疗选项的患者。本发明通过提供用于生成TIL的缩短的制造过程来满足此需要。
本发明提供了用于扩增TIL和产生治疗性TIL群体的改进和/或缩短的过程和方法，包括用于对治疗性TIL群体的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗效果的方法。
发明内容
本文提供了用于扩增TIL和产生治疗性TIL群体的方法，所述方法包括用于对TIL的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗功效的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤组织添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得所述第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或CD3激动剂和CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第五TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(f)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(b)至(f)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变、从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变和/或从步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括：
在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，所述第四TIL群体的培养或快速第二扩增的步骤是通过以下来进行：在第二细胞培养基中培养第四TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时第四TIL群体拆分为多个继代培养物，所述继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL或治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，使用抗CD3激动剂珠粒或抗体进行激活第二TIL群体的步骤。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤是使用OKT-3进行。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤是使用300ng/mL的OKT-3进行。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤是使用抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体进行。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤是使用TransAct进行。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤是使用以1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct进行。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，所述激活第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所述培养第四TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，所述培养第四TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，所述培养第四TIL群体的步骤进行约8-9天。
在一些实施方案中，所述培养第四TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施方案中，所述培养第四TIL群体的步骤进行约8-10天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，所述方法还包括：
在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养或初始扩增第一TIL群体的步骤包括在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，接着在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体2-6天。
在一些实施方案中，培养或快速第二扩增第三TIL群体的步骤是通过以下来进行：在第二细胞培养基中培养第三TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时第三TIL群体拆分成多个继代培养物，所述继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，所述培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所述培养第三TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，所述培养第三TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，所述培养第三TIL群体的步骤进行约8-9天。
在一些实施方案中，所述培养第三TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施方案中，所述培养第三TIL群体的步骤进行约8-10天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约16-18天的时段内完成。
在一些实施方案中，在第一培养基中培养或初始扩增第一TIL群体的步骤中还包含抗CD3和抗CD28珠粒或抗体。
在一些实施方案中，所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含TransAct。
在一些实施方案中，所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含以1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct。
在一些实施方案中，所述第一培养基包含300ng/mL的OKT-3。
在一些实施方案中，培养或初始扩增第一TIL群体的步骤包括在包含IL-2和抗CD3和抗CD28珠粒或抗体的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，接着在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体2-4天。
在一些实施方案中，所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含TransAct。
在一些实施方案中，所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含以1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct。
在一些实施方案中，所述第一培养基包含300ng/mL的OKT-3。
在一些实施方案中，所述经扩增数目的TIL包含治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少两种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤由介导至少两种基因编辑器转移的单个电穿孔事件组成。
在一些实施方案中，在所述电穿孔步骤中至少两种基因编辑器中的每一者是通过电穿孔事件独立于任何其他基因编辑器的转移而单独转移。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括每个电穿孔事件后的静息期。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括介导第一基因编辑器转移以调节第一蛋白质表达的第一电穿孔事件、第一静息期、介导第二基因编辑器转移以调节第二蛋白质表达的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2和/或IL-15的第二细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含300IU/mL、1000IU/mL或6000IU/mL的IL-2的第二细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含15ng/mL的IL-15的第二细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约25、28、30、32、35或37℃与约5％ CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约1至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约10小时至1天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约12小时至24小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约15小时至约18小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤之前为在细胞穿孔缓冲液中洗涤第二或第三TIL群体。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节PD-1表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种基因编辑器包含调节TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和/或CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CTLA-4的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和LAG-3的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CISH的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和TIGIT的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和LAG-3的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和CISH的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节LAG-3和CISH的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节LAG-3和CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CISH和CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自由PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B组成的组，条件是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质不同。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为TIGIT并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一基因编辑器下调第一蛋白质的表达并且所述第二基因编辑器下调第二蛋白质的表达。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞(APC)为PBMC。
在一些实施方案中，所述PBMC是经照射并且同种异体的。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，所述IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在一些实施方案中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织被加工成多个肿瘤片段。
在一些实施方案中，将所述肿瘤片段添加到密闭系统中。
在一些实施方案中，将150个或更少的片段、100个或更少的片段、或50个或更少的片段添加到密闭系统中。167.一种经基因编辑的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其包含经扩增的TIL群体，其中至少一种蛋白质的表达受转移到经扩增的TIL群体的至少一部分中的基因编辑器的调节。
在一些实施方案中，所述基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述至少两种蛋白质的表达由转移到经扩增的TIL群体的至少一部分中的至少两种基因编辑器调节，其中所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自由PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B组成的组，条件是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质不同。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一TALE蛋白和所述第二TALE蛋白选自由LAG-3和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，本文公开的经基因编辑的TIL群体是通过本文公开的方法制造。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文公开的经基因编辑的TIL群体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的本文公开的经基因编辑的TIL群体。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-8天以获得所述第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使所述第三TIL群体静息约1天；
(g)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体来进行第二扩增，以产生第四TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得所述第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(h)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中步骤(a)至(h)中的一者或多者在密闭、无菌系统中进行；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；
(j)使用基于二甲亚砜的冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体；以及
(k)将治疗有效剂量的所述经收集的TIL群体从所述输注袋施用至所述患者；
其中所述电穿孔步骤包括递送转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统以抑制PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和/或CBL-B的表达。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CTLA-4表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH和CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH和TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CBL-B和TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，TIL的治疗有效剂量为约1×109至约1×1011个TIL。
在一些实施方案中，在步骤(k)中施用治疗有效剂量的经收集的TIL群体之前，已对患者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在一些实施方案中，所述方法还包括用在步骤(k)中向患者施用治疗有效剂量的经收集的TIL群体之后第二天起始的高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为转移性黑素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为NSCLC。
在一些实施方案中，所述癌症为转移性NSCLC。
在一些实施方案中，所述基因编辑引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。
附图说明
图1：示例性Gen 2(过程2A)图表，其提供步骤A至F的概述。
图2A至图2C：用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的一个实施方案的过程流程图。
图3：显示经冷冻保存的TIL示例性制造过程(约22天)的一个实施方案的图。
图4：显示Gen 2(过程2A，一种用于TIL制造的22天过程)的一个实施方案的图。
图5：过程1C和用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的示例性实施方案的步骤A至F的比较表。
图6：过程1C的一个实施方案和用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的一个实施方案的详细比较。
图7：示例性Gen 3型TIL制造过程。
图8A至图8P：A)显示2A过程(约22天过程)与用于TIL制造的Gen 3过程(约14天至16天过程)的一个实施方案之间的比较。B)示例性过程Gen 3图表，其提供步骤A至F的概述(约14天至16天过程)。C)提供三种示例性Gen 3过程的图表，其中概述三种过程变化形式中的每一者的步骤A至F(约14天至16天过程)。D)示例性经修改的类Gen 2过程，其提供步骤A至F的概述(约22天过程)。E-P)KO TIL TALEN过程的示例性实施方案的示意图。
图9：提供Gen 2(过程2A)与Gen 3过程之间的可比较性的实验流程图。
图10：显示各种Gen 2(过程2A)与Gen 3.1过程实施方案之间的比较。
图11：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图12：Gen 3过程(称为Gen 3.1)的一个实施方案的培养基条件的概述。
图13：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图14：比较Gen 2和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图15：提供所描述的扩增过程的各种实施方案中的培养基使用的表。
图16：Gen 3过程(16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图17：使用Gen 3扩增平台扩增来自造血性恶性疾病的T细胞的方法的一个示例性实施方案的示意图。
图18：提供结构I-A和I-B。圆柱体是指个别多肽结合域。结构I-A和I-B包括三个线性连接的源自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合域，其折叠形成三价蛋白质，所述三价蛋白质然后经由IgG1-Fc(包括CH3和CH2域)与第二三价蛋白质连接，所述IgG1-Fc然后经由二硫键(小长椭圆形)将两个三价蛋白质连接在一起，从而稳定结构并提供能够将六个受体的细胞内信号传导域与信号传导蛋白集合在一起以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合域可为包含例如由接头连接的VH和VL链的scFv域，所述接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。
图19：Gen 3过程(16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图20：提供Gen 3.1过程(16天过程)的一个示例性实施方案的过程概述。
图21：Gen 3.1测试过程(16天至17天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图22：Gen 3过程(16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图23：示例性Gen 2和示例性Gen 3过程的比较表。
图24：Gen 3过程(16天至17天过程)制备时间线的一个示例性实施方案的示意图。
图25：Gen 3过程(14天至16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图26A至图26B：Gen 3过程(16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图27：Gen 3过程(16天过程)的一个示例性实施方案的示意图。
图28：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的一个实施方案的比较。
图29：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的一个实施方案的比较。
图30：Gen 3实施方案组成部分。
图31：Gen 3实施方案流程图比较(Gen 3.0、Gen 3.1对照、Gen 3.1测试)。
图32：显示Gen 3过程(16天至17天过程)的一个示例性实施方案的组成部分。
图33：验收标准表。
图34：全规模PD-1KO TIL TALEN过程的实验流程图。
图35：全规模PD-1KO TIL TALEN过程的实验流程图。
图36A至图36D：KO TIL TALEN过程的示例性实施方案的示意图。
图37：实施例12中描述的过程的一个示例性实施方案的示意图。
图38A至图38B：PDCD-1KO TIL的体内功效。A)通过流式细胞术评估的PDCD-1KO效率。B)用PDCD-1KO或模拟TIL过继性转移移植有黑素瘤肿瘤细胞的hIL-2NOG小鼠(每个治疗组n＝14)。包括抗PD-1抗体治疗组合模拟TIL作为PD-1/PD-L1阻断的对照。统计学显著性由*p<0.05、**p<0.01和****p<0.0001表示。
图39A至图39E：TIL产物分析。A)活细胞剂量，B)纯度，C)同一性，D)效能，和E)TIL产物的PDCD-1KO效率。
图40A至图40B：TIL产物分析。A)TIL分化和B)TIL记忆。
图41A至图41B：激活和抑制相关标志物在PDCD-1KO TIL上的表达。
图42A至图42B：PDCD-1KO TIL产物的IL-2非依赖性增殖测定。
图43：PDCD-1KO TIL产物的核型分析结果总结。
图44A至图44B：电穿孔前细胞的细胞存活率(图44A)和复苏倍数(图44B)。
图45A至图45B：电穿孔后细胞的复苏倍数(图45A)和细胞存活率(图45B)。
图46A至图46C：CD3+(图46A)、CD8+(图46B)和CD4+(图46C)细胞的基因敲除效率。
图47A至图47B：电穿孔后细胞的复苏倍数(图47A)和细胞存活率(图47B)。
图48A至图48B：当使用6000IU/mL IL-2时，电穿孔后细胞的复苏倍数(图48A)和细胞存活率(图48B)。
图49A至图49B：当使用各种条件时，电穿孔后细胞的复苏倍数(图49A)和细胞存活率(图49B)。
图50A至图50C：CD3+(图50A)、CD8+(图50B)和CD4+(图50C)细胞的基因敲除效率。
图51：电穿孔前的细胞存活率。
图52：电穿孔前的细胞复苏倍数。
图53A至图53B：电穿孔后细胞的复苏倍数(图53A)和细胞存活率(图53B)。
图54A至图54C：CD3+(图54A)、CD8+(图54B)和CD4+(图54C)细胞的基因敲除效率。
图55A至图55B：各种洗涤步骤后的细胞数目(图55A)和存活率(图55B)。
图56A至图56B：使用PBS洗涤(图56A)或Cyto洗涤(图56B)的各种旋转条件后的细胞数目。
图57A至图57B：使用PBS洗涤(图57A)或Cyto洗涤(图57B)的各种旋转条件后的细胞存活率。
图58A至图58B：各种旋转条件后细胞的总旋转比较细胞数目(图58A)和总旋转比较细胞存活率(图58B)。
图59：各种旋转条件后的总旋转比较细胞损失百分比。
图60A至图60C：电穿孔期间的损失百分比和存活率，特定而言洗涤步骤中的细胞损失百分比(图60A)、电穿孔后的细胞损失百分比(图60B)和电穿孔后的细胞存活率。
图61A至图61C：CD3+(图61A)、CD8+(图61B)和CD4+(图61C)细胞的基因敲除效率。
图62A至图62B：REP收集物的细胞存活率(图62A)和扩增倍数(图62B)。
图63A至图63B：电穿孔后的细胞损失百分比(图63A)和细胞存活率(图63B)。
图64A至图64C：CD3+(图63A)、CD4+(图63B)和CD8+(图63C)细胞的基因敲除效率。
图65A至图65B：REP收集物的扩增倍数(图65A)和细胞存活率(图65B)。
图66A至图66C：细胞生长(图66A)、第一电穿孔基因敲除效率(图66B)和第二电穿孔基因敲除效率(图66C)。
图67：静息3天的生长百分比。
图68A至图68C：PD-1基因敲除效率。
图69：根据NGS的PDCD1基因修饰。
图70A至图70B：在CD3+PD-1-子集中TCR Vβ亚型在主体PD-1KO TIL产物和NE TIL中的分布。
图71A至图71B：如通过MLR(图71A)和多功能性(图71B)测量的PD-1KO TIL效应功能。
图72：M1152 PD-1KO TIL产物的体内抗肿瘤活性。
图73A至图73B：通过蛋白质印迹法(western blot)测量的自体TIL中的TALEN蛋白持久性作为时间的函数。
图74A-F：示例性TIL制造过程。
图75A-B：实施例22中描述的1/2期研究的示意图。
图76：实施例23中描述的数据总结。
图77A-D：来自实施例23的演示日实验的结果。
图78A-C：来自实施例23的氖实验1的结果。
图79A-C：来自实施例23的氙实验1的结果。
图80A-B：来自实施例23的氙实验3的结果。
图81A-C：来自实施例23的氙实验4的结果。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1为莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为重组人类IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为IL-2形式。
SEQ ID NO:6为奈沃白介素α的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为IL-2形式。
SEQ ID NO:8为粘蛋白域多肽。
SEQ ID NO:9为重组人类IL-4蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为重组人类IL-7蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11为重组人类IL-15蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为重组人类IL-21蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13为IL-2序列。
SEQ ID NO:14为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:15为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:16为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO:17为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO:18为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO:19为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO:20为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO:21为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO:22为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO:23为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO:24为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO:25为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO:26为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO:27为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO:28为IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO:29为IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO:30为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO:31为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO:32为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO:33为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO:34为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO:35为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO:36为VL链。
SEQ ID NO:37为轻链。
SEQ ID NO:38为轻链。
SEQ ID NO:39为轻链。
SEQ ID NO:40为人类4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41为鼠类4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO:43为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO:44为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:45为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:46为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO:47为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO:48为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO:49为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:50为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:51为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:52为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO:53为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO:54为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:55为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:56为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO:57为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO:58为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO:59为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:60为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:61为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:62为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc域。
SEQ ID NO:63为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:64为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:65为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:66为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:67为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:68为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:69为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:70为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:71为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:72为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:73为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc域。
SEQ ID NO:74为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:75为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:76为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:77为4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:78为4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:79为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:80为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:81为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:82为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:83为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:84为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:85为人类OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86为鼠类OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO:88为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO:89为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:90为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:91为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO:92为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO:93为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO:94为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:95为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:96为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:97为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO:98为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO:99为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:100为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:101为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO:102为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO:103为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO:104为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO:105为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO:106为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO:107为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO:108为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO:109为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:110为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:111为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO:112为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO:113为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO:114为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO:115为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO:116为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO:117为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:118为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:119为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO:120为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO:121为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO:122为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO:123为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO:124为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO:125为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:126为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:127为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO:128为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO:129为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO:130为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO:131为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO:132为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO:133为OX40配体(OX40L)氨基酸序列。
SEQ ID NO:134为OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:135为OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO:136为OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:137为OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:138为OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:139为OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:140为OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:141为OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:142为OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:143为OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:144为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:145为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:146为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:147为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:148为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:149为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:150为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:151为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:152为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:153为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:154为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:155为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:156为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:157为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:158为PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:159为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:160为PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:161为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:162为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:163为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:164为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:165为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:166为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:167为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:168为PD-1抑制剂派姆单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:169为PD-1抑制剂派姆单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:170为PD-1抑制剂派姆单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:171为PD-1抑制剂派姆单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:172为PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:173为PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:174为PD-1抑制剂派姆单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:175为PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:176为PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:177为PD-1抑制剂派姆单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:178为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:179为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:180为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:181为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:182为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:183为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:184为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:185为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:186为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:187为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:188为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:189为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:190为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:191为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:192为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:193为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:194为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:195为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:196为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:197为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:198为PD-L1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:199为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:200为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:201为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:202为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:203为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:204为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:205为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:206为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:207为PD-L1抑制剂阿特珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:208为CTLA-4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:209为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:210为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:211为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:212为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:213为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:214为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:215为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:216为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:217为CTLA-4抑制剂伊匹单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:218为CTLA-4抑制剂曲美木单抗(tremelimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:219为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:220为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:221为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:222为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:223为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:224为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:225为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:226为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:227为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:228为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:229为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:230为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:231为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:232为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:233为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:234为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:235为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:236为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:237为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:238为示例性Clo05 l核酸酶域氨基酸序列。
SEQ ID NO:239为示例性piggyBac(PB)转座酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:240为示例性睡美人转座酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:241为示例性过度活跃的睡美人(SB100X)转座酶氨基酸序列。
I.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提及的所有专利和公开都通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration/co-administering)”、“与……组合施用(administered in combination with/administering in combinationwith)”、“同时(simultaneous)”和“并行(concurrent)”涵盖向受试者施用两种或更多种活性药物成分(在本发明的优选实施方案中，例如多种TIL)，使得活性药物成分和/或其代谢物两者同时存在于受试者中。共同施用包括以分开的组合物同时施用、以分开的组合物在不同时间施用或以其中存在两种或更多种活性药物成分的组合物的形式施用。以分开的组合物同时施用和以其中存在两种试剂的组合物的形式施用是优选的。
术语“体内”是指发生于受试者体内的事件。
术语“体外”是指发生于受试者体外的事件。体外测定涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，并且还可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的测定。
术语“离体”是指涉及对已从受试者身体取出的细胞、组织和/或器官进行治疗或执行程序的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者体内。
术语“快速扩增”意指抗原特异性TIL的数目在一周时间内增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选地在一周时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选在一周时间内增加至少约100倍。本文中描述多种快速扩增方案。
本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”意指最初作为已离开受试者血流并迁移至肿瘤中的白细胞获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀手细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和继代TIL两者。“原代TIL”是如本文所概述的从患者组织样品获得的TIL(有时称为“新鲜收集”)，并且“继代TIL”是任何如本文中所论述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)主体TIL和经扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞群体可包含经基因修饰的TIL。
本文中的“细胞群体”(包含TIL)意指许多具有共同特质的细胞。通常，群体的数目在1×106至1×1010的范围内，其中不同的TIL群体包含不同数目。例如，原代TIL在IL-2的存在下的初始生长产生大约1×108个细胞的主体TIL群体。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群体用于输注。
本文中“冷冻保存的TIL”意指在约-150℃至-60℃的范围内处理并且储存TIL，无论是原代的、主体的或经扩增的(REP TIL)。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包含在实施例中描述。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作原代TIL来源的冷冻组织样品区分。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”意指先前经冷冻保存并且然后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群体。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一者或多者分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。
术语“冷冻保存培养基(cryopreservation media/cryopreservation medium)”是指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％ DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及其组合。术语“CS10”是指获自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基为包含DMSO的无血清、无动物成分的培养基。在一些实施方案中，CS10培养基包含10％ DMSO。
术语“中央记忆T细胞”是指在人类中为CD45R0+并且组成性表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)的T细胞子集。中央记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中央记忆T细胞在TCR触发后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中央记忆T细胞主要存在于血液的CD4隔室中，并且在人类中按比例富集于淋巴结和扁桃体中。
术语“效应记忆T细胞”是指人类或哺乳动物T细胞的子集，如中央记忆T细胞，为CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成性表达(CCR7lo)并且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62Llo)。中央记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后快速分泌高水平炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8隔室中，并且在人类中按比例富集于肺、肝脏和肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
术语“密闭系统”是指对外部环境密闭的系统。适用于细胞培养方法的任何密闭系统都可用于本发明的方法。密闭系统包括例如(但不限于)密闭G容器。一旦将肿瘤区段添加到密闭系统中，所述系统就不对外部环境开放，直至TIL准备好向患者施用为止。
如本文所用，术语“片段化(fragmenting)”、“片段(fragment)”和“片段化的(fragmented)”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械片段化方法，例如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC为一种类型的抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞优选是经照射的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”是指从外周血扩增的T细胞。在一些实施方案中，PBL是与来自供体的全血或单采术产物分离。在一些实施方案中，PBL是通过正向或负向选择T细胞表型(例如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或单采术产物分离。
术语“抗CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人类、人源化、嵌合、鼠类或哺乳动物抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体，并且包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotech公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA,USA))和莫罗单抗或其变体、保守性氨基酸取代、糖化形式或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)。能够产生OKT-3的杂交瘤寄存于美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)并且指定ATCC登记号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也寄存于欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)并且指定目录号86022706。
表1.莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白介素-2的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-2描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人类IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:3)。例如，术语IL-2涵盖人类重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含2200万IU)以及由美国新罕布什尔州朴茨茅斯(Portsmouth,NH,USA)的CellGenix公司(CELLGRO GMP)或美国新泽西州东不伦瑞克(East Brunswick,NJ,USA)的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(去丙氨酰基-1，丝氨酸-125人类IL-2)为分子量大约15kDa的非糖基化人类重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:4)。术语IL-2还涵盖如本文中所描述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前药贝培阿地白介素(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如同SEQ ID NO:4的聚乙二醇化人类重组IL-2，其中平均6个赖氨酸残基被[(2,7-双{[甲基聚(氧乙烯)]氨基甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基N6取代)，其可购自美国加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco,CA,USA)的NektarTherapeutics，或者可通过本领域中已知的方法制备，例如国际专利申请公开第WO 2018/132496 A1号的实施例19中描述的方法或美国专利申请公开第US2019/0275133 A1号的实施例1中描述的方法，所述公开的公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的贝培阿地白介素(NKTR-214)和其他聚乙二醇化IL-2分子描述于美国专利申请公开第US2014/0328791A1号和国际专利申请公开第WO 2012/065086 A1号中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利第4,766,106号、第5,206,344号、第5,089,261号和第4,902,502号中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利第6,706,289号中，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为可购自Synthorx公司的THOR-707。THOR-707和适用于本发明的额外替代形式的IL-2的制备和特性描述于美国专利申请公开第US 2020/0181220 A1号和第US 2020/0330601 A1号中，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离和纯化的IL-2多肽；以及在选自以下的氨基酸位置结合至分离和纯化的IL-2多肽的缀合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自R38和K64。在一些实施方案中，氨基酸位置选自E61、E62和E68。在一些实施方案中，氨基酸位置在E62。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯基丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱氨酸。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，IL-2缀合物与IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力为与IL-2Rα的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些实施方案中，缀合部分削弱或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施方案中，缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物各独立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚噁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物各独立地包含PEG。在一些实施方案中，PEG为线性PEG或分支PEG。在一些实施方案中，水溶性聚合物各独立地包含多糖。在一些实施方案中，多糖包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，水溶性聚合物各独立地包含聚糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物各独立地包含多元胺。在一些实施方案中，缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质各独立地包含白蛋白、转铁蛋白(transferrin)或转甲状腺素蛋白(transthyretin)。在一些实施方案中，蛋白质各独立地包含Fc部分。在一些实施方案中，蛋白质各独立地包含IgG的Fc部分。在一些实施方案中，缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，额外的缀合部分包含多肽。在一些实施方案中，多肽各独立地包含XTEN肽、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白质(GLK)聚合物。在一些实施方案中，分离和纯化的IL-2多肽通过谷氨酰化修饰。在一些实施方案中，缀合部分直接结合至分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，缀合部分经由接头间接结合至分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，接头包含同型双官能接头。在一些实施方案中，同型双官能接头包含罗曼特氏试剂(Lomant's reagent)二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、糖基双(琥珀酰亚胺基丁二酸)亚乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、己二亚氨酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代双丙酰亚胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含有芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方案中，接头包含异型双官能接头。在一些实施方案中，异型双官能接头包含3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(sIAB)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、碘乙酸对硝苯酯(NPIA)、羰基反应性和硫氢基反应性交联剂，例如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮水杨基酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮水杨基酰胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基丁二酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-叠氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sADP)、4-(对叠氮苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸对硝苯酯(ρNPDP)、对硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮苯基乙二醛(APG)。在一些实施方案中，接头包含可裂解接头，任选地包含二肽接头。在一些实施方案中，二肽接头包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方案中，接头包含不可裂解接头。在一些实施方案中，接头包含顺丁烯二酰亚胺基，任选地包含顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方案中，接头还包含间隔子。在一些实施方案中，间隔子包含对氨基苯甲基醇(PAB)、对氨基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，额外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为本文所描述的任一种IL-2形式的片段。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是如美国专利申请公开US 2020/0181220 A1号和美国专利申请公开US2020/0330601 A1号中所公开般聚乙二醇化。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和参照SEQ ID NO:5内的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方案中，IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO:5的一个残基的N端缺失。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链接合，但保持与中间亲和力IL-2Rβ-γ信号传导复合物的正常结合。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和参照SEQ ID NO:5内的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和参照SEQ ID NO:5内的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)，其共价连接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；和参考SEQ ID NO:5内的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为奈沃白介素α(也称为ALKS-4230(SEQ ID NO:6)，其可购自Alkermes公司)。奈沃白介素α也称为人类白介素2片段(1-59)变体(Cys125>Ser51)，其经由肽基接头(60GG61)融合至人类白介素2片段(62-132)，所述片段经由肽基接头(133GSGGGS138)融合至人类白介素2受体α链片段(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，经糖基化；人类白介素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125(51)>Ser]-突变体(1-59)，其经由G2肽接头(60-61)融合至人类白介素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)并且经由GSG3S肽接头(133-138)融合至人类白介素2受体α链(IL2R亚基α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖型α。奈沃白介素α的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:6中。在一些实施方案中，奈沃白介素α展现以下翻译后修饰：在以下位置处的二硫桥键：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO:6中的编号)，以及在以下位置处的糖基化位点：N187、N206、T212(使用SEQ IDNO:6中的编号)。奈沃白介素α的制备和特性以及适用于本发明的IL-2的额外替代形式描述于美国专利申请公开第US2021/0038684 A1号和美国专利第10,183,979号中，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式具有SEQ ID NO:6中所提供的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为包含SEQ ID NO:7的氨基酸24-452的融合蛋白或其变体、片段或衍生物。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为包含与SEQ IDNO:7的氨基酸24-452具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白，或其变体、片段或衍生物。适用于本发明的其他IL-2形式描述于美国专利第10,183,979号中，其公开内容通过引用并入本文。任选地，在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为包含第一融合伴侣的融合蛋白，所述第一融合伴侣通过粘蛋白域多肽接头连接至第二融合伴侣，其中所述第一融合伴侣为IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％氨基酸序列同一性并且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性的蛋白质，并且其中第二融合伴侣包含全部或一部分包含Fc区的免疫球蛋白，其中粘蛋白域多肽接头包含SEQ ID NO:8或与SEQ IDNO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中与第一融合伴侣在不存在粘蛋白域多肽接头的情况下与第二融合伴侣的融合相比，融合蛋白的半衰期有所改进。
表2.白介素的氨基酸序列。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子移植蛋白质，所述抗体细胞因子移植蛋白质包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和移植到VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，其中相对于调节性T细胞，所述抗体细胞因子移植蛋白质优先扩增T效应细胞。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植到VH或VL的CDR中，其中所述IL-2分子为突变蛋白，并且其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方案中，IL-2方案包含施用美国专利申请公开第US 2020/0270334 A1号中所描述的抗体，所述公开的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和移植到VH或VL的CDR中的IL-2分子或其片段，其中所述IL-2分子为突变蛋白，其中相对于调节性T细胞，所述抗体细胞因子移植蛋白优先扩增T效应细胞，并且其中所述抗体还包含选自由以下组成的组的IgG类重链和IgG类轻链：包含SEQ ID NO:39的IgG类轻链和包含SEQ ID NO:38的IgG类重链；包含SEQ ID NO:37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO:29的IgG类重链；包含SEQ ID NO:39的IgG类轻链和包含SEQ ID NO:29的IgG类重链；和包含SEQ ID NO:37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO:38的IgG类重链。
在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VH的HCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VH的HCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VH的HCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VL的LCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VL的LCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植到VL的LCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N端区处或附近，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会将CDR序列移码。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N端区处，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列的一个或两个氨基酸，或整个CDR序列。
在一些实施方案中，IL-2分子直接移植到无肽接头的CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间没有另外的氨基酸。在一些实施方案中，IL-2分子间接移植到具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个或多个另外的氨基酸。
在一些实施方案中，本文所描述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开第US 2020/0270334A1号中表1中的氨基酸序列，所述公开的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含选自由SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25组成的组的HCDR1。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16组成的组的HCDR1。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含选自由以下组成的组的HCDR1：选自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26组成的组的HCDR2。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含选自由SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27组成的组的HCDR3。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含VH区，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含重链，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含VL区，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含VH区，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和VL区，其包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含重链区，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；和轻链区，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含重链区，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；和轻链区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含重链区，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；和轻链区，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白质包含重链区，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；和轻链区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号的IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其变体、衍生物或片段，或其保守性氨基酸取代，或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的蛋白质。在一些实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子移植蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些实施方案中，本文中所描述的抗体细胞因子移植蛋白质的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或类似分子)长。在一些实施方案中，本文中所描述的抗体细胞因子移植蛋白质具有如表3中所阐述的序列。
表3：示例性帕利珠单抗抗体-IL-2移植蛋白质的序列
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)是指被称为白介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在由IL-4激活后，Th2 T细胞随后以正回馈回路产生额外IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并且诱导来自B细胞的类别转换至IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人类IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA)的ThermoFisher Scientific公司(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人类IL-4的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:9)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白介素7的糖基化组织衍生性细胞因子，其可获自基质和上皮细胞以及树突状细胞。Fry和Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7可刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α和共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育和在周边内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人类IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific公司(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人类IL-7的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:10)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白介素-15的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚基。重组人类IL-15是分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(和N端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific公司(人类IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人类IL-15的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:11)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白介素-21的多效性细胞因子蛋白，并且包括所有形式的IL-21，包括人类和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95，其公开内容通过引用并入本文。IL-21主要通过自然杀手T细胞和活化的人类CD4+T细胞产生。重组人类IL-21是分子质量为15.4kDa的含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisherScientific公司(人类IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人类IL-21的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:21)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明组合物待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和疾患的个别差异来确定。通常可说明本文所描述的包含肿瘤浸润淋巴细胞(例如继代TIL或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/千克体重(例如，105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/千克体重)的剂量施用，包括在所述范围内的所有整数值。TIL(在一些情况下，包括经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以这些剂量多次施用。TIL(在一些情况下，包括基因工程化TIL)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.1988,319,1676)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易由医药领域的技术人员通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗来确定。
术语“血液科恶性疾病(hematological malignancy/hematologic malignancy)”或有相关含义的术语是指哺乳动物造血和淋巴组织(包括(但不限于)血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液科恶性疾病也称为“液体肿瘤”。血液科恶性疾病包括(但不限于)急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液科恶性疾病”是指影响B细胞的血液科恶性疾病。
术语“液体肿瘤”是指性质上为流体的异常细胞团块。液体肿瘤癌症包括(但不限于)白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液科恶性疾病。获自液体肿瘤的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤(包括在外周血中循环的液体肿瘤)的TIL在本文中也可称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用并且仅基于衍生细胞的组织类型而有所不同。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境是指以下的复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性并且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号传导分子、细胞外基质和机械信号”，如Swartz等人,Cancer Res.,2012,72,2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一些实施方案中，本发明包括用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，可提供TIL群体，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，非清髓性化学疗法为环磷酰胺60mg/kg/d持续2天(在TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/d持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施方案中，在根据本发明的非清髓性化学疗法和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞并且竞争免疫系统的组件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文中所描述的化合物或化合物组合的量，其足以实现预期应用，包括(但不限于)疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或施用方式而变化。所述术语也适用于将诱发目标细胞中的特定反应(例如血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将根据以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时序、其所施用的组织和其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗(treatment/treating/treat)”等是指获得所要的药理学和/或生理学效应。所述效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，并且/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人类中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中出现所述疾病；(b)抑制疾病，即，遏制其发展或进展；和(c)缓解疾病，即，引起疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”也意欲涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或疾患的情况下也如此。例如，“治疗”涵盖可在不存在疾病状况的情况下(例如在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
术语“非清髓性化学疗法”、“非清髓性淋巴细胞耗竭”、“NMALD”、“NMA LD”、“NMA-LD”和上述术语的任何变体可互换使用，以指示旨在耗竭患者的淋巴样免疫细胞同时避免耗竭患者的髓样免疫细胞的化学治疗方案。通常，在如本文所述向患者施用肿瘤浸润淋巴细胞之前，患者接受一个疗程的非清髓性化学疗法。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”指示核酸或蛋白质包含两个或更多个在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。例如，通常以重组方式产生核酸，其具有两个或更多个来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白指示蛋白质包含两个或更多个在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性(sequenceidentity)”、“同一性百分比(percent identity)”和“序列同一性百分比(sequencepercent identity)”(或其同义词，例如“99％同一”)是指两个或更多个序列或子序列在进行比较和比对(需要时引入空位)以达到最大对应性并且不将任何保守性氨基酸取代视为序列同一性的部分时，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。用以确定序列同一性百分比的适合的程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心(U.S.Government's National Center for Biotechnology Information)BLAST网站的BLAST程序包。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的Genentech)或MegAlign(可购自DNASTAR)是另外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件来确定用于最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖(但不限于)包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列内或相邻的某些位置有一个或多个取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包含一个或多个保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体还包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”意指最初作为已离开受试者血流并迁移至肿瘤中的白细胞获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀手细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和继代TIL两者。“原代TIL”是如本文中所概述的从患者组织样品获得的细胞(有时称为“新鲜收集”)，并且“继代TIL”是任何如本文中所论述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)如本文中所论述的主体TIL和经扩增的TIL(“REP TIL”)以及“reREP TIL”。reREP TIL可包括例如第二扩增TIL或第二额外扩增TIL(例如图8的步骤D中所描述的TIL，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一者或多者分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。TIL可进一步通过效能表征，例如，如果例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可视为强效的。如果例如干扰素(IFNγ)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，则TIL可视为强效的。
术语“脱氧核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未经修饰的和经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中的脱氧核糖核苷酸之间的连接。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。术语“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA，以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文中所描述的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则涵盖其在本发明的治疗性组合物中的使用。例如其他药物的额外活性药物成分也可并入所描述的组合物和方法中。
术语“约”和“大约”意指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在既定值或范围的一个数量级内，优选地50％内，更优选地20％内，再更优选地10％内，并且甚至更优选地5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差异取决于研究下的特定系统，并且可由本领域普通技术人员容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”意指尺寸、大小、制剂、参数、形状和其他数量(quantity)和特征并不精确并且不需要精确，而是可以视需要为近似值和/或较大或较小的，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。一般而言，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征都为“约”或“大约”的。应注意，大小、形状和尺寸非常不同的实施方案可采用所描述的布置。
当以原始和修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包含(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“由……组成(consisting of)”相对于哪些未叙述的另外的技术方案要素或步骤(如果存在)被排除在权利要求的范围之外来定义技术方案范围。术语“包含”旨在为包含性的或开放性的，并且不排除任何另外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由……组成”不包含除权利要求中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，并且在后一情况中排除与指定材料一般相关的杂质。术语“基本上由……组成”将技术方案的范围限于所指定要素、步骤或材料和实质上不影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施方案中，本文所描述的实施本发明的所有组合物、方法和试剂盒可由任何过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”和其复数形式“抗体(antibodies)”是指完整的免疫球蛋白和任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”进一步指包括通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个域CL。抗体的VH和VL区可进一步细分成高变区，其称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，并且其可穿插有保守性更高的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一个或多个表位相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包含免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”是指诱导免疫反应的物质。在一些实施方案中，如果通过主要组织相容复合物(MHC)分子呈递，则抗原为能够由抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还涵盖T细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别。在一些实施方案中，抗原能够诱导引起B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的激活的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，这可能需要抗原含有或连接至Th细胞表位。抗原还可具有一个或多个表位(例如B表位和T表位)。在一些实施方案中，抗原优选将通常以高特异性和选择性方式与其对应抗体或TCR反应，并且不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式是指单一分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识和技术制得：向测试受试者注射适合抗原，并且然后分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合于编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA放置于表达载体中，然后转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组产生将在下文更详细地描述。
如本文所用，术语抗体(或简单地说“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留特异性结合于抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种二价片段，其包含铰链区处通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)域抗体(dAb)片段(Ward等人,Nature,1989,341,544-546)，其可由一个VH或一个VL域组成；和(vi)经分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域(VL和VH)是由独立基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，所述合成接头使得能够将所述两个域制造成其中VL与VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人,Science 1988,242,423-426；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,5879-5883)。此类scFv抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选片段。在一些实施方案中，scFv蛋白域包含VH部分和VL部分。scFv分子在VL域为scFv分子的N端部分的情况下表示为VL-L-VH，或者在VH域为scFv分子的N端部分的情况下表示为VH-L-VL。用于制备scFv分子和设计适合的肽接头的方法描述于美国专利第4,704,692号；美国专利第4,946,778号；R.Raag和M.Whitlow,“Single Chain Fvs.”FASEB第9卷:73-80(1995)；和R.E.Bird和B.W.Walker,Single Chain Antibody Variable Regions,TIBTECH,第9卷:132-137(1991)中，其公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“人类抗体”旨在包括满足以下条件的抗体：具有其中框架区和CDR区都源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人类抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人类框架序列上的抗体。
术语“人类单克隆抗体”是指具有可变区的呈现单一结合特异性的抗体，所述可变区中的框架和CDR区都源自人类种系免疫球蛋白序列。在一些实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因非人类动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体；(c)从重组、组合人类抗体库分离的抗体；和(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有其中框架区和CDR区源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组人类抗体可经历体外突变诱发(或当使用人类Ig序列的转基因动物时，体内体细胞突变诱发)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为虽然源自人类种系VH和VL序列并且与其相关，但在体内可能并非天然存在于人类抗体种系谱系内的序列。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，包括抗体与另一种活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”是指与另一种治疗部分缀合的抗体或其片段，所述治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文中所描述的抗体缀合。
术语“人源化抗体(humanized antibody/humanized antibodies)”和“人源化”意指其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人类框架序列上的抗体。可在人类框架序列中进行其他框架区修饰。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式为含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的15个高变区的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部至少一个并且通常两个可变域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环并且全部或基本上全部FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人,Nature1986,321,522-525；Riechmann等人,Nature 1988,332,323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.1992,2,593-596。本文中所描述的抗体也可经修饰以使用已知提供效应功能和/或FcR结合的改进(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如以下所公开的氨基酸取代中的任一者：国际专利申请公开第WO 1988/07089A1号、第WO 1996/14339A1号、第WO 1998/05787A1号、第WO 1998/23289A1号、第WO 1999/51642A1号、第WO 99/58572A1号、第WO 2000/09560A2号、第WO 2000/32767A1号、第WO 2000/42072A2号、第WO 2002/44215A2号、第WO 2002/060919A2号、第WO 2003/074569 A2号、第WO 2004/016750 A2号、第WO 2004/029207 A2号、第WO 2004/035752 A2号、第WO 2004/063351A2号、第WO 2004/074455 A2号、第WO 2004/099249 A2号、第WO 2005/040217 A2号、第WO 2005/070963 A1号、第WO 2005/077981A2号、第WO 2005/092925 A2号、第WO 2005/123780 A2号、第WO2006/019447 A1号、第WO 2006/047350 A2号和第WO 2006/085967A2号；以及美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；和第7,083,784号；其公开内容通过引用并入本文。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一物种的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体并且恒定区序列源自人类抗体的抗体。
“双功能抗体”为具有两个抗原结合位点的小型抗体片段。片段包含重链可变域(VH)，其连接至相同多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变域(VL)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的接头，迫使所述域与另一条链的互补域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更详细地描述于例如欧洲专利第EP 404,097号，国际专利公开第WO 93/11161号；和Bolliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90,6444-6448中。
术语“糖基化”是指抗体的经修饰的衍生物。去糖基化抗体未发生糖基化。糖基化可经改变以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，其引起消除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除所述位点处的糖基化。去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力，如美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中所描述。另外或可替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或等分GlcNac结构增加的抗体。已证明此类经改变的糖基化模式会提高抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已在本领域中描述并且可用作表达本发明的重组抗体以产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709不具有岩藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得表达于Ms704、Ms705和Ms709细胞系中的抗体在其碳水化合物上不具有岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种置换载体进行的所靶向的CHO/DG44细胞中的FUT8基因的断裂而形成(参见例如美国专利公开第2004/0110704号或Yamane-Ohnuki等人,Biotechnol.Bioeng.,2004,87,614-622)。作为另一实例，欧洲专利第EP 1,176,195号描述一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而表现出低岩藻糖基化，并且还描述了如下细胞系：其具有用于将岩藻糖添加到结合于抗体的Fc区的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开WO 03/035835描述变异型CHO细胞系，即Lec 13细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，还引起表达于所述宿主细胞中的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,J.Biol.Chem.2002,277,26733-26740。国际专利公开WO 99/54342描述经工程改造以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得表达于工程化细胞系中的抗体表现出增加的二分GlcNac结构，从而提高抗体的ADCC活性(也参见Umana等人,Nat.Biotech.1999,17,176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶使抗体的岩藻糖残基裂解。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体去除岩藻糖基残基，如Tarentino等人,Biochem.1975,14,5516-5523中所描述。
“聚乙二醇化”是指经修饰的抗体或其片段，其通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，在使一个或多个PEG基团变得连接至抗体或抗体片段的条件下反应。例如，聚乙二醇化可增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化是经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体为去糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的并且可应用于本发明的抗体，如例如欧洲专利第EP0154316号和第EP 0401384号以及美国专利第5,824,778号中所描述，其公开内容各自通过引用并入本文。
术语“生物类似物”意指满足以下条件的生物产品(包括单克隆抗体或蛋白质)：尽管存在临床非活性组分的少量差异，但其与美国核准的参考生物产品极类似，并且生物产品与参考产品之间在产品的安全性、纯度和效能方面不存在临床上有意义的差异。此外，类似生物或“生物类似物”药物为与已被欧洲药物管理局(European Medicines Agency)授权使用的另一种生物药物类似的生物药物。术语“生物类似物”也由其他国家和地区监管机构同义地使用。生物产品或生物药物是由生物来源(例如细菌或酵母)制得或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人类胰岛素或红细胞生成素)或复杂分子(例如单克隆抗体)组成。例如，如果参考IL-2蛋白为阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构批准的参考阿地白介素的蛋白质是“与阿地白介素生物类似”或为“阿地白介素的生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似物”药物为与已由欧洲药物管理局(EMA)授权使用的另一种生物药物类似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号的第6条和指令2001/83/EC的第10(4)条，经修订并且因此在欧洲，生物类似物可根据法规(EC)第726/2004号的第6条和指令2001/83/EC的第10(4)条而授权、批准授权或作为授权提交的对象。经授权的原始生物药物产品在欧洲可被称为“参考药品”。CHMP关于类似生物药物产品的指南中概述了产品被视为生物类似物的一些要求。此外，产品特定指南，包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南，由EMA以逐项产品的方式提供并且发布在其网站上。如本文中所描述的生物类似物可在质量特征、生物活性、作用机制、安全性概况和/或功效方面与参考药品类似。另外，生物类似物可用于或旨在用于治疗与参考药品相同的疾患。因此，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或极类似的质量特征。或者或另外，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或极类似的生物活性。或者或另外，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或极类似的安全性概况。或者或另外，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或极类似的功效。如本文中所描述，在欧洲，已将生物类似物与由EMA授权的参考药品相比较。然而，在一些情况下，在某些研究中，可将生物类似物与在欧洲经济区(European Economic Area)以外获得授权的生物药品(非EEA授权的“比较物”)相比较。此类研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物类似物”也涉及已与或可与非EEA授权的比较物相比较的生物药品。某些生物类似物是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物类似物可具有氨基酸序列，其在氨基酸结构中具有不显著影响多肽功能的少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)。生物类似物可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％或更高，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。生物类似物可包含与参考药品的翻译后修饰不同的一个或多个翻译后修饰，例如(但不限于)糖基化、氧化、去酰胺和/或截短，条件是所述差异不会引起药品的安全性和/或功效的变化。生物类似物可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特别是，但非排他性地，如果所述差异解决或旨在解决与参考药品相关的安全性问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外，生物类似物可在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈递方式方面与参考药品不同，条件是不损害药品的安全性和功效。与参考药品相比，生物类似物可包含例如药物动力学(PK)和/或药效动力学(PD)概况的差异，但仍视为与参考药品充分类似，从而可被授权或视为适于授权。在某些情况下，生物类似物表现出与参考药品相比不同的结合特征，其中监管机构(例如EMA)未将所述不同结合特征视为类似生物产品获得授权的障碍。术语“生物类似物”也由其他国家和地区监管机构同义地使用。
II.基因编辑过程
A.概述：TIL扩增+基因编辑
本发明的实施方案涉及用于扩增TIL群体的方法，所述方法包括一个或多个对TIL的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗作用的步骤。如本文所用，“基因编辑(gene-editing/gene editing)”和“基因组编辑”是指一种基因修饰，其中在细胞的基因组中永久性修饰DNA，例如在细胞的基因组内插入、缺失、修饰或置换DNA。在一些实施方案中，基因编辑引起DNA序列表达的沉默(有时称为基因敲除)或抑制/降低(有时称为基因敲低)。根据本发明的实施方案，使用基因编辑技术来增强治疗性TIL群体的有效性。
可根据本文中所描述的方法的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法还包括对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据其他实施方案，根据WO 2018/081473A1、WO 2018/129332 A1或WO 2018/182817 A1中所描述的方法的任何实施方案进行用于将TIL扩增成治疗性TIL群体的方法，所述文献通过引用整体并入本文，其中所述方法还包括对TIL的至少一部分进行基因编辑。因此，本发明的一个实施方案提供已根据本文中所描述的任何实施方案扩增的治疗性TIL群体，其中至少一部分治疗性群体已经基因编辑，例如至少一部分转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
B.TIL扩增期间的基因编辑
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(f)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，在包含IL-2的第三细胞培养基中培养所述多个继代培养物中的每一者约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(g)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，在包含IL-2的第三细胞培养基中培养所述多个继代培养物中的每一者约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述方法包括培养或初始扩增第一TIL群体的步骤，包括在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，接着在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养2-6天。
在一些实施方案中，所述方法包括通过在第二细胞培养基中培养第三TIL群体约1-7天的第一时段来进行培养或快速第二扩增第三TIL群体的步骤，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，将所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天、约3-8天、约4-8天、约5-8天、约6-8天、约7-8天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天、约1-2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5-15天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5-15天、约6-15天、约7-15天、约8-15天、约9-15天、约10-15天、约11-15天、约12-15天、约13-15天、约14-15天、约5-14天、约6-14天、约7-14天、约8-14天、约9-14天、约10-14天、约11-14天、约12-14天、约13-14天、约5-13天、约6-13天、约7-13天、约8-13天、约9-13天、约10-13天、约11-13天、约12-13天、约5-12天、约6-12天、约7-12天、约8-12天、约9-12天、约10-12天、约11-12天、约5-11天、6-11天、7-11天、约8-11天、约9-11天、约10-11天、约5-10天、6-10天、7-10天、约8-10天、约9-10天、约5-9天、6-9天、7-9天、约8-9天、约5-8天、约6-8天、7-8天、约5-7天、约6-7天、约5-6天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约9天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约10天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约11天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约12天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约13天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约14天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约23天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约24天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约25天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约26天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约27天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约28天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约29天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约30天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约31天的时段内完成。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(e)、(a)-(f)或(a)-(g)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天、约3-8天、约4-8天、约5-8天、约6-8天、约7-8天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤5天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5-15天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5-15天、约6-15天、约7-15天、约8-15天、约9-15天、约10-15天、约11-15天、约12-15天、约13-15天、约14-15天、约5-14天、约6-14天、约7-14天、约8-14天、约9-14天、约10-14天、约11-14天、约12-14天、约13-14天、约5-13天、约6-13天、约7-13天、约8-13天、约9-13天、约10-13天、约11-13天、约12-13天、约5-12天、约6-12天、约7-12天、约8-12天、约9-12天、约10-12天、约11-12天、约5-11天、6-11天、7-11天、约8-11天、约9-11天、约10-11天、约5-10天、6-10天、7-10天、约8-10天、约9-10天、约5-9天、6-9天、7-9天、约8-9天、约5-8天、约6-8天、7-8天、约5-7天、约6-7天、约5-6天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约9天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约10天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约11天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约12天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约13天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约14天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约23天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约24天的时段内完成。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第三TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第三TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(d)或(a)-(e)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(d)或(a)-(e)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(d)或(a)-(e)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，然后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(e)所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，将所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(f)所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，将所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3-9天、约3-8天、约4-8天、约5-8天、约6-8天、约7-8天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约1-7天、约2-7天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天、约1-2天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约1天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3-6天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约23天的时段内完成。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)或(a)-(f)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)或(a)-(f)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(e)或(a)-(f)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2-4天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约2-4天、约3-4天、约2-3天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5-15天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5-15天、约6-15天、约7-15天、约8-15天、约9-15天、约10-15天、约11-15天、约12-15天、约13-15天、约14-15天、约5-14天、约6-14天、约7-14天、约8-14天、约9-14天、约10-14天、约11-14天、约12-14天、约13-14天、约5-13天、约6-13天、约7-13天、约8-13天、约9-13天、约10-13天、约11-13天、约12-13天、约5-12天、约6-12天、约7-12天、约8-12天、约9-12天、约10-12天、约11-12天、约5-11天、6-11天、7-11天、约8-11天、约9-11天、约10-11天、约5-10天、6-10天、7-10天、约8-10天、约9-10天、约5-9天、6-9天、7-9天、约8-9天、约5-8天、约6-8天、7-8天、约5-7天、约6-7天、约5-6天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约9天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约10天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约11天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约12天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约13天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约14天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(f)或(a)-(g)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(f)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，将所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(g)将所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，将所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2-4天。在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约2-4天、约3-4天、约2-3天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约1-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天、约1-2天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约1天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3-6天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约3天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约4天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约5天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约6天。在一些实施方案中，培养多个继代培养基中的每一者的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(f)或(a)-(g)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中进行所述第一TIL群体的初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至9天的时段；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在第二细胞培养基中进行所述第四TIL群体的快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中进行所述第一TIL群体的初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至9天的时段；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中进行所述第三TIL群体的快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化肿瘤片段以产生肿瘤消化物；
(c)在第一细胞培养基中进行所述第一TIL群体的初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至9天的时段；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在第二细胞培养基中进行所述第四TIL群体的快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(a)获得和/或接收来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化肿瘤片段以产生肿瘤消化物；
(c)在第一细胞培养基中进行所述第一TIL群体的初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至9天的时段；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(e)在第二细胞培养基中进行所述第三TIL群体的快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，初始扩增进行约3-9天。在一些实施方案中，初始扩增进行约1-9天、2-9天、3-9天、约4-9天、约5-9天、约6-9天、约7-9天、约8-9天、约1-8天、约2-8天、约3-8天、约4-8天、约5-8天、约6-8天、约7-8天、约1-7天、约2-7天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天或约1-2天。在一些实施方案中，初始扩增进行约1天。在一些实施方案中，初始扩增进行约2天。在一些实施方案中，初始扩增进行约3天。在一些实施方案中，初始扩增进行约4天。在一些实施方案中，初始扩增进行约5天。在一些实施方案中，初始扩增进行约6天。在一些实施方案中，初始扩增进行约7天。在一些实施方案中，初始扩增进行约8天。在一些实施方案中，初始扩增进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天、约2-7天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天或约1-2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，快速第二扩增进行约5-15天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约5-15天、约6-15天、约7-15天、约8-15天、约9-15天、约10-15天、约11-15天、约12-15天、约13-15天、约14-15天、约5-14天、约6-14天、约7-14天、约8-14天、约9-14天、约10-14天、约11-14天、约12-14天、约13-14天、约5-13天、约6-13天、约7-13天、约8-13天、约9-13天、约10-13天、约11-13天、约12-13天、约5-12天、约6-12天、约7-12天、约8-12天、约9-12天、约10-12天、约11-12天、约5-11天、6-11天、7-11天、约8-11天、约9-11天、约10-11天、约5-10天、6-10天、7-10天、约8-10天、约9-10天、约5-9天、6-9天、7-9天、约8-9天、约5-8天、约6-8天、7-8天、约5-7天、约6-7天、约5-6天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约5天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约6天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约7天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约8天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约9天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约10天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约11天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约12天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约13天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约14天。在一些实施方案中，快速第二扩增进行约15天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约23天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约24天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约25天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约26天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约27天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约28天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约29天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约30天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约31天的时段内完成。
在一些实施方案中，快速第二扩增是通过在第二培养基中培养第三TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，快速第二扩增是通过在第二培养基中培养第三TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)或(a)-(f)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(e)或(a)-(f)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(e)或(a)-(f)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
根据一些实施方案，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，用于将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤组织添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得第二TIL群体；
(c)使用CD3和CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(f)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(b)至(f)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变、从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变和/或从步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，用于将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织样品或肿瘤片段以产生肿瘤消化物；
(c)将所述肿瘤组织添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得第二TIL群体；
(d)使用CD3和CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(g)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(c)至(g)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变、从步骤(e)至步骤(f)的转变和/或从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，第一扩增进行约3-9天。在一些实施方案中，第一扩增进行约3-9天、约3-8天、约3-7天、约3-6天、约3-5天、约3-4天、约4-9天、约4-8天、约5-9天、约5-8天、约6-9天、约6-8天、约7-9天、约7-8天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约3-5天、约4-5天、约3-4天。在一些实施方案中，第一扩增进行约3天。在一些实施方案中，第一扩增进行约4天。在一些实施方案中，第一扩增进行约5天。在一些实施方案中，第一扩增进行约6天。在一些实施方案中，第一扩增进行约7天。在一些实施方案中，第一扩增进行约8天。在一些实施方案中，第一扩增进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1-7天、约2-7天、约3-7天、4-7天、约5-7天、约6-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天、约1-2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，第二扩增进行约5-15天。在一些实施方案中，第二扩增进行约5-15天、约6-15天、约7-15天、约8-15天、约9-15天、约10-15天、约11-15天、约12-15天、约13-15天、约14-15天、约5-14天、约6-14天、约7-14天、约8-14天、约9-14天、约10-14天、约11-14天、约12-14天、约13-14天、约5-13天、约6-13天、约7-13天、约8-13天、约9-13天、约10-13天、约11-13天、约12-13天、约5-12天、约6-12天、约7-12天、约8-12天、约9-12天、约10-12天、约11-12天、约5-11天、6-11天、7-11天、约8-11天、约9-11天、约10-11天、约5-10天、6-10天、7-10天、约8-10天、约9-10天、约5-9天、6-9天、7-9天、约8-9天、约5-8天、约6-8天、7-8天、约5-7天、约6-7天、约5-6天。在一些实施方案中，第二扩增进行约5天。在一些实施方案中，第二扩增进行约6天。在一些实施方案中，第二扩增进行约7天。在一些实施方案中，第二扩增进行约8天。在一些实施方案中，第二扩增进行约9天。在一些实施方案中，第二扩增进行约10天。在一些实施方案中，第二扩增进行约11天。在一些实施方案中，第二扩增进行约12天。在一些实施方案中，第二扩增进行约13天。在一些实施方案中，第二扩增进行约14天。在一些实施方案中，第二扩增进行约15天。
在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约8天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约9天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约10天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约11天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约12天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约13天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约14天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约15天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约16天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约17天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约18天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约19天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约20天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约21天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约22天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约23天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约24天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约25天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约26天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约27天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约28天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约29天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约30天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约31天的时段内完成。在一些实施方案中，所述方法的步骤在约32天的时段内完成。
在一些实施方案中，第二扩增是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，第二扩增是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约1天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约2天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约3天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约4天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约6天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约4天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约5天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过在第二培养基中培养第四TIL群体约7天的第一时段来进行，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者期间，或在以上方法中所概述的步骤(a)-(f)或(a)-(g)中的任一者之前或之后。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行一次以上。根据某些实施方案，在培养步骤期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”培养步骤)，并且对经收集的TIL进行基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回培养步骤中(例如，引入回培养基中)以继续培养步骤，使得至少一部分最终转移到输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。
应注意，扩增过程的替代实施方案可不同于上文所示的方法；例如，替代实施方案可能不具有相同步骤(a)-(f)或(a)-(g)，或者可具有不同数目的步骤。不考虑具体实施方案，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行。例如，替代实施方案可包括多于两个培养步骤，并且在第三或第四培养步骤期间可能对TIL进行基因编辑，等等。
在一些实施方案中，当TIL仍在培养基中并且正在进行培养步骤时，进行基因编辑，即，它们未必从培养步骤“取出”以进行基因编辑。根据一些实施方案，对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程之后，随后将所述TIL再放置回培养基中。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤。
在一些实施方案中，所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，所述基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所述TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，所述基因编辑器还包含下调CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所述基因编辑器还包含下调LAG-3表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所述基因编辑器还包含下调CISH表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所述基因编辑器还包含下调CBL-B表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所述基因编辑器还包含下调TIGIT表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4的表达下调以及PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3的表达下调以及PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH的表达下调以及PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CBL-B的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B/TIGIT双基因敲除TIL。
在一些实施方案中，基因编辑步骤还包括静息步骤。根据一些实施方案，所述静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育第四TIL群体。根据一些实施方案，所述静息步骤在约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃、约40℃下进行。根据一些实施方案，所述静息步骤进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在约30℃下温育约15小时至约23小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至约23小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约16小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约17小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约18小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约19小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约20小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约21小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约22小时。根据一些实施方案，所述静息步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约23小时。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞(APC)为PBMC。根据一些实施方案，所述PBMC是经照射的。根据一些实施方案，所述PBMC是同种异体的。根据一些实施方案，所述PBMC是经照射并且同种异体的。根据一些实施方案，所述抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织是来自经解剖的肿瘤。
在一些实施方案中，所述经解剖的肿瘤小于8小时。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织选自由以下组成的组：黑素瘤肿瘤组织、头颈部肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、神经胶母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约1.5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2.5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3.5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约4mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约4.5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约5.5mm至6mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约1.5mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2.5mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3.5mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约4mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约4.5mm至5mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约1.5mm至4mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2mm至4mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2.5mm至4mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3mm至4mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约3.5mm至4mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约1.5mm至3mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2mm至3mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约2.5mm至3mm的近似球形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成直径为约1.5mm至2mm的近似球形片段。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少1.5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少2mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少2.5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少3mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少3.5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少4mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少4.5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成最短边长为至少5.5mm且最长边长为约6mm的大致矩形片段。
在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约3mm或约6mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约3mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约3.5mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约4mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约4.5mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约5mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约5.5mm的大致立方体片段。在一些实施方案中，所述肿瘤组织被片段化成边长为约6mm的大致立方体片段。
在一些实施方案中，本发明提供了通过如本文中所述的方法产生的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物的治疗性群体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的通过如本文中所述的方法产生的治疗性TIL群体。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胆管癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：皮肤黑素瘤、眼部黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、结膜恶性黑素瘤、转移性黑素瘤、多形性黄色星形细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、神经节胶质瘤和毛细胞星形细胞瘤、具有显著粘液分化的子宫内膜样腺癌(ECMD)、乳头状甲状腺癌、浆液性低级别或交界性卵巢癌、毛细胞白血病和朗格汉斯细胞组织细胞增生症。
在一些实施方案中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1500IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2500IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3500IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以4000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以4500IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以5000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以5500IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1000IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1500IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2000IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2500IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3000IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3500IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以4000IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以4500IU/mL与5000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1000IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1500IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2000IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2500IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3000IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以3500IU/mL与4000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1000IU/mL与3000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1500IU/mL与3000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2000IU/mL与3000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以2500IU/mL与3000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1000IU/mL与2000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。在一些实施方案中，所述IL-2以1500IU/mL与2000IU/mL之间的初始浓度存在于第一扩增中的细胞培养基中。
在一些实施方案中，第二扩增步骤，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在并且所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施方案中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方案中，所述第一扩增是使用透气容器进行。在一些实施方案中，所述第二扩增是使用透气容器进行。
在一些实施方案中，所述第一细胞培养基还包含选自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合组成的组的细胞因子。在一些实施方案中，所述第二细胞培养基和/或所述第三培养基还包含选自由IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合组成的组的细胞因子。
在一些实施方案中，所述方法还包括在向患者施用TIL或PBL产物之前用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括用在向患者施用TIL或PBL产物之后第二天起始的IL-2方案治疗患者的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括用在向患者施用TIL或PBL产物同一天起始的IL-2方案治疗患者的步骤。在一些实施方案中，所述IL-2方案包含阿地白介素、奈沃白介素或其生物类似物或变体。
在一些实施方案中，所述治疗有效量的TIL产物包含约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
在一些实施方案中，所述第二TIL群体的数目为所述第一TIL群体的至少50倍。
C.PD-1
针对诱导检查点阻断而研究最多的目标之一为程序性死亡受体(PD1或PD-1，也称为PDCD1)，其为T细胞调节剂的CD28超家族的成员。其配体PD-L1和PD-L2表达于各种肿瘤细胞(包括黑素瘤)上。PD-1与PD-L1的相互作用可抑制T细胞效应功能，引起慢性刺激环境下的T细胞耗竭，并且诱导肿瘤微环境中的T细胞凋亡。PD-1也可在肿瘤特异性逃避免疫监视中起作用。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制PD-1的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可涉及使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如PD-1)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1的表达沉默或减少。
D.CTLA-4
CTLA-4表达是在活化T细胞上的T细胞激活时经诱导，并且与抗原呈递细胞激活抗原CD80和CD86竞争结合。CTLA-4与CD80或CD86的相互作用可引起T细胞抑制并用于维持免疫反应的平衡。然而，抑制CTLA-4与CD80或CD86的相互作用可延长T细胞激活并且因此提高针对癌症抗原的免疫反应的水平。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的CTLA-4的表达沉默或减少。根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1与CTLA-4两者的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法(例如，过程2A或图20和图21中所显示的方法)的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制CTLA-4的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如CTLA-4)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法来沉默或抑制TIL中的CTLA-4的表达。在一些实施方案中，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1和CTLA-4的表达沉默或减少。
E.LAG-3
在II类主要组织相容复合物(MHC)接合后，由T细胞和自然杀手(NK)细胞表达淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，CD223)。尽管机制尚不明确，但对其进行调节可引起对T细胞功能的负调节作用，防止组织损伤和自身免疫。因此，LAG-3阻断可改进抗肿瘤反应。参见例如Marin-Acevedo等人,Journal of Hematology&Oncology(2018)11:39。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的LAG-3的表达沉默或减少。根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1和LAG-3两者的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法(例如，过程2A或图20和图21中所显示的方法)的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制LAG-3的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如LAG-3)处的双链或单链断裂的产生。根据特定实施方案，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中的LAG-3的表达。在一些实施方案中，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1和LAG-3的表达沉默或减少。
F.Cish
Cish，细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)家族的成员，由CD8+T细胞中的TCR刺激诱导并抑制其针对肿瘤的功能亲合力。CD8+T细胞中的Cish的基因缺失可增强其扩增、功能亲合力和细胞因子多功能性，引起现有肿瘤的明显和持久消退。参见例如Palmer等人,Journal of Experimental Medicine,212(12):2095(2015)。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的Cish的表达沉默或减少。根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1和Cish两者的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法(例如，过程2A或图20和图21中所显示的方法)的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制Cish的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如Cish)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中的Cish的表达。在一些实施方案中，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1和Cish的表达沉默或减少。
G.CBL-B
CBLB(或CBL-B)为E3泛素-蛋白质连接酶并且为T细胞激活的负调节剂。Bachmaier等人,Nature,2000,403,211-216；Wallner等人,Clin.Dev.Immunol.2012,692639。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的CBL-B的表达沉默或减少。根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1和CBL-B两者的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法(例如，过程2A或图20和图21中所显示的方法)的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制CBL-B的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如CBL-B)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中的PKA的表达。在一些实施方案中，使用TALEN基因敲除使CBL-B沉默。在一些实施方案中，使用TALE-KRAB转录抑制剂基因敲入使CBL-B沉默。关于这些方法的更多细节可见于Boettcher和McManus,Mol.Cell Review,2015,58,575-585中。在一些实施方案中，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1和CBL-B的表达沉默或减少。
H.TIGIT
TIGIT是在调控、记忆和活化的T细胞上表达的细胞表面蛋白。TIGIT属于免疫球蛋白的脊髓灰质炎病毒受体(PVR)家族并抑制T细胞激活。(Yu等人,Nat Immunol.,2009,10(1):48-57)。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的TIGIT的表达沉默或减少。根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法使TIL中的PD-1和TIGIT两者的表达沉默或减少。例如，可根据本文中所描述的方法(例如，过程2A或图20和图21中所显示的方法)的任何实施方案进行用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，其中所述方法包括通过沉默或抑制TIGIT的表达来对TIL的至少一部分进行基因编辑。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如TIGIT)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中的PKA的表达。在一些实施方案中，可使用TALEN基因敲除使TIGIT沉默。在一些实施方案中，使用TALE-KRAB转录抑制剂基因敲入使TIGIT沉默。关于这些方法的更多细节可见于Boettcher和McManus,Mol.Cell Review,2015,58,575-585中。在一些实施方案中，可使用TALEN方法使TIL中的PD-1和TIGIT的表达沉默或减少。
III.基因编辑方法
如上文所论述，本发明的实施方案提供了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其经由基因编辑进行基因修饰以增强其治疗作用。本发明的实施方案涵盖经由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL群体中进行的基因编辑，以抑制一种或多种蛋白质的表达。本发明的实施方案还提供了用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中所述方法包括对TIL进行基因编辑。存在若干种可用于基因修饰TIL群体的基因编辑技术，所述基因编辑技术适合于根据本发明使用。
在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生一种或多种蛋白质的基因的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括反转录病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导步骤。慢病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如Levine等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.2006,103,17372-77；Zufferey等人,Nat.Biotechnol.1997,15,871-75；Dull等人,J.Virology 1998,72,8463-71和美国专利第6,627,442号中，其公开内容各自通过引用并入本文。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-反转录病毒转导步骤。γ-反转录病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如Cepko和Pear,Cur.Prot.Mol.Biol.1996,9.9.1-9.9.16中，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统是本领域中已知的，并且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包含帽和多腺苷酸尾的mRNA)的转座酶的系统。合适的转座子介导的基因转移系统，包括类鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x；和酶活性增加的工程化酶，描述于例如Hackett等人,Mol.Therapy 2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，其公开内容各自通过引用并入本文。
在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生或抑制(例如沉默)一种或多种蛋白质的基因的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法是本领域中已知的，并且描述于例如Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其公开内容各自通过引用并入本文。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；以及(3)第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中的孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；以及(3)第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时段，并且使得维持TIL的存活率。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面涂布和内吞作用)是本领域中已知的并且描述于以下中：Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其公开内容各自通过引用并入本文。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的并且描述于Rose等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，其公开内容各自通过引用并入本文。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其公开内容各自通过引用并入本文。
根据一个实施方案，基因编辑过程可包括使用可程序化核酸酶，所述可程序化核酸酶介导一个或多个免疫检查点基因处的双链或单链断裂的产生。此类可程序化核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即，它们依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶域靶向此位置并介导在目标序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机制募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)目标基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN经由蛋白质-DNA相互作用实现特定DNA结合，而CRISPR系统，例如Cas9，通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA向导分子和通过蛋白质-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,NatureMedicine,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，其在下文中更详细地描述。根据一个实施方案，用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如过程2A)的任何实施方案或如WO2018/081473A1、WO 2018/129332 A1或WO 2018/182817 A1中所描述进行，其中所述方法还包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一者或多者对TIL的至少一部分进行基因编辑，以产生可提供增强的治疗作用的TIL。根据一个实施方案，可通过比较经基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评价相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评价经基因编辑的TIL的改进的治疗作用。
在本发明的一些实施方案中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，并且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
1.TALE方法
可根据本文所描述或如WO 2018/081473 A1、WO 2018/129332A1或WO 2018/182817 A1中所描述的方法的任何实施方案进行用于将TIL扩增成治疗性群体的方法，其中所述方法还包括通过TALE方法对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用TALE方法可引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。或者，在TIL扩增过程期间使用TALE方法可引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表“转录激活因子样效应”蛋白，其包括TALEN(“转录激活因子样效应物核酸酶”)。使用TALE系统来基因编辑的方法在本文中也可称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，并且含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复域构成的DNA结合域。TALE特异性是通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合域中的特异性RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合域。将TALE的DNA结合域与IIS型FokI核酸内切酶的催化域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合和产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可组合TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuti cals(美国肯塔基州列克星敦(Lexington,KY,USA))和Life Technolo gies(美国纽约州格兰德岛(Grand Island,NY,USA))市售。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于美国专利申请公开第US 2011/0201118 A1号、第US 2013/0117869 A1号、第US 2013/0315884 A1号、第US 2015/0203871 A1号和第US 2016/0120906A1号中，其公开内容通过引用并入本文。
可通过经由TALE方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
靶向PD-1基因的TALE-核酸酶的非限制性实例提供于下表中。在这些实例中，靶向基因组序列含有由15-bp间隔子(以小写字母显示)分隔的两个17-碱基对(bp)长序列(称为半目标，以大写字母显示)。每个半目标是由表中所列的半TALE-核酸酶的重复序列识别。因此，根据特定实施方案，根据本发明的TALE-核酸酶识别选自由以下组成的组的目标序列并使其裂解：SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128。TALEN序列和基因编辑方法也描述于Gautron等人,Molecular Therapy:Nucleic Acids 2017年12月,第9卷:312-321，其通过引用并入本文。
可通过经由TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。
用于通过TALE方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其通过引用并入本文。
2.Cas-CLOVER方法
用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如过程2A)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中所述方法还包括通过Cas-CLOVER方法对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用Cas-CLOVER方法可引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。或者，在TIL扩增过程期间使用Cas-CLOVER方法可引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达增强。
Cas-CLOVER为一种二聚体、高保真位点特异性核酸酶(SSN)，其由催化死亡的SpCas9(dCas9)与来自梭菌Clo051 IIs型限制性核酸内切酶的核酸酶域的融合物组成(Madison等人,“Cas-CLOVER is a novel high-fidelity nuclease for safe androbust generation of TSCM-enriched allogeneic CAR-T cells”,Molecular Therapy-Nucleic Acids,2022)。这产生一种核酸酶，其活性基于通过RNA引导识别两个相邻的20-nt目标序列而实现的Clo051核酸酶域的二聚化确定。与配对切口酶方法不同，例如，当使用Cas9-D10A突变体时，单体Cas-CLOVER不会引入切口或DSB。Cas-CLOVER已证明具有低脱靶核酸酶活性。
示例性Cas-CLOVER系统包括于WO2019/126578中描述的那些，所述文献的内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，Cas-CLOVER系统包含融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子，基本上由其组成或由其组成。
DNA定位组分
在实施方案中，DNA定位组分能够结合特定DNA序列。在实施方案中，DNA定位组分选自例如DNA结合寡核苷酸、DNA结合蛋白、DNA结合蛋白复合物和其组合。其他合适的DNA结合组分将由本领域普通技术人员认识到。
在实施方案中，DNA定位组分包含针对基因组中的一个或多个特定基因座的寡核苷酸。所述寡核苷酸可选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合物和其组合。
在实施方案中，DNA定位组分包含核苷酸结合蛋白或蛋白复合物，其在结合至目标DNA时结合寡核苷酸。蛋白质或蛋白质复合物可能能够识别选自RNA-DNA异源双链体、R环或其组合的特征。在实施方案中，DNA定位组分包含能够识别选自Cas9、级联复合物、RecA、RNase H、RNA聚合酶、DNA聚合酶或其组合的R环的蛋白质或蛋白质复合物。在实施方案中，DNA定位组分包含能够结合目标DNA的工程化蛋白质。在实施方案中，DNA定位组分包含能够结合选自大范围核酸酶、锌指阵列、转录激活因子样(TAL)阵列和其组合的DNA序列的蛋白质。在实施方案中，DNA定位组分包含含有天然存在的DNA结合域的蛋白质。在实施方案中，DNA定位组分包含bZIP域、螺旋-环-螺旋、螺旋-转角-螺旋、HMG-盒、亮氨酸拉链、锌指或其组合。在实施方案中，DNA定位组分包含针对基因组中特定基因座的寡核苷酸。示例性寡核苷酸包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂合物和其任何组合。在实施方案中，DNA定位组分包含能够识别选自RNA-DNA异源双链体、R环和其任何组合的特征的蛋白质或蛋白质复合物。能够识别R环的示例性蛋白质或蛋白质复合物包括但不限于Cas9、级联复合物、RecA、RNaseH、RNA聚合酶、DNA聚合酶和其任何组合。在实施方案中，能够识别R环的蛋白质或蛋白质复合物包含Cas9。在实施方案中，DNA定位组分包含能够结合选自大范围核酸酶、锌指阵列、TAL阵列和其任何组合的DNA序列的蛋白质。在实施方案中，DNA定位组分包含针对基因组中的目标位置的寡核苷酸和能够结合至目标DNA序列的蛋白质。
在实施方案中，DNA定位组分包含至少一种向导RNA(gRNA)，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，DNA定位组分包含两种gRNA，基本上由其组成或由其组成，其中第一gRNA特异性结合至双链DNA目标序列的第一条链，并且第二gRNA特异性结合至双链DNA目标序列的第二条链。或者，在实施方案中，DNA定位组分包含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN，也称为TAL蛋白)的DNA结合域，基本上由其组成，或由其组成。在实施方案中，DNA定位组分包含源自黄单胞菌属或罗氏杆菌属(Ralstonia)的TALEN或TAL蛋白的DNA结合域，基本上由其组成，或由其组成。
效应分子
在实施方案中，效应分子能够在基因组中的特定基因座处产生预定效应。示例性效应分子但不限于转录因子(激活因子或抑制因子)、染色质重塑因子、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、转座酶、甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰转移酶、去乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶、解旋酶、荧光团或其任何组合。
在实施方案中，效应分子包含转座酶。在实施方案中，效应分子包含PB转座酶(PBase)。在实施方案中，效应分子包含核酸酶。核酸酶的非限制性实例包括限制性核酸内切酶、归巢核酸内切酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶或其任何组合。在某些实施方案中，效应分子包含限制性核酸内切酶。在某些实施方案中，效应分子包含IIS型限制性核酸内切酶。在实施方案中，效应分子包含核酸内切酶。核酸内切酶的非限制性实例包括AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I和Clo051。在实施方案中，效应分子包含BmrI、BfiI或Clo051。
在实施方案中，效应分子包含同二聚体或异二聚体，基本上由其组成，或由其组成。在实施方案中，效应分子包含核酸酶、任选地核酸内切酶，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，Cas9为催化非活性或“失活”的Cas9(dCas9(WO2019/126578的SEQ ID NO:302和303))。在实施方案中，Cas9为Cas9的催化非活性或“失活”核酸酶域。在实施方案中，dCas9是由源自全长、催化失活的Cas9的较短序列编码，本文中称为“小”dCas9或dSaCas9(WO2019/126578的SEQ ID NO:23)。
在融合蛋白的实施方案中，效应分子包含一种或多种II型核酸酶的同二聚体或异二聚体，基本上由其组成或由其组成。在融合蛋白的实施方案中，效应分子包含II型核酸酶的同二聚体或异二聚体，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，II型核酸酶包含AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I或Clo051中的一者或多者。
在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含Clo051、BfiI或BmrI，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含与Clo051、BfiI或BmrI形成异二聚体的Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含与Clo051形成异二聚体的催化非活性形式的Cas9(例如dCas9或dSaCas9)或其片段，基本上由其组成或由其组成。示例性Clo05 l核酸酶域可包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：
EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAE
KIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY(SEQ ID NO:238)。
在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含源自黄单胞菌属或罗氏杆菌属的TALEN或TAL蛋白的DNA结合域，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含与Clo051、BfiI或BmrI形成同二聚体或异二聚体的源自黄单胞菌属或罗氏杆菌属的TALEN或TAL蛋白的DNA结合域，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子，包括包含同二聚体或异二聚体的那些效应分子，包含与Clo051形成同二聚体或异二聚体的源自黄单胞菌属或罗氏杆菌属的TALEN或TAL蛋白的DNA结合域，基本上由其组成或由其组成。
连接
在实施方案中，融合蛋白包含DNA定位组分和效应分子，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，编码融合蛋白的一种或多种组分的核酸序列可以可操作地连接例如于表达载体中。在实施方案中，融合蛋白为嵌合蛋白。在实施方案中，融合蛋白是由一种或多种重组核酸序列编码。在实施方案中，融合蛋白还包括接头区以可操作地连接融合蛋白的两个组分。例如，在实施方案中，融合蛋白包含由接头区可操作地连接的DNA定位组分和效应分子，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，DNA定位组分、接头区和效应分子可由插入表达盒和/或表达载体中的一种或多种核酸序列编码，使得核酸序列的翻译产生融合蛋白。在实施方案中，融合蛋白可包含DNA定位组分与效应分子之间的非共价连接。非共价连接可包含抗体、抗体片段、抗体模拟物或支架蛋白。
融合蛋白
在实施方案中，DNA定位组分包含至少一种gRNA，基本上由其组成或由其组成，并且效应分子包含Cas9、Cas9核酸酶域或其片段，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，DNA定位组分包含至少一种gRNA，基本上由其组成或由其组成，并且效应分子包含失活的Cas9(dCas9)或失活的核酸酶域，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，DNA定位组分包含至少一种gRNA，基本上由其组成或由其组成，并且效应分子包含失活的小Cas9(dSaCas9)，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，效应分子包含Cas9、dCas9、dSaCas9或其核酸酶域和第二核酸内切酶，基本上由其组成或由其组成。第二核酸内切酶可包含IIS型核酸内切酶，基本上由其组成或由其组成，所述IIS型核酸内切酶包括但不限于AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051中的一者或多者。
在融合蛋白的实施方案中，DNA定位组分包含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN，也称为TAL蛋白)的DNA结合域，基本上由其组成或由其组成，并且效应分子包含核酸内切酶，基本上由其组成或由其组成。在本公开的融合蛋白的实施方案中，DNA定位组分包含源自黄单胞菌属或罗氏杆菌属的TALEN或TAL蛋白的DNA结合域，基本上由其组成或由其组成，并且效应分子包含IIS型核酸内切酶，基本上由其组成或由其组成，所述IIS型核酸内切酶包括但不限于AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I或Clo051中的一者或多者。
在某些实施方案中，示例性dCas9-Clo051融合蛋白可包含WO2019/126578的SEQID NO:305或307的氨基酸序列或WO2019/126578的SEQ ID NO:306或308的核酸序列，基本上由其组成或由其组成。
构建体
在实施方案中，核酸酶域包含dCas9和Clo051，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，核酸酶域包含dSaCas9和Clo051，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，核酸酶域包含黄单胞菌属-TALE和Clo051，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，核酸酶域包含罗氏杆菌属-TALE和Clo051，基本上由其组成或由其组成。在实施方案中，融合蛋白包含dCas9-Clo051、dSaCas9-Clo051、黄单胞菌属-TALE-Clo051或罗氏杆菌属-TALE-Clo051。在实施方案中，编码融合蛋白的载体包含Csy4-T2A-Clo051-G4S接头-dCas9(化脓性链球菌(Streptoccocus pyogenes))或pRT1-Clo051-dCas9双NLS。
根据一些实施方案，Cas-CLOVER系统包含含有DNA定位组分和效应分子的融合蛋白，其中所述DNA定位组分与TIL中DNA分子的目标序列杂交，其中所述DNA分子编码并且所述TIL表达至少一种免疫检查点分子，并且所述效应分子裂解DNA分子，从而改变至少一种免疫检查点分子的表达。
根据特定实施方案，Cas-CLOVER方法包括通过引入对免疫检查点基因的目标DNA序列具特异性的Cas-CLOVER系统(例如，dCas9-Clo051、dSaCas9-Clo051、黄单胞菌属-TALE-Clo051或罗氏杆菌属-TALE-Clo051融合蛋白)来沉默或减少TIL中一种或多种免疫检查点基因的表达。融合蛋白可作为DNA、mRNA、蛋白质递送。在基因组与Cas-CLOVER系统接触后，目标双链DNA的一条或多条链可被切割。如果在存在一种或多种DNA修复途径或其组分的情况下进行切割，则Cas-CLOVER方法会通过插入、缺失或取代一个或多个碱基对来中断基因表达或修饰基因组序列。可通过非同源末端接合(NHEJ，一种通常引起DNA中的插入或缺失(插入/缺失)的机制)来修复细胞中的DSB。插入/缺失通常引起移码，产生功能丧失型等位基因；例如，通过在靶向基因的开放阅读框架(ORF)内引起早熟终止密码子。根据某些实施方案，结果为靶向免疫检查点基因内的功能丧失型突变。
或者，代替NHEJ，可通过同源定向修复(HDR)来修复由Cas-CLOVER系统诱导的DSB。尽管NHEJ介导的DSB修复通常破坏基因的开放阅读框架，但可使用同源定向修复(HDR)来产生在单一核苷酸变化至大型插入范围内的特定核苷酸变化。根据一些实施方案，使用HDR通过将含有所需序列的DNA修复模板递送至具有Cas-CLOVER系统的TIL中来基因编辑免疫检查点基因。修复模板优选含有紧邻目标基因的上游和下游的所需编辑以及其他同源序列(通常称为左和右同源臂)。
可通过经由Cas-CLOVER方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
用于通过Cas-CLOVER方法改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于WO2019126578、US2017/0107541、US2017/0114149、US2018/0187185和美国专利第10,415,024号中，其内容通过引用整体并入本文。用于执行Cas-CLOVER方法的资源，例如CLOVER mRNA和Cas-CLOVER mRNA构建体，可购自例如Demeetra和Hera Biolabs的公司。
根据一些实施方案，用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2并且任选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激所述第二TIL群体，其中从步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)对所述第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑器转移到所述第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)使所述第二TIL群体静息约1天；
(g)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3抗体、任选地OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(h)收集从步骤(g)获得的治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中从步骤(g)至步骤(h)的转变在不开放所述系统的情况下进行，其中所述经收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；以及
(j)任选地使用冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体，
其中所述电穿孔步骤包括递送至少一种包含Cas-CLOVER系统的基因编辑器系统，所述至少一种基因编辑器系统调节至少一种检查点蛋白在第二TIL群体的多个细胞中的表达。
根据一些实施方案，用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2并且任选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行；
(d)通过添加OKT-3来刺激所述第二TIL群体并培养约1至3天以获得所述第二TIL群体，其中从步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)对所述第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑器转移到所述第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)使所述第二TIL群体静息约1天；
(g)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3抗体、任选地OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至11天以获得所述第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(h)收集从步骤(g)获得的治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中从步骤(g)至步骤(h)的转变在不开放所述系统的情况下进行，其中所述经收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；以及
(j)任选地使用冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体，
其中所述电穿孔步骤包括递送至少一种包含Cas-CLOVER系统的基因编辑器系统，所述至少一种基因编辑器系统抑制至少一种检查点蛋白在所述第二TIL群体的多个细胞中的表达。
IV.基因表达方法
在一些实施方案中，基因修饰TIL群体以调节蛋白质表达的方法可任选地包括稳定并入用于产生一种或多种蛋白质的基因的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括反转录病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-反转录病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括腺病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括腺相关病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括单纯疱疹病毒转导步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括痘病毒病毒转导步骤。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导步骤，包括使用人类免疫缺陷病毒(HIV)(包括HIV-1)的慢病毒转导。慢病毒转导系统和其他合适的病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如Levine等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.2006,103,17372-77；Zufferey等人,Nat.Biotechnol.1997,15,871-75；Dull等人,J.Virology 1998,72,8463-71，和美国专利第5,350,674号、第5,585,362号和第6,627,442号中，其各自的公开内容均通过引用并入本文。在一个实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-反转录病毒转导步骤。γ-反转录病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如Cepko和Pear,Cur.Prot.Mol.Biol.1996,9.9.1-9.9.16；Hawley等人,Gene Ther.1994,1,136-38中；其公开内容通过引用并入本文。
1.piggyBac方法
用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如过程2A)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中所述方法还包括通过piggyBac方法(例如，piggyBac转座子和转座酶或piggyBac样转座子和转座酶)对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用piggyBac方法可引起至少一种免疫调节组合物在至少一部分治疗性TIL群体的细胞表面处的表达。或者，在TIL扩增过程期间使用piggyBac方法可引起至少一种免疫调节组合物在至少一部分治疗性TIL群体的细胞表面处的表达并且任选地引起一种或多种免疫检查点基因在至少一部分治疗性TIL群体中的增强。在一些实施方案中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文中所描述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合域)。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
piggyBac转座子为可移动遗传元件，其在供体载体与宿主染色体之间有效地进行转位。此系统几乎没有货物限制，并且是完全可逆的，切除后不会在基因组中留下足迹。piggyBac转座子/转座酶系统由识别位于转座子盒两侧的piggyBac特异性反向末端重复序列(ITR)的转座酶组成。转座酶切除可转座元件，以将其整合至优先位于哺乳动物基因组常染色质区域中的TT/AA染色体位点中(Ding等人,2005；和Bradley 2007；Wilson等人,2007；Wang等人,2008；Li等人,2011)。
示例性piggyBac系统包括在WO2019/046815中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，piggyBac系统包含转座子/转座酶系统。
在实施方案中，piggyBac方法包括向TIL递送(a)包含编码转座酶的序列的核酸或氨基酸序列和(b)包含编码转座子的DNA序列的重组和非天然存在的DNA序列。
在实施方案中，编码转座酶的序列为mRNA序列。在实施方案中，编码转座酶的序列为DNA序列。在实施方案中，DNA序列为cDNA序列。在实施方案中，编码转座酶的序列为氨基酸序列。蛋白质Super piggybac转座酶(SPB)可在与转座子DNA预温育后递送。
转座子/转座酶
示例性转座子/转座酶系统包括但不限于piggyBac转座子和转座酶、睡美人转座子和转座酶、Helraiser转座子和转座酶以及Tol2转座子和转座酶。
piggyBac转座酶识别转座子末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且将ITR之间的内容物移动至TTAA染色体位点。piggyBac转座子系统对可包括在ITR之间的所关注基因没有有效负载限制。在实施方案中，转座子为piggyBac转座子或piggyBac样转座子。
piggyBac和piggyBac样转座酶和转座子的实例包括例如WO2019/046815中公开的那些，其内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，piggyBac或piggyBac样转座酶过度活跃。过度活跃的piggyBac或piggyBac样转座酶为比其所衍生的天然存在变体更具活性的转座酶。在实施方案中，过度活跃的piggyBac或piggyBac样转座酶分离自或源自家蚕(Bombyxmori)。过度活跃的氨基酸取代的列表可见于美国专利第10,041,077号，其内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，piggyBac或piggyBac样转座酶为整合缺陷型。在实施方案中，整合缺陷型piggyBac或piggyBac样转座酶为可切除其相应转座子但以比相应野生型转座酶更低的频率整合所切除的转座子的转座酶。整合缺陷型氨基酸取代的列表可见于美国专利第10,041,077号，其内容通过引用整体并入。
在实施方案中，piggyBac或piggyBac样转座子能够通过piggyBac或piggyBac样转座酶插入在靶核酸内的序列5'-TTAT-3处。在实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac转座子的实施方案中，转座酶为piggyBac转座酶。在实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac样转座子的实施方案中，转座酶为piggyBac样转座酶。在实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac转座子的实施方案中，转座酶为piggyBacTM或SuperpiggyBacTM(SPB)转座酶。在实施方案中，并且特别是其中转座酶为Super piggyBacTM(SPB)转座酶的实施方案中，编码转座酶的序列为mRNA序列。
睡美人(SB)转座子是通过识别ITR的睡美人转座酶转位至目标基因组中，并且将ITR之间的内容物移动至TA染色体位点中。在实施方案中，转座子为睡美人转座子。在实施方案中，转座酶为睡美人转座酶(参见例如美国专利第9,228,180号，其内容整体并入本文)。在实施方案中，睡美人转座酶为过度活跃的睡美人(SB100X)转座酶。
Helraiser转座子是由Helitron转座酶转位。与其他转座酶不同，Helitron转座酶不含RNase-H样催化域，而包含由复制起始域(Rep)和DNA解旋酶域组成的RepHel基序。Rep域为HUH核酸酶超家族的核酸酶域。在实施方案中，转座子为Helraiser转座子。在Helraiser转座子序列的实施方案中，转座酶的侧翼为左右末端序列，称为LTS和RTS。在实施方案中，此等序列以保守5'-TC/CTAG-3'基序终止。在实施方案中，具有形成发夹终止结构的潜力的19bp回文序列位于RTS上游11个核苷酸处并且包含序列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG。在实施方案中，并且特别是其中转座子为Helrais er转座子的实施方案中，转座酶为Helitron转座酶。
Tol2转座子可分离自或源自青鳉鱼的基因组，并且可类似于hAT家族的转座子。本公开的示例性Tol2转座子由包含约4.7千碱基的序列编码，并且含有编码Tol2转座酶的基因，所述基因含有四个外显子。在实施方案中，转座子为Tol2转座子。在本公开的方法的某些实施方案中，并且特别是其中转座子为Tol2转座子的那些实施方案中，转座酶为Tol2转座酶。
在实施方案中，载体包含编码转座子的重组和非天然存在的DNA序列。在实施方案中，载体包含任何形式的DNA，并且其中载体包含至少100个核苷酸(nt)、500nt、1000nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6500nt、7000nt、7500nt、8000nt、8500nt、9000nt、9500nt、10,000nt或介于两者之间的任何数目的核苷酸。在实施方案中，载体包含单链或双链DNA。在实施方案中，载体包含环状DNA。在实施方案中，载体为质粒载体、纳米质粒载体、小环。在实施方案中，载体包含线性或线性化的DNA。在实施方案中，载体为双链doggyboneTMDNA序列。
在实施方案中，编码转座子的重组和非天然存在的DNA序列还包含编码一种或多种免疫检查点基因的序列。
在实施方案中，编码转座酶的核酸序列为DNA序列，并且编码转座酶的DNA序列和编码转座子的DNA序列的量等于或小于10.0μg/100μL，小于7.5μg/100μL，小于6.0μg/100μL，小于5.0μg/100μL，小于2.5μg/100μL，或小于1.67μg/100μL，小于0.55μg/100μL，小于0.19μg/100μL，小于0.10μg/100μL的电穿孔或核转染反应。在某些实施方案中，在电穿孔或核转染反应中编码转座酶的DNA序列的量和编码转座子的DNA序列的量的浓度等于或小于100μg/mL，等于或小于75μg/mL，等于或小于60μg/mL，等于或小于50μg/mL，等于或小于25μg/mL，等于或小于16.7μg/mL，等于或小于5.5μg/mL，等于或小于1.9μg/mL，等于或小于1.0μg/mL。
在实施方案中，编码转座酶的核酸序列为RNA序列，并且编码转座酶的RNA序列和编码转座子的RNA序列的量等于或小于10.0μg/100μL，小于7.5μg/100μL，小于6.0μg/100μL，小于5.0μg/100μL，小于2.5μg/100μL，或小于1.67μg/100μL，小于0.55μg/100μL，小于0.19μg/100μL，小于0.10μg/100μL的电穿孔或核转染反应。在某些实施方案中，在电穿孔或核转染反应中编码转座酶的RNA序列的量和编码转座子的RNA序列的量的浓度等于或小于100μg/mL，等于或小于75μg/mL，等于或小于60μg/mL，等于或小于50μg/mL，等于或小于25μg/mL，等于或小于16.7μg/mL，等于或小于5.5μg/mL，等于或小于1.9μg/mL，等于或小于1.0μg/mL。
在实施方案中，TIL由第二基因编辑工具进一步修饰，包括但不限于本文中所描述的那些。在实施方案中，第二基因编辑工具可包括仅切除的piggyBac转座酶以再切除所插入的序列或其任何部分。例如，仅切除的piggyBac转座酶可用于“再切除”转座子。
根据一些实施方案，piggyBac系统包含转座子/转座酶系统，其中转座酶识别位于包含编码一种或多种免疫检查点基因的货物的转座子盒两侧的ITR，并且切除可转座元件以将其整合至TT/AA染色体位点中，导致转座子盒的基因组插入和一种或多种免疫检查点基因的表达。根据一些实施方案，货物编码两种或更多种免疫检查点分子。
可通过经由piggyBac方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21、NOTCH 1/2细胞内域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
用于通过piggyBac方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于WO2019/046815、WO2015006700、WO2010085699、WO2010099301、WO2010099296、WO2006122442、WO2001081565和WO1998040510中，其内容通过引用整体并入本文。
用于执行piggyBac方法的资源，例如用于表达转座子/转座酶的质粒，可购自例如Demeetra和Hera Biolabs的公司。
根据一些实施方案，用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2并且任选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激所述第二TIL群体，其中从步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)对所述第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑器转移到所述第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)使所述第二TIL群体静息约1天；
(g)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3抗体、任选地OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(h)收集从步骤(g)获得的治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中从步骤(g)至步骤(h)的转变在不开放所述系统的情况下进行，其中所述经收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；以及
(j)任选地使用冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体，
其中所述电穿孔步骤包括递送至少一种包含piggyBac系统的基因编辑器系统，其中至少一种基因编辑器系统影响至少一种免疫调节组合物在第二TIL群体的多个细胞中的细胞表面的表达并且调节至少一种检查点蛋白在第二TIL群体的多个细胞中的表达。
根据一些实施方案，用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2并且任选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行；
(d)通过添加OKT-3刺激所述第二TIL群体并培养约1至3天以获得所述第二TIL群体，其中从步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)对所述第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑器转移到所述第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)使所述第二TIL群体静息约1天；
(g)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3抗体、任选地OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(h)收集从步骤(g)获得的治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中从步骤(g)至步骤(h)的转变在不开放所述系统的情况下进行，其中所述经收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；以及
(j)任选地使用冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体，
其中所述电穿孔步骤包括递送至少一种包含piggyBac系统的基因编辑器系统，所述至少一种基因编辑器系统影响至少一种免疫调节组合物在第二TIL群体的多个细胞中的细胞表面的表达。在一些实施方案中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文中所描述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合域)。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施方案中，免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括使用非病毒技术，例如piggyBac方法(例如，piggyBac转座子和转座酶或piggyBac样转座子和转座酶)。在一些实施方案中，所述方法包括向TIL递送：(a)包含编码转座酶的序列的核酸或氨基酸序列；和(b)包含编码转座子的DNA序列的重组和非天然存在的DNA序列。在本公开的方法的某些实施方案中，编码转座酶的序列为mRNA序列。编码转座酶的mRNA序列可在体外产生。在本公开的方法的某些实施方案中，编码转座酶的序列为DNA序列。编码转座酶的DNA序列可在体外产生。DNA序列可为cDNA序列。在本公开的方法的某些实施方案中，编码转座酶的序列为氨基酸序列。编码转座酶的氨基酸序列可在体外产生。蛋白质Super piggybac转座酶(SPB)可在与转座子DNA预温育后递送。在某些实施方案中，转座子为piggyBac转座子或piggyBac样转座子。在某些实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶为piggyBac转座酶。在某些实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac样转座子的那些实施方案中，转座酶为piggyBac样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac转座酶包含含有WO2019046815的SEQ ID NO:14487的氨基酸序列。在某些实施方案中，并且特别是其中转座子为piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶为piggyBacTM或Super piggyBacTM(SPB)转座酶。在某些实施方案中，并且特别是其中转座酶为Super piggyBacTM(SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列为mRNA序列。在本公开的方法的某些实施方案中，转座酶为piggyBacTM(PB)转座酶。piggyBac(PB)转座酶可包含与以下序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比的同一性的氨基酸序列或由其组成：
在本公开的方法的某些实施方案中，转座子为睡美人转座子。在本公开的方法的某些实施方案中，转座酶为睡美人转座酶(参见例如美国专利第9,228,180号，其内容整体并入本文)。在某些实施方案中，睡美人转座酶为过度活跃的睡美人(SB100X)转座酶。在某些实施方案中，睡美人转座酶包含与以下序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比的同一性的氨基酸序列：
在某些实施方案中，包括其中睡美人转座酶为过度活跃的睡美人(SB100X)转座酶的那些实施方案中，睡美人转座酶包含与以下序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比的同一性的氨基酸序列：
V.Gen 2TIL制造过程
图1和图2中描绘含有这些特征中的一些的称为Gen 2(也称为过程2A)的示例性TIL过程系列。Gen 2的实施方案示于图2中。
如本文所论述，本发明可包括与再刺激经冷冻保存的TIL以在移植到患者中之前提高其代谢活性并因此提高相对健康状况相关的步骤，以及测试所述代谢健康状况的方法。如本文大体上概述，TIL通常获自患者样品并且在移植到患者中之前经操作以扩增其数目。在一些实施方案中，TIL可任选地如下文所论述经基因操作。
在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存。在解冻后，其也可在输注到患者中之前经再刺激以增加其代谢。
在一些实施方案中，将第一扩增(包括称为预REP的过程以及图1和图36中所示的作为步骤B的过程)缩短为3至14天，并且将第二扩增(包括称为REP的过程以及图1或图36中所示的作为步骤D的过程)缩短为7至14天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。在一些实施方案中，将第一扩增(例如，图1或图36中步骤B描述的扩增)缩短为11天并且将第二扩增(例如，图1或图36中步骤D中描述的扩增)缩短为11天。在一些实施方案中，将第一扩增和第二扩增的组合(例如，在图1或图36中描述为步骤B和步骤D的扩增)缩短为22天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。
下文中的“步骤”标示A、B、C等是参考图1或图36以及参考本文中所描述的某些实施方案。下文和图1和图36中的步骤的次序为示例性的，并且本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及额外步骤、步骤的重复和/或步骤的省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样品
一般而言，TIL最初获自患者肿瘤样品并且然后扩增成更大的群体以用于如本文中所描述的进一步操纵，任选地冷冻保存，如本文所概述的再刺激以及任选地评价作为TIL健康状况的指标的表型和代谢参数。
患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的其他手段获得。在一些实施方案中，使用多病灶取样。在一些实施方案中，手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的其他手段包括多病灶取样(即，从患者中的一个或多个肿瘤位点和/或位置以及在相同位置或紧密相邻的一个或多个肿瘤处获得样品)。一般而言，肿瘤样品可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，例如获自血液科恶性疾病的肿瘤。实体肿瘤可为肺组织。在一些实施方案中，适用的TIL是获自非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤可为皮肤组织。在一些实施方案中，适用的TIL是获自黑素瘤。
一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器分割片段化成1mm3至约8mm3之间的小型片状物，其中约2-3mm3为尤其适用的。在一些实施方案中，使用酶肿瘤消化物从这些片段培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶介质(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park MemorialInstitute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤放置于酶介质中并且机械解离肿瘤大约1分钟，接着在37℃下在5％CO2中温育30分钟，接着在前述条件下重复机械解离和温育循环，直至仅存在小组织块。在这个过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL分支亲水性多糖的密度梯度分离以去除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，所述公开的公开内容通过引用并入本文。任何前述方法可用于本文中所描述的任何实施方案中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种或多种解离(消化)酶，例如但不限于胶原酶(包括任何掺合物或类型的胶原酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和其任何组合。
在一些实施方案中，解离酶是从冻干酶复原。在一些实施方案中，冻干酶是在一定量的无菌缓冲液如HBSS中复原。
在一些情况下，胶原酶(例如无动物源1型胶原酶)是在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶289.2PZ U。在一些实施方案中，胶原酶是在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方案中，在复原后，胶原酶储备液的范围为约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施方案中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方案中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶的储备液是可变的并且可能需要确定浓度。在一些实施方案中，可检验冻干储备液的浓度。在一些实施方案中，添加到消化混合液中的酶的最终量是基于所确定的储备液浓度调节。
在一些实施方案中，酶混合物包括约4.7mL无菌HBSS中的约10.2ul中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL胶原酶(1.2PZ/mL)和250ul DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施方案中，TIL是源自实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化并且以全肿瘤进行酶促消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在旋转下在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤。在一些实施方案中，在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在旋转下在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在恒定旋转下消化肿瘤过夜。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在恒定旋转下消化肿瘤过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在无菌缓冲液中用冻干酶复原肿瘤。在一些实施方案中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方案中，酶混合物包含胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶为胶原酶IV。在一些实施方案中，胶原酶的工作储备液为100mg/mL的10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL的10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶的工作储备液为10mg/mL的10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL的胶原酶、1000IU/mL的DNA酶和1mg/mL的透明质酸酶。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL的胶原酶、500IU/mL的DNA酶和1mg/mL的透明质酸酶。
一般而言，经收集的细胞悬浮液被称为“原代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，片段化为物理片段化。在一些实施方案中，片段化为分割。在一些实施方案中，片段化是通过消化。在一些实施方案中，TIL最初可从酶肿瘤消化物和肿瘤片段培养，所述酶肿瘤消化物和肿瘤片段是由将获自患者的肿瘤样品消化或片段化获得。
在一些实施方案中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图1或图36中所提供)中获得肿瘤样品后，肿瘤经历物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化在获得肿瘤之后并且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将10、20、30、40或更多个片段或块状物置于每个容器中以进行第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将30或40个片段或块状物置于每个容器中以进行第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将40个片段或块状物置于每个容器中以进行第一扩增。在一些实施方案中，多个片段包含约4个至约50个片段，其中每个片段的体积为约27mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约30个至约60个片段，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个片段包含约4个片段。
在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段是通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段为约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约10mm3。在一些实施方案中，肿瘤为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施方案中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施方案中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施方案中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施方案中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。
在一些实施方案中，将肿瘤切除以使每个块状物上的出血性、坏死性和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤切除以使每个块状物上的出血性组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤切除以使每个块状物上的坏死性组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤切除以使每个块状物上的脂肪组织的量减至最小。
在一些实施方案中，进行肿瘤片段化以便维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤片段化。在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶介质(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育，接着进行机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶介质中后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。然后可将溶液在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，并且然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再温育30分钟后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后如果大片组织仍存在，则施加1或2次额外机械解离至样品，不论是否再在37℃下在5％ CO2中温育30分钟。在一些实施方案中，在最终温育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用Ficoll进行密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，将第一扩增步骤之前收集的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施方案中，细胞可任选地在样品收集之后冷冻并且在进入步骤B(其在下文进一步详细描述以及图1和图36以及图8中示例)中所描述的扩增之前冷冻储存。
1.胸膜渗出T细胞和TIL
在一些实施方案中，样品为胸膜液样品。在一些实施方案中，根据本文中所描述的方法的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样品。在一些实施方案中，样品为源于胸腔积液的样品。在一些实施方案中，根据本文中所描述的方法的用于扩增的T细胞或TIL的来源为源于胸腔积液的样品。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此种样品可源自原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，样品可源自来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发性转移性癌细胞。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样品为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样品为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样品可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中在胸腔和腹腔中都具有间皮细胞系和流体形式，并且在一些实施方案中，此类流体含有TIL。在所公开的方法利用胸膜液的一些实施方案中，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施方案中，胸膜液呈未经处理的形式直接从患者中取出。在一些实施方案中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液放置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方案中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液放置于标准管(Veridex)中。在一些实施方案中，在从患者收集之后立即将样品放置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。如果保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方案中，样品是在从患者中取出后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，样品是在4℃下从患者中取出后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方案中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样品。在一些实施方案中，稀释度为1:10胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:9胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:8胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:5胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:2胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:1胸膜液/稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方案中，样品是在从患者收集和稀释后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，如果保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24-48小时内显著减少。在一些实施方案中，胸膜液样品是在从患者中取出并稀释后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，胸膜液样品是在从患者中取出并在4℃下稀释后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在其他实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，在胸膜液必须冷冻保存以便运输至进行所述方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24-48小时之后)的情形下，此胸膜液的预处理是优选的。在一些实施方案中，通过在将胸膜液样品从受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物重悬于缓冲液中来制备胸膜液样品。在一些实施方案中，对胸膜液样品进行多次离心和重悬，然后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方案中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，在进一步处理中使用的胸膜液样品是通过将流体经由含有已知并且基本上均匀的孔径的过滤器过滤而制备的，所述孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施方案中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在其他实施方案中，孔径可为5μM或更大，并且在其他实施方案中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一者。过滤后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)从膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可将以这种方式浓缩的细胞(包括TIL)用于所述方法的进一步处理步骤中。
在一些实施方案中，使胸膜液样品(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或重悬的细胞沉淀物与溶解试剂接触，所述溶解试剂差异性地溶解样品中存在的无核红细胞。在一些实施方案中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，这个步骤是在进一步的处理步骤之前进行。适合的溶解试剂包括单一溶解试剂或溶解试剂和淬灭试剂，或溶解试剂、淬灭试剂和固定试剂。适合的溶解系统为市售的，并且包括BD Pharm LyseTM系统(BectonDickenson)。其他溶解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(Beckman Coulter公司)或氯化铵系统。在一些实施方案中，溶解试剂可随主要需求而变化，所述需求为红细胞的有效溶解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除使用单一试剂用于溶解以外，适用于本文中所描述的方法的溶解系统可包括第二试剂，例如在所述方法的剩余步骤期间淬灭或延迟溶解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(Beckman Coulter公司)。取决于溶解试剂的选择或所述方法的优选实施，还可采用常规固定试剂。
在一些实施方案中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样品，然后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
B.步骤B：第一扩增
在一些实施方案中，本发明的方法实现获得年轻TIL，其与较年长的TIL(即，在向受试者/患者施用之前进一步经历更多轮复制的TIL)相比，在向受试者/患者施用时能够实现增加的复制循环并且因此可提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人,Scand.J.Immunol.2012,75,157-167；Dudley等人,Clin.Cancer Res.2010,16,6122-6131；Huang等人,J.Immunother.2005,28,258-267；Besser等人,Clin.CancerRes.2013,19,OF1-OF9；Besser等人,J.Immunother.2009,32:415-423；Robbins等人,J.Immunol.2004,173,7125-7130；Shen等人,J.Immunother.2007,30,123-129；Zhou等人,J.Immunother.2005,28,53-62；和Tran等人,J.Immunother.2008,31,742-751，其各自通过引用并入本文。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生表现并增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明的方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加，所述其他方法包括例如除图1或图36中实施的方法以外的方法。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图5和/或图6中示例的称为过程1C的方法制备的TIL，通过本发明的方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，在第一扩增中获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图1或图36的步骤A中所描述的肿瘤片段的解剖或消化后，所得细胞在含有IL-2的血清中在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方案中，在2mL孔中在包含具有6000IU/mL IL-2的失活人类AB血清的培养基中温育肿瘤消化物。将此原代细胞群体培养数天的时段，通常3至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养7至14天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养10至14天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养约11天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施方案中，TIL的扩增可使用如下文和本文中所描述的初始主体TIL扩增步骤(例如图1或图36的步骤B中所描述的步骤，其可包括称为预REP的过程)进行，接着进行如下文步骤D和本文中所描述的第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，接着进行任选的冷冻保存，并且接着进行如下文和本文中所描述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可任选地针对如本文中所描述的表型特征和代谢参数进行表征。
在TIL培养在24孔板中起始，例如使用Costar 24孔细胞培养簇的实施方案中，平底(Corning Incorporated,Corning,NY，每个孔可用含有1×106个肿瘤消化物细胞或一个肿瘤片段和IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.,Emeryville,CA)的2mL完全培养基(CM)接种。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，第一扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)中起始培养的实施方案中，每个培养瓶装载有含有10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤片段的具有IL-2的10-40mL CM。G-REX10和24孔板都在加湿温育箱中在37℃、5％ CO2下温育并且在培养起始后5天，取出一半培养基并更换为新鲜的CM和IL-2，并且在第5天之后，每2-3天更换一半培养基。
在制备肿瘤片段后，所得细胞(即，片段)在含有IL-2的血清中，在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方案中，将肿瘤消化物在2mL孔中，在包含失活人类AB血清(或在一些情况下，如本文所概述，在存在APC细胞群体的情况下)和6000IU/mL IL-2的培养基中温育。将此原代细胞群体培养数天的时段，通常10至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，生长培养基在第一扩增期间包含IL-2或其变体。在一些实施方案中，IL为重组人类IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有4-8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有5-7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，如实施例5中所描述制备IL-2储备溶液。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mLIL-21。
在一些实施方案中，细胞培养基包含抗CD3激动剂抗体，例如OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、和50ng/mL至100ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施方案中，OKT-3在第一扩增起始时(第0天)存在于细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增期间的任何时间将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第3天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第4天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第5天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第6天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第7天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第8天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第9天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第10天将OKT-3添加到细胞培养基中。在一些实施方案中，在第一扩增的第11天将OKT-3添加到细胞培养基中。
在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第3天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第2天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第1天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第2天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第3天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第3天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第3天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第4天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第5天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第6天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第7天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第8天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第9天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第10天与第11天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第5天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第0天与第4天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第5天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第1天与第4天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第5天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第2天与第4天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第3天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第3天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第3天与第5天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第3天与第4天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第4天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第4天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第4天与第5天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第5天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。在一些实施方案中，在第一扩增的第5天与第6天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，在第一扩增的第6天与第7天之间一次或多次添加OKT-3。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白，以及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，第一扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其被称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人类AB血清、25mMHepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性培养瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)中起始培养的实施方案中，每个培养瓶装载有含10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤片段的具有IL-2的10-40mL CM。G-REX10和24孔板都在加湿温育箱中在37℃、5％ CO2下培养并且在培养起始后5天，取出一半培养基并更换为新鲜的CM和IL-2，并且在第5天之后，每2-3天更换一半培养基。在一些实施方案中，CM为实施例中所描述的CM1，参见实施例1。在一些实施方案中，第一扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中进行。在一些实施方案中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，第一扩增(包括例如图1或图36的步骤B中所描述那些的过程，其可包括有时称为预REP的过程)缩短为3-14天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，第一扩增(包括例如图1或图36的步骤B中所描述那些的过程，其可包括有时称为预REP的过程)缩短为7至14天，如实施例中所论述以及图4和图5中所示，以及包括例如图1或图36的步骤B中所描述的扩增。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短为10-14天。在一些实施方案中，第一扩增缩短为11天，如例如图1或图36的步骤B中所描述的扩增中所论述。
在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施方案中，使用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，在第一扩增期间，包括例如在根据图1或图36以及本文所描述的步骤B过程期间可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合。在一些实施方案中，使用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，在根据图1或图36以及如本文中所描述的步骤B过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合。
在一些实施方案中，如实施例和附图中所论述，第一扩增(包括称为预REP的过程；例如，根据图1或图36的步骤B)过程缩短为3至14天。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短为7至14天。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短为10至14天。在一些实施方案中，第一扩增缩短为11天。
在一些实施方案中，在密闭系统生物反应器中进行第一扩增，例如根据图1或图36的步骤B。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子和其他添加剂
本文所描述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合以及IL-2、IL-15和IL-21中的两者或更多者的组合来进行TIL的快速扩增和或第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2，或IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，并且特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中其他地方所描述。在其他实施方案中，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂I-α激动剂，包括增殖物激活受体(PPAR)-γ激动剂如噻唑烷二酮化合物，如美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。
C.步骤C：第一扩增至第二扩增的转变
在一些情况下，从第一扩增获得的主体TIL群体，包括例如从例如图1或图36中所示的步骤B获得的TIL群体，可使用下文所论述的方案立即冷冻保存。或者，获自第一扩增的TIL群体(称为第二TIL群体)可经历第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增)并且然后如下文所论述冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将用于疗法的情况下，第一TIL群体(有时称为主体TIL群体)或第二TIL群体(其在一些实施方案中可包括称为REP TIL群体的群体)可在扩增之前或在第一扩增之后并且在第二扩增之前进行基因修饰以用于适合的治疗。
在一些实施方案中，储存获自第一扩增(例如，来自如图1或图36中所指示的步骤B)的TIL直至进行用于选择的表型分析。在一些实施方案中，获自第一扩增(例如，来自如图1或图36中所指示的步骤B)的TIL未经储存并且直接继续进行第二扩增。在一些实施方案中，获自第一扩增的TIL在第一扩增之后并且在第二扩增之前未经冷冻保存。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约3天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约4天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约4天至10天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约7天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后约14天发生。
在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后1天至14天发生。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后3天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后4天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后5天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后6天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后7天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后8天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后9天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后10天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后11天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后12天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后13天至14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后14天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后1天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后2天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后3天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后4天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后5天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后6天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后7天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后8天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后9天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后10天至11天发生。在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后11天发生。
在一些实施方案中，TIL在第一扩增之后并且在快速第二扩增之前未经储存，并且TIL直接进行第二扩增(例如，在一些实施方案中，在如图1或图36中所示的步骤B至步骤D的转变期间未进行储存)。在一些实施方案中，转变在如本文中所描述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二扩增而无转变期。
在一些实施方案中，第一扩增至第二扩增的转变(例如根据图1或图36的步骤C)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100生物反应器。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施方案中，将从第一扩增(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤B)获得的TIL转变为激活或基因编辑步骤。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至5天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至4天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4至5天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至7天发生。
在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在密闭系统中发生，如本文中所描述。
在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和/或抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含OKT3的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1-7天、约2-7天、约3-7天、约4-7天、约5-7天、约6-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天或约1-2天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1天。在一些实施方案中，激活步骤进行约2天。在一些实施方案中，激活步骤进行约3天。在一些实施方案中，激活步骤进行约4天。在一些实施方案中，激活步骤进行约5天。在一些实施方案中，激活步骤进行约6天。在一些实施方案中，激活步骤进行约7天。
根据本说明书，可使用本领域中已知的任何合适的抗CD3/抗CD38珠粒。合适的抗CD3/抗CD38珠粒包括但不限于市售产品，包括但不限于用于T细胞扩增和激活的DynabeadsTM人类T-激活剂CD3/CD28(可购自Invitrogen)、ImmunoCultTM人类CD3/CD28 T细胞激活剂(可购自StemCell Technologies)和T Cell TransActTM(可购自MiltenyiBiotec)。
在一些实施方案中，激活步骤是任选的。在一些实施方案中，如果第一扩增包括OKT-3，则激活步骤是任选的。
在一些实施方案中，将从第一扩增(例如，从图36C-D中所示的步骤B)或从激活步骤(例如，从图36A-B中所示的步骤C)获得的TIL转变为基因编辑步骤。
在一些实施方案中，基因编辑步骤包括对TIL群体进行无菌电穿孔步骤。在一些实施方案中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调LAG-3表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CISH表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调TIGIT表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CBL-B表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4的表达下调以及PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3的表达下调以及PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH的表达下调以及PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CBL-B的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出TIGIT的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、CBL-B和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B/TIGIT双基因敲除TIL。
在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤C)获得的TIL转变为第二电穿孔步骤。在一些实施方案中，在第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间存在静息步骤。在一些实施方案中，所述静息步骤在约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃、约40℃下进行。根据一些实施方案，所述静息步骤进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约1.5天、约2天、约2.5天或约3天。在一些实施方案中，第二电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CTLA-4。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CISH的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调LAG-3的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调TIGIT的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CBL-B的表达。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4的表达下调以及PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3的表达下调以及PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH的表达下调以及PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CBL-B的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出TIGIT的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、CBL-B和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B/TIGIT双基因敲除TIL。
在一些实施方案中，基因编辑步骤还包括静息步骤。根据一些实施方案，所述静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育第四TIL群体。根据一些实施方案，静息步骤在约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃、约40℃下进行。根据一些实施方案，静息步骤进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。根据一些实施方案，静息步骤包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至约23小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至约23小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约16小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约17小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约18小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约19小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约20小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约21小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约22小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约23小时。
在一些实施方案中，将从基因编辑步骤或静息步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤C)获得的TIL转变为第二扩增步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤D)。在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤至第二扩增步骤的转变在基因编辑步骤或静息步骤开始后约0.5天、1天、2天、3天或4天发生。
在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤至第二扩增步骤的转变在密闭系统中发生，如本文中所描述。
在一些实施方案中，TIL在基因编辑步骤或静息步骤之后并且第二扩增之前未储存，并且TIL直接进行第二扩增(例如，在一些实施方案中，在从步骤C至步骤D的转变期间未储存，如图36A-D或图8I-P中所示)。
在一些实施方案中，从第一扩增至第二扩增的转变，例如根据图36的步骤C，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，密闭系统用于TIL扩增，如本文中所描述。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100生物反应器。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
D.步骤D：第二扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群体的数目在收集和初始主体处理之后扩增，例如在步骤A和步骤B以及称为步骤C的转变之后，如图1或图36中所指示)。这种进一步扩增在本文中称为第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP)的扩增过程；以及如图1或图36的步骤D中所指示的过程。第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。
在一些实施方案中，第二扩增或第二TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1或图36的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约14天。
在一些实施方案中，第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1或图36的步骤D中所指示的过程)进行。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦(Raritan,NJ)的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本(Auburn,CA)的MiltenyiBiotech)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原可任选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下任选地从载体表达，所述载体例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μMMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL还可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二扩增的部分发生。在一些实施方案中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL、或8000IU/mL IL-2。
在一些实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、和50ng/mL至100ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白，以及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，在第二扩增期间，包括例如在根据图1或图36以及本文所描述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，在根据图1或图36以及如本文中所描述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合。
在一些实施方案中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞并且任选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方案中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mLIL-21。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中，TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，REP和/或第二扩增是在培养瓶中进行，其中在150mL培养基中混合主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mLIL-2。进行培养基更换(通常用新鲜培养基经由抽吸进行2/3培养基更换)直至细胞转移到替代性生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)缩短为7-14天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，第二扩增缩短为11天。
在一些实施方案中，REP和/或第二扩增可使用如先前描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人,J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42)或透气性培养皿(G-REX培养瓶)进行。在一些实施方案中，第二扩增(包括称为快速扩增的扩增)是在T-175培养瓶中进行，并且可将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加到每个T-175培养瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物中培养。T-175培养瓶可在37℃、5％ CO2下温育。可在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方案中，在第7天，可将来自两个T-175培养瓶的细胞在3L袋中组合，并且将300mL AIM V与5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2添加到300mL TIL悬浮液中。每天或每两天对每个袋中的细胞数目进行计数，并且添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/毫升之间。
在一些实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图1或图36的步骤D中提及的扩增)可在具有100cm透气硅底的500mL容量透气培养瓶(G-REX-100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿(New Brighton,MN,USA)的Wilson Wolf Manufacturing公司)中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC一起在400mL补充有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％ CO2中温育。在第5天，可将250mL上清液取出并放入离心瓶中并且以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL沉淀物可用150mL具有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬，并且添加回初始G-REX-100培养瓶中。当TIL在G-REX-100培养瓶中连续扩增时，在第7天，每个G-REX-100中的TIL可悬浮于每个培养瓶中存在的300mL培养基中，并且细胞悬浮液可分成可用于接种3个G-REX-100培养瓶的3份100mL等分试样。然后可将150mL具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加到每个培养瓶中。G-REX-100培养瓶可在37℃、5％ CO2下温育并且在4天后，可将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加到每个G-REX-100培养瓶中。可在培养第14天收集细胞。在一些实施方案中，过程采用不同的离心速度(400g、300g、200g，持续5分钟)和不同的重复次数。
在一些实施方案中，第二扩增(包括称为REP的扩增)是在培养瓶中进行，其中在150mL培养基中将主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合。在一些实施方案中，替换培养基直至细胞转移到替代生长箱室。在一些实施方案中，用新鲜培养基通过抽吸来置换2/3的培养基。在一些实施方案中，替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方案中，进行第二扩增(包括称为REP的扩增)，并且还包括其中针对优良肿瘤反应性来选择TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
任选地，细胞存活率测定可在第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准测定进行。例如，可在主体TIL样品上进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞并允许存活率评估。在一些实施方案中，TIL样品可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯(Lawrence,MA)的Nexcelom Bioscience)计算和确定存活率。在一些实施方案中，存活率是根据标准Cellometer K2Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
在一些实施方案中，TIL的第二扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人,2008,JImmunother.,31,742-751，和Dudley等人,2003,JImmunother.,26,332-342)或透气G-REX培养瓶进行。在一些实施方案中，使用培养瓶进行第二扩增。在一些实施方案中，使用透气G-REX培养瓶进行第二扩增。在一些实施方案中，第二扩增是在T-175培养瓶中进行，并且将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中并且将其添加到每个T-175培养瓶中。TIL与作为“饲养”细胞的经照射(50Gy)的同种异体PBMC以1:100的比率一起培养并且细胞在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养。T-175培养瓶在37℃、5％ CO2下温育。在一些实施方案中，在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方案中，在第7天，在3L袋中将来自2个T-175培养瓶的细胞合并并且将具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的300mL AIM-V添加到300mL TIL悬浮液中。可每天或每两天对每个袋中的细胞数目进行计数，并且可添加新鲜培养基以使细胞计数保持在约0.5与约2.0×106个细胞/毫升之间。
在一些实施方案中，第二扩增(包括称为REP的扩增)是在具有100cm2透气硅底的500mL容量瓶(G-REX-100，Wilson Wolf)中进行，将约5×106或10×106个TIL与经照射的同种异体PBMC以1:100的比率在400mL补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶在37℃、5％ CO2下温育。在一些实施方案中，在第5天，取出250mL上清液并放入离心瓶中并且以1500rpm(491g)离心10分钟。TIL沉淀物然后可用具有3000IU/mL IL-2的150mL新鲜50/50培养基重悬并且添加回初始G-REX-100培养瓶中。在TIL于G-REX-100培养瓶中连续扩增的实施方案中，在第7天，将每个G-REX-100中的TIL悬浮于每个培养瓶中存在的300mL培养基中，并且将细胞悬浮液分成可用于接种3个G-REX-100培养瓶的三份100mL等分试样。然后将150mL具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加到每个培养瓶中。G-REX-100培养瓶在37℃、5％ CO2下温育并且在4天后，将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加到每个G-REX-100培养瓶中。在培养的第14天收集细胞。在一些实施方案中，过程采用不同的离心速度(400g、300g、200g，持续5分钟)和不同的重复次数。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生表现并增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，在第二扩增中获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方案中，第二扩增培养基(例如，有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。
在一些实施方案中，在密闭系统生物反应器中进行第二扩增，例如根据图1或图36的步骤D。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施方案中，快速或第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大(scaling up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中在小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速或第二扩增；并且然后(b)实现将小规模培养中的TIL转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)中并且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4至7天的时段。
在一些实施方案中，快速或第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大(scaling out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中在第一小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速或第二扩增；并且然后(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器中的来自第一小规模培养的TIL部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时段。
在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施方案中，快速或第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中在小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速或第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的TIL转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4至7天的时段。
在一些实施方案中，快速或第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中在小规模培养中培养TIL约5天的时段来进行快速或第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的TIL转移并分配到2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时段。
在一些实施方案中，在快速或第二扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL。在一些实施方案中，在快速或第二扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施方案中，每个第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2至5个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施方案中，在完成快速或第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速或第二扩增后，将一个或多个TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速扩增后，每个TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施方案中，在拆分为多个步骤之前，快速或第二扩增进行约3至7天的时段。在一些实施方案中，快速或第二扩增的拆分发生在快速或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。
在一些实施方案中，快速或第二扩增的拆分发生在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天。在一个示例性实施方案中，快速或第二扩增的拆分发生在第一扩增开始后约第16天。
在一些实施方案中，快速或第二扩增在拆分后进一步进行约7至11天的时段。在一些实施方案中，快速或第二扩增在拆分后进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基包含与在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基包含与在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜细胞培养基置换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基置换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施方案中，在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基包含IL-2和任选地OKT-3。在一些实施方案中，在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施方案中，在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和任选地OKT-3的新鲜培养基置换在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分后用于快速或第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基置换在拆分前用于快速或第二扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施方案中，快速扩增的拆分是在密闭系统中进行。
在一些实施方案中，在快速或第二扩增期间的TIL培养规模的纵向扩大包括向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基(也称为馈送TIL)。在一些实施方案中，馈送包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施方案中，馈送包括以规则间隔将新鲜细胞培养基添加到TIL培养物中。在一些实施方案中，新鲜细胞培养基经由恒定流动而供应至TIL。在一些实施方案中，使用例如Xuri W25的自动细胞扩增系统进行快速扩增和馈送。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序(例如包括例如图1或图36的步骤D中所描述的扩增以及称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且如实施例中所描述用于REP程序，其提供了用于评价经照射的同种异体PBMC的无复制能力的示例性方案。
在一些实施方案中，如果第14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养物的初始活细胞数目，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受用于本文中所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养物的初始活细胞数目相比未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文中所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养物的初始活细胞数目相比未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文中所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10-50ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞/约100×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞/约50×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞/约25×106个TIL的比率。
在一些实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且用于本文中所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一些实施方案中，在第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文中所描述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合以及IL-2、IL-15和IL-21中的两者或更多者的组合来进行TIL的快速扩增和或第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，并且特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施方案中，步骤D还可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤D还可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤D还可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中其他地方所描述。此外，可在步骤D期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂I-α激动剂，包括增殖物激活受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑烷二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。
E.步骤E：收集TIL
在第二扩增步骤后，可收集细胞。在一些实施方案中，在例如图1或图36中所提供的一个、两个、三个、四个或更多个扩增步骤后收集TIL。在一些实施方案中，在两个扩增步骤后收集TIL，例如如图1或图36中所提供。
TIL可以任何适当和无菌方式收集，包括例如离心。用于收集TIL的方法是本领域中众所周知的并且任何此类已知方法都可与本发明的方法一起使用。在一些实施方案中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International公司。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方案中，细胞收集是经由细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也是指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以去除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭、无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，收集，例如根据图1或图36的步骤E，是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施方案中，根据图1或图36的步骤E是根据本文中所描述的过程进行。在一些实施方案中，密闭系统是在无菌条件下经由注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方案中，采用如实施例中所描述的密闭系统。
在一些实施方案中，根据实施例中所描述的方法收集TIL。在一些实施方案中，第1天和第11天之间的TIL是使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实施例中的第11天TIL收集。在一些实施方案中，第12天和第24天之间的TIL是使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实施例中的第22天TIL收集。在一些实施方案中，第12天和第22天之间的TIL是使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实施例中的第22天TIL收集。
F.步骤F：最终配制和转移到输注容器
在如图1或图36中以示例性次序提供并且如上文和本文中所详细概述的步骤A至E完成后，将细胞转移到容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施方案中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL，就将其转移到容器以用于向患者施用。
在一些实施方案中，使用本公开的APC扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施方案中，药物组合物为TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
VI.Gen 3TIL制造过程
在不受任何特定理论限制的情况下，据认为如本发明方法中所描述的起动T细胞激活的启始第一扩增和接着加强T细胞激活的快速第二扩增，允许制备保留“较年轻”表型的经扩增T细胞，并且因此预期本发明的经扩增T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞表现出较高细胞毒性。特别是，据认为如本发明方法所教导的通过暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和任选地抗原呈递细胞(APC)来起动T细胞的激活并且然后通过后续暴露于另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC来加强，其限制或避免培养基中的T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群体，所述T细胞因培养扩增而耗竭较少并且对癌细胞表现出较高细胞毒性。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下达到培养规模的纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将小规模培养中的T细胞转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)并且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养T细胞约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)将来自第一小规模培养中的T细胞转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相同的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)将来自小规模培养的T细胞转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)将来自小规模培养的T细胞转移并分配到2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约5天的时段。
在一些实施方案中，在快速扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL。在一些实施方案中，在快速扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施方案中，每个第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2至5个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施方案中，在完成快速扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速扩增后，将一个或多个TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速扩增后，每个TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施方案中，在分成多个步骤之前将快速扩增进行约1至5天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的拆分发生在快速扩增开始后约第1天、第2天、第3天、第4天或第5天。
在一些实施方案中，快速扩增的拆分发生在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天。在一个示例性实施方案中，快速扩增的拆分发生在启始第一扩增开始后约第10天。在另一个示例性实施方案中，快速扩增的拆分发生在启始第一扩增开始后约第11天。
在一些实施方案中，快速扩增在拆分后进一步进行约4至11天的时段。在一些实施方案中，快速扩增在拆分后进一步进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基包含与在拆分后用于快速扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基包含与在拆分后用于快速扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施方案中，在拆分后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2和任选地OKT-3。在一些实施方案中，在拆分后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施方案中，在拆分后用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和任选地OKT-3的新鲜培养基来替换在拆分前用于快速扩增的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分后用于快速扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换在拆分前用于快速扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施方案中，快速扩增的拆分是在密闭系统中进行。
在一些实施方案中，在快速扩增期间TIL培养规模的纵向扩大包括向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基(也称为馈送TIL)。在一些实施方案中，馈送包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施方案中，馈送包括以规则间隔将新鲜细胞培养基添加到TIL培养物中。在一些实施方案中，新鲜细胞培养基经由恒定流动而供应至TIL。在一些实施方案中，使用例如Xuri W25的自动细胞扩增系统进行快速扩增和馈送。
在一些实施方案中，快速第二扩增是在通过启始第一扩增所实现的T细胞激活开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。
在一些情况下，快速第二扩增是在通过启始第一扩增实现的T细胞激活已降低刚好或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之后进行。
在一些实施方案中，快速第二扩增是在通过启始第一扩增所实现的T细胞激活已降低刚好或大约1％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施方案中，快速第二扩增是在通过启始第一扩增实现的T细胞激活已降低刚好或大约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施方案中，快速第二扩增是在通过启始第一扩增实现的T细胞激活已降低至少刚好或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之后进行。
在一些情况下，快速第二扩增是在通过启始第一扩增实现的T细胞激活已降低至多刚好或大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之后进行。
在一些实施方案中，通过启始第一扩增实现的T细胞激活的降低是通过T细胞响应于抗原刺激而释放的干扰素γ的量的减少来确定。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在至多刚好或大约7天或大约8天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在至多刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增是在至多刚好或大约11天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增是在至多刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增是在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约7天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约11天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在至多刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在至多刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约8天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约9天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在8天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在9天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约7天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在刚好或大约1天至刚好或大约9天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的启始第一扩增是在7天的时段内进行并且T细胞的快速第二扩增是在9天的时段内进行。
在一些实施方案中，T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，T细胞为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在一些实施方案中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方案中，T细胞是获自患有癌症的供体。
在一些实施方案中，T细胞是获自从患有癌症的患者切除的肿瘤的TIL。
在一些实施方案中，T细胞是获自患有血液科恶性疾病的患者的骨髓的MIL。
在一些实施方案中，T细胞是获自供体的外周血单核细胞(PBMC)的PBL。在一些实施方案中，供体患有癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患有肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方案中，供体患有血液科恶性疾病。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如T细胞)可使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLL分离)从收集自受试者的血液单元获得。在一个优选方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，通过单采术收集的细胞可经洗涤以去除血浆级分并且任选地将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，细胞是用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果并非全部)二价阳离子。在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过经由PERCOLL梯度离心或通过逆流离心淘析耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一些实施方案中，T细胞为从来自供体的全血或富含淋巴细胞的单采术产物分离的PBL。在一些实施方案中，供体患有癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患有肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施方案中，供体患有血液科恶性疾病。在一些实施方案中，PBL是通过使用阳性或阴性选择方法而从全血或富含淋巴细胞的单采术产物分离，即，使用T细胞表型的标志物(例如，CD3+CD45+)去除PBL，或去除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施方案中，PBL是通过梯度离心分离。在从供体组织分离PBL后，PBL的启始第一扩增可根据本文所描述的任何方法的启始第一扩增步骤，通过将适合数目的经分离PBL(在一些实施方案中，约1×107个PBL)接种于启始第一扩增培养物中来起始。
含有这些特征中的一些的称为过程3(在本文中也称为Gen 3)的示例性TIL过程描绘于图8(特别是，例如，图8B和/或图8C和/或图8D)中以及图36中，并且本发明的此实施方案与Gen 2相比的一些优势描述于图1、图2、图8、图30和图31(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中。Gen 3的实施方案示于图1、图8、图30和图36(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中。过程2A或Gen 2或Gen 2A也描述于美国专利公开第2018/0280436号中，其通过引用整体并入本文。Gen 3过程也描述于国际专利公开WO 2020/096988中。
如本文中所论述和大体上概述，TIL是取自患者样品，并且使用本文所描述并且称为Gen 3的TIL扩增过程操作以在移植到患者中之前扩增其数目。在一些实施方案中，TIL可任选地如下文所论述经基因操作。在一些实施方案中，TIL可在扩增之前或之后冷冻保存。在解冻后，它们还可在输注到患者中之前经再刺激以增加其代谢。
在一些实施方案中，启始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，并且快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。在一些实施方案中，启始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，并且快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤D的过程)缩短为1至8天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。在一些实施方案中，启始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤B的过程)缩短为1至7天，并且快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。在一些实施方案中，启始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是，例如，图8B和/或图8C)中示为步骤B的过程)为1至7天，并且快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中示为步骤D的过程)为1至10天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为8天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为8至9天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为7至8天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为8天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为8天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为9天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为8天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为10天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为7天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为7至10天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为7天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为8至10天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)为7天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为9至10天。在一些实施方案中，启始第一扩增(例如，图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，并且快速第二扩增(例如，如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施方案中，启始第一扩增和快速第二扩增(例如，在图8(特别是，例如，图8B和/或图8C)中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合为14-16天，如下文以及实施例和附图中所详细论述。特别是，认为本发明的某些实施方案包含启始第一扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原而激活。在某些实施方案中，在如上文所描述的启始第一扩增步骤中激活的TIL为第一TIL群体，即，其为原代细胞群体。
下文中的“步骤”标识A、B、C等是参考图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的非限制性实例和参考本文中所描述的某些非限制性实施方案。下文和图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中的步骤次序为示例性的，并且本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样品
一般而言，TIL最初获自患者肿瘤样品(“原代TIL”)或获自循环淋巴细胞(例如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞)，并且然后扩增成较大群体以进行如本文中所描述的进一步操作，任选地经冷冻保存，并且任选地评价表型和作为TIL健康指标的代谢参数。
患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由手术切除、穿刺活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段获得。一般而言，肿瘤样品可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，例如获自血液科恶性疾病的肿瘤。实体肿瘤可为任何癌症类型，包括(但不限于)乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括(但不限于)鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑素瘤)。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，适用的TIL是获自恶性黑素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高水平的TIL。
一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器分割片段化成1mm3至约8mm3之间的小型片状物，其中约2-3mm3是特别适用的。TIL是从这些片段使用酶促肿瘤消化物培养。此类肿瘤消化物可通过在酶介质(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤放置于酶介质中并且机械解离肿瘤大约1分钟，接着在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，接着在前述条件下重复机械解离和温育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL分支亲水性多糖的密度梯度分离以去除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，所述公开的公开内容通过引用并入本文。任何前述方法可用于本文中所描述的任何实施方案中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种或多种解离(消化)酶，例如但不限于胶原酶(包括任何掺合物或类型的胶原酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和其任何组合。
在一些实施方案中，解离酶是从冻干酶复原。在一些实施方案中，冻干酶是在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原酶(例如无动物源1型胶原酶)是在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶289.2PZ U。在一些实施方案中，胶原酶是在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方案中，在复原后，胶原酶储备液的范围为约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施方案中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方案中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶的储备液是可变的并且可能需要确定浓度。在一些实施方案中，可检验冻干储备液的浓度。在一些实施方案中，添加到消化混合液中的酶的最终量是基于所确定的储备液浓度调节。
在一些实施方案中，酶混合物包括约4.7mL无菌HBSS中的约10.2ul中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL胶原酶(1.2PZ/mL)和250ul DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施方案中，TIL是源自实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化。在一些实施方案中，实体肿瘤未经片段化并且以全肿瘤进行酶促消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤是在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在旋转下在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，肿瘤是在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，肿瘤是在37℃、5％ CO2下在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤。在一些实施方案中，在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在旋转下在包含胶原酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化肿瘤1-2小时。在一些实施方案中，在恒定旋转下消化肿瘤过夜。在一些实施方案中，在37℃、5％ CO2下在恒定旋转下消化肿瘤过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在无菌缓冲液中用冻干酶复原肿瘤。在一些实施方案中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方案中，酶混合物包含胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶为胶原酶IV。在一些实施方案中，胶原酶的工作储备液为100mg/mL 10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶的工作储备液为10mg/mL 10X工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原酶、1000IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原酶、500IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
一般而言，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施方案中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，片段化为物理片段化。在一些实施方案中，片段化为分割。在一些实施方案中，片段化是通过消化。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养。
在一些实施方案中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所提供)中获得肿瘤样品后，对肿瘤进行物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化在获得肿瘤之后并且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施方案中，片段化步骤是体外或离体过程。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将10、20、30、40或更多个片段或块状物置于每个容器中进行启始第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将30或40个片段或块状物置于每个容器中进行启始第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并且将40个片段或块状物置于每个容器中进行启始第一扩增。在一些实施方案中，多个片段包含约4个至约50个片段，其中每个片段的体积为约27mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约30个至约60个片段，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个片段包含约4个片段。
在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段是通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段为约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约10mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施方案中，肿瘤片段为1mm×1mm×1mm。在一些实施方案中，肿瘤片段为2mm×2mm×2mm。在一些实施方案中，肿瘤片段为3mm×3mm×3mm。在一些实施方案中，肿瘤片段为4mm×4mm×4mm。
在一些实施方案中，将肿瘤片段化以使每个块状物上出血性、坏死性和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤片段化以使每个块状物上出血性组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤片段化以使每个块状物上坏死性组织的量减至最小。在一些实施方案中，将肿瘤片段化以使每个块状物上脂肪组织的量减至最小。在某些实施方案中，肿瘤片段化步骤是体外或离体方法。
在一些实施方案中，进行肿瘤片段化以便维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤片段化。在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶介质(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育，接着进行机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶介质中后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。然后可将溶液在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，并且然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再温育30分钟后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后如果大片组织仍存在，则施加1或2次额外机械解离至样品，不论是否再在37℃下在5％ CO2中温育30分钟。在一些实施方案中，在最终温育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，将启始第一扩增步骤之前的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。
在一些实施方案中，细胞可任选地在样品分离之后(例如，在获得肿瘤样品后和/或在从肿瘤样品获得细胞悬浮液后)冷冻，并且在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，所述步骤B进一步详细描述于下文并且示例于图8(特别是例如图8B)中。
1.空芯针/小型活检来源的TIL
在一些实施方案中，TIL最初是获自通过空芯针活检或类似程序获得的患者肿瘤样品(“原代TIL”)并且然后扩增成较大群体以进行如本文中所描述的进一步操作，任选地经冷冻保存，并且任选地评价表型和代谢参数。
在一些实施方案中，患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由小型活检、空芯针活检、穿刺活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段获得。一般而言，肿瘤样品可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，例如获自血液科恶性疾病的肿瘤。在一些实施方案中，样品可来自多个小肿瘤样品或活检。在一些实施方案中，样品可包含来自同一患者的单一肿瘤的多个肿瘤样品。在一些实施方案中，样品可包含来自同一患者的一个、两个、三个或四个肿瘤的多个肿瘤样品。在一些实施方案中，样品可包含来自同一患者的多个肿瘤的多个肿瘤样品。实体肿瘤可为肺和/或非小细胞肺癌(NSCLC)。
一般而言，获自肿瘤核心或片段的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施方案中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，如果肿瘤为转移性肿瘤并且在过去已有效治疗/取出原发性病灶，则可能需要取出一个转移性病灶。在一些实施方案中，在可用时，微创方法是取出皮肤病灶或颈部或腋窝区域上的淋巴结。在一些实施方案中，取出皮肤病灶或取出其小型活检。在一些实施方案中，取出淋巴结或其小型活检。在一些实施方案中，肿瘤为黑素瘤。在一些实施方案中，黑素瘤的小型活检包含黑痣或其一部分。
在一些实施方案中，小型活检为穿孔活检。在一些实施方案中，穿孔活检是以圆形刀片压入皮肤中获得。在一些实施方案中，穿孔活检是以圆形刀片压入可疑黑痣周围的皮肤中获得。在一些实施方案中，穿孔活检是以圆形刀片压入皮肤中获得，并且取出一块圆形皮肤。在一些实施方案中，小型活检为穿孔活检并且取出圆形部分的肿瘤。
在一些实施方案中，小型活检为切除式活检。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检并且取出整个黑痣或生长物。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检并且连同小边缘的正常外观皮肤取出整个黑痣或生长物。
在一些实施方案中，小型活检为切开式活检。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检并且仅采集最不规则部分的黑痣或生长物。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检，并且所述切开式活检是在其他技术无法完成时使用，例如当可疑黑痣非常大时使用。
在一些实施方案中，小型活检为肺活检。在一些实施方案中，小型活检是通过支气管镜检获得。通常，支气管镜检是在患者麻醉下使小工具通过鼻或口、下至咽喉并且进入支气管通道，其中使用小工具来取出一些组织。在一些实施方案中，在无法经由支气管镜检到达肿瘤或生长物的情况下，可以采用经胸穿刺活检。通常，对于经胸穿刺活检，患者也处于麻醉下并且将针穿过皮肤直接插入可疑位点以取出小组织样品。在一些实施方案中，经胸穿刺活检可能需要介入性放射线学(例如使用x射线或CT扫描引导针头)。在一些实施方案中，小型活检是通过穿刺活检获得。在一些实施方案中，小型活检是经内视镜超声波获得(例如，内视镜附灯并且经口置于食道中)。在一些实施方案中，小型活检是经手术获得。
在一些实施方案中，小型活检为头颈活检。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检，其中从外观异常区域切除一小块组织。在一些实施方案中，如果容易接近异常区，则无需住院就可采集样品。在一些实施方案中，如果肿瘤在口腔或咽喉内部较深处，则活检可能需要在手术室全身麻醉进行。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检，其中取出整个区域。在一些实施方案中，小型活检为细针抽吸(FNA)。在一些实施方案中，小型活检为细针抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器的非常细的针头从肿瘤或肿块抽取(抽吸)细胞。在一些实施方案中，小型活检为穿孔活检。在一些实施方案中，小型活检为穿孔活检，其中使用穿孔镊取出一块可疑区域。
在一些实施方案中，小型活检为宫颈活检。在一些实施方案中，小型活检是经由阴道镜获得。通常，阴道镜方法采用附接至双目放大镜的附灯放大仪器(阴道镜)，然后用于对一小部分的宫颈进行活检检查。在一些实施方案中，小型活检为宫颈锥状切除/锥状活检。在一些实施方案中，小型活检为宫颈锥状切除/锥状活检，其中可能需要门诊手术以从宫颈取出较大块组织。在一些实施方案中，除了有助于确诊之外，锥状活检也可以用作初始治疗。
术语“实体肿瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。术语“实体肿瘤癌症”是指恶性、赘生性或癌性实体肿瘤。实体肿瘤癌症包括肺癌。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤的组织结构包括相互相依组织隔室，包括实质(癌细胞)和有癌细胞分散其中并且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
在一些实施方案中，来自肿瘤的样品是以细针抽吸物(FNA)、空芯针活检、小型活检(包括例如穿孔活检)形式获得。在一些实施方案中，首先将样品放置于G-REX-10中。在一些实施方案中，当存在1个或2个空芯针活检和/或小型活检样品时，首先将样品放置于G-REX-10中。在一些实施方案中，当存在3、4、5、6、8、9或10个或更多个空芯针活检和/或小型活检样品时，首先将样品放置于G-REX-100中。在一些实施方案中，当存在3、4、5、6、8、9或10个或更多个空芯针活检和/或小型活检样品时，首先将样品放置于G-REX-500中。
FNA可获自皮肤肿瘤，包括例如黑素瘤。在一些实施方案中，FNA是获自皮肤肿瘤，例如来自患有转移性黑素瘤的患者的皮肤肿瘤。在一些情况下，患有黑素瘤的患者先前已经历手术治疗。
FNA可获自肺肿瘤，包括例如NSCLC。在一些实施方案中，FNA是获自肺肿瘤，例如来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺肿瘤。在一些情况下，NSCLC患者先前已经受外科治疗。
本文所描述的TIL可获自FNA样品。在一些情况下，FNA样品是使用在18号针头至25号针头范围中的细规格针头从患者获得或分离。细规格针头可为18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施方案中，来自患者的FNA样品可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
在一些情况下，本文所描述的TIL是获自空芯针活检样品。在一些情况下，空芯针活检样品是使用在11号针头至16号针头范围中的外科或医用针头从患者获得或分离。针头可为11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施方案中，来自患者的空芯针活检样品可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
一般而言，经收集的细胞悬浮液被称为“原代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施方案中，TIL并非获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，实体肿瘤核心未经片段化。
在一些实施方案中，TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶介质(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育，接着进行机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶介质中后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。然后可将溶液在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，并且然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再温育30分钟后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后如果大片组织仍存在，则施加1或2次额外机械解离至样品，不论是否再在37℃下在5％CO2中温育30分钟。在一些实施方案中，在最终温育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，获得第一TIL群体包含多病灶取样方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种或多种解离(消化)酶，例如但不限于胶原酶(包括任何掺合物或类型的胶原酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和其任何组合。
在一些实施方案中，解离酶是从冻干酶复原。在一些实施方案中，冻干酶是在一定量的无菌缓冲液如汉克氏平衡盐溶液(Hank's balance salt solution，HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原酶(例如无动物源1型胶原酶)是在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶289.2PZ U。在一些实施方案中，胶原酶是在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施方案中，在复原后，胶原酶储备液的范围为约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施方案中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I是在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方案中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶储备液可发生变化，因此验证冻干储备液的浓度并且相应地修改添加到消化混合液中的酶的最终量。
在一些实施方案中，酶混合物包括约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μl胶原酶(1.2PZ/mL)和250μl DNA酶I(200U/mL)。
2.胸腔积液T细胞和TIL
在一些实施方案中，样品为胸膜液样品。在一些实施方案中，根据本文中所描述的方法的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样品。在一些实施方案中，样品为源于胸腔积液的样品。在一些实施方案中，根据本文中所描述的方法的用于扩增的T细胞或TIL的来源为源于胸腔积液的样品。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此种样品可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，样品可为来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样品为胸膜渗出物。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样品为胸膜溢出物。其他生物样品可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中在胸腔和腹腔中都具有间皮细胞系和流体形式，并且在一些实施方案中，此类流体含有TIL。在本发明示例胸膜液的一些实施方案中，可以使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施方案中，胸膜液呈未经处理的形式直接从患者中取出。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施方案中，在从患者收集之后立即将样品放置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。如果保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方案中，样品是在从患者中取出后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，样品是在4℃下从患者中取出后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方案中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样品。在一些实施方案中，稀释度为1:10胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:9胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:8胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:5胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:2胸膜液/稀释剂。在其他实施方案中，稀释度为1:1胸膜液/稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方案中，样品是在从患者收集和稀释后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，如果保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24-48小时内显著减少。在一些实施方案中，胸膜液样品是在从患者中取出并稀释后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，胸膜液样品是在从患者中取出并在4℃下稀释后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在其他实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，在胸膜液必须冷冻保存以便运输至进行所述方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24-48小时之后)的情形下，此胸膜液的预处理是优选的。在一些实施方案中，通过在将胸膜液样品从受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物重悬于缓冲液中来制备胸膜液样品。在一些实施方案中，对胸膜液样品进行多次离心和重悬，然后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方案中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样品。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的胸膜液样品是通过将流体经由含有已知并且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备的，所述孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施方案中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在其他实施方案中，孔径可为5μM或更大，并且在其他实施方案中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一者。过滤后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)从膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以这种方式浓缩的细胞(包括TIL)用于所述方法的接触步骤中。
在一些实施方案中，使胸膜液样品(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或重悬的细胞沉淀物与溶解试剂接触，所述溶解试剂差异性地溶解样品中存在的无核红细胞。在一些实施方案中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，这个步骤是在进一步的处理步骤之前进行。适合的溶解试剂包括单一溶解试剂或溶解试剂和淬灭试剂，或溶解试剂、淬灭试剂和固定试剂。适合的溶解系统是市售的，并且包括BD Pharm LyseTM系统(BectonDickenson)。其他溶解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(Beckman Coulter公司)或氯化铵系统。在一些实施方案中，溶解试剂可随主要需求而变化，所述需求是红细胞的有效溶解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除使用单一试剂用于溶解以外，适用于本文中所描述的方法的溶解系统可包括第二试剂，例如在所述方法的剩余步骤期间淬灭或延迟溶解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(Beckman Coulter公司)。取决于溶解试剂的选择或所述方法的优选实施，还可采用常规固定试剂。
在一些实施方案中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样品，然后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
3.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一些实施方案中，PBL是使用本文所描述的方法扩增。在本发明的一些实施方案中，所述方法包括获得来自全血的PBMC样品。在一些实施方案中，所述方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一些实施方案中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样品解冻并且计算PBMC的数目。使用人类泛T细胞分离试剂盒与LS柱(Miltenyi Biotec)分离T细胞。
PBL方法2。在本发明的一些实施方案中，PBL是使用PBL方法2扩增，所述方法包括获得来自全血的PBMC样品。通过在37℃下温育PBMC至少三小时并且然后分离非粘附细胞来富集来自PBMC的T细胞。
在本发明的一些实施方案中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样品解冻，并且将PBMC细胞以每孔600万个细胞接种于CM-2培养基中的6孔板中并且在37℃下温育3小时。3小时后，取出非粘附细胞(其为PBL)并且计算其数目。
PBL方法3。在本发明的一些实施方案中，PBL是使用PBL方法3扩增，所述方法包括获得来自外周血的PBMC样品。B细胞是使用CD19+选择分离并且T细胞是使用负向选择PBMC样品的非CD19+级分来选择。
在本发明的一些实施方案中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻并且计算其数目。使用CD19多分选人类试剂盒(Miltenyi Biotec)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人类泛T细胞分离试剂盒和LS柱(MiltenyiBiotec)纯化T细胞。
在一些实施方案中，PBMC是从全血样品分离。在一些实施方案中，使用PBMC样品作为扩增PBL的起始物质。在一些实施方案中，样品在扩增过程之前经冷冻保存。在其他实施方案中，使用新鲜样品作为扩增PBL的起始物质。在本发明的一些实施方案中，使用本领域中已知的方法从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，使用人类泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施方案中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)从PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施方案中，PBMC样品是在可有效鉴定非粘附细胞的所需温度下温育一段时间。在本发明的一些实施方案中，温育时间为约3小时。在本发明的一些实施方案中，温度为约37℃。然后使用上文所描述的过程扩增非粘附细胞。
在一些实施方案中，PBMC样品是来自任选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，肿瘤样品是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样品是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、或1年或更长时间。在其他实施方案中，PBMC是来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如伊布替尼(ibrutinib))的患者。
在一些实施方案中，PBMC样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗并且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如伊布替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施方案中，PBMC样品是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样品是来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗并且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、或至少1年或更长时间的受试者或患者。在其他实施方案中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一些实施方案中，在第0天，针对CD19+选择细胞并且据此分选。在本发明的一些实施方案中，使用抗体结合珠粒进行选择。在本发明的一些实施方案中，在第0天从PBMC分离纯T细胞。
在本发明的一些实施方案中，对于未经伊布替尼或其他ITK抑制剂预先治疗的患者，10-15mL血沉棕黄层将产生约5×109个PBMC，其又将产生约5.5×107个PBL。
在本发明的一些实施方案中，对于经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一些实施方案中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个PBL。
在任何前述实施方案中，PBMC可来源于全血样品，通过单采术获得，来源于血沉棕黄层，或从本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施方案中，PBL是使用美国专利申请公开第US 2020/0347350A1号中所描述的方法制备，其公开内容通过引用并入本文。
4.扩增来自骨髓源PBMC的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本发明的一些实施方案中，所述方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC并且分选，并且将非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行声波处理并且将一部分经声波处理的细胞级分添加回至所选细胞级分中。
在本发明的一些实施方案中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样品解冻并且计算PBMC的数目。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色并使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本发明的一些实施方案中，PBMC是获自骨髓。在一些实施方案中，PBMC是经由单采术、抽吸、穿刺活检或本领域中已知的其他类似方式从骨髓获得。在一些实施方案中，PBMC是新鲜的。在其他实施方案中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一些实施方案中，MIL是从10-50mL骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施方案中，从患者获得10mL骨髓抽吸物。在其他实施方案中，从患者获得20mL骨髓抽吸物。在其他实施方案中，从患者获得30mL骨髓抽吸物。在其他实施方案中，从患者获得40mL骨髓抽吸物。在其他实施方案中，从患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施方案中，从约10-50mL骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在其他实施方案中，产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施方案中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个MIL。在本发明的一些实施方案中，产生约1×106个MIL。
在本发明的一些实施方案中，来源于骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生大约1.4×105个MIL。
在任何前述实施方案中，PBMC可来源于全血样品、骨髓，通过单采术获得，来源于血沉棕黄层，或从本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施方案中，使用美国专利申请公开第US2020/0347350A1号中所描述的方法制备MIL，其公开内容通过引用并入本文。
B.步骤B：启始第一扩增
在一些实施方案中，本发明方法提供较年轻TIL，所述较年轻TIL相较于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前已进一步进行更多轮复制的TIL)可能提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人,Scand.J.Immunol.2012,75,157-167；Dudley等人,Clin.Cancer Res.2010,16,6122-6131；Huang等人,J.Immunother.2005,28,258-267；Besser等人,Clin.Cancer Res.2013,19,OF1-OF9；Besser等人,J.Immunother.2009,32,415-423；Robbins等人,J.Immunother.2004,173,7125-7130；Shen等人,J.Immunother.2007,30,123-129；Zhou等人,J.Immunother.2005,28,53-62；和Tran等人,J.Immunother.2008,31,742-751，其中的每一者通过引用并入本文。
在例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤A中所描述的肿瘤片段和/或肿瘤片段的分割或消化后，将所得细胞在有利于TIL但不利于肿瘤和其他细胞生长的条件下培养于含有IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中。在一些实施方案中，IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养起始时(例如在第0天)与肿瘤消化物和/或肿瘤片段一起添加。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤片段以每容器至多60个片段并且与6000IU/mL IL-2温育于容器中。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养数天的时段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养数天的时段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，启始第一扩增发生1至8天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，启始第一扩增发生1至7天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生5至8天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生5至7天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生约6至8天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生约6至7天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生约7至8天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生约7天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，此启始第一扩增发生约8天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施方案中，TIL的扩增可使用如下文和本文中所描述的启始第一扩增步骤(例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的步骤，其可包括称为预REP或启始REP的过程并且其从第0天和/或从培养起始含有饲养细胞)进行，接着进行如下文在步骤D中和本文中所描述的快速第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，接着进行任选的冷冻保存，并且接着进行如下文和本文中所描述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可任选地针对如本文中所描述的表型特征和代谢参数进行表征。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，第一扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。
在一些实施方案中，有少于或等于240个肿瘤片段。在一些实施方案中，有少于或等于240个肿瘤片段被放入少于或等于4个容器中。在一些实施方案中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方案中，少于或等于60个肿瘤片段被放入1个容器中。在一些实施方案中，每个容器包含每容器少于或等于500mL培养基。在一些实施方案中，培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施方案中，培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器30ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在制备肿瘤片段后，将所得细胞(即，为原代细胞群体的片段)在有利于TIL但不利于肿瘤和其他细胞生长的条件下培养于含有IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中，并且其允许从第0天培养开始TIL启始和加速生长。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤片段与6000IU/mL IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起温育。将此原代细胞群体培养数天的时段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，在启始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养数天的时段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，在启始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方案中，IL-2为重组人类IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有4-8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有5-7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液如实施例C中所描述制备。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或约8000IU/mL IL-2。
在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mLIL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mLIL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基还包含IL-15。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基包含约2IU/mLIL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、和50ng/mL至100ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含15ng/mL至30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含30ng/mLOKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施方案中，启始第一扩增细胞培养基在细胞培养基中包含一种或多种TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白，以及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，启始第一扩增细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，启始第一扩增细胞培养基还包含初始浓度约6000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，启始第一扩增培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其被称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人类AB血清、25mMHepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在一些实施方案中，CM为实施例中所描述的CM1。在一些实施方案中，启始第一扩增是在初始细胞培养基或第一细胞培养基中进行。在一些实施方案中，启始第一扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为饲养细胞)。
在一些实施方案中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定培养基。在一些实施方案中，无血清或确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方案中，无血清或确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-VSFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium,DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle,BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)。
在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的一者或多者：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种抗生素和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，确定培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，所述常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基。
在一些实施方案中，以无血清或确定培养基的总体积计，无血清或确定培养基中的总血清替代物浓度(体积％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约10％。
在一些实施方案中，无血清或确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂都可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)，并且2-巯基乙醇于培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisherScientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂都可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约6000IU/mLIL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，并且2-巯基乙醇于培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM、或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM、或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，培养基中的2-巯基乙醇的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，通过引用并入本文的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的确定培养基可用于本发明。在所述公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种或多种选自由以下组成的组的成分，或通过组合一种或多种选自由以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种或多种选自由以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，基础细胞培养基选自由以下组成的组：杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基。
在一些实施方案中，确定培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，并且白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方案中，确定培养基中的非微量元素部分成分是以表4中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列举的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定培养基中的非微量元素部分成分是以表4中的标题“1X培养基的优选实施方案”栏中列举的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施方案的一些中，无血清补充剂包含表4中的标题“补充剂的优选实施方案”栏中列举的类型和浓度的非微量部分成分。
表4：非微量元素部分成分的浓度
在一些实施方案中，确定培养基的摩尔渗透压浓度介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，摩尔渗透压浓度介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方案中，Smith等人,Clin.Transl.Immunology,4(1),2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定培养基可用于本发明。简而言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基并且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为1至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为2至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为3至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为4至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为5至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为6至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图1或图36(尤其例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为7至8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为8天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为1至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为2至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为3至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为4至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8B和/或图8C)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为5至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为6至7天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，启始第一扩增过程(包括例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或启始REP的那些过程)为7天，如实施例和附图中所论述。
在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行1天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行1天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行2天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行2天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行3天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行3天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行4天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行4天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行5天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行5天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行6天至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行6天至7天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行7至8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行8天。在一些实施方案中，启始第一TIL扩增可在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后进行7天。
在一些实施方案中，TIL的启始第一扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在启始第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，在启始第一扩增期间，包括例如在根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)以及本文所描述的步骤B过程期间可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在启始第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，在根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)以及如本文中所描述的步骤B过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合。
在一些实施方案中，启始第一扩增(例如根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-10。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第4-8天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第4-7天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第5-8天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第5-7天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第6-8天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第6-7天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第7或8天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在启始第一扩增期间第8天期间的任何时间添加。
在一些实施方案中，本文中所描述的启始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8B)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或启始REP的那些扩增)在TIL扩增起始时和启始第一扩增期间需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施方案中，饲养细胞是获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，启始第一扩增期间使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，启始第一扩增期间使用每容器2.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，启始第一扩增期间使用每GREX-102.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，启始第一扩增期间使用每GREX-100 2.5×108个饲养细胞。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且如实施例中所描述用于REP程序，其提供了用于评价经照射的同种异体PBMC的无复制能力的示例性方案。
在一些实施方案中，如果第14天活细胞总数小于在启始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，如果第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在启始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mLIL-2存在下培养。
在一些实施方案中，如果第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在启始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10-50ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和3000IU/mLIL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，本文所描述的启始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文所描述的启始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文所描述的启始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施方案中，本文所描述的启始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞。在其他实施方案中，启始第一扩增所需的饲养细胞数目为用于快速第二扩增的饲养细胞数目的四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一。
在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器30ng OKT-3。在一些实施方案中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含500mL培养基、6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基、6000IU/mL IL-2、15μg OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。
在一些实施方案中，本文所描述的启始第一扩增程序在第二扩增期间需要多于TIL的过量饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且用于本文中所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一些实施方案中，在启始第一扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文所描述的扩增方法通常使用具有高剂量的细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子与以下的组合进行TIL的启始第一扩增也是可能的：如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述的IL-2、IL-15和IL-21中的两种或更多种的组合，其公开内容通过引用并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，并且特别是如其中所描述的T细胞。参见例如表2。
在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤B还可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中其他地方所描述。此外，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂I-α激动剂，包括增殖物激活受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑烷二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。
C.步骤C：启始第一扩增至快速第二扩增的转变
在一些情况下，获自启始第一扩增(其可包括有时称为预REP的扩增)的主体TIL群体，包括例如获自例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的步骤B的TIL群体，可经历快速第二扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)并且然后如下文所论述冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将用于疗法的情况下，来自启始第一扩增的经扩增TIL群体或来自快速第二扩增的经扩增TIL群体可在扩增步骤之前或在启始第一扩增之后并且在快速第二扩增之前进行基因修饰以用于合适治疗。
在一些实施方案中，获自启始第一扩增(例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的步骤B)的TIL经储存直至为了选择而测定表型。在一些实施方案中，获自启始第一扩增(例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的步骤B)的TIL未经储存并且直接进行快速第二扩增。在一些实施方案中，获自启始第一扩增的TIL在启始第一扩增之后并且在快速第二扩增之前不经冷冻保存。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在肿瘤片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约3天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约3天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约4天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约4天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约5天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约5天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约6天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约6天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约7天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后约8天发生。
在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后1天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后1天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后2天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后2天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后3天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后3天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后4天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后4天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后5天至7天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后5天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后6天至7天发生在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后6天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后7天至8天发生。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后7天发生在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一启始扩增步骤起始后8天发生。
在一些实施方案中，TIL在初步第一扩增之后并且在快速第二扩增之前未经储存，并且TIL直接进行快速第二扩增(例如在一些实施方案中，在如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示的步骤B至步骤D的转变期间未经储存)。在一些实施方案中，转变在如本文中所描述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自启始第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行快速第二扩增而无转变期。
在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变(例如根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤C)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如GREX-10或GREX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施方案中，启始第一扩增至快速第二扩增的转变涉及容器大小的规模纵向扩大。在一些实施方案中，启始第一扩增与快速第二扩增相比是在较小容器中进行。在一些实施方案中，启始第一扩增在GREX-100中进行并且快速第二扩增在GREX-500中进行。
在一些实施方案中，将从第一扩增(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤B)获得的TIL转变为激活或基因编辑步骤。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至5天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约3天至4天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约4至5天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至7天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约5天至6天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至14天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至13天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至12天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至11天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至10天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至9天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至8天发生。在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在片段化发生后约6天至7天发生。
在一些实施方案中，从第一扩增至激活或基因编辑步骤的转变在密闭系统中发生，如本文中所描述。
在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和/或抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含OKT3的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1-7天、约1-6天、约2-6天、约3-6天、约4-6天、约5-6天、约1-5天、约2-5天、约3-5天、约4-5天、约1-4天、约2-4天、约3-4天、约1-3天、约2-3天、约1-2天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1天。在一些实施方案中，激活步骤进行约2天。在一些实施方案中，激活步骤进行约3天。在一些实施方案中，激活步骤进行约4天。在一些实施方案中，激活步骤进行约5天。在一些实施方案中，激活步骤进行约6天。在一些实施方案中，激活步骤进行约7天。
鉴于本说明书，可使用本领域中已知的任何合适的抗CD3/抗CD38珠粒。合适的抗CD3/抗CD38珠粒包括但不限于市售产品，包括但不限于用于T细胞扩增和激活的DynabeadsTM人类T-激活剂CD3/CD28(可购自Invitrogen)、ImmunoCultTM人类CD3/CD28 T细胞激活剂(可购自StemCell Technologies)和T Cell TransActTM(可购自MiltenyiBiotec)。
在一些实施方案中，激活步骤是任选的。在一些实施方案中，如果第一扩增包括OKT-3，则激活步骤是任选的。
在一些实施方案中，将从第一扩增(例如，从图36C-D中所示的步骤B)或从激活步骤(例如，从图36A-B中所示的步骤C)获得的TIL转变为基因编辑步骤。
在一些实施方案中，基因编辑步骤包括对TIL群体进行无菌电穿孔步骤。在一些实施方案中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调LAG-3表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CISH表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CBL-B表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调TIGIT表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4的表达下调以及PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3的表达下调以及PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH的表达下调以及PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CBL-B的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B/TIGIT双基因敲除TIL。
在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤C)获得的TIL转变为第二电穿孔步骤。在一些实施方案中，在第一电穿孔步骤与第二电穿孔步骤之间存在静息步骤。在一些实施方案中，静息步骤在约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃、约40℃下进行。根据一些实施方案，静息步骤进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约1.5天、约2天、约2.5天或约3天。在一些实施方案中，第二电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CTLA-4。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CISH的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调LAG-3的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调TIGIT的表达。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调CBL-B的表达。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4的表达下调以及PD-1、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3的表达下调以及PD-1、CTLA-4、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH的表达下调以及PD-1、LAG-3、CTLA-4、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CBL-B的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出TIGIT的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、CBL-B和PD-1中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CBL-B/TIGIT双基因敲除TIL。
在一些实施方案中，基因编辑步骤还包括静息步骤。根据一些实施方案，静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育第四TIL群体。根据一些实施方案，静息步骤在约30℃、约30.5℃、约31℃、约31.5℃、约32℃、约32.5℃、约33℃、约33.5℃、约34℃、约34.5℃、约35℃、约35.5℃、约36℃、约36.5℃、约37℃、约37.5℃、约38℃、约38.5℃、约39℃、约39.5℃、约40℃下进行。根据一些实施方案，静息步骤进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。根据一些实施方案，静息步骤包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至约23小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至约23小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约16小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约17小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约18小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约19小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约20小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约21小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约22小时。根据一些实施方案，静息步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约23小时。
在一些实施方案中，将从基因编辑步骤或静息步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤C)获得的TIL转变为第二扩增步骤(例如，从图36A-D或图8I-P中所示的步骤D)。在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤至第二扩增步骤的转变在基因编辑步骤或静息步骤开始后约0.5天、1天、2天、3天或4天发生。
在一些实施方案中，从基因编辑步骤或静息步骤至第二扩增步骤的转变在密闭系统中发生，如本文中所描述。
在一些实施方案中，TIL在基因编辑步骤或静息步骤之后并且第二扩增之前未储存，并且TIL直接进行第二扩增(例如，在一些实施方案中，在从步骤C至步骤D的转变期间未储存，如图36A-D或图8I-P中所示)。
在一些实施方案中，从第一扩增至第二扩增的转变，例如根据图36的步骤C，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，密闭系统用于TIL扩增，如本文中所描述。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100生物反应器。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
D.步骤D：快速第二扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群体在如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的收集和启始第一扩增(步骤A和步骤B)和称为步骤C的转变之后进一步扩增数目。这种进一步扩增在本文中称为快速第二扩增或快速扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP)的扩增过程；以及如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中所指示的过程。快速第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。在一些实施方案中，在快速第二扩增起始后1天、2天、3天或4天(即，在整体Gen 3过程的第8、9、10或11天)，将TIL转移到较大体积容器。
在一些实施方案中，TIL的快速第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约1天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约1天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约2天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约2天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约3天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约3天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约4天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约4天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约5天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约5天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约6天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约6天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约7天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约7天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约8天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约8天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约9天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约1天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约2天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约3天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约4天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约5天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约6天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约7天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约8天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行约10天。
在一些实施方案中，快速第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中所指示的过程)进行。在一些实施方案中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施方案中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中将饲养细胞添加到最终浓度，所述最终浓度为存在于启始第一扩增中的饲养细胞浓度的两倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原可任选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下任选地从载体表达，所述载体例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二扩增的部分发生。在一些实施方案中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL、或8000IU/mL IL-2。
在一些实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、和50ng/mL至100ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含15ng/mL至30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含30ng/mL至60ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，细胞培养基包含约60ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含每容器7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白，以及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，在第二扩增期间，包括例如在根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)以及本文所描述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，在根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)以及如本文中所描述的步骤D过程期间可包括IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合。
在一些实施方案中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞并且任选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方案中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约12IU/mLIL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mLIL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mLIL-21。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1比10、约1比15、约1比20、约1比25、约1比30、约1比35、约1比40、约1比45、约1比50、约1比75、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，REP和/或快速第二扩增是在培养瓶中进行，其中在150mL培养基中混合主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30ng/mL OKT3抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2，其中饲养细胞浓度为启始第一扩增中的饲养细胞浓度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。替换培养基(通常经由抽取2/3用过的培养基并且用相等体积的新鲜培养基替换来替换2/3培养基)直至细胞转移到替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方案中，快速第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)为7至9天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，第二扩增为7天。在一些实施方案中，第二扩增为8天。在一些实施方案中，第二扩增为9天。
在一些实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中提及的扩增)可在具有100cm透气硅底的500mL容量透气培养瓶(G-REX-100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC一起在400mL的补充有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％ CO2中温育。在第5天，可将250mL上清液取出并放入离心瓶中并且以1500rpm(491×g)离心10分钟。可将TIL沉淀物用150mL的含有5％人类AB血清、6000IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬，并且添加回原始GREX-100培养瓶中。当TIL在GREX-100培养瓶中连续扩增时，在第10或11天可将TIL移至较大培养瓶，例如GREX-500。可在培养第14天收集细胞。细胞可在培养的第15天收集。细胞可在培养的第16天收集。在一些实施方案中，替换培养基直至细胞转移到替代生长箱室。在一些实施方案中，通过抽取用过的培养基并且用相等体积的新鲜培养基替换来替换2/3培养基。在一些实施方案中，替代生长箱室包括GREX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。在一些实施方案中，过程采用不同的离心速度(400g、300g、200g，持续5分钟)和不同的重复次数。
在一些实施方案中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定培养基。在一些实施方案中，无血清或确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方案中，无血清或确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-VSFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基。
在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的一者或多者：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种抗生素和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，确定培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，所述常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基。
在一些实施方案中，以无血清或确定培养基的总体积计，无血清或确定培养基中的总血清替代物浓度(体积％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清或确定培养基的总体积的约10％。
在一些实施方案中，无血清或确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂都可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisherScientific)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂都可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisherScientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约6000IU/mLIL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL IL-2。
在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM、或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM、或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，国际专利申请公开第WO 1998/030679号和美国专利申请公开第US2002/0076747A1号中所描述的确定培养基(其通过引用并入本文)适用于本发明中。在所述公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种或多种选自由以下组成的组的成分，或通过组合一种或多种选自由以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种或多种选自由以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4 +、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，基础细胞培养基选自由以下组成的组：杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫改良杜尔贝科培养基。
在一些实施方案中，确定培养基中甘氨酸的浓度在约5-200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5-250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5-300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5-200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5-400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1-1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1-45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1-250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10-500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2-110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3-175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5-500mg/L，硫胺素的浓度为约1-20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1-20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1-200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1-50mg/L，胰岛素的浓度为约1-100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001-0.0001mg/L，并且白蛋白(例如I)的浓度为约5000-50,000mg/L。
在一些实施方案中，确定培养基中的非微量元素部分成分是以表4中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列举的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定培养基中的非微量元素部分成分是以表4中的标题“1X培养基的优选实施方案”栏中列举的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施方案的一些中，无血清补充剂包含表4中的标题“补充剂的优选实施方案”栏中列举的类型和浓度的非微量部分成分。
在一些实施方案中，确定培养基的摩尔渗透压浓度介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，摩尔渗透压浓度介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方案中，在Smith等人,Clin.Transl.Immunology,4(1),2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定培养基适用于本发明。简而言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基并且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方案中，进行快速第二扩增(包括称为REP的扩增)，并且其还包括其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
任选地，可在快速第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准测定来进行细胞存活率测定。例如，可在主体TIL样品上进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞并允许存活率评估。在一些实施方案中，TIL样品可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯的Nexcelom Bioscience)计算和确定存活率。在一些实施方案中，存活率是根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生表现并增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，在第二扩增中获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30ug/培养瓶OKT-3以及如下文更详细论述的7.5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30ug/培养瓶OKT-3以及如下文更详细论述的5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施方案中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将小规模培养中的TIL转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)并且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4至7天的时段。
在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的TIL部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时段。
在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3至7天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4至7天的时段。
在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时段来进行快速或第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移并分配到2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时段。
在一些实施方案中，在快速第二扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL。在一些实施方案中，在快速或第二扩增的拆分后，每个第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施方案中，每个第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2至5个亚群中。在一些实施方案中，将第一小规模TIL培养物分配到多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施方案中，在完成快速第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速或第二扩增后，将一个或多个TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施方案中，在完成快速扩增后，每个TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施方案中，在分成多个步骤之前将快速第二扩增进行约3至7天的时段。在一些实施方案中，快速第二扩增的拆分发生在快速或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天。
在一些实施方案中，快速第二扩增的拆分发生在第一扩增(即预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天。在一个示例性实施方案中，快速或第二扩增的拆分发生在第一扩增开始后约第16天。
在一些实施方案中，快速第二扩增在拆分后进一步进行约7至11天的时段。在一些实施方案中，快速第二扩增在拆分后进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步任选地APC。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、任选地OKT-3和进一步任选地APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施方案中，拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和任选地OKT-3。在一些实施方案中，拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施方案中，拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和任选地OKT-3的新鲜培养基来替换在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施方案中，拆分后用于快速第二扩增的细胞培养基是通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换在拆分前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方案中，本文中所描述的快速第二扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中所描述的那些扩增以及称为REP的那些扩增)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且如实施例中所描述用于REP程序，其提供了用于评价经照射的同种异体PBMC的无复制能力的示例性方案。
在一些实施方案中，如果第7或14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文中所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文中所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是无复制能力的并且可接受其用于本文中所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2000-5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30-60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比10、约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，本文所描述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在一些实施方案中，本文所描述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文所描述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文所描述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施方案中，本文中所描述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施方案中，快速第二扩增需要快速第二扩增的两倍数目的饲养细胞。在其他实施方案中，当本文中所描述的启始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约5×108个饲养细胞。在其他实施方案中，当本文中所描述的启始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约7.5×108个饲养细胞。在其他实施方案中，快速第二扩增需要启始第一扩增的两倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X数目的饲养细胞。
在一些实施方案中，本文所描述的快速第二扩增程序在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。在一些实施方案中，PBMC以添加到启始第一扩增的PBMC浓度的两倍添加到快速第二扩增。
一般而言，同种异体PBMC是经由照射或热处理而失活，并且用于本文中所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一些实施方案中，在快速第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文中所描述的快速第二扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来快速第二扩增TIL也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用两种或更多种IL-2、IL-15和IL-21的组合，其公开内容通过引用并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，并且特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施方案中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)还可包括将OKT-3抗体或莫罗单抗添加到培养基中，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤D还可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中其他地方所描述。在一些实施方案中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)还可包括将OX-40激动剂添加到培养基中，如本文中其他地方所描述。此外，可在步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)期间在培养基中使用添加剂，例如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂I-α激动剂，包括增殖物激活受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑烷二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。
E.步骤E：收集TIL
在快速第二扩增步骤后，可收集细胞。在一些实施方案中，在例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所提供的一个、两个、三个、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所提供的两个扩增步骤(一个启始第一扩增和一个快速第二扩增)之后收集TIL。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法是本领域中众所周知的并且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施方案中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International公司。本发明的方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施方案中，细胞收集是经由细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也是指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以去除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭、无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文中所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施方案中，根据图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤E是根据本文中所描述的过程进行。在一些实施方案中，密闭系统是在无菌条件下经由注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方案中，采用如本文中所描述的密闭系统。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文中所描述的方法收集第14与16天之间的TIL。在一些实施方案中，使用如本文中所描述的方法在第14天收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文中所描述的方法在第15天收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文中所描述的方法在第16天收集TIL。
F.步骤F：最终制剂和转移到输注容器
在如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中以示例性次序提供并且如上文和本文中所概述的步骤A至E完成后，将细胞转移到容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施方案中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，就将其转移到容器以用于向患者施用。
在一些实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL是以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施方案中，药物组合物为TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。如本文所公开扩增的TIL可通过如本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，TIL是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
VII.其他Gen 2、Gen 3和其他TIL制造过程实施方案
A.PBMC饲养细胞比率
在一些实施方案中，用于本文中所描述的扩增方法(参见例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P))的培养基包括抗CD3抗体，例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞激活和细胞分裂。这种作用可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常是优选的；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，特此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，PBMC饲养细胞层的数目如下计算：
A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr3＝523.6μm3
B.具有40μm(4个细胞)高度的G-REX-100(M)体积：V＝(4/3)πr3＝4×1012μm3
C.填满柱B所需的细胞数目：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3×0.64＝4.86×108
D.可在4D空间中最佳激活的细胞数目：4.86×108/24＝20.25×106
E.外推至G-REX-500的饲养细胞和TIL数目：TIL：100×106和饲养细胞：2.5×109
在此计算中，使用在具有100cm2底面的圆柱体中提供TIL激活的二十面体几何学所需的单核细胞近似数目。计算导出的T细胞阈值激活的实验结果为约5×108，其与NCI实验数据密切相关，如Jin等人,J.Immunother.2012,35,283-292中所描述。在(C)中，乘数(0.64)是等效球体的随机填充密度，由Jaeger和Nagel,Science,1992,255,1523-3计算得出。在(D)中，除数24是4维空间中可接触类似物体的等效球体的数目或“牛顿数”，如Musin,Russ.Math.Surv.,2003,58,794-795中所描述。
在一些实施方案中，在启始第一扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目大约为在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目的一半。在某些实施方案中，方法包括在相较于快速第二扩增的细胞培养基包含大约50％较少抗原呈递细胞的细胞培养基中进行启始第一扩增。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)数目大于在启始第一扩增期间外源供应的APC数目。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约20:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率为刚好或大约2:1。
在其他实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在启始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率为刚好或大约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施方案中，在启始第一扩增期间外源供应的APC数目为刚好或大约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，并且在快速第二扩增期间外源供应的APC数目为刚好或大约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施方案中，在启始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或大约1.5×108个APC至刚好或大约3×108个APC的范围，并且在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或大约4×108个APC至刚好或大约7.5×108个APC的范围。
在其他实施方案中，在启始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或大约2×108个APC至刚好或大约2.5×108个APC的范围，并且在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或大约4.5×108个APC至刚好或大约5.5×108个APC的范围。
在其他实施方案中，在启始第一扩增期间外源供应的APC数目为刚好或大约2.5×108个APC，并且在快速第二扩增期间外源供应的APC数目为刚好或大约5×108个APC。
在一些实施方案中，在启始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)数目是在启始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC数目的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在启始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞至第一TIL群体并且在第7天添加抗原呈递细胞至第二TIL群体，其中在第0天添加的抗原呈递细胞的数目为在启始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数目的大约50％。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目大于在启始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约1.0×106个APC/cm2至刚好或大约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约1.5×106个APC/cm2至刚好或大约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约2×106个APC/cm2至刚好或大约3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以刚好或大约2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以刚好或大约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约2.5×106个APC/cm2至刚好或大约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约3.5×106个APC/cm2至刚好或大约6.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约4.0×106个APC/cm2至刚好或大约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约4.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC是以刚好或大约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以刚好或大约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，并且在快速第二扩增外源供应的APC是以刚好或大约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约1.0×106个APC/cm2至刚好或大约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，并且在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约2.5×106个APC/cm2至刚好或大约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约1.5×106个APC/cm2至刚好或大约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，并且在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约3.5×106个APC/cm2至刚好或大约6×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约2×106个APC/cm2至刚好或大约3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，并且在快速第二扩增外源供应的APC是以选自刚好或大约4×106个APC/cm2至刚好或大约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在启始第一扩增外源供应的APC是以刚好或大约2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，并且在快速第二扩增外源供应的APC是以刚好或大约4×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约20:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为刚好或大约2:1。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为刚好或大约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施方案中，在启始第一扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或大约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC(包括例如PBMC)，并且在快速第二扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或大约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC(包括例如PBMC)。
在其他实施方案中，在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约1×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或大约3.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，并且在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约3.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或大约1×109个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方案中，在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约1.5×108个APC至刚好或大约3×108个APC(包括例如PBMC)的范围，并且在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约4×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或大约7.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方案中，在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约2×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或大约2.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，并且在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或大约4.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或大约5.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施方案中，在启始第一扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或大约2.5×108个APC(包括例如PBMC)，并且在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为刚好或大约5×108个APC(包括例如PBMC)。
在一些实施方案中，在启始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数是在快速第二扩增第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在启始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞层至第一TIL群体并且在第7天添加抗原呈递细胞层至第二TIL群体，其中在第0天添加的抗原呈递细胞层的数目为在第7天添加的抗原呈递细胞层的数目的大约50％。
在其他实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在启始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约1.5个细胞层至刚好或大约2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约1个细胞层至刚好或大约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约3个细胞层至刚好或大约10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约2个细胞层至刚好或大约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约4个细胞层至刚好或大约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约4个细胞层至刚好或大约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或大约1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或大约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:10的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:8的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:7的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:6的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:5的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:4的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:3的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:2的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.2至刚好或大约1:8的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.3至刚好或大约1:7的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.4至刚好或大约1:6的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.5至刚好或大约1:5的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.6至刚好或大约1:4的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.7至刚好或大约1:3.5的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.8至刚好或大约1:3的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.9至刚好或大约1:2.5的范围。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率为刚好或大约1:2。
在其他实施方案中，启始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或大约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施方案中，启始第一扩增中的APC的数目选自约1.0×106个APC/cm2至约4.5×106个APC/cm2的范围，并且快速第二扩增中的APC的数目选自约2.5×106个APC/cm2至约7.5×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方案中，启始第一扩增中的APC的数目选自约1.5×106个APC/cm2至约3.5×106个APC/cm2的范围，并且快速第二扩增中的APC的数目选自约3.5×106个APC/cm2至约6.0×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方案中，启始第一扩增中的APC的数目选自约2.0×106个APC/cm2至约3.0×106个APC/cm2的范围，并且快速第二扩增中的APC的数目选自约4.0×106个APC/cm2至约5.5×106个APC/cm2的范围。
A.任选的细胞培养基组分
1.抗CD3抗体
在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法(包括称为REP的扩增方法，参见例如图1和图8(特别是，例如，图8B))的培养基包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞激活和细胞分裂。这种作用可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常是优选的；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，特此通过引用整体并入。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人类CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人类CD3多克隆和单克隆抗体，包括(但不限于)鼠类、人类、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech)。参见表1。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人类CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人类CD3多克隆和单克隆抗体，包括(但不限于)鼠类、人类、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech)。
2.4-1BB(CD137)激动剂
在一些实施方案中，启始第一扩增和/或快速第二扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可为本领域中已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可为能够与人类或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子还包括抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；人类、人源化或嵌合抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、任何上述物质的表位结合片段，以及与4-1BB结合的抗体的工程化形式，例如scFv分子。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为一种完全人类抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，用于本发明所公开的方法和组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人类抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，以及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈免疫反应。Lee等人,PLOSOne 2013,8,e69677。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为激动性抗4-1BB人源化或完全人类单克隆抗体(即，源自单细胞系的抗体)。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌图木单抗或乌瑞鲁单抗，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为乌图木单抗或乌瑞鲁单抗，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可为融合蛋白。在一些实施方案中，相较于通常具有两个配体结合域的激动性单克隆抗体，多聚4-1BB激动剂，例如三聚或六聚4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合域)可诱导优良受体(4-1BBL)聚类和内部细胞信号传导复合物形成。包含三个TNFRSF结合域和IgG1-Fc并且任选地进一步连接两个或更多个这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)或更大融合蛋白描述于例如Gieffers等人,Mol.Cancer Therapeutics 2013,12,2735-47中。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈免疫反应。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动活性与人类4-1BB(SEQ ID NO:40)结合。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是与人类4-1BB(SEQ ID NO:40)结合的结合分子。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是与鼠类4-1BB(SEQ ID NO:41)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列概述于表5中。
表5.4-1BB抗原的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括如下4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约100pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约90pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约80pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约70pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约60pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约50pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约40pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、或以约30pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约7.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、以约7.5×1051/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、以约8×105l/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、以约9×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合、或以约1×106 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类4-1BB结合的4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约2×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、或以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.8×10-51/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合、或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类4-1BB结合的4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约10nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约9nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约8nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约7nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约6nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约5nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约4nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约3nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约2nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、或以约1nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为乌图木单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌图木单抗可购自Pfizer公司。乌图木单抗为免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人类)单克隆抗体。乌图木单抗的氨基酸序列阐述于表6中。乌图木单抗包含位于Asn59和Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)的重链链内二硫桥键；位于位置22'-87'(VH-VL)和136'-195'(CH1-CL)的轻链链内二硫桥键；位于IgG2A同工型位置218-218、219-219、222-222和225-225、位于IgG2A/B同工型位置218-130、219-219、222-222和225-225和位于IgG2B同工型位置219-130(2)、222-222和225-225的链间重链-重链二硫桥键；以及位于IgG2A同工型位置130-213'(2)、IgG2A/B同工型位置218-213'和130-213'和位于IgG2B同工型位置218-213'(2)的链间重链-轻链二硫桥键。乌图木单抗以及其变体和片段的制备和特性描述于美国专利第8,821,867号、第8,337,850号和第9,468,678号以及国际专利申请公开第WO 2012/032433 A1号中，其中每一者的公开内容通过引用并入本文。乌图木单抗的临床前特征描述于Fisher等人,Cancer Immunolog.&Immunother.2012,61,1721-33中。目前乌图木单抗在多种血液和实体肿瘤适应症中的临床试验包括美国国家卫生研究院(U.S.NationalInstitutes of Health)clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO:42所提供的重链和SEQ ID NO:43所提供的轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:42和SEQ IDNO:43所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:43所示序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含乌图木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:44所示的序列，并且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:45所示的序列，以及其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少99％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少98％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少97％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少96％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少95％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含有包含VH和VL区的scFv抗体，所述区各自分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列至少99％同一。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为药物监管机构参考乌图木单抗核准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，所述4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其与所述参考药品或参考生物产品相比包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。
表6.与乌图木单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自Bristol-MyersSquibb公司和Creative Biolabs公司。乌瑞鲁单抗为免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人类)单克隆抗体。乌瑞鲁单抗的氨基酸序列阐述于表7中。乌瑞鲁单抗包含位于位置298(和298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)(和位于位置22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”)的重链链内二硫桥键；位于位置23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)(和位于位置23”'-88”'和136”'-196”')的轻链链内二硫桥键；位于位置227-227”和230-230”的链间重链-重链二硫桥键；和位于135-216'和135”-216”'的链间重链-轻链二硫桥键。乌瑞鲁单抗以及其变体和片段的制备和特性描述于美国专利第7,288,638号和第8,962,804号中，其公开内容通过引用并入本文。乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征描述于Segal等人,Clin.Cancer Res.2016,可访问http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前乌瑞鲁单抗在多种血液和实体肿瘤适应症中的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO:52所提供的重链和SEQ ID NO:53所提供的轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:53所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:53所示序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:54所示的序列，并且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:55所示的序列，和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少99％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少98％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少97％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少96％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少95％同一。在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含有包含VH和VL区的scFv抗体，所述区各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列至少99％同一。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为药物监管机构参考乌瑞鲁单抗核准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，所述4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物学产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。
表7.与乌瑞鲁单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂选自由以下组成的组：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen552532)、BBK2(Thermo FisherMS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、通过寄存为ATCC第HB-11248号的细胞系产生并在美国专利第6,974,863号中公开的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BDPharmingen 559446)、美国专利申请公开第US 2005/0095244号中公开的抗体、美国专利第7,288,638号中公开的抗体(例如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美国专利第6,887,673号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第7,214,493号中公开的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、美国专利第6,905,685号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第6,362,325号中公开的抗体(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美国专利第6,974,863号中公开的抗体(例如53A2)；美国专利第6,210,669号中公开的抗体(例如1D8、3B8或3El)、美国专利第5,928,893号中描述的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、国际专利申请公开第WO 2012/177788号、第WO 2015/119923号和第WO 2010/042433号中公开的抗体，以及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公开中的每一者的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为以下中描述的4-1BB激动性融合蛋白：国际专利申请公开第WO 2008/025516 A1号、第WO 2009/007120A1号、第WO 2010/003766 A1号、第WO 2010/010051 A1号和第WO 2010/078966 A1号；美国专利申请公开第US 2011/0027218A1号、第US2015/0126709 A1号、第US2011/0111494A1号、第US2015/0110734 A1号和第US2015/0126710 A1号；和美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为如结构I-A(C端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc抗体片段融合蛋白)中所描绘的4-1BB激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物(参见图18)。在结构I-A和I-B中，圆柱是指个别多肽结合域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合域，所述TNFRSF结合域源自例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(TNFSF9))或结合4-1BB的抗体，所述TNFRSF结合域折叠以形成三价蛋白质，然后所述三价蛋白质经由IgG1-Fc(包括CH3和CH2域)与第二三价蛋白质连接，然后所述IgG1-Fc用于经由二硫键(细长小椭圆)将两个三价蛋白质连接在一起，从而使结构稳定并且提供能够将六个受体的细胞内信号传导域与信号传导蛋白质连在一起以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合域可为包含例如由接头连接的VH和VL链的scFv域，所述接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。可使用任何scFv域设计，例如以下中描述的那些scFv域：de Marco,Microbial Cell Factories,2011,10,44；Ahmad等人,Clin.&Dev.Immunol.2012,980250；Monnier等人,Antibodies,2013,2,193-208；或本文中别处并入的参考文献。这种形式的融合蛋白结构描述于美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中，其公开内容通过引用并入本文。
图18中所提供的结构I-A的其他多肽域的氨基酸序列可见于表8中。Fc域优选包含完整恒定域(SEQ ID NO:62的氨基酸17-230)、完整铰链域(SEQ ID NO:62的氨基酸1-16)或铰链域的一部分(例如SEQ ID NO:62的氨基酸4-16)。用于连接C端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中所提供的实施方案，包括适合于融合其他多肽的接头。
表8.具有C端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列。
图18中所提供的结构I-B的其他多肽域的氨基酸序列可见于表9中。如果Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO:73中所示的序列，并且接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所阐述的那些实施方案。
表9.具有N端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个选自由以下组成的组的4-1BB结合域：乌图木单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌图木单抗的可变重链和可变轻链、选自表10中所描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合，以及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个含有4-1BBL序列的4-1BB结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个包含根据SEQ ID NO:77的序列的4-1BB结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个含有可溶性4-1BBL序列的4-1BB结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个包含根据SEQ ID NO:78的序列的4-1BB结合域。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合域，所述一个或多个结合域为包含各自分别与SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所示的序列至少95％同一的VH和VL区的scFv域，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合域，所述一个或多个结合域为包含各自分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55中所示的序列至少95％同一的VH和VL区的scFv域，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合域，所述一个或多个结合域为包含各自与表10中所提供的VH和VL序列至少95％同一的VH和VL区的scFv域，其中VH和VL域由接头连接。
表10.适用作融合蛋白中的4-1BB结合域或适用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽域。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合域，还包含在N末端和/或C末端的额外域，并且其中所述额外域为Fab或Fc片段域。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合域，还包含在N末端和/或C末端的额外域，并且其中所述额外域为Fab或Fc片段域，其中可溶性4-1BB域中的每一者缺乏茎区(其促进三聚作用并且提供距离细胞膜的某一距离，但不为4-1BB结合域的一部分)并且第一和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子域，其中可溶性TNF超家族细胞因子域中的每一者缺乏茎区并且所述第一和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，并且其中每个TNF超家族细胞因子域为4-1BB结合域。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性scFv抗体，其包含与任一前述VL域连接的任一前述VH域。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂为BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体，目录号79097-2，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为Creative Biolabs4-1BB激动剂抗体，目录号MOM-18179，可购自美国纽约州雪利(Shirley,NY,USA)的Creative Biolabs。
3.OX40(CD134)激动剂
在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可为能够与人类或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人类抗体、人源化或嵌合抗体和抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、任一上述物质的表位结合片段，和与OX40结合的抗体的工程化形式，例如scFv分子。在一些实施方案中，OX40激动剂为一种完全人类抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，用于本公开方法和组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人类抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40阿德奈汀、抗OX40域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，以及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施方案中，OX40激动剂为激动性抗OX40人源化或完全人类单克隆抗体(即，源自单细胞系的抗体)。
在一些实施方案中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等人,J.Immunother.2009,182,1481-89。在一些实施方案中，相较于通常具有两个配体结合域的激动性单克隆抗体，多聚OX40激动剂，例如三聚或六聚OX40激动剂(具有三个或六个配体结合域)可诱导优良受体(OX40L)聚类和内部细胞信号传导复合物形成。包含三个TNFRSF结合域和IgG1-Fc并且任选地进一步连接两个或更多个这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)或更大融合蛋白描述于例如Gieffers等人,Mol.Cancer Therapeutics 2013,12,2735-47中。
已知激动性OX40抗体和融合蛋白可诱导强烈免疫反应。Curti等人,CancerRes.2013,73,7189-98。在一些实施方案中，OX40激动剂为以足够减少毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如NK细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除Fc区功能性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和激动活性与人类OX40(SEQ ID NO:85)结合。在一些实施方案中，OX40激动剂为与人类OX40(SEQ ID NO:85)结合的结合分子。在一些实施方案中，OX40激动剂为与鼠类OX40(SEQ ID NO:86)结合的结合分子。表11中概述与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表11.OX40抗原的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所描述组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，所述OX40激动剂以约100pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约90pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约80pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约70pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约60pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约50pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约40pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40或以约30pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，所述OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合、以约8×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合、以约9×1051/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合或以约1×106 1/M·s或更快的k缔合与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，所述OX40激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.4×10-51/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.6×10-51/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，所述OX40激动剂以约10nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约9nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约8nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约7nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约6nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约5nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约4nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约3nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约2nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合或以约1nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，OX40激动剂为塔沃西单抗，也称为MEDI 0562或MEDI-0562。塔沃西单抗可获自AstraZeneca公司的MedImm une子公司。塔沃西单抗为免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化和嵌合单克隆抗体。塔沃西单抗的氨基酸序列阐述于表12中。塔沃西单抗包含在位置301和301”处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化复合物双触角CHO型聚糖；在位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、265-325(CH2)和371-429(CH3)处(和在位置22”-95”、148”-204”、265”-325''和371”-429”处)的重链链内二硫桥键；在位置23'-88'(VH-VL)和134'-194'(CH1-CL)处(和在位置23”'-88”'和134”'-194”'处)的轻链链内二硫桥键；在位置230-230”和233-233”处的链间重链-重链二硫桥键；和在224-214'和224”-214”'处的链间重链-轻链二硫桥键。塔沃西单抗在各种实体肿瘤适应症中的当前临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT02318394和NCT02705482。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含SEQ ID NO:87所提供的重链和SEQ ID NO:88所提供的轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:87和SEQ ID NO:88所示序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含塔沃西单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:89所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:90所示序列，和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少99％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少98％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少97％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少96％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少95％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含scFv抗体，所述scFv抗体包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少99％同一的VH和VL区。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92和SEQID NO:93中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为药物监管机构参考塔沃西单抗核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。
表12.与塔沃西单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为11D4，其为可获自Pfizer公司的完全人类抗体。11D4的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容通过引用并入本文。11D4的氨基酸序列阐述于表13中。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含SEQ ID NO:97所提供的重链和SEQ ID NO:98所提供的轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:97和SEQ ID NO:98所示序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:99所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:100所示序列，和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少99％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少98％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少97％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少96％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少95％同一的VH和VL区。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为药物监管机构参考11D4核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为11D4。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为11D4。
表13.与11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为18D8，其为可获自Pfizer公司的完全人类抗体。18D8的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容通过引用并入本文。18D8的氨基酸序列阐述于表14中。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含SEQ ID NO:107所提供的重链和SEQ ID NO:108所提供的轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:107和SEQ IDNO:108所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:109所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:110所示序列，和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少99％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少98％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少97％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少96％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少95％同一的VH和VL区。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为药物监管机构参考18D8核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为18D8。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为18D8。
表14.与18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为Hu119-122，其为可获自GlaxoSmithKline plc的人源化抗体。Hu119-122的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容通过引用并入本文。Hu119-122的氨基酸序列阐述于表15中。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:117所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:118所示序列和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列至少99％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列至少98％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列至少97％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列至少96％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列至少95％同一的VH和VL区。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为药物监管机构参考Hu119-122核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu119-122。
表15.与Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为Hu106-222，其为可获自GlaxoSmithKline plc的人源化抗体。Hu106-222的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容通过引用并入本文。Hu106-222的氨基酸序列阐述于表16中。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:125所示序列，并且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:126所示序列，和其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少99％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少98％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少97％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少96％同一的VH和VL区。在一些实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少95％同一的VH和VL区。
在一些实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132中所阐述的序列和其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为药物监管机构参考Hu106-222核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为Hu106-222。
表16.与Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体为MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469为鼠类单克隆抗体。Weinberg等人,J.Immunother.2006,29,575-585。在一些实施方案中，OX40激动剂为由9B12杂交瘤产生，由Biovest公司(美国马萨诸塞州马尔文(Malvern,MA,USA))寄存的抗体，如Weinberg等人,J.Immunother.2006,29,575-585中所描述，其公开内容特此通过引用整体并入。在一些实施方案中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施方案中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为L106 BD(Pharmingen，产品#340420)。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品#340420)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品#340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施方案中，OX40激动剂为ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录#20073)。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录#20073)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa CruzBiotechnology，目录#20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施方案中，OX40激动剂为鼠类单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可购自新罕布什尔州西黎巴嫩(West Lebanon,NH)的BioXcell公司的InVivoMAb。
在一些实施方案中，OX40激动剂选自以下中描述的OX40激动剂：国际专利申请公开第WO 95/12673号、第WO 95/21925号、第WO 2006/121810号、第WO 2012/027328号、第WO2013/028231号、第WO 2013/038191号和第WO 2014/148895号；欧洲专利申请EP 0672141；美国专利申请公开第US2010/136030号、第US2014/377284号、第US2015/190506号和第US2015/132288号(包括克隆20E5和12H3)；以及美国专利第7,504,101号、第7,550,140号、第7,622,444号、第7,696,175号、第7,960,515号、第7,961,515号、第8,133,983号、第9,006,399号和第9,163,085号，其公开内容各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，OX40激动剂为如结构I-A(C端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc-抗体片段融合蛋白)中所描绘的OX40激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的特性已在上文和美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中描述，其公开内容通过引用并入本文。图18中所提供的结构I-A的多肽域的氨基酸序列见于表9中。Fc域优选包含完整恒定域(SEQ IDNO:62的氨基酸17-230)、完整铰链域(SEQ ID NO:62的氨基酸1-16)或铰链域的一部分(例如SEQ ID NO:62的氨基酸4-16)。用于连接C端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中所提供的实施方案，包括适合于融合其他多肽的接头。同样，图18中所提供的结构I-B的多肽域的氨基酸序列见于表10中。如果Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO:73所示的序列，并且接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所阐述的那些实施方案。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个选自由以下组成的组的OX40结合域：塔沃西单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表17中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述的可变重链和可变轻链的任何组合，以及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个含有OX40L序列的OX40结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个含有根据SEQ ID NO:133的序列的OX40结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个含有可溶性OX40L序列的OX40结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个含有根据SEQ ID NO:134的序列的OX40结合域。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个含有根据SEQ ID NO:135的序列的OX40结合域。
在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自分别与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自分别与SEQ IDNO:125和SEQ ID NO:126所示序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。在一些实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合域，所述一个或多个结合域为scFv域，所述scFv域包含各自与表17中所提供的VH和VL序列至少95％同一的VH和VL区，其中VH和VL域由接头连接。
表17.适用作融合蛋白(例如结构I-A及I-B)中的OX40结合域或适用作scFv OX40激动剂抗体的其他多肽域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合域，其还包含在N末端和/或C末端处的额外域，并且其中所述额外域为Fab或Fc片段域。在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合域，其还包含在N末端和/或C末端处的额外域，其中所述额外域为Fab或Fc片段域，其中可溶性OX40结合域中的每一者缺乏茎区(其促成三聚作用并且提供距离细胞膜的某一距离，但不为OX40结合域的一部分)并且所述第一和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子域，其中可溶性TNF超家族细胞因子域中的每一者缺乏茎区并且所述第一和第二肽接头独立地具有3-8个氨基酸的长度，并且其中TNF超家族细胞因子域为OX40结合域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为MEDI6383。MEDI6383为OX40激动性融合蛋白并且可如美国专利第6,312,700号中所描述来制备，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性scFv抗体，其包含与任一前述VL域连接的任一前述VH域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州雪利的Creative Biolabs公司。
在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司。
B.任选的细胞存活率分析
任选地，在启始第一扩增(有时称为初始主体扩增(initial bulk expansion))后，可使用本领域中已知的标准测定进行细胞存活率测定。因此，在某些实施方案中，方法包括在启始第一扩增之后进行细胞存活率测定。例如，可对主体TIL样品进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞并允许存活率评估。其他用于测试存活率的测定可包括(但不限于)阿尔玛蓝(Alamar blue)测定和MTT测定。
1.细胞计数、存活率、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或存活率。标志物(例如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及本文所公开或描述的任何其他标志物)的表达可通过流式细胞术，使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)，用抗体，例如(但不限于)可购自BD Bio-sciences的那些(BD Biosciences，加利福尼亚州圣荷西(San Jose,CA))测量。细胞可使用一次性c-芯片血球计(VWR，伊利诺伊州巴达维亚(Batavia,IL))手动计算，并且存活率可使用本领域中已知的任何方法(包括但不限于台盼蓝染色)评估。还可基于通过引用整体并入本文的美国专利申请公开第2018/0282694号测定细胞存活率。还可基于美国专利申请公开第2018/0280436号或国际专利申请公开第WO/2018/081473号测定细胞存活率，其都出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些情况下，主体TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。替代地，主体TIL群体可进行REP并且然后如下文所论述冷冻保存。类似地，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况下，主体或REP TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
2.细胞培养
在一些实施方案中，用于扩增TIL的方法(包含上文所论述以及图1和图8，特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P中示例的那些方法)可包括使用约5,000mL至约25,000mL细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL细胞培养基、或约5,800mL至约8,700mL细胞培养基。在一些实施方案中，培养基为不含血清培养基。在一些实施方案中，启始第一扩增中的培养基不含血清。在一些实施方案中，第二扩增中的培养基不含血清。在一些实施方案中，启始第一扩增和第二扩增(也称为快速第二扩增)中的培养基都不含血清。在一些实施方案中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM链霉素硫酸盐和10μM庆大霉素硫酸盐)细胞培养基(Invitrogen，加利福尼亚州喀斯巴德(CarlsbadCA))。就此而言，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一些实施方案中，扩增TIL数目可包括频繁性不超过每三或四天一次地饲养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的饲养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基是未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。
在一些实施方案中，方法期间包括获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在第一透气容器中培养肿瘤组织样品持续约1至8天的时段，例如约7天作为启始第一扩增，或约8天作为启始第一扩增，所述第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移到第二透气容器并且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至9天(例如约7天、约8天或约9天)的时段，所述第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，方法期间包括获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在第一透气容器中培养肿瘤组织样品持续约1至7天(例如约7天)的时段作为启始第一扩增，所述第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移到第二透气容器并且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至14天或约7至9天(例如约7天、约8天、或约9天、约10天或约11天)的时段，所述第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，方法期间包括获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；在第一透气容器中培养肿瘤组织样品持续约1至7天(例如约7天)的时段作为启始第一扩增，所述第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移到第二透气容器并且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至11天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时段，所述第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，TIL是在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，使用PBMC，使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括美国专利申请公开第2005/0106717A1号中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，TIL是在透气袋中扩增。在一些实施方案中，TIL是使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))扩增。在一些实施方案中，TIL是使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare))扩增。在一些实施方案中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，所述透气细胞袋的容积选自由以下组成的组：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一些实施方案中，TIL可在G-REX培养瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。此类实施方案使细胞群体从约5×105个细胞/平方厘米扩增至10×106至30×106个细胞/平方厘米。在一些实施方案中，这未进行饲养。在一些实施方案中，这未进行饲养，只要G-REX培养瓶中的培养基位于约10cm的高度即可。在一些实施方案中，这未进行饲养但添加一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子可作为推注添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法是本领域中已知的并且已用于扩增TIL，并且包括以下中描述的那些：美国专利申请公开第US2014/0377739A1号、国际公开第WO 2014/210036A1号、美国专利申请公开第us 2013/0115617A1号、国际公开第WO 2013/188427 A1号、美国专利申请公开第US 2011/0136228A1号、美国专利第US 8,809,050 B2号、国际公开第WO 2011/072088A2号、美国专利申请公开第US2016/0208216A1号、美国专利申请公开第US2012/0244133 A1号、国际公开第WO 2012/129201A1号、美国专利申请公开第US2013/0102075 A1号、美国专利第US 8,956,860 B2号、国际公开第WO 2013/173835A1号、美国专利申请公开第US2015/0175966 A1号，其公开内容通过引用并入本文。此类过程也描述于Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35:283-292中。
C.TIL中基因的任选基因敲低或基因敲除
在一些实施方案中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造过程期间(各自如本文所提供)经进一步操作，以用暂时性方式改变蛋白质表达。在一些实施方案中，暂时改变的蛋白质表达是由于暂时性基因编辑。在一些实施方案中，本发明的经扩增的TIL用转录因子(TF)和/或其他能够暂时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施方案中，TF和/或其他能够暂时改变蛋白质表达的分子提供TIL群体中改变的肿瘤抗原表达和/或改变肿瘤抗原特异性T细胞的数目。
在某些实施方案中，方法包括对TIL群体进行基因编辑。在某些实施方案中，方法包括对第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体进行基因编辑。
在一些实施方案中，本发明包括经由核苷酸插入，例如经由核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)至TIL群体中进行基因编辑，以促进一种或多种蛋白质的表达或抑制一种或多种蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施方案中，本发明的经扩增的TIL经历暂时改变蛋白质表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第一扩增之前的主体TIL群体，包括例如获自例如图8(特别是图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的步骤A的TIL群体中。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第一扩增期间，包括例如获自例如图8(例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所指示的步骤B的TIL群体中。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第一扩增之后，包括例如在第一与第二扩增之间转变的TIL群体(例如本文中所描述的第二TIL群体)、获自例如图8中所指示的步骤B并且包括于步骤C中的TIL群体中。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第二扩增之前的主体TIL群体中，包括例如在获自例如图8中所指示的步骤C并且在步骤D中其扩增之前的TIL群体中。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第二扩增期间，包括例如在例如图8中所指示的步骤D中扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)中。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达发生在第二扩增之后，包括例如在获自例如图8中所指示的步骤D中的扩增的TIL群体中。
在一些实施方案中，暂时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法是本领域中已知的，并且描述于例如以下中：Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，暂时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面涂布和内吞作用)是本领域中已知的并且描述于以下中：Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，暂时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的并且描述于Rose等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，暂时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其公开内容各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起干记忆T细胞(TSCM)增加。TSCM是抗原经历中央记忆T细胞的早期祖细胞。TSCM通常展示定义干细胞的长期存活、自我更新和多效能能力，并且通常为产生有效TIL产物所需的。在过继性细胞转移的小鼠模型中，已证实TSCM与其他T细胞子集相比增强的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起具有包含高比例的TSCM的组成的TIL群体。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIL群体中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时改变引起具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的TIL群体。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时改变引起具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％ TSCM的治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起抗原经历T细胞回春(rejuvenation)。在一些实施方案中，回春包括例如增加的增殖、增加的T细胞激活和/或增加的抗原识别。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达改变一大部分T细胞的表达，以保留肿瘤来源的TCR贮库。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达不改变肿瘤来源的TCR贮库。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达维持肿瘤来源的TCR贮库。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质引起特定基因的表达改变。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向包括(但不限于)以下的基因：PD-1(也称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(chimeric co-stimulatoryreceptor；CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向选自由以下组成的组的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向PD-1。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向TGFBR2。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR4/5。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CBL-B。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CISH。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向IL-2。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向IL-12。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向IL-15。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向IL-21。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向TIM3。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向LAG3。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向TIGIT。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向TGFβ。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR1。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR2。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR4。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCR5。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CXCR1。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CXCR2。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CSCR3。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL5(RANTES)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CXCL1。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CXCL8。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL22。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CCL17。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向VHL。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向CD44。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向PIK3CD。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向SOCS1。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向胸腺细胞选择相关的高迁移率组(HMG)盒(TOX)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向锚蛋白重复域11(ANKRD11)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向BCL6辅抑制物(BCOR)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起趋化因子受体增加和/或过表达。在一些实施方案中，因暂时性蛋白质表达而过表达的趋化因子受体包括具有配体的受体，所述配体包括(但不限于)CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ途径阻断)。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起趋化因子受体增加和/或过表达，以例如改进TIL运输或运动至肿瘤部位。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CCR(嵌合共刺激受体)增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由以下组成的组的趋化因子受体增加和/或过表达：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起白介素增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由以下组成的组的白介素增加和/或过表达：IL-2、IL-12、IL-15和/或IL-21。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起NOTCH 1/2ICD增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起VHL增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CD44增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PIK3CD增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起SOCS1的增加和/或过表达。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起cAMP蛋白激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由以下组成的组的分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由以下组成的组的两种分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和选自由以下组成的组的一种分子的表达降低和/或减少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起以下的表达降低和/或减少：PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBL-B、TIM3、TIGIT和其组合。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和以下中的一者的表达降低和/或减少：CTLA-4、LAG3、CISH、CBL-B、TIM3、TIGIT和其组合。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和CTLA-4的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和CBL-B的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起PD-1和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CTLA-4和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CTLA-4和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CTLA-4和CBL-B的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CTLA-4和TIM-3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CTLA-4和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起LAG3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起LAG3和CBL-B的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起LAG3和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CISH和CBL-B的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起CISH和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIM3和PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIM3和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIM3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIM3和CBL-B的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起TIM3和TIGIT的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，选自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和其组合组成的组的粘附分子通过γ反转录病毒或慢病毒方法插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集TIL群体中(例如粘附分子的表达增加)。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合组成的组的分子的表达降低和/或减少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和其组合的表达增加和/或增强。在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达引起选自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBL-B和其组合组成的组的分子的表达降低和/或减少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和其组合的表达增加和/或增强。
在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。
在一些实施方案中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％。在一些实施方案中，表达增加至少约90％。在一些实施方案中，表达增加至少约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约99％。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达是通过用转录因子(TF)和/或其他能够暂时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导。在一些实施方案中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够暂时改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。此类方法证明将包括转录因子的蛋白质递送至包括T细胞的多种原代人类细胞的能力，其已描述于美国专利申请公开第US2019/0093073A1号、第US2018/0201889 A1号和第US2019/0017072A1号中，其公开内容各自通过引用并入本文。此类方法可用于本发明中，以将TIL群体暴露于转录因子(TF)和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子，其中所述TF和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子提供TIL群体中的肿瘤抗原的表达增加和/或肿瘤抗原特异性T细胞的数目增加，从而导致TIL群体重新程序化和重新程序化TIL群体的治疗功效相较于非重新程序化TIL群体增加。在一些实施方案中，重新程序化导致相对于开始或先前TIL群体(即，在重新程序化之前)，效应T细胞和/或中央记忆T细胞亚群增加，如本文所描述。
在一些实施方案中，转录因子(TF)包括(但不限于)TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)为TCF-1。在一些实施方案中，转录因子(TF)为NOTCH1/2ICD。在一些实施方案中，转录因子(TF)为MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)与诱导性多能干细胞培养物(iPSC)，例如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/ThermoFisher)一起施用，以诱导额外TIL重新程序化。在一些实施方案中，转录因子(TF)与iPSC混合液一起施用，以诱导额外TIL重新程序化。在一些实施方案中，转录因子(TF)不与iPSC混合液一起施用。在一些实施方案中，重新程序化引起TSCM的百分比增加。在一些实施方案中，重新程序化引起TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％TSCM。
在一些实施方案中，如上文所描述的暂时改变蛋白质表达的方法可与基因修饰TIL群体的方法组合，包括稳定并入用于产生一种或多种蛋白质的基因的步骤。在某些实施方案中，方法包括基因修饰TIL群体的步骤。在某些实施方案中，方法包括基因修饰第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括反转录病毒转导步骤。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导步骤。慢病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如以下中：Levine等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.2006,103,17372-77；Zufferey等人,Nat.Biotechnol.1997,15,871-75；Dull等人,J.Virology 1998,72,8463-71和美国专利第6,627,442号，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-反转录病毒转导步骤。γ-反转录病毒转导系统是本领域中已知的并且描述于例如Cepko和Pear,Cur.Prot.Mol.Biol.1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统是本领域中已知的，并且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包含帽和多腺苷酸尾的mRNA)的转座酶。包括类鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x；和酶活性增加的工程化酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如以下中：Hackett等人,Mol.Therapy 2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，其公开内容各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，暂时改变TIL中的蛋白质表达是由小干扰RNA(siRNA)诱导，所述小干扰RNA有时称为短干扰RNA或沉默RNA，其为双链RNA分子，长度通常为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。
在一些实施方案中，暂时改变蛋白质表达是表达减少。在一些实施方案中，暂时改变TIL中的蛋白质表达是由自我递送RNA干扰(sdRNA)诱导，所述自我递送RNA干扰为具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双链体，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇结合的13至15个碱基有义(乘客)链。小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，为双链RNA分子，长度通常为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。sdRNA为进入细胞不需要递送媒介物的共价和疏水性修饰的RNAi化合物。sdRNA通常为具有极小双链区的不对称化学修饰核酸分子。sdRNA分子通常含有单链区和双链区，并且可在分子的单链和双链区内含有各种化学修饰。另外，如本文中所描述，sdRNA分子可与疏水性缀合物如常规和高级固醇型分子连接。sdRNA和制备此类sdRNA的相关方法也已广泛描述于例如以下中：美国专利申请公开第US2016/0304873 A1号、第US2019/0211337A1号、第US2009/0131360A1号和第US 2019/0048341A1号，以及美国专利第10,633,654号和第10,913,948B2号，其公开内容各自通过引用并入本文。为了优化sdRNA结构、化学性质、靶向位置、序列偏好等，已开发一种算法并将其用于sdRNA效能预测。基于这些分析，功能性sdRNA序列通常定义为在1μM浓度下表达减少超过70％，其中概率超过40％。
双链DNA(dsRNA)可通常用以定义包含一对互补RNA链，通常有义(乘客)和反义(向导)链的任何分子，并且可包括单链悬垂区。与siRNA不同，术语dsRNA通常是指包括siRNA分子的序列的前体分子，所述siRNA分子通过裂解酶系统(包括Dicer)的作用从较大dsRNA分子释放。
在一些实施方案中，方法包括暂时改变TIL群体(包括经修饰以表达CCR的TIL)中蛋白质表达，包括使用自我递送RNA干扰(sdRNA)，其为例如具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双链体，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇结合的13至15个碱基有义(乘客)链。使用siRNA和sdRNA的方法已描述于以下中：Khvorova和Watts,Nat.Biotechnol.2017,35,238-248；Byrne等人,J.Ocul.Pharmacol.Ther.2013,29,855-864；和Ligtenberg等人,Mol.Therapy,2018,26,1482-93，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，siRNA的递送是使用电穿孔或细胞膜破坏(例如挤压或SQZ法)来完成。在一些实施方案中，递送siRNA或sdRNA至TIL群体不需要使用电穿孔、SQZ或其他方法来完成，实际上使用1至3天时段使TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL于培养基中的siRNA或sdRNA。在某些实施方案中，方法包括递送siRNA或sdRNA至TIL群体，其包括将TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL于培养基中的siRNA或sdRNA持续1至3天之间的时段。在一些实施方案中，递送siRNA或sdRNA至TIL群体是使用1至3天时段使TIL群体暴露于浓度为10μM/10,000个TIL于培养基中的siRNA或sdRNA来完成。在一些实施方案中，递送siRNA或sdRNA至TIL群体是使用1至3天时段使TIL群体暴露于浓度为50μM/10,000个TIL于培养基中的siRNA或sdRNA来完成。在一些实施方案中，递送siRNA或sdRNA至TIL群体是使用1至3天时段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL于培养基中之间的siRNA或sdRNA来完成。在一些实施方案中，递送siRNA或sdRNA至TIL群体是使用1至3天时段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL于培养基中之间的siRNA或sdRNA来完成，其中暴露于siRNA或sdRNA是通过添加新鲜siRNA或sdRNA至培养基来进行两次、三次、四次或五次。其他合适过程描述于例如以下中：美国专利申请公开第US 2011/0039914A1号、第US2013/0131141 A1号和第US2013/0131142A1号，和美国专利第9,080,171号，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，在制造期间将siRNA或sdRNA插入TIL群体中。在一些实施方案中，sdRNA编码干扰以下的RNA：NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBL-B。在一些实施方案中，表达减少是基于例如通过流式细胞术和/或qPCR评估的基因沉默的百分比而确定。在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。
基于化学修饰siRNA的自我可递送RNAi技术可用于本发明的方法中，以成功递送sdRNA至如本文中所描述的TIL。主链修饰与不对称siRNA结构和疏水配体的组合(参见例如Ligtenberg等人,Mol.Therapy,2018,26,1482-93和美国专利申请公开第2016/0304873A1号，其公开内容通过引用并入本文)允许sdRNA通过简单地添加到培养基中，利用sdRNA的核酸酶稳定性而无需额外的制剂和方法就可渗透经培养的哺乳动物细胞。这种稳定性允许仅通过维持sdRNA于培养基中的有效浓度，支持恒定水平的RNAi介导的目标基因活性减少。尽管不受理论束缚，但sdRNA的主链稳定化提供延长减少基因表达效应，其在非分裂细胞中可持续数月。
在一些实施方案中，超过95％的TIL转染效率和目标的表达减少通过各种特定siRNA或sdRNA发生。在一些实施方案中，含有若干未经修饰的核糖残基的siRNA或sdRNA经完全修饰的序列置换，以增加RNAi效应的效能和/或寿命。在一些实施方案中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更长时间。在一些实施方案中，表达减少效应在siRNA或sdRNA处理TIL 10天或更长时间后降低。在一些实施方案中，目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，TIL中的目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1途径中的表达减少允许TIL表现出更强效的体内效应，这在一些实施方案中是因为避免PD-1/PD-L1途径的抑制效应。在一些实施方案中，因siRNA或sdRNA的PD-1的表达减少导致TIL增殖增加。
在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出70％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出75％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出80％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出85％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出90％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出95％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出99％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时表现出目标基因表达减少。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA寡核苷酸剂包含一种或多种修饰以增加治疗剂的稳定性和/或有效性并实现寡核苷酸至待治疗的细胞或组织的有效递送。此类修饰可包括2'-O-甲基修饰、2'-O-氟修饰、二硫代磷酸酯修饰、2'F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的和/或2'脱氧核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸经修饰以包括一个或多个疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苯甲基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。在一些实施方案中，糖可经修饰并且经修饰的糖可包括(但不限于)D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-0-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤基(包括2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等。在一些实施方案中，糖部分可为己糖并且并入寡核苷酸中，如Augustyns等人,Nucl.Acids.Res.1992,18,4711，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上为双链，即在分子的任一端处无悬垂单链序列，即为钝端。在一些实施方案中，个别核酸分子可具有不同长度。换句话说，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上不为双链。例如，当使用两个分开的核酸分子时，分子中的一者，例如包含反义序列的第一分子可比与其杂交的第二分子更长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施方案中，当使用单核酸分子时，在任一端处的一部分的分子可保持单链。
在一些实施方案中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在至少约70％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在至少约80％的寡核苷酸长度上为双链的。在其他实施方案中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约90％-95％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约96％-98％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如通过修饰3'或5'键联而基本上保护其免受核酸酶的影响，如美国专利第5,849,902号中所描述，其公开内容通过引用并入本文。例如，寡核苷酸可通过纳入“阻断基团”而具有抗性。如本文所用的术语“阻断基团”是指可作为用于合成的保护基或偶联基团与寡核苷酸或核单体连接的取代基(例如除OH基团以外)(例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-0-CH2-CH2-O-)磷酸盐(PO3 2")、膦酸氢盐或氨基亚磷酸酯)。“阻断基团”还可包括“末端阻断基团”或“核酸外切酶阻断基团”，其保护寡核苷酸的5'和3'端，其包括经修饰的核苷酸和非核苷酸核酸外切酶抗性结构。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA内的至少一部分连续多核苷酸通过取代基键联，例如硫代磷酸酯键联连接。
在一些实施方案中，化学修饰可导致至少1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或500％的细胞摄取siRNA或sdRNA增强。在一些实施方案中，C或U残基中的至少一者包括疏水性修饰。在一些实施方案中，多个C和U含有疏水性修饰。在一些实施方案中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C和U可含有疏水性修饰。在一些实施方案中，所有C和U都含有疏水性修饰。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA分子经由并入可质子化胺而表现出增强的胞内体释放。在一些实施方案中，将可质子化胺并入有义链中(在RISC装载后被舍弃的分子部分中)。在一些实施方案中，本发明的siRNA或sdRNA化合物包含不对称化合物，所述不对称化合物包含双链体区(有效RISC进入所需，10-15个碱基长)和4-12个核苷酸长的单链区；具有13个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，采用6个核苷酸的单链区。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA的单链区包含2-12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中，采用6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中，本发明的siRNA或sdRNA化合物还包括独特的化学修饰模式，其提供稳定性并与RISC进入相容。例如，向导链还可通过任何证实稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施方案中，向导链中的化学修饰模式包括大多数C和U核苷酸经2'F修饰并且5'端经磷酸化。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA中至少30％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA中100％的核苷酸为经修饰的。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA分子具有极少双链区。在一些实施方案中，分子的双链区介于8-15个核苷酸长范围内。在一些实施方案中，分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在一些实施方案中，双链区为13个核苷酸长。向导链与乘客链之间可有100％互补性，或向导链与乘客链之间可存在一个或多个错配。在一些实施方案中，在双链分子的一端上，分子为钝端或具有一个核苷酸的悬垂物。分子的单链区在一些实施方案中为介于4-12个核苷酸长。在一些实施方案中，单链区可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。在一些实施方案中，单链区也可小于4个核苷酸或大于12个核苷酸长。在某些实施方案中，单链区为6或7个核苷酸长。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA分子具有增加的稳定性。在一些情况下，化学修饰的siRNA或sdRNA分子在培养基中的半衰期长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时，包括任何中间值。在一些实施方案中，siRNA或sd-RNA在培养基中的半衰期超过12小时。
在一些实施方案中，对siRNA或sdRNA进行优化以增加效能和/或减少毒性。在一些实施方案中，向导链和/或乘客链的核苷酸长度和/或向导链和/或乘客链中硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面可影响RNA分子的效能，而用2'-0-甲基(2'OMe)修饰置换2'-氟(2'F)修饰在一些方面可影响分子的毒性。在一些实施方案中，预期减少分子的2'F含量将减少分子的毒性。在一些实施方案中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响摄取分子至细胞中，例如被动摄取分子至细胞中的效率。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA不具有2'F修饰，但其特征在于细胞摄取与组织渗透方面的功效相等。
在一些实施方案中，向导链的长度为大约18-19个核苷酸并且具有大约2-14个磷酸酯修饰。例如，向导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超过14个经磷酸酯修饰的核苷酸。向导链可含有一个或多个赋予增加的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸，可在3'端、5'端或遍布于整个向导链中。在一些实施方案中，向导链的3'端10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。向导链还可含有2'F和/或2'OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施方案中，向导链中位置1的核苷酸(向导链的最5'位置中的核苷酸)经2'OMe修饰和/或磷酸化。向导链内的C和U核苷酸可经2'F修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置2-10(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'F修饰。向导链内的C和U核苷酸也可经2'OMe修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置11-18(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'OMe修饰。在一些实施方案中，在向导链的最3'端处的核苷酸未经修饰。在某些实施方案中，向导链内的大多数C和U经2'F修饰，并且向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，并且向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化，并且位置2-10中的C或U经2'F修饰。
自我可递送RNAi技术提供一种直接用RNAi剂(无论是siRNA、sdRNA或是其他RNAi剂)转染细胞而无需额外制剂或技术的方法。转染难以转染细胞系的能力、高体内活性和使用简单性是所述组合物和方法的特征，其相对于基于siRNA的传统技术存在显著的功能优势，并且因此在关于减少本发明的TIL中目标基因表达的方法的若干实施方案中采用sdRNA方法。sdRNA方法允许直接递送化学合成化合物至广泛范围的离体和体内原代细胞和组织。在本文中本发明的一些实施方案中描述的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特(Worcester,MA,USA)的Advirna LLC。
siRNA和sdRNA可以疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂交结构形式形成，并且公开于例如Byrne等人,J.Ocular Pharmacol.Therapeut.,2013,29,855-864中，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用无菌电穿孔递送至本文所描述的TIL。在某些实施方案中，方法包括无菌电穿孔TIL群体以递送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合递送至细胞。在一些实施方案中，此跨膜递送系统包括脂质、病毒载体等。在一些实施方案中，寡核苷酸剂为不需要任何递送剂的自我递送RNAi剂。在某些实施方案中，方法包括使用跨膜递送系统来递送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群体。
使寡核苷酸和寡核苷酸组合物与本文所描述的TIL接触(例如使其接触，在本文中也称为施用或递送至)并且被摄入，包括经由TIL被动摄取。sdRNA可在以下时添加到如本文中所描述的TIL：在第一扩增期间(例如步骤B)、在第一扩增之后(例如在步骤C期间)、在第二扩增之前或期间(例如在步骤D之前或期间)、在步骤D之后并且在步骤E中收集之前、在步骤F中收集期间或之后、在步骤F中最终配制和/或转移到输注袋之前或期间、以及在步骤F中任何任选的冷冻保存步骤之前。此外，sdRNA可在从步骤F中任何冷冻保存步骤解冻之后添加。在一些实施方案中，可将一个或多个靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT和CBL-B)的sdRNA，以选自由100nM至20mM、200nM至10mM、500nm至1mM、1μM至100μM和1μM至100μM组成的组的浓度，添加到包含TIL和其他药剂的细胞培养基。在一些实施方案中，可将一个或多个靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT和CBL-B)的sdRNA，以选自由以下组成的组的量添加到包含TIL和其他药剂的细胞培养基：0.1μMsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μMsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μMsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基或10μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基。在一些实施方案中，可将一个或多个靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT和CBL-B)的sdRNA，在预REP或REP阶段期间一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加到TIL培养物。
本发明的寡核苷酸组合物，包括siRNA或sdRNA，可在扩增过程期间，例如通过将高浓度siRNA或sdRNA溶解于细胞培养基中并允许足够时间发生被动摄取而与如本文中所描述的TIL接触。在某些实施方案中，本发明方法包括使TIL群体与如本文中所描述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施方案中，方法包括将寡核苷酸(例如siRNA或sdRNA)溶解于细胞培养基中，并且使细胞培养基与TIL群体接触。TIL可为如本文中所描述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
在一些实施方案中，递送寡核苷酸至细胞中可通过合适的本领域公认方法增强，包括磷酸钙、DMSO、甘油或聚葡萄糖、电穿孔，或通过转染，例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域中已知的方法，例如描述于以下的那些方法：美国专利第4,897,355号；第5,459,127号；第5,631,237号；第5,955,365号；第5,976,567号；第10,087,464号；和第10,155,945号；和Bergan等人,Nucl.Acids Res.1993,21,3567，其公开内容各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用超过一种siRNA或sdRNA来减少目标基因表达。在一些实施方案中，靶向siRNA或sdRNA的PD-1、TIM-3、CBL-B、LAG3、CTLA-4、TIGIT和/或CISH中的一者或多者一起使用。在一些实施方案中，PD-1siRNA或sdRNA与TIM-3、CBL-B、LAG3、CTLA-4、TIGIT和/或CISH中的一者或多者一起使用，以减少超过一种基因目标的表达。在一些实施方案中，LAG3 siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的CISH组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，TIGIT siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的PD-1组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，CISH siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的PD-1组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，CTLA-4siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的PD-1组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，LAG-3siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的PD-1组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，CBL-B siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的PD-1组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBL-B、LAG3和/或CISH中的一者或多者的siRNA或sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC或多个其他供应商。
在一些实施方案中，siRNA或sdRNA靶向选自由以下组成的组的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA靶向选自由以下组成的组的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且另一种siRNA或sdRNA靶向选自由以下组成的组的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBL-B、BAFF(BR3)和其组合。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBL-B、TIM3和其组合。在一些实施方案中，siRNA或sdRNA靶向选自PD-1和以下中的一者的基因：LAG3、CISH、CBL-B、TIM3和其组合。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，并且一种siRNA或sdRNA靶向CBL-B。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，并且一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，并且一种siRNA或sdRNA靶向CBL-B。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，并且一种siRNA或sdRNA靶向CBL-B。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，并且一种siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，并且一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，并且一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，并且一种siRNA或sdRNA靶向CBL-B。
如本文所论述，本发明的实施方案提供了已经由基因编辑进行基因修饰以增强其治疗作用的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。本发明的实施方案涵盖经由核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群体中进行的基因编辑，以促进一种或多种蛋白质的表达并且抑制一种或多种蛋白质的表达以及其组合。本发明的实施方案还提供了用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中所述方法包括对TIL进行基因编辑。存在若干种可用于基因修饰TIL群体的基因编辑技术，所述基因编辑技术适合于根据本发明使用。此类方法包括下文所描述的方法以及本文别处所描述的病毒和转座子方法。在一些实施方案中，基因修饰TIL、MIL或PBL以表达CCR的方法还可包括经由稳定基因敲除此类基因或暂时基因敲低此类基因来抑制基因表达的修饰。
在一些实施方案中，方法包括在如本文中所描述的第一群体、第二群体和/或第三群体中基因修饰TIL群体的方法。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定并入用于产生或抑制(例如沉默)一种或多种蛋白质的基因的步骤。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括电穿孔步骤。电穿孔方法是本领域中已知的，并且描述于例如以下中：Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其公开内容各自通过引用并入本文。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中的孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组所述至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组所述至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时段，以及使得维持TIL的存活率。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面涂布和内吞作用)是本领域中已知的并且描述于Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号中，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的并且描述于Rose等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，其公开内容各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其公开内容各自通过引用并入本文。TIL可为如本文中所描述的第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
根据一个实施方案，基因编辑方法可包括使用介导在一个或多个免疫检查点基因处产生双链或单链断裂的可程序化核酸酶。此类可程序化核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶域靶向此位置并且介导在目标序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机制募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)目标基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN经由蛋白质-DNA相互作用实现特定DNA结合，而CRISPR系统(例如Cas9)通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA向导分子和通过蛋白质-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,NatureMedicine,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，所述方法在下文更详细地描述。根据一个实施方案，将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如，Gen 2)的任何实施方案或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述进行，其中所述方法还包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一者或多者对TIL的至少一部分进行基因编辑，以产生可提供增强的治疗作用的TIL。根据一个实施方案，可通过体外比较经基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评价相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评价经基因编辑的TIL的改进的治疗作用。在某些实施方案中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法对TIL群体进行基因编辑。
在本发明的一些实施方案中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，并且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如，Gen 2)的任何实施方案或如美国专利申请公开第US 2020/0299644A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述进行，其中所述方法还包括通过CRISPR方法(例如，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR代表成簇规律间隔短回文重复序列。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的并入RNA和Cas蛋白并且可根据本发明使用的CRISPR系统：I、II和III型。II型CRISPR(通过Cas9示例)是最充分表征的系统之一。
CRISPR技术是改编自细菌和古菌(单细胞微生物域)的天然防御机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎和破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒和其他外来体的攻击。CRISPR为具有两个独特特征的DNA特化区：存在核苷酸重复序列和间隔子。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区中，其中短外来DNA区段(间隔子)穿插在重复序列中。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合于CRISPR基因组基因座内并且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火成反式激活crRNA(tracrRNA)，并且引导Cas蛋白进行序列特异性裂解和沉默病原性DNA。Cas9蛋白进行的目标识别需要crRNA内的“种子”序列和crRNA结合区上游的含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻基序(PAM)序列。由此CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向以裂解几乎任何DNA序列。原生系统中的crRNA和tracrRNA可简化为大约100个核苷酸的单向导RNA(sgRNA)以用于基因工程化。CRISPR/Cas系统通过共同递送表达Cas9核酸内切酶和必需crRNA组分的质粒可直接携带入人类细胞。可使用不同的Cas蛋白变体来减少靶向限制(例如Cas9的异种同源物，例如Cpf1)。
可通过经由CRISPR方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过经由CRISPR方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过CRISPR方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,697,359号、第8,993,233号、第8,795,965号、第8,771,945号、第8,889,356号、第8,865,406号、第8,999,641号、第8,945,839号、第8,932,814号、第8,871,445号、第8,906,616号和第8,895,308号中，其公开内容各自通过引用并入本文。用于进行CRISPR方法的资源，例如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒，可购自公司如GenScript。
在一些实施方案中，基因修饰如本文中所描述的TIL群体可使用如美国专利第US9790490号中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容通过引用并入本文。
用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法(例如，Gen 2)的任何实施方案或如美国专利申请公开第US 2020/0299644A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述进行，其中所述方法还包括通过TALE方法对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表转录激活因子样效应物蛋白，其包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。使用TALE系统来基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE是来自植物病原细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，并且含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复域构成的DNA结合域。TALE特异性是通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合域中的特异性RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合域。将TALE的DNA结合域与IIS型FokI核酸内切酶的催化域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合和产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可组合TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuti cals(美国肯塔基州列克星敦(Lexington,KY,USA))和Life Technolo gies(美国纽约州格兰德岛(Grand Island,NY,USA))市售。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于美国专利申请公开第US 2011/0201118 A1号、第US 2013/0117869 A1号、第US 2013/0315884 A1号、第US 2015/0203871 A1号和第US 2016/0120906A1号中，其公开内容各自通过引用并入本文。
可通过经由TALE方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过经由TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过TALE方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其通过引用并入本文。
用于将TIL扩增成治疗性群体的方法可根据本文中所描述的方法的任何实施方案或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容通过引用并入本文)中所描述进行，其中所述方法还包括通过锌指或锌指核酸酶方法对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达增强。
呈保守ββα构型的个别锌指含有大约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA主沟槽中的3bp。锌指具有两个蛋白域。第一域为DNA结合域，其包括真核转录因子并且含有锌指。第二域为核酸酶域，其包括FokI限制酶并且负责DNA的催化裂解。
个别ZFN的DNA结合域通常含有介于三个与六个之间的个别锌指重复并且可各自识别介于9个与18个之间的碱基对。如果锌指域对其预期目标位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法是组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对目标位点的3指阵列。替代地，可使用基于选择的方法，例如寡聚池工程化(OPEN)，来自随机分组文库选择新的锌指阵列，所述随机分组文库考虑介于邻近指之间的上下文依赖性相互作用(context-dependent interaction)。工程化锌指可购自Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙(Richmond,CA,USA))和Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))。
可通过经由锌指方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过经由锌指方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过锌指方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,746,838号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,866,997号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,030,215号、第7,220,719号、第7,241,573号、第7,241,574号、第7,585,849号、第7,595,376号、第6,903,185号和第6,479,626号中，其各自通过引用并入本文。
用于通过锌指方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的其他实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于Beane等人,Mol.Therapy,2015,23,1380-1390中，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，TIL任选地经基因工程化以包括其他功能性，所述功能性包括(但不限于)高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，方法包括对TIL群体进行基因工程化以包括高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群体可为如本文中所描述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
D.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用较少培养瓶并允许成本降低。在一些实施方案中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统是本领域中众所周知的并且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVac cines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm处。
无菌连接装置(STCD)在两件相容性管之间产生无菌熔接部分(weld)。此程序允许无菌连接多个容器和管直径。在一些实施方案中，密闭系统包括如实施例中所描述的鲁尔锁(luer lock)和热封系统。在一些实施方案中，密闭系统是在无菌条件下经由注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方案中，采用如实施例中所描述的密闭系统。在一些实施方案中，根据本文实例中所描述的方法，将TIL配制至最终产物配制容器中。
在一些实施方案中，从获得肿瘤片段的时间至准备向患者施用TIL或冷冻保存为止，密闭系统使用一个容器。在一些实施方案中，当使用两个容器时，第一容器为密闭G容器，并且在不开放第一密闭G容器的情况下离心TIL群体并且将其转移到输注袋。在一些实施方案中，当使用两个容器时，输注袋为含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦已添加肿瘤样品和/或肿瘤片段，就从外部紧密密封系统以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。
在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在不存在微生物污染下和/或在微生物污染显著减少下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压各自随细胞培养而变化。因此，即使适合于细胞培养的培养基经循环，但密闭环境仍需要不断地维持为TIL增殖的最佳环境。为此目的，合乎需要的是，借助于传感器监测密闭环境的培养液内的pH、二氧化碳分压和氧气分压的物理因素，其信号用于控制安设在培养环境的入口处的气体交换器，并且根据培养液中的变化实时调整密闭环境的气体分压以便优化细胞培养环境。在一些实施方案中，本发明提供了密闭细胞培养系统，其在至密闭环境的入口处并入配备有测量密闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压的监测装置的气体交换器，并且通过基于来自监测装置的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施方案中，连续地或间歇地控制密闭环境内的压力。也就是说，密闭环境中的压力可借助于例如压力维持装置来改变，从而确保空间在正压力状态下适合于TIL生长或促进在负压力状态下渗出流体并且因此促进细胞增殖。此外，通过间歇性地施加负压力，有可能借助于暂时性缩小密闭环境的容积而均匀且有效地置换密闭环境中的循环液体。
在一些实施方案中，可替换或添加TIL增殖的最佳培养物组分，并且可添加包括例如IL-2和/或OKT3以及组合的因子。
E.TIL的任选的冷冻保存
可任选地将主体TIL群体(例如第二TIL群体)或经扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)冷冻保存。在一些实施方案中，对治疗性TIL群体进行冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存发生于在第二扩增后收集的TIL。在一些实施方案中，对图1和/或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的示例性步骤F中对TIL进行冷冻保存。在一些实施方案中，TIL是冷冻保存于输注袋中。在一些实施方案中，TIL是在置于输注袋中之前冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存TIL并且不将其置于输注袋中。在一些实施方案中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。这通常通过将TIL群体放置于冷冻溶液(例如85％补体失活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞放置于低温小瓶中并储存在-80℃持续24小时，其中任选地转移到气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。
在适当时，从冷冻器取出细胞并且在37℃水浴中解冻直至大约4/5的溶液解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中并且任选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，可对解冻的TIL进行计数并且如本领域中已知来评估存活率。
在一些实施方案中，TIL群体是使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)冷冻保存。在一些实施方案中，TIL群体是使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在一些实施方案中，TIL群体是使用1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基冷冻保存。在一些实施方案中，TIL群体是使用约1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基(还包含额外IL-2)冷冻保存。
如上文所论述并且如图1和/或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的步骤A至E中所示例，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的多个点。在一些实施方案中，在第一扩增之后(如例如根据步骤B所提供)经扩增的TIL群体或在根据图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D的一个或多个第二扩增之后的经扩增的TIL群体可进行冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群体放置于冷冻溶液(例如85％补体失活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞放置于低温小瓶中并储存在-80℃持续24小时，其中任选地转移到气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。在一些实施方案中，TIL是冷冻保存于5％ DMSO中。在一些实施方案中，TIL是冷冻保存于细胞培养基加5％ DMSO中。在一些实施方案中，TIL是根据实施例6中提供的方法冷冻保存。
在适当时，从冷冻器取出细胞并且在37℃水浴中解冻直至大约4/5的溶液解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中并且任选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，可对解冻的TIL进行计数并且如本领域中已知来评估存活率。
在某些情况下，图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B的TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可经历来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤C和步骤D，并且然后在图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在其中基因修饰TIL将用于疗法中的情况下，来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B或步骤D的TIL群体可经历基因修饰以用于合适的治疗。
F.经扩增的TIL的表型特征
在一些实施方案中，分析TIL在扩增后的多种表型标志物的表达，所述标志物包括本文和实施例中所描述的那些。在一些实施方案中，检查一种或多种表型标志物的表达。在一些实施方案中，在来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤B中的第一扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤C中的转变期间分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤C中的转变期间并且在冷冻保存之后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中的第二扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在来自图1或图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)的步骤D中的两次或更多次扩增之后分析TIL的表型特征。
在一些实施方案中，标志物选自由CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，检查CD8的表达。在一些实施方案中，检查CD28的表达。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8和/或CD28的表达更高。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是，例如，图8B)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8的表达更高。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是，例如，图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD28的表达更高。在一些实施方案中，高CD28表达指示较年轻更持久的TIL表型。在一些实施方案中，测量一种或多种调节标志物的表达。
在一些实施方案中，在用于扩增本文所描述的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法的任一步骤期间，未基于CD8和/或CD28表达进行第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或所收集TIL群体的选择。
在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是，例如，图8A)中提供的2A过程，根据本发明的方法产生的TIL的中央记忆细胞的百分比更高。在一些实施方案中，中央记忆细胞的记忆标志物选自由CCR7和CD62L组成的组。
在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL记忆子集可分为不同记忆子集。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含中央记忆(CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含效应记忆(EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含RA+效应记忆/效应(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些实施方案中，TIL表达一种或多种选自由以下组成的组的标志物：颗粒酶B、穿孔蛋白和颗粒溶解素。在一些实施方案中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施方案中，TIL表达穿孔蛋白。在一些实施方案中，TIL表达颗粒溶解素。
在一些实施方案中，还可使用细胞因子释放测定，评价再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施方案中，可评价TIL的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。在一些实施方案中，IFN-γ分泌是通过ELISA测定测量。在一些实施方案中，在快速第二扩增步骤之后，在如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所提供的步骤D之后，通过ELISA测定测量IFN-γ分泌。在一些实施方案中，TIL健康是通过IFN-γ(IFN-γ)分泌测量。在一些实施方案中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效能测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过测定用抗CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的水平测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ水平可通过测量IFN-γ释放测定。在一些实施方案中，例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)TIL中所提供的Gen 3过程中的步骤D相较于例如图8(特别是，例如，图8A)中所提供的2A过程中的步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，IFN-γ的分泌增加三倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL中的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图8B方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于一倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于两倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于三倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于四倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于五倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/mL至约1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少550pg/mL、至少600pg/mL、至少650pg/mL、至少700pg/mL、至少750pg/mL、至少800pg/mL、至少850pg/mL、至少900pg/mL、至少950pg/mL或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/mL/5e5个细胞至约1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞、至少250pg/mL/5e5个细胞、至少300pg/mL/5e5个细胞、至少350pg/mL/5e5个细胞、至少400pg/mL/5e5个细胞、至少450pg/mL/5e5个细胞、至少500pg/mL/5e5个细胞、至少550pg/mL/5e5个细胞、至少600pg/mL/5e5个细胞、至少650pg/mL/5e5个细胞、至少700pg/mL/5e5个细胞、至少750pg/mL/5e5个细胞、至少800pg/mL/5e5个细胞、至少850pg/mL/5e5个细胞、至少900pg/mL/5e5个细胞、至少950pg/mL/5e5个细胞或至少1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生表现并增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加，所述其他方法包括例如除图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中实施的方法以外的方法。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图8(特别是，例如，图8A)中示例的称为Gen2的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，在第一扩增中获得的TIL表现出T细胞贮库多样性的增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。在一些实施方案中，如本文中所描述的过程(例如Gen 3过程)相较于其他过程(例如称为Gen 2的过程)，基于样品内独特肽CDR的数目，展示更高的克隆多样性。
在一些实施方案中，TIL的激活和耗竭可通过检查一种或多种标志物确定。在一些实施方案中，激活和耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施方案中，标志物的激活和耗竭包括(但不限于)一种或多种选自由以下组成的组的标志物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG-3)。在一些实施方案中，标志物的激活和耗竭包括(但不限于)一种或多种选自由以下组成的组的标志物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施方案中，标志物的激活和耗竭包括(但不限于)一种或多种选自由以下组成的组的标志物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施方案中，可确定和/或分析T细胞标志物(包括激活和耗竭标志物)以检查T细胞激活、抑制或功能。在一些实施方案中，T细胞标志物可包括(但不限于)一种或多种选自由以下组成的组的标志物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59。
在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。
在一些实施方案中，表现出分泌高于1000pg/mL至300000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于1000pg/mL、高于2000pg/mL、高于3000pg/mL、高于4000pg/mL、高于5000pg/mL、高于6000pg/mL、高于7000pg/mL、高于8000pg/mL、高于9000pg/mL、高于10000pg/mL、高于20000pg/mL、高于30000pg/mL、高于40000pg/mL、高于50000pg/mL、高于60000pg/mL、高于70000pg/mL、高于80000pg/mL、高于90000pg/mL、高于100000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于1000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于2000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于3000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于4000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于5000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于6000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于7000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于8000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于9000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于10000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于20000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于30000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于40000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于50000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于60000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于70000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于80000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于90000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于100000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于120000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于140000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于160000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于180000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于200000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于220000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于240000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于260000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于280000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出分泌高于300000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)产生的TIL。
在一些实施方案中，本发明的扩增方法产生表现出相较于非扩增TIL群体增加的体外颗粒酶B分泌的扩增TIL群体，包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P中提供的TIL。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少两倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少六倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少七倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少八倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少九倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少十倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些实施方案中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更低水平的TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少一倍水平的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少两倍水平的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少三倍水平的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少四倍水平的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少五倍水平的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，测量IFN-γ和颗粒酶B水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量颗粒酶B和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α水平以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施方案中，表型特征是在冷冻保存之后检查。
G.另外的过程实施方案
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将从受试者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行启始第一扩增，其中所述启始第一扩增进行约1至7天或约1至8天以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至11天或约1至10天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集从步骤(c)获得的所述治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体是在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分是在第二小规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约5至7天的时段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将从受试者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行启始第一扩增，其中所述启始第一扩增进行约1至8天以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至8天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集从步骤(c)获得的治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体是在较大规模培养中培养约4至8天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分是在第二小规模培养中培养约4至6天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约4至6天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约4至5天的时段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将从受试者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤片段而获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行启始第一扩增，其中所述启始第一扩增进行约1至7天以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体的数目大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至11天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体；以及(d)收集从步骤(c)获得的所述治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养的规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移到比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体是在较大规模培养中培养约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分是在第二小规模培养中培养约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约4至7天的时段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-g500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，从小规模培养转移到此类第二容器的第二TIL群体部分是在较大规模培养中培养约5天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过使第一TIL群体与还包含外源性抗原呈递细胞(APC)的培养基接触来进行，其中步骤(c)中培养基中的APC的数目大于步骤(b)中培养基中的APC的数目。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，培养基补充有额外外源性APC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约20:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约9:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约8:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约7:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约6:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约1.1:1至刚好或大约2:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约10:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约5:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约4:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约3:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.9:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.8:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.7:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.6:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.5:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.4:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.3:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.2:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或大约2:1至刚好或大约2.1:1的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或大约2:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或大约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中初步第一扩增中添加的APC数目为刚好或大约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，并且其中快速第二扩增中添加的APC数目为刚好或大约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中初步第一扩增中添加的APC数目选自刚好或大约1×108个APC至刚好或大约3.5×108个APC的范围，并且其中快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或大约3.5×108个APC至刚好或大约1×109个APC的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中初步第一扩增中添加的APC数目选自刚好或大约1.5×108个APC至刚好或大约3×108个APC的范围，并且其中快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或大约4×108个APC至刚好或大约7.5×108个APC的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中初步第一扩增中添加的APC数目选自刚好或大约2×108个APC至刚好或大约2.5×108个APC的范围，并且其中快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或大约4.5×108个APC至刚好或大约5.5×108个APC的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中刚好或大约2.5×108个APC被添加到初步第一扩增，并且刚好或大约5×108个APC被添加到快速第二扩增。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个肿瘤片段被分布到多个分开的容器中，在每个分开的容器中，第一TIL群体是在步骤(a)中获得，第二TIL群体是在步骤(b)中获得，并且第三TIL群体是在步骤(c)中获得，并且将来自步骤(c)中多个容器的治疗性TIL群体合并以产生来自步骤(d)的经收集的TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个肿瘤均匀分布到多个分开的容器中。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含至少两个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至二十个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至十五个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至十个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至五个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个分开的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个分开的容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在每个容器中对步骤(b)中的第一TIL群体进行启始第一扩增，在同一容器中对由此类第一TIL群体产生的第二TIL群体进行步骤(c)中的快速第二扩增。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中分开的容器中的每一者包含第一透气表面区域。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个肿瘤片段分布于单一容器中。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中单一容器包含第一透气表面区域。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，并且其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约一个细胞层至刚好或大约三个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约1.5个细胞层至刚好或大约2.5个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约2个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3个细胞层至刚好或大约10个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约4个细胞层至刚好或大约8个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，启始第一扩增是在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，并且在步骤(c)中，快速第二扩增是在包含第二透气表面区域的第二容器中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二容器大于第一容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，并且其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约一个细胞层至刚好或大约三个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约1.5个细胞层至刚好或大约2.5个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约2个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3个细胞层至刚好或大约10个细胞层的平均厚度层叠到第二透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约4个细胞层至刚好或大约8个细胞层的平均厚度层叠到第二透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠到第二透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第二透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，启始第一扩增是在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，并且在步骤(c)中，快速第二扩增是在第一容器中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，并且其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约一个细胞层至刚好或大约三个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约1.5个细胞层至刚好或大约2.5个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约2个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3个细胞层至刚好或大约10个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约4个细胞层至刚好或大约8个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠到第一透气表面区域上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以刚好或大约以下的平均厚度层叠到第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:10的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:9的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:8的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:7的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:6的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:5的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:4的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:3的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1至刚好或大约1:2的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.2至刚好或大约1:8的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.3至刚好或大约1:7的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.4至刚好或大约1:6的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.5至刚好或大约1:5的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.6至刚好或大约1:4的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.7至刚好或大约1:3.5的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.8至刚好或大约1:3的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.9至刚好或大约1:2.5的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:2的范围。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，初步第一扩增是通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，并且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或大约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或大约1.5:1至刚好或大约100:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或大约50:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或大约25:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或大约20:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或大约10:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体在数目上比第一TIL群体高至少刚好或大约50倍。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二TIL群体在数目上比第一TIL群体高至少刚好或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中的第二时段开始后刚好或大约2天或刚好或大约3天，对细胞培养基补充另外的IL-2。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，还包括使用冷冻保存过程冷冻保存步骤(d)中的经收集的TIL群体的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，包括在步骤(d)后进行将来自步骤(d)的经收集的TIL群体转移到任选地含有HypoThermosol的输注袋的另外步骤(e)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，包括使用冷冻保存过程冷冻保存包含步骤(e)中的经收集的TIL群体的输注袋的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中使用1:1比率的经收集的TIL群体与冷冻保存培养基来进行冷冻保存过程。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中PBMC为经照射并且同种异体的。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中添加到细胞培养物的APC总数为2.5×108个。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中添加到细胞培养物的APC总数为5×108个。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中APC为PBMC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中PBMC为经照射并且同种异体的。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中使用基于膜的细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中使用LOVO细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约5至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约10至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约15至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约20至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约25至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约30至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约35至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约40至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约45至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约50至刚好或大约60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含在步骤(b)中每容器刚好或大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个片段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约27mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约20mm3至刚好或大约50mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约21mm3至刚好或大约30mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约22mm3至刚好或大约29.5mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约23mm3至刚好或大约29mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约24mm3至刚好或大约28.5mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约25mm3至刚好或大约28mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约26.5mm3至刚好或大约27.5mm3的体积。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中每个片段具有刚好或大约以下的体积：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm3。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含刚好或约30至刚好或约60个片段，其中总体积为刚好或大约1300mm3至刚好或大约1500mm3。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含刚好或大约50个片段，其中总体积为刚好或大约1350mm3。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中多个片段包含刚好或大约50个片段，其中总质量为刚好或大约1克至刚好或大约1.5克。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中细胞培养基提供于呈G容器或Xuri细胞袋的容器中。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度为约6,000IU/mL。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中冷冻保存培养基包含7％至10％DMSO。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)中的第一时段是在刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(c)中的第二时段是在刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)中的第一时段和步骤(c)中的第二时段各自分别是在刚好或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)中的第一时段和步骤(c)中的第二时段各自分别是在刚好或大约5天、6天或7天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)中的第一时段和步骤(c)中的第二时段各自分别是在刚好或大约7天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约14天至刚好或大约18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约15天至刚好或大约18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约16天至刚好或大约18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约17天至刚好或大约18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约14天至刚好或大约17天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约15天至刚好或大约17天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约16天至刚好或大约17天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约14天至刚好或大约16天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约15天至刚好或大约16天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约14天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约15天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约16天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约17天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约14天或更短时间中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约15天或更短时间中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约16天或更短时间中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)至(d)是在总共刚好或大约18天或更短时间中进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(d)中收集的治疗性TIL群体包含足以用于TIL的治疗有效剂量的TIL。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中足以用于治疗有效剂量的TIL数目为刚好或大约2.3×1010个至刚好或大约13.7×1010个。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(c)中的第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中相较于通过长于16天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中相较于通过长于17天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中相较于通过长于18天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中相对于获自步骤(b)第二细胞群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞，获自步骤(c)第三TIL群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞表现出增加的CD8和CD28表达。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中引述的每个容器为密闭容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中引述的每个容器为G容器。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-10。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-100。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-500。
在其他实施方案中，本发明提供了通过如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过在不添加任何抗原呈递细胞(APC)或OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过在不添加任何抗原呈递细胞(APC)的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过在不添加任何OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过在不添加抗原呈递细胞(APC)并且不添加OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过过程长度超过16天的过程制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过过程长度超过17天的过程制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体与通过过程长度超过18天的过程制备的TIL相比提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的干扰素-γ产生。
在其他实施方案中，本发明提供了如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的多克隆性。
在其他实施方案中，本发明提供了如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的功效。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，所述治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其与通过在不添加任何抗原呈递细胞(APC)的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其与通过在不添加任何OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗性TIL群体，其与通过在不添加任何APC的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗性TIL群体，其与通过在不添加任何OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗性TIL群体，其与通过在不添加任何APC的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了治疗性TIL群体，其与通过在不添加任何OKT3的情况下进行TIL的第一扩增的方法制备的TIL相比能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施方案中，由于本文中所描述，例如以上步骤A至F中或根据以上步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是，例如，图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D和/或图8E和/或图8F和/或图8G和/或图8H和/或图8I和/或图8J和/或图8K和/或图8L和/或图8M和/或图8N和/或图8O和/或图8P)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中肿瘤片段为小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中肿瘤片段为空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中肿瘤片段为细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中肿瘤片段为小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中肿瘤片段为空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中(i)所述方法包括从一个或多个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行启始第一扩增步骤之前进行在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时段的步骤；(iii)所述方法包括进行启始第一扩增约8天的时段；和(iv)所述方法包括进行快速第二扩增约11天的时段。在一些前述实施方案中，方法的所述步骤在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中(i)所述方法包括从一个或多个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行启始第一扩增步骤之前进行在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时段的步骤；(iii)所述方法包括进行启始第一扩增约8天的时段；和(iv)所述方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物拆分为至多5个继代培养物，以及培养所述继代培养物约6天。在一些前述实施方案中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施方案中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施方案中，方法的所述步骤在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一TIL群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中(i)所述方法包括从1至约10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检获得第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行启始第一扩增步骤之前进行在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时段的步骤；(iii)所述方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时段来进行启始第一扩增步骤，以获得第二TIL群体；和(iv)所述方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体约11天的时段来进行快速第二扩增步骤。在一些前述实施方案中，方法的所述步骤在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中(i)所述方法包括从1至约10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检获得第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行启始第一扩增步骤之前进行在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时段的步骤；(iii)所述方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时段来进行启始第一扩增步骤，以获得第二TIL群体；和(iv)所述方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物拆分为至多5个继代培养物，以及在包含IL-2的细胞培养基中培养所述继代培养物中的每一者约6天。在一些前述实施方案中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施方案中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施方案中，方法的所述步骤在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中(i)所述方法包括从1至约10个来自受试者的肿瘤组织的空芯针活检获得第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行启始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在G-REX-100M培养瓶中在包含6000IU IL-2/mL的0.5L CM1培养基的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时段；(iii)所述方法包括通过以下方式进行启始第一扩增：添加含有6000IU/mLIL-2、30ng/mL OKT-3和约108个饲养细胞的0.5L CM1培养基，并培养约8天的时段；和(iv)所述方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：(a)将第二TIL群体转移到含有具有3000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和5×109个饲养细胞的5L CM2培养基的G-REX-500MCS培养瓶中，并培养约5天；(b)通过将109个TIL转移到含有具有3000IU/mL IL-2的5L AIM-V培养基的至多5个G-REX-500MCS培养瓶中的每一者中而将培养物拆分为至多5个继代培养物，并且培养所述继代培养物约6天。在一些前述实施方案中，方法的所述步骤在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长和启始第一T细胞群体的激活来进行从供体获得的第一T细胞群体的启始第一扩增；(b)在步骤(a)中启始的第一T细胞群体的激活开始衰减后，通过培养第一T细胞群体以实现生长和增强第一T细胞群体的激活来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，以获得第二T细胞群体；以及(c)收集第二T细胞群体。在其他实施方案中，快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移到大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，以及在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约4至7天的时段。在其他实施方案中，快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分是在第二小规模培养中培养约4至7天的时段。在其他实施方案中，快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约4至7天的时段。在其他实施方案中，快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约5天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速第二扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移到大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，以及在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约5至7天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分是在第二小规模培养中培养约5至7天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约5至7天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增的步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约5至6天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约5天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约6天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中快速扩增步骤拆分为多个步骤以通过以下方式达到培养规模的横向扩大和纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时段来进行快速第二扩增；并且然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配到至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移到此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分是在较大规模培养中培养约7天的时段。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)的启始第一扩增是在至多7天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增是在至多8天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增是在至多9天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增是在至多10天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增是在至多11天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在7天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多9天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在7天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多10天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在7天或8天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多9天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在7天或8天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多10天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在8天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多9天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中步骤(a)中的启始第一扩增是在8天的时段内进行，并且步骤(b)的快速第二扩增是在至多8天的时段内进行。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体是在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体是在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体是在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第一APC群体层叠到第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体是在容器中在第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第二APC群体层叠到第一透气表面上，并且其中第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体是在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，并且第一APC群体层叠到第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体是在容器中在第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第二APC群体层叠到第一透气表面上，并且其中第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体是在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第一APC群体层叠到第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体是在容器中在第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第二APC群体层叠到第一透气表面上，并且其中第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体是在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，并且第一APC群体层叠到第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体是在容器中在第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，并且第二APC群体层叠到第一透气表面上，并且其中第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第二APC群体中的APC的数目与第一APC群体中的APC的数目的比率为约2:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一APC群体中的APC的数目为约2.5×108，并且第二APC群体中的APC的数目为约5×108。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以2个APC层的平均厚度层叠到第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以选自4至8个APC层的范围内的平均厚度层叠到第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中层叠到第一透气表面上的APC层的平均数目与在步骤(a)中层叠到第一透气表面上的APC层的平均数目的比率为2:1。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约1.0×106个APC/cm2至刚好或大约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约1.5×106个APC/cm2至刚好或大约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约2.0×106个APC/cm2至刚好或大约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或大约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约2.5×106个APC/cm2至刚好或大约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约3.5×106个APC/cm2至刚好或大约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约4.0×106个APC/cm2至刚好或大约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或大约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约1.0×106个APC/cm2至刚好或大约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，并且在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约2.5×106个APC/cm2至刚好或大约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约1.5×106个APC/cm2至刚好或大约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，并且在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约3.5×106个APC/cm2至刚好或大约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或大约2.0×106个APC/cm2至刚好或大约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，并且在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或大约4.0×106个APC/cm2至刚好或大约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或大约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，并且在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或大约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中APC为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中PBMC经照射并且对于第一T细胞群体的供体为外源性的。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中T细胞为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是通过从供体的全血分离而获得。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是通过从供体的单采术产物分离而获得。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是通过T细胞表型的正向或负向选择从供体的全血或单采术产物分离。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中T细胞表型为CD3+和CD45+。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在进行第一T细胞群体的启始第一扩增之前，从NK细胞分离T细胞。在其他实施方案中，通过从第一T细胞群体去除CD3-CD56+细胞来将第一T细胞群体中的T细胞与NK细胞分离。在其他实施方案中，通过使用去除CD3-CD56+细胞级分并回收阴性级分的门控策略对第一T细胞群体进行细胞分选，从第一T细胞群体去除CD3-CD56+细胞。在其他实施方案中，前述方法被用于以高百分比的NK细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于以高百分比的CD3-CD56+细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于以存在大量NK细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于以大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于从患有以存在大量NK细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于从患有以存在大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法被用于从患有卵巢癌的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中将刚好或大约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞接种于容器中，以起始此类容器中的初步第一扩增培养。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中将第一T细胞群体分布到多个容器中，并且在每个容器中接种刚好或大约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞，以起始此类容器中的初步第一扩增培养。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在步骤(c)中收集的第二T细胞群体为治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自一个或多个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至20个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至10个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)、空芯针活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自一个或多个来自供体的肿瘤组织空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至20个来自供体的肿瘤组织空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至10个来自供体的肿瘤组织空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织空芯针活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自一个或多个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自一个或多个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至20个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至10个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿孔活检)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自一个或多个来自供体的肿瘤组织空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至20个来自供体的肿瘤组织空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1至10个来自供体的肿瘤组织空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一T细胞群体是获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织空芯针穿刺活检。
在其他实施方案中，本发明提供了用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养肿瘤样品约3天来获得和/或接收来自从受试者中的肿瘤的一个或多个小型活检、空芯针活检或穿刺活检获得的肿瘤样品的第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行启始第一扩增，以产生第二TIL群体，其中在包含第一透气表面区域的容器中进行启始第一扩增，其中所述启始第一扩增进行约7或8天的第一时段以获得第二TIL群体，其中第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(iii)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群体的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，以产生第三TIL群体，其中在快速第二扩增中添加的APC的数目为步骤(ii)中添加的APC的数目的至少两倍，其中快速第二扩增进行约11天的第二时段以获得第三TIL群体，其中第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中在包含第二透气表面区域的容器中进行快速第二扩增；(iv)收集从步骤(iii)获得的治疗性TIL群体；以及(v)将来自步骤(iv)的经收集的TIL群体转移到输注袋。
在其他实施方案中，本发明提供了用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养肿瘤样品约3天来获得和/或接收来自从受试者中的肿瘤的一个或多个小型活检、空芯针活检或穿刺活检获得的肿瘤样品的第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行启始第一扩增，以产生第二TIL群体，其中所述启始第一扩增进行约7或8天的第一时段以获得第二TIL群体，其中第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(iii)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，以产生第三TIL群体，其中快速第二扩增进行约11天的第二时段以获得第三TIL群体，其中第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中在包含第二透气表面区域的容器中进行快速第二扩增；以及(iv)收集从步骤(iii)获得的治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在第二时段的第5天后，将培养物拆分为2个或更多个继代培养物，并且向每个继代培养物补充额外数量的第三培养基并培养约6天。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在第二时段的第5天后，将培养物拆分为2个或更多个继代培养物，并且向每个继代培养物补充包含IL-2的第四培养基并培养约6天。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中在第二时段的第5天后，将培养物拆分为至多5个继代培养物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中方法中的所有步骤是在约22天内完成。
在其他实施方案中，本发明提供了一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：(i)通过培养第一T细胞群体以实现生长和启始第一T细胞群体的激活来进行第一T细胞群体的启始第一扩增，所述第一T细胞群体是来源于从供体中的肿瘤的一个或多个小型活检、空芯针活检或穿刺活检获得的肿瘤样品；(ii)在步骤(a)中启始的第一T细胞群体的激活开始衰减后，通过培养第一T细胞群体以实现生长和增强第一T细胞群体的激活来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，以获得第二T细胞群体；以及(iv)收集第二T细胞群体。在一些实施方案中，肿瘤样品是从多个空芯针活检获得。在一些实施方案中，多个空芯针活检选自由以下组成的组：2、3、4、5、6、7、8、9和10个空芯针活检。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中T细胞或TIL从肿瘤消化物中获得。在一些实施方案中，通过在酶介质(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中温育肿瘤，接着进行机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本)来产生肿瘤消化物。在一些实施方案中，将肿瘤放置于肿瘤解离酶混合物中，所述肿瘤解离酶混合物包括一种或多种解离(消化)酶，例如(但不限于)胶原酶(包括任何掺合物或类型的胶原酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、蛋白酶型XIV(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和其任何组合。在其他实施方案中，将肿瘤放置于肿瘤解离酶混合物中，所述肿瘤解离酶混合物包括胶原酶(包括任何掺合物或类型的胶原酶)、中性蛋白酶(分散酶)和脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中TIL群体经受基因编辑过程。在一些实施方案中，基因编辑过程可在TIL扩增方法期间的任何时间进行，包括扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后，例如，上文概述的步骤A、B、C、D、E和F中的一者或多者之前、期间或之后。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一扩增步骤之后为激活步骤。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和/或抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤包括在包含抗CD3和抗CD38珠粒的培养基中培养TIL约1-7天。在一些实施方案中，激活步骤进行约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中激活步骤之后为基因编辑步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中第一扩增步骤之后为基因编辑步骤。在一些实施方案中，当第一扩增步骤包括OKT-3时，第一扩增步骤之后为基因编辑步骤。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中基因编辑步骤包括对TIL群体进行无菌电穿孔步骤。在一些实施方案中，无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。根据一些实施方案，基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，TALE核酸酶系统下调PD-1的表达。根据一些实施方案，基因编辑器还包含下调CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达的TALE核酸酶系统。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为PD-1/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/LAG-3双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CTLA-4/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CISH双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为LAG-3/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/TIGIT双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为CISH/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL为TIGIT/CBL-B双基因敲除TIL。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1的表达下调以及CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1和CTLA-4的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1和LAG-3的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1和CISH的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1和TIGIT的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出PD-1和CBL-B的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4和LAG-3的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4和CISH的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4和TIGIT的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CTLA-4和CBL-B的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3和CISH的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3和TIGIT的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出LAG-3和CBL-B的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH和TIGIT的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出CISH和CBL-B的表达下调。根据一些实施方案，所得TIL表现出TIGIT和CBL-B的表达下调。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中基因编辑步骤之后为静息步骤。在一些实施方案中，静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育TIL群体约1-24小时。根据一些实施方案，静息步骤在约30℃下进行约1-24小时。根据一些实施方案，静息步骤在约37℃下进行约1-24小时。根据一些实施方案，静息步骤在约37℃下进行约1小时，接着在约30℃下进行约15-23小时。
在一些实施方案中，本发明提供了经修改的如上适用的前述段落中的任一者中所描述的方法，其中静息步骤之后为第二扩增步骤。
VIII.药物组合物、剂量和给药方案
在一些实施方案中，使用本公开的方法扩增和/或基因修饰的TIL、MIL或PBL(包括基因修饰以表达CCR的TIL、MIL或PBL)作为药物组合物施用至患者。在一些实施方案中，药物组合物为TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC或黑素瘤的情况下。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为转移性NSCLC或转移性黑素瘤的情况下。在一些实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为转移性黑素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为转移性NSCLC的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供于本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将取决于施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。适当时还可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量，将取决于所治疗的人类或哺乳动物、病症或疾患的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和处方医师的判断。
在一些实施方案中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg、或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg、或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的试剂的任一种公认模式，包括鼻内和透皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
在其他实施方案中，本发明提供了一种输注袋，其包含在如上前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包含在如上前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体和药学上可接受的载体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种输注袋，其包含在如上前述段落中的任一者中所描述的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了一种在如上前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体的冷冻保存制剂。
在其他实施方案中，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包含在如上前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体和冷冻保存培养基。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上前述段落中的任一者中所描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有DMSO。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的如上前述段落中的任一者中所描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有7％至10％DMSO。
在其他实施方案中，本发明提供了一种在如上前述段落中的任一者中所描述的TIL组合物的冷冻保存制剂。
在一些实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL是以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施方案中，药物组合物为TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC的情况下。在一些实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症为NSCLC时。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供于本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将取决于施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。适当时还可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将取决于所治疗的人类或哺乳动物、病症或疾患的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和处方医师的判断。
在一些实施方案中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg、或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg、或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的试剂的任一种公认模式，包括鼻内和透皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
IX.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集和TIL培养。此类方法均已描述于本领域中，例如通过引用整体并入本文的Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35(3):283-292。下文贯穿各个部分，包括实施例，描述了治疗方法的实施方案。
发现根据本文中所描述的方法，包括例如上文步骤A至F中所描述或根据上文步骤A至F(也如例如图1、图36和/或图8中所示)而产生的扩增TIL在治疗癌症患者方面的特殊用途(例如，如通过引用整体并入本文的Goff等人,J.Clinical Oncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所描述)。在一些实施方案中，如先前描述从经切除的转移性黑素瘤寄存物生长TIL(参见通过引用整体并入本文的Dudley等人,J Immunother.,2003,26:332-342)。可在无菌条件下分割新鲜肿瘤。可收集代表性样品以用于正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单个片段。在一些实施方案中，从每名患者获得5、10、15、20、25或30个样品。在一些实施方案中，从每名患者获得20、25或30个样品。在一些实施方案中，从每名患者获得20、22、24、26或28个样品。在一些实施方案中，从每名患者获得24个样品。可将样品放置于24孔板的个别孔中，维持于含高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤破坏和/或TIL增殖。如本文所描述，可将在处理后剩余活细胞的任何肿瘤酶促消化成单细胞悬浮液并冷冻保存。
在一些实施方案中，可对成功生长的TIL进行取样以用于表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)，并在可用时针对自体肿瘤进行测试。如果过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)水平＞200pg/mL并且为背景的两倍，则可认为TIL具反应性。(Goff等人,J Immunother.,2010,33:840-847；其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，可选择已证明具有自体反应性或充足生长模式的培养物用于第二扩增(例如根据图1、图36和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在第二扩增期间高度增殖)的经扩增TIL用于另外的第二扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如，在如图1、图36和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增期间的高增殖)的TIL用于根据图1、图36和/或图8的步骤D的额外第二扩增。
可通过针对表面标志物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(BD BioSciences)以及通过本文所描述的任一种方法分析输注袋TIL的冷冻保存样品的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附测定技术测量血清细胞因子。血清IFN-g的升高定义为＞100pg/mL和大于43的基线水平。
在一些实施方案中，通过本文所提供的方法，例如图1、图36和/或图8中示例的方法产生的TIL实现TIL的临床功效的惊人改进。在一些实施方案中，与通过除本文所描述的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL相比，通过本文所提供的方法，例如图1、图36和/或图8中示例的方法产生的TIL表现出提高的临床功效。在一些实施方案中，除本文所描述的方法外的方法包括称为过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方案中，通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量增加的功效。在一些实施方案中，与通过除本文所描述的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL相比，通过本文所提供的方法，例如图1或图36中示例的方法产生的TIL表现出类似的反应时间和安全性概况。
在一些实施方案中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效能测定。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ水平，可测量IFN-γ产生，所述方法包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中的IFN-γ。在一些实施方案中，IFN-γ指示在治疗肿瘤中的治疗功效和/或增加的临床功效。
在一些实施方案中，通过本发明的方法制备的TIL，包括如例如图1或图36中所描述的那些TIL，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效能测定。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ水平，可测量IFN-γ产生，所述方法包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ。
在一些实施方案中，通过本发明的方法(包括如例如图1、图36和/或图8中所描述的方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1、图36和/或图8中示例的方法，例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL表现出增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)，如本领域已知以及本文所描述。
A.治疗癌症的方法
本文所描述的组合物和方法可用于一种治疗疾病的方法中。在一些实施方案中，其用于治疗成人患者或儿科患者中的过度增殖性病症，例如癌症。其还可用于治疗如本文和以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施方案中，过度增生病症为癌症。在一些实施方案中，过度增生病症为实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，实体肿瘤癌症选自由以下组成的组：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人类乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和宫颈腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、下咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC和小细胞肺癌)、黑素瘤(包括葡萄膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤、虹膜黑素瘤或转移性黑素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰腺癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨骼和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括间变性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方案中，过度增生病症为血液科恶性疾病。在一些实施方案中，血液科恶性疾病选自由以下组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症为血液科恶性疾病。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以下调PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH和CBL-B中的一者或多者的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症是血液科恶性疾病。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以下调PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH和CBL-BR中的一者或多者的MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症是血液科恶性疾病。
在一些实施方案中，所述癌症为前述癌症中的一者，包括实体肿瘤癌症和血液科恶性疾病，其对于用至少一种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的。在一些实施方案中，癌症对用至少两种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。在一些实施方案中，癌症对用至少三种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。
在一些实施方案中，所述癌症为微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)癌症。MSI-H和dMMR癌症和其检测已描述于Kawakami等人,Curr.Treat.OptionsOncol.2015,16,30中，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以下调PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中所述患者是人类。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以下调PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中所述患者是非人类。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以下调PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B中的一者或多者的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中所述患者是伴侣动物。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症难以用BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂治疗。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症难以用选自由以下组成的组的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、恩拉非尼(encorafenib)、索拉非尼(sorafenib)和其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症难以用选自由以下组成的组的MEK抑制剂治疗：曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、贝美替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹马色替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)和其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症难以用选自由以下组成的组的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼、达拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼和其药学上可接受的盐或溶剂化物；并且难以用选自由以下组成的组的MEK抑制剂治疗：曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、匹马色替尼、瑞法替尼和其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症是儿科癌症。
在一些实施方案中，本发明一种包括治疗患有癌症的患者的方法，其中所述癌症是葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述葡萄膜黑素瘤是脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤或虹膜黑素瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述儿科癌症是神经母细胞瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述儿科癌症是肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述肉瘤是骨肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述肉瘤是软组织肉瘤。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述软组织肉瘤是横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤或原始神经外胚层肿瘤(PNET)。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述儿科癌症是中枢神经系统(CNS)相关癌症。在一些实施方案中，儿科癌症难以用化学疗法治疗。在一些实施方案中，儿科癌症难以用放射疗法治疗。在一些实施方案中，儿科癌症难以用地努图希单抗(dinutuximab)治疗。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中所述CNS相关癌症为神经管胚细胞瘤、松果体母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤或神经胶母细胞瘤。
本文中所描述的组合物和方法可用于治疗癌症的方法，其中癌症难以用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗或对先前治疗具有抗性。在一些实施方案中，患者是抗PD-1或抗PD-L1抗体的原发性难治性患者。在一些实施方案中，患者未展示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应。在一些实施方案中，患者展示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应，接着患者的癌症进展。在一些实施方案中，癌症难以用抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1或抗PD-L1抗体与至少一种化学治疗剂的组合治疗。在一些实施方案中，先前化学治疗剂为卡铂、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)和/或顺铂。在一些先前实施方案中，化学治疗剂是铂双重化学治疗剂。在一些实施方案中，铂双重疗法包含选自由顺铂和卡铂组成的组的第一化学治疗剂，和选自由长春瑞滨(vinorelbine)、吉西他滨(gemcitabine)和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)或白蛋白结合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel))组成的组的第二化学治疗剂。在一些实施方案中，铂双重化学治疗剂与培美曲塞组合。
在一些实施方案中，NSCLC为PD-L1阴性和/或来自患有表达PD-L1并且肿瘤比例评分(TPS)<1％的癌症的患者，如本文别处所描述。
在一些实施方案中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中所述铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自由顺铂和卡铂组成的组，
ii)和第二化学治疗剂，其选自由以下组成的组：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)。
在一些实施方案中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体、培美曲塞和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中所述铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自由顺铂和卡铂组成的组，
ii)和第二化学治疗剂，其选自由以下组成的组：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型太平洋紫杉醇)。
在一些实施方案中，NSCLC已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC已用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者尚未接受治疗。在一些实施方案中，NSCLC尚未用抗PD-1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC尚未用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施方案中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗，但目前不再用所述化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者未经抗PD-1/PD-L1治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者具有低PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者未经NSCLC治疗或已接受化学治疗剂治疗，但未经PD-1/PD-L1治疗。在一些实施方案中，NSCLC患者未经治疗或已接受化学治疗剂治疗，但未经抗PD-1/PD-L1治疗并且具有低PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者在基线时患有大块疾病。在一些实施方案中，受试者在基线时患有大块疾病并且具有低PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者未经治疗或已接受化学治疗剂治疗，但未经抗PD-1/PD-L1治疗并且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，患者在基线时患有大块疾病并且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施方案中，NSCLC患者具有未经治疗的NSCLC或已接受化学疗法(例如，已接受化学治疗剂)，但未经抗PD-1/PD-L1治疗，并且所述患者具有低PD-L1表达和/或在基线时具有大块疾病。在一些实施方案中，当在横向或冠状面中测量的最大肿瘤直径大于7cm时指示为大块疾病。在一些实施方案中，当存在具有20mm或更大的短轴直径的肿胀淋巴结时指示为大块疾病。在一些实施方案中，化学治疗剂包括NSCLC的标准护理治疗剂。
在一些实施方案中，通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施方案中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方案中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有≥1％的TPS。在一些实施方案中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且在所述抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施方案中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且在所述抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施方案中，通过本发明的方法(包括如例如图1、图36或图8中所描述的那些方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1、图36或图8中示例的那些方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL表现出增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示对癌症治疗的治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1、图36或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
在一些实施方案中，使用如本文中所描述的一种或多种测试方法通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施方案中，患有NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方案中，NSCLC肿瘤具有≥1％的TPS。在一些实施方案中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施方案中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且在所述抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施方案中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施方案中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有≥1％的TPS。在一些实施方案中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并且在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施方案中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并且在所述抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施方案中，NSCLC是表现出肿瘤比例评分(TPS)的NSCLC，或在抗PD-1或抗PD-L1疗法之前从患者获取的活肿瘤细胞的百分比，在任何强度下显示部分或完全膜染色的PD-L1蛋白的百分比低于1％(TPS<1％)。在一些实施方案中，NSCLC为表现出选自由以下组成的组的TPS的NSCLC：<50％、<45％、<40％、<35％、<30％、<25％、<20％、<15％、<10％、<9％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.9％、<0.8％、<0.7％、<0.6％、<0.5％、<0.4％、<0.3％、<0.2％、<0.1％、<0.09％、<0.08％、<0.07％、<0.06％、<0.05％、<0.04％、<0.03％、<0.02％和<0.01％。在一些实施方案中，NSCLC为表现出选自由以下组成的组的TPS的NSCLC：约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％和约0.01％。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与1％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.9％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.8％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.7％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.6％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.5％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.4％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.3％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.2％之间的TPS的NSCLC。在一些实施方案中，NSCLC是表现出0％与0.1％之间的TPS的NSCLC。TPS可通过本领域中已知的方法测量，例如描述于Hirsch等人,J.Thorac.Oncol.2017,12,208-222中的方法或用于在使用派姆单抗或其他抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗之前测定TPS的方法。还可使用经美国食品药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准的用于测量TPS的方法。在一些实施方案中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施方案中，在循环肿瘤细胞上发现PD-L1。
在一些实施方案中，部分膜染色包括1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。在一些实施方案中，完整膜染色包括约100％膜染色。
在一些实施方案中，测试PD-L1可涉及测量患者血清中的PD-L1的水平。在这些实施方案中，患者血清中的PD-L1的测量消除了肿瘤异质性的不确定性和患者进行连续活检的不适。
在一些实施方案中，相较于基线或标准水平升高的可溶性PD-L1与NSCLC的恶化的预后相关。参见例如Okuma等人,Clinical Lung Cancer,2018,19,410-417；Vecchiarelli等人,Oncotarget,2018,9,17554-17563。在一些实施方案中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1在循环肿瘤细胞上表达。
在一些实施方案中，受试者或患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)，其特征在于以下中的至少一者：
i.PD-L1的预定肿瘤比例评分(TPS)<1％，
ii.PD-L1的TPS分数为1％-49％，或
iii.一个或多个驱动突变的预定缺失，
其中所述驱动突变选自由以下组成的组：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变。
在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的本文中所描述的治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的本文中所描述的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中在分别施用治疗有效剂量的本文中所描述的治疗性TIL群体和TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨(fludarabine)持续五天。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，所述方法还包括在向受试者施用TIL细胞之后第二天开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟推注型静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为实体肿瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为黑素瘤、转移性黑素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、转移性NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为黑素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为转移性黑素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为HNSCC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为宫颈癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为NSCLC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为转移性NSCLC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为胃肠癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的用于治疗患有本文中所描述的癌症的受试者的方法，其中癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文中所描述的治疗性TIL群体，其包括向所述受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文中所描述的TIL组合物，其包括向所述受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或本文中所描述的TIL组合物，其中在向受试者施用治疗有效剂量的本文中所描述的治疗性TIL群体或本文中所描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其还包含在向患者施用TIL细胞之后第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为实体肿瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为黑素瘤、转移性黑素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、转移性NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为黑素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为转移性黑素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为HNSCC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为宫颈癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为NSCLC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为转移性NSCLC。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为神经胶母细胞瘤。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为胃肠癌。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供了经修改的本文中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供了本文中所描述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，其包括向所述受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了前述段落中的任一者中所描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供本文中所描述的治疗性TIL群体或本文中所描述的TIL组合物在治疗患者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向患者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案，并且然后向受试者施用治疗有效剂量的前述段落中的任一者中所描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的本文中所描述的TIL组合物。
1.与PD-1和PD-L1抑制剂的组合
在一些实施方案中，向癌症患者提供的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗，或者可包括组合治疗，所述组合治疗包括TIL和一种或多种PD-1和/或PD-L1抑制剂。
程序性死亡1(PD-1)是由T细胞、B细胞、自然杀手(NK)T细胞、活化的单核细胞和树突状细胞表达的288个氨基酸的跨膜免疫检查点受体蛋白。PD-1，也称为CD279，属于CD28家族，并且在人类中是由2号染色体上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族域、跨膜区和细胞内域组成，所述细胞内域含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸切换基序(ITSM)。已知PD-1和其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受性中起重要作用，如Keir等人,Annu.Rev.Immunol.2008,26,677-704中所描述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)表达于肿瘤细胞和基质细胞上，其可能遇到表达PD-1的活化T细胞，导致对T细胞的免疫抑制。PD-L1是由人类9号染色体上的Cd274基因编码的290个氨基酸的跨膜蛋白。使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，可克服免疫抗性，如近期临床研究，例如Topalian等人,N.Eng.J.Med.2012,366,2443-54中所描述的研究所显示。PD-L1表达于许多肿瘤细胞系上，而PD-L2表达于主要地表达于树突状细胞和一些肿瘤系上。除T细胞(其在激活后诱导性表达PD-1)以外，PD-1还表达于B细胞、自然杀手细胞、巨噬细胞、活化的单核细胞和树突状细胞上。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂可为本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。特别是，其为在以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。关于PD-1抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-1抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-1抑制剂时还可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为多克隆抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。在一些实施方案中，抗体竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，所述PD-1抑制剂以约100pM或更低的KD结合人类PD-1、以约90pM或更低的KD结合人类PD-1、以约80pM或更低的KD结合人类PD-1、以约70pM或更低的KD结合人类PD-1、以约60pM或更低的KD结合人类PD-1、以约50pM或更低的KD结合人类PD-1、以约40pM或更低的KD结合人类PD-1、以约30pM或更低的KD结合人类PD-1、以约20pM或更低的KD结合人类PD-1、以约10pM或更低的KD结合人类PD-1，或以约1pM或更低的KD结合人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，所述PD-1抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1、以约7.5×1051/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1、以约8×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1、以约9×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1、以约9.5×105l/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1，或以约1×106l/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，所述PD-1抑制剂以约2×10-51/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1，或以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.8×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.9×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1，或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，所述PD-1抑制剂以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合，或以约1nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗(可从Bristol-Myers Squibb公司以OPDIVO购得)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗为阻断PD-1受体的完全人类IgG4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体为免疫球蛋白G4κ抗(人类CD274)抗体。纳武单抗被指定化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4并且也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武单抗的制备和特性描述于美国专利第8,008,449号和国际专利公开第WO 2006/121168号中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。纳武单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已描述于Wang等人,Cancer Immunol.Res.2014,2,846-56；Page等人,Ann.Rev.Med.,2014,65,185-202；和Weber等人,J.Clin.Oncology,2013,31,4311-4318中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。纳武单抗的氨基酸序列阐述于表18中。纳武单抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”和360”-418”处具有重链内二硫键；在23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处具有轻链内二硫键；在127-214'、127”-214”'处具有重链-轻链间二硫键；在219-219”和222-222”处具有重链-重链间二硫键；并且在290、290”处具有N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO:158所提供的重链和SEQ ID NO:159所提供的轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:158和SEQ IDNO:159中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:463和SEQ ID NO:159中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含纳武单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:160中所示的序列，并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:161中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:160和SEQ ID NO:161中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:167中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为药物监管机构参考纳武单抗核准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为纳武单抗。抗PD-1抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为纳武单抗。
表18.与纳武单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，并且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用纳武单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑素瘤，并且每2周以约240mg进行施用。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑素瘤，并且每4周以约480mg进行施用。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑素瘤，并且每3周在同一天施用约1mg/kg纳武单抗，接着施用3mg/kg伊匹单抗，持续4次剂量，然后每2周施用240mg或每4周施用480mg纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以辅助治疗黑素瘤。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以辅助治疗黑素瘤。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以辅助治疗黑素瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗并且每6周以约1mg/kg施用伊匹单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每3周以约360mg施用纳武单抗，加上每6周1mg/kg伊匹单抗与2个周期的含铂双重化学疗法，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg或每4周以480mg施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，每3周以约360mg施用纳武单抗并且每6周施用1mg/kg伊匹单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，以约3mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹单抗达4次剂量，然后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，以约3mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹单抗达4次剂量，然后每2周施用240mg、每4周施用480mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗成人和儿科患者中的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和儿科患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和儿科患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗以治疗<40kg的儿科患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，以约3mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天施用1mg/kg伊匹单抗达4次剂量，然后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和儿科患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，以约3mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天施用1mg/kg伊匹单抗达4次剂量，然后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和儿科患者的微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，以约1mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天施用3mg/kg伊匹单抗达4次剂量，然后每2周施用纳武单抗240mg，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，以约1mg/kg施用纳武单抗，接着每3周在同一天施用3mg/kg伊匹单抗达4次剂量，然后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含派姆单抗(可从美国新泽西州凯尼尔沃思(Kenilworth,NJ,USA)的默克公司以KEYTRUDA购得)或其抗原结合片段、缀合物或变体。派姆单抗被指定CAS登记号1374853-91-4并且也称为兰立珠单抗、MK-3475和SCH-900475。派姆单抗具有免疫球蛋白G4抗(人类蛋白PDCD1(程序性细胞死亡1))抗体，含(人类-小家鼠单克隆重链)二硫键与人类-小家鼠单克隆轻链二聚体结构。派姆单抗的结构还可描述为免疫球蛋白G4抗(人类程序性细胞死亡1)抗体；含人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')二硫键与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)双二硫键。派姆单抗的特性、用途和制备描述于国际专利公开第WO 2008/156712 A1号、美国专利第8,354,509号以及美国专利申请公开第US2010/0266617 A1号、第US2013/0108651A1号和第US2013/0109843 A2号中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。派姆单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效描述于Fuerst,Oncology Times,2014,36,35-36；Robert等人,Lancet,2014,384,1109-17；和Thomas等人,Exp.Opin.Biol.Ther.,2014,14,1061-1064中。派姆单抗的氨基酸序列阐述于表19中。派姆单抗包括以下二硫桥键：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425和367”-425”；以及以下糖基化位点(N)：Asn-297和Asn-297”。派姆单抗为在Fc区中含稳定化S228P突变的IgG4/κ同种型；IgG4铰链区中这种突变的插入防止形成IgG4抗体通常观测到的半分子。派姆单抗在每条重链的Fc域内在Asn297处异质糖基化，使得完整抗体的分子量为大约149kDa。派姆单抗的主要糖型为岩藻糖基化去半乳糖基双触角聚糖形式(G0F)。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO:168所提供的重链和SEQ ID NO:169所提供的轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:168和SEQ IDNO:169中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含派姆单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:170中所示的序列，并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:171中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:170和SEQ ID NO:171中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:177中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为药物监管机构参考派姆单抗核准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为派姆单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为派姆单抗。抗PD-1抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为派姆单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为派姆单抗。
表19.与派姆单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为派姆单抗或其生物类似物，并且派姆单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为派姆单抗或其生物类似物，并且派姆单抗是以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为派姆单抗或其生物类似物，其中派姆单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为派姆单抗或其生物类似物，并且纳武单抗是以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为派姆单抗或其生物类似物，其中每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用派姆单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗黑素瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗SCLC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗SCLC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，施用派姆单抗以治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗HNSCC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗HNSCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用派姆单抗以治疗典型霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用派姆单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷结直肠癌(dMMR CRC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗胃癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗胃癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗食道癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗食道癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗宫颈癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗宫颈癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗HCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，成人每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma；MCC)。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗MCC。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用派姆单抗以治疗MCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗并且每天两次经口施用阿西替尼5mg以治疗RCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗子宫内膜癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗并且每天一次经口施用用于非MSI-H或dMMR肿瘤的乐伐替尼(lenvatinib)20mg以治疗子宫内膜癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，成人每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用派姆单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗cSCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用派姆单抗以治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用派姆单抗以治疗TNBC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，如果患者或受试者为成人，即治疗成人适应症，则可采用另外的每6周400mg的给药方案。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始派姆单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周施用派姆单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周施用派姆单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为可购得的抗PD-1单克隆抗体，例如抗m-PD-1克隆J43(目录号BE0033-2)和RMP1-14(目录号BE0146)(美国新罕布什尔州西黎巴嫩的Bio XCell公司)。多种可购得的抗PD-1抗体是本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是公开于美国专利第8,354,509号或美国专利申请公开第2010/0266617A1号、第2013/0108651A1号、第2013/0109843A2号中的抗体，所述文献的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是描述于美国专利第8,287,856号、第8,580,247号和第8,168,757号以及美国专利申请公开第2009/0028857A1号、第2010/0285013A1号、第2013/0022600A1号和第2011/0008369A1号中的抗PD-1抗体，所述文献的教导内容特此通过引用并入。在其他实施方案中，PD-1抑制剂是公开于美国专利第8,735,553B1号中的抗PD-1抗体，所述专利的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为皮立珠单抗，也称为CT-011，其描述于美国专利第8,686,119号中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂可为小分子或肽或肽衍生物，例如美国专利第8,907,053号、第9,096,642号和第9,044,442号以及美国专利申请公开第US2015/0087581号中所描述的那些；1,2,4-噁二唑化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0073024号中所描述的那些；环状肽模拟化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0073042号中所描述的那些；环状化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0125491中所描述的那些；1,3,4-噁二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/033301号中所描述的那些；基于肽的化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/036927号和第WO 2015/04490号中所描述的那些；或基于肽的巨环化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2014/0294898号中所描述的那些；所述专利中的每一者的公开内容特此通过引用整体并入。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是西米普利单抗(cemiplimab)，其可购得自Regeneron公司。
在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂可为本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。特别是，其为在以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。关于PD-L1和PD-L2抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-L1或PD-L2抑制剂时还可指代化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物、过程和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为小分子。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为多克隆抗体。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争结合PD-L1或PD-L2和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。在一些实施方案中，抗体竞争结合PD-L1或PD-L2，和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。
在一些实施方案中，本文中提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具选择性，因为化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度相比其与包括PD-L2受体的其他受体结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施方案中，化合物以如下结合常数结合至PD-L1受体，所述结合常数为相比结合至PD-L2受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
在一些实施方案中，本文中提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具选择性，因为化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度相比其与包括PD-L1受体的其他受体结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施方案中，化合物以如下结合常数结合至PD-L2受体，所述结合常数为相比结合至PD-L1受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
不受任何理论束缚，据认为肿瘤细胞表达PD-L1，并且T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞对PD-L1的表达不为PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效所需。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达PD-L1。在其他实施方案中，肿瘤细胞并不表达PD-L1。在一些实施方案中，方法可包括PD-1和PD-L1抗体(例如本文中所描述的PD-1和PD-L1抗体)与TIL的组合。可同时或依序施用PD-1和PD-L1抗体与TIL的组合。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，所述PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约100pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约90pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约80pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约70pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约60pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约50pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约40pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2，或以约30pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，所述PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约7.5×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2、以约8×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2、以约8.5×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2、以约9×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2、以约9.5×105 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2，或以约1×106 1/M·s或更快的k缔合结合于人类PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，所述PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-L1或PD-L2、以约2.1×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.4×10-51/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-1、以约2.7×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-L1或PD-L2，或以约3×10-5 1/s或更慢的k解离结合于人类PD-L1或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，所述PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合，或以约1nM或更低的IC50阻断人类PD-1或阻断人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736(其可从马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,Maryland)的Medimmune,LLC(AstraZeneca plc的子公司)购得)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,779,108号或美国专利申请公开第2013/0034559号中的抗体，所述文献的公开内容通过引用并入本文。德瓦鲁单抗的临床功效已描述于Page等人,Ann.Rev.Med.,2014,65,185-202；Brahmer等人,J.Clin.Oncol.2014,32,5s(增刊，摘要8021)；和McDermott等人,CancerTreatment Rev.,2014,40,1056-64中。德瓦鲁单抗的制备和特性描述于美国专利第8,779,108号中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。德瓦鲁单抗的氨基酸序列阐述于表20中。德瓦鲁单抗单克隆抗体包括22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429和371”-429'处的二硫键；以及Asn-301和Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO:178所提供的重链和SEQ ID NO:179所提供的轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO:178和SEQ ID NO:179中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含德瓦鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:180中所示的序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:181中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:180和SEQ ID NO:181中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ IDNO:181中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为药物监管机构参考德瓦鲁单抗核准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。
表20.与德瓦鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可从MerckKGaA/EMD Serono购得)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2014/0341917 A1号中，其公开内容特别通过引用并入本文。阿维鲁单抗的氨基酸序列阐述于表21中。阿维鲁单抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”和370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22”'-90”'和138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；223-215'和223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；229-229”和232-232”处的重链-重链内二硫键(h11，h 14)；300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合物双触角CHO类聚糖；以及450和450'处的H CHS K2 C端赖氨酸裁剪。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO:188所提供的重链和SEQ ID NO:189所提供的轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:188和SEQ IDNO:189中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ IDNO:189中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO:188和SEQ ID NO:189中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:190中所示的序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:191中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:190和SEQ ID NO:191中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQIDNO:191中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为药物监管机构参考阿维鲁单抗核准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。
表21.与阿维鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为阿特珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(其可从瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland)的Genentech公司(Roche Holding AG的子公司)以TECENTRIQ购得)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,217,149号中的抗体，所述专利的公开内容特别通过引用并入本文。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利申请公开第2010/0203056A1号、第2013/0045200A1号、第2013/0045201A1号、第2013/0045202A1号或第2014/0065135A1号中的抗体，所述文献的公开内容特别通过引用并入本文。阿特珠单抗的制备和特性描述于美国专利第8,217,149号中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。阿特珠单抗的氨基酸序列阐述于表22中。阿特珠单抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”和368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；221-214'和221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；227-227”和230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；以及298和298'处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4>A)。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO:198所提供的重链和SEQ ID NO:199所提供的轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:198和SEQ IDNO:199中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ IDNO:199中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO:198和SEQ ID NO:199中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含阿特珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:200中所示的序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:201中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQID NO:200和SEQ ID NO:201中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ IDNO:201中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:200和SEQ IDNO:201中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体为药物监管机构参考阿特珠单抗核准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，所述抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为阿特珠单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中所述抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为阿特珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为阿特珠单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为阿特珠单抗。
表22.与阿特珠单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包括美国专利申请公开第US 2014/0341917 A1号中所描述的那些抗体，所述文献的公开内容通过引用并入本文。在其他实施方案中，还包括与这些抗体中的任一者竞争结合至PD-L1的抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体为MDX-1105，也称为BMS-935559，其公开于美国专利第US 7,943,743号中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利第US 7,943,743号中的抗PD-L1抗体，所述专利通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为可购得的单克隆抗体，例如INVIVOMAB抗m-PD-L1克隆10F.9G2(目录号BE0101，美国新罕布什尔州西黎巴嫩的Bio X Cell公司)。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体为可购得的单克隆抗体，例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多种可购得的抗PD-L1抗体是本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，PD-L2抑制剂为可购得的单克隆抗体，例如BIOLEGEND24F.10C12小鼠IgG2a，κ同种型(目录号329602，加利福尼亚圣地亚哥的Biolegend公司)、SIGMA抗PD-L2抗体(目录号SAB3500395，密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司)或本领域普通技术人员已知的其他可购得的抗PD-L2抗体。
2.与CTLA-4抑制剂的组合
在一些实施方案中，提供给癌症患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗，或者可包括组合治疗，包括TIL和一种或多种CTLA-4抑制剂。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族成员并且表达于辅助T细胞表面上。CTLA-4为CD28依赖性T细胞激活的负向调节因子并且充当适应性免疫反应的检查点。类似于T细胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4结合抗原在细胞上呈递CD80和CD86。CTLA-4将抑制因子信号递送至T细胞，而CD28递送刺激信号。针对人类CTLA-4的人类抗体已描述为许多疾病状况的免疫刺激调节剂，例如治疗或预防病毒和细菌感染并且治疗癌症(WO 01/14424和WO 00/37504)。已在临床试验中研究了多种完全人类抗人类CTLA-4单克隆抗体(mAb)，用于治疗各种类型的实体肿瘤，所述抗体包括(但不限于)伊匹单抗(MDX-010)和曲美木单抗(CP-675,206)。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂可为本领域已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。特别是，其为在以下段落中更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。关于CTLA-4抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的CTLA-4抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及CTLA-4抑制剂时还可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。
适用于本发明的方法的CTLA-4抑制剂包括(但不限于)抗CTLA-4抗体、人类抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹单抗)、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激动共刺激途径的CTLA-4抑制剂、公开于PCT公开第WO 2001/014424号中的抗体、公开于PCT公开第WO 2004/035607号中的抗体、公开于美国公开第2005/0201994号中的抗体和公开于授与欧洲专利第EP 1212422 B1号中的抗体，所述专利中的每一者的公开内容通过引用并入本文。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号中；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号中；以及美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号中，所述文献中的每一者的公开内容通过引用并入本文。可用于本发明方法中的其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,J.Clin.Oncology,22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,Cancer Res.,58:5301-5304(1998)；以及美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，所述文献中的每一者的公开内容通过引用并入本文。
另外的CTLA-4抑制剂包括(但不限于)以下：通常由于被激活而能够破坏CD28抗原结合至其同源配体的能力、抑制CTLA-4结合至其同源配体的能力、增强经由共刺激途径的T细胞反应、破坏B7结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏B7激活共刺激途径的能力、破坏CD80结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD80激活共刺激途径的能力、破坏CD86结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD86激活共刺激途径的能力和破坏共刺激途径的任何抑制剂。这必定包括：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激途径的其他成员的RNAi抑制剂(单链和双链)；以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂以如下Kd结合于CTLA-4，所述Kd为约10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小，例如10-13M与10-16M之间，或在任两个前述值作为端点的任何范围内。在一些实施方案中，当使用相同测定比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd不超过伊匹单抗的Kd的10倍。在一些实施方案中，当使用相同测定比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd与伊匹单抗的Kd大致相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些实施方案中，当使用相同测定比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值高不超过10倍。在一些实施方案中，当使用相同测定比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值大致相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些实施方案中，以如下量使用CTLA-4抑制剂，所述量足以相对于适合的对照将CTLA-4的表达抑制和/或使CTLA-4的生物活性降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如50％与75％、75％与90％、或90％与100％之间。在一些实施方案中，以如下量使用CTLA-4途径抑制剂，所述量足以通过使CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合相对于适合的对照减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于适合的对照减少50％与75％、75％与90％、或90％与100％之间来降低CTLA-4的生物活性。在评估或量化所关注的药剂的效应的上下文中的适合对照通常为尚未暴露于所关注的药剂(例如CTLA-4途径抑制剂)或用所述药剂处理的相当的生物系统(例如细胞或受试者)(或已暴露于可忽略量或用可忽略量进行处理)。在一些实施方案中，生物系统可充当其自身的对照，例如可在暴露于药剂或用药剂处理之前评估生物系统并与开始或结束暴露或处理之后的状态进行比较。在一些实施方案中，可使用历史对照。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗(可从Bristol-Myers Squibb公司以Yervoy购得)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹单抗是指抗CTLA-4抗体，一种来源于具有编码重链和轻链的人类基因以产生功能性人类谱系的转基因小鼠的完全人类IgG 1κ抗体。伊匹单抗也可通过其CAS登记号477202-00-9和在PCT公开第WO 01/14424号中提及，所述公开出于所有目的通过引用整体并入。其以抗体10DI的形式公开。特定而言，伊匹单抗含有轻链可变区和重链可变区(具有包含SEQ ID NO:211的轻链可变区并且具有包含SEQ ID NO:210的重链可变区)。伊匹单抗的药物组合物包括含有伊匹单抗和一种或多种稀释剂、媒介物或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹单抗的药物组合物的实例描述于国际专利申请公开第WO 2007/67959号中。伊匹单抗可经静脉内(IV)施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO:208所提供的重链和SEQ IDNO:209所提供的轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:210中所示的序列，并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:211中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQID NO:210和SEQ ID NO:211中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQID NO:211中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为药物监管机构参考伊匹单抗核准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为伊匹单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。伊匹单抗的氨基酸序列阐述于表23中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为伊匹单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为伊匹单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为伊匹单抗。
表23.伊匹单抗的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或其生物类似物，其中伊匹单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或其生物类似物，并且伊匹单抗是以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或其生物类似物，并且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用伊匹单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗不可切除性或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，每3周以约mg/kg施用伊匹单抗，持续最多4次剂量以治疗不可切除性或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以辅助治疗黑素瘤。在一些实施方案中，每3周以约10mg/kg施用伊匹单抗，持续4次剂量，接着每12周施用10mg/kg，持续至多3年，以辅助治疗黑素瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约1mg/kg施用伊匹单抗，紧接着在同一天施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，在完成组合的4次剂量之后，可根据标准给药方案针对晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌以单一药剂形式施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，每3周经30分钟以约1mg/kg静脉内施用伊匹单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌。在一些实施方案中，在完成组合物的4次剂量之后，如根据标准给药方案所推荐针对微卫星高不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌以单一药剂形式施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每3周经30分钟以约3mg/kg静脉内施用伊匹单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用1mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，在完成组合的4次剂量之后，根据标准给药方案针对肝细胞癌以单一药剂形式施用纳武单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹单抗并且每2周施用3mg/kg纳武单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹单抗，加上每3周360mg纳武单抗与2个周期的含铂双重化学疗法，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹单抗并且每3周施用360mg纳武单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始伊匹单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始伊匹单抗施用。
曲美木单抗(也称为CP-675,206)为完全人类IgG2单克隆抗体并且CAS编号为745013-59-6。曲美木单抗以抗体11.2.1形式公开于美国专利第6,682,736号(通过引用并入本文)中。曲美木单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别阐述于SEQ IND NO:218和219中。已在临床试验中针对治疗包括黑素瘤和乳腺癌的各种肿瘤研究了曲美木单抗；其中每4或12周以0.01与15mg/kg之间的剂量范围呈单次剂量或多次剂量静脉内施用曲美木单抗。在本发明提供的方案中，局部施用，特别是皮内或皮下施用曲美木单抗。皮内或皮下施用的曲美木单抗的有效量通常在每人5-200毫克/剂的范围内。在一些实施方案中，曲美木单抗的有效量在每人每剂10-150毫克/剂的范围内。在一些特定实施方案中，曲美木单抗的有效量为每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO:218所提供的重链和SEQ IDNO:219所提供的轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含曲美木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:220中所示的序列，并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:221中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:224中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为药物监管机构参考曲美木单抗核准的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为曲美木单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。曲美木单抗的氨基酸序列阐述于表24中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为曲美木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为曲美木单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为曲美木单抗。
表24.曲美木单抗的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，其中曲美木单抗是以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，并且曲美木单抗是以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，并且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用曲美木单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在从受试者或患者获得肿瘤样品之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为来自Agenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗为完全人类单克隆抗体。泽弗利单抗被指定化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9并且也称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备和特性描述于美国专利第10,144,779号和美国专利申请公开第US2020/0024350A1号中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO:228所提供的重链和SEQ IDNO:229所提供的轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含泽弗利单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:230中所示的序列，并且CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:231中所示的序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231中所示的序列至少99％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231中所示的序列至少98％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231中所示的序列至少97％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231中所示的序列至少96％同一的VH区和VL区。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231中所示的序列至少95％同一的VH区和VL区。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233和SEQ ID NO:234中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3域；以及分别具有SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236和SEQ ID NO:237中所阐述的序列或其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3域。在一些实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为药物监管机构参考泽弗利单抗核准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施方案中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，所述抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施方案中，一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。泽弗利单抗的氨基酸序列阐述于表25中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物监管机构如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施方案中，生物类似物提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。
表25.泽弗利单抗的氨基酸序列。
另外的抗CTLA-4抗体的实例包括(但不限于)：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659和ADG116，其为本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体为公开于以下专利公开中的任一者中的抗CTLA-4抗体：US2019/0048096 A1；US2020/0223907；US2019/0201334；US2019/0201334；US2005/0201994；EP 1212422B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO2006/12168；和WO1997020574，其中的每一者通过引用并入本文。另外的CTLA-4抗体描述于以下中：美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号；以及美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号；和/或美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，其中的每一者通过引用并入本文。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体为例如公开于以下中的那些抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,10067-10071(1998)；Camacho等人,J.Clin.Oncol.,2004,22,145(摘要第2505号(2004)(抗体CP-675206)；或Mokyr等人,Cancer Res.,1998,58,5301-5304(1998)，其中的每一者通过引用并入本文。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为如WO 1996/040915(通过引用并入本文)中所公开的CTLA-4配体。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为CTLA-4表达的核酸抑制剂。例如，抗CTLA-4RNAi分子可呈描述于以下的分子的形式：PCT公开第WO 1999/032619号和第WO 2001/029058号；美国公开第2003/0051263号、第2003/0055020号、第2003/0056235号、第2004/265839号、第2005/0100913号、第2006/0024798号、第2008/0050342号、第2008/0081373号、第2008/0248576号和第2008/055443号；和/或美国专利第6,506,559号、第7,282,564号、第7,538,095号和第7,560,438号(通过引用并入本文)。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在欧洲专利第EP 1309726号(通过引用并入本文)中描述的双链RNAi分子形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在美国专利第7,056,704号和第7,078,196号(通过引用并入本文)中描述的双链RNAi分子形式。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为国际专利申请公开第WO2004/081021号(通过引用并入本文)中所描述的适体。
在其他实施方案中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子为在美国专利第5,898,031号、第6,107,094号、第7,432,249号和第7,432,250号以及欧洲申请第EP 0928290号(通过引用并入本文)中描述的RNA分子。
3.患者的淋巴细胞耗竭预调节
在一些实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的TIL之前经非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，本发明包括用于治疗已用非清髓性化学疗法预治疗的患者的癌症的TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体是通过输注施用。在一些实施方案中，非清髓性化学疗法为环磷酰胺60mg/kg/d持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施方案中，在根据本公开的非清髓性化学疗法和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN购得)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施方案中，TIL群体用于与IL-2组合治疗癌症，其中IL-2是在TIL群体之后施用。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞并且竞争免疫系统的元件(‘细胞因子库’)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
一般而言，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式被称为马磷酰胺)和其组合的施用实现淋巴细胞耗竭。此类方法描述于Gassner等人,Cancer Immunol.Immunother.2011,60,75-85；Muranski等人,Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668-681；Dudley等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-5239和Dudley等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-2357中，所有所述文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，氟达拉滨是以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨是以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，施用氟达拉滨治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，氟达拉滨是以10毫克/千克/天、15毫克/千克/天、20毫克/千克/天、25毫克/千克/天、30毫克/千克/天、35毫克/千克/天、40毫克/千克/天或45毫克/千克/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35毫克/千克/天施用2-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35毫克/千克/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以25毫克/千克/天施用4-5天。
在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施方案中，施用环磷酰胺治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，环磷酰胺是以100毫克/平方米/天、150毫克/平方米/天、175毫克/平方米/天、200毫克/平方米/天、225毫克/平方米/天、250毫克/平方米/天、275毫克/平方米/天或300毫克/平方米/天的剂量施用。在一些实施方案中，环磷酰胺是经静脉内(即i.v.)施用。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以35毫克/千克/天施用2-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250毫克/平方米/天静脉内施用4-5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250毫克/平方米/天静脉内施用4天。
在一些实施方案中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用给患者进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方案中，经4天以25毫克/平方米/天静脉内施用氟达拉滨并且以250毫克/平方米/天静脉内施用环磷酰胺。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天和以约25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天和以约15毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施方案中，环磷酰胺是与美司钠一起施用。在一些实施方案中，美司钠是以15mg/kg施用。在一些实施方案中，输注美司钠，并且如果连续输注，则历经24小时，伴随各自环磷酰胺剂量开始，美司钠可经大约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，然后在剩余22小时以3毫克/千克/小时的速率输注。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：始于在向患者施用第三TIL群体之后第二天，用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：始于向患者施用第三TIL群体当天，用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭包含5天的预调节治疗。在一些实施方案中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺是与美司钠一起施用。在一些实施方案中，所述方案还包含氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续一天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表26施用。
表26.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨25毫克/平方米/天 | X | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表27施用。
表27.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | |||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | |||||||
| 氟达拉滨25毫克/平方米/天 | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表28施用。
表28.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||
| 氟达拉滨25毫克/平方米/天 | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表29施用。
表29.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨25毫克/平方米/天 | X | X | X | |||||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表30施用。
表30.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨30毫克/平方米/天 | X | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表31施用。
表31.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | |||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | |||||||
| 氟达拉滨30毫克/平方米/天 | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表32施用。
表32.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||
| 氟达拉滨30毫克/平方米/天 | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案是根据表33施用。
表33.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨30毫克/平方米/天 | X | X | X | |||||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，与上述清髓性淋巴细胞耗竭方案实施方案一起使用的TIL输注可为本文中所述的任何TIL组合物，以及添加IL-2方案和施用如本文中所述的联合疗法(例如PD-1和PD-L1抑制剂)。
4.IL-2方案
在一些实施方案中，IL-2方案包含高剂量IL-2方案，其中高剂量IL-2方案包含阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性TIL群体的治疗有效部分之后第二天开始静脉内施用，其中阿地白介素或其生物类似物或变体是每八小时使用15分钟推注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最多为14个剂量。在休止9天后，可重复此时程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施方案中，IL-2是以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施方案中，IL-2是以至多6次剂量的最大剂量施用。
在一些实施方案中，IL-2方案包含递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人,J.Clin.Oncol.1999,17,2752-61和Eton等人,Cancer 2000,88,1703-9，所述文献的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，递减IL-2疗法包含经6小时静脉内施用18×106IU/m2，接着经12小时静脉内施用18×106IU/m2，接着经24小时静脉内施用18×106IU/m2，接着经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体。此治疗周期可每28天重复，达最多四个周期。在一些实施方案中，递减IL-2方案包含第1天18,000,000IU/m2，第2天9,000,000IU/m2以及第3天和第4天4,500,000IU/m2。
在一些实施方案中，IL-2方案包含低剂量IL-2方案。可使用本领域中已知的任何低剂量IL-2方案，包括Dominguez-Villar和Hafler,Nat.Immunology 2000,19,665-673；Hartemann等人,Lancet Diabetes Endocrinol.2013,1,295-305；和Rosenzwaig等人,Ann.Rheum.Dis.2019,78,209-217中所描述的低剂量IL-2方案，所述文献的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，低剂量IL-2方案包含每24小时18×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体，以连续输注形式施用5天；接着2-6天不施用IL-2疗法；任选地接着以每24小时连续输注18×106IU/m2的形式再静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体5天；任选地接着3周不施用IL-2疗法，然后可施用其他周期。
在一些实施方案中，IL-2是以至多6次剂量的最大剂量施用。在一些实施方案中，高剂量IL-2方案经改适用于儿科用途。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为600,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为400,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为300,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为200,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8-12小时剂量为100,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。
在一些实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。在一些实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用贝培阿地白介素或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用THOR-707或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施方案中，IL-2方案包含在施用TIL之后施用奈沃白介素α或其片段、变体或生物类似物。在某些实施方案中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量向患者施用奈沃白介素。
在一些实施方案中，IL-2方案包含施用移植到抗体主链上的IL-2片段。在一些实施方案中，IL-2方案包含施用结合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子移植蛋白。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植到VH或VL的CDR中，其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植到VH或VL的CDR中，其中所述IL-2分子为突变蛋白，并且其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用抗体或其片段、变体或生物类似物，所述抗体包含选自由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:38组成的组的重链和选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39组成的组的轻链。
在一些实施方案中，本文中所描述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。
在一些实施方案中，与清髓性淋巴细胞耗竭方案的前述实施方案一起使用的TIL输注可为本文中所描述的任何TIL组合物并且还可包括代替TIL输注的MIL和PBL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文中所描述的联合疗法(例如PD-1和/或PD-L1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)。
实施方案
本文提供了用于扩增TIL和产生治疗性TIL群体的方法，所述方法包括用于对TIL的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗功效的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8-9天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8-10天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约11天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约12天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约13天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约14天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过以下来进行：在第二细胞培养基中培养第四TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约1天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约2天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28珠粒激动剂或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(f)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(g)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约8-9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约8-10天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约11天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约12天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约13天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约14天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤是通过以下来进行：在第二细胞培养基中培养第三TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约1天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约2天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(e)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(f)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第三TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8-9天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约8-10天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约11天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约12天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约13天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约14天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤进行约15天。
在一些实施方案中，培养第四TIL群体的步骤是通过以下来进行：在第三细胞培养基中培养第四TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第四培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约1天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约2天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(f)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(g)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，培养多个继代培养物的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，在第一培养基中培养第一TIL群体的步骤中，第一培养基还包含抗CD3和抗CD28珠粒或抗体。
在一些实施方案中，抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含第一培养基中的OKT-3。
在一些实施方案中，在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤中，第二培养基还包含抗CD3和抗CD28珠粒或抗体。
在一些实施方案中，抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含第二培养基中的OKT-3。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化肿瘤片段以产生肿瘤消化物；
(c)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(d)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化肿瘤片段以产生肿瘤消化物；
(c)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(d)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(e)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约1天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约2天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约3天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约4天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约5天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约6天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约7天。
在一些实施方案中，所述启始第一扩增进行约8天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，所述快速第二扩增进行约9天。
在一些实施方案中，所述快速第二扩增进行约10天。
在一些实施方案中，通过在第二细胞培养基中培养第三或第四TIL群体约1-7天的第一时段来进行快速第二扩增，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3-6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约1天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约2天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所述第一培养时段为约7天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约3天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约4天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约5天。
在一些实施方案中，所述第二培养时段为约6天。
在一些实施方案中，所有步骤在约16-18天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约16天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约17天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约18天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约18-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约21天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约23天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约24天的时段内完成。
在一些实施方案中，所述第一培养基包含APC。
在一些实施方案中，所述第二培养基中的APC的数目大于所述第一培养基中的APC的数目。
在一些实施方案中，所述第一培养基包含OKT-3。
在一些实施方案中，在初始扩增步骤中，所述第一培养基还包含抗CD3和抗CD28珠粒或抗体。
在一些实施方案中，所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含OKT-3。
在一些实施方案中，所述经扩增数目的TIL包含治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤组织添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或CD3激动剂和CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第五TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(f)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(b)至(f)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变、从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变和/或从步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，本文提供了一种将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在酶介质中消化肿瘤组织样品以产生肿瘤消化物；
(c)将所述肿瘤消化物添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得第二TIL群体；
(d)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或CD3激动剂和CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(f)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第五TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(g)收集从步骤(f)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(c)至(g)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变、从步骤(e)至步骤(f)的转变和/或从步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，所述酶介质包含DNA酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含胶原酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含中性蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶介质包含透明质酸酶。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约3天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约4天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约5天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约6天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约7天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约8天。
在一些实施方案中，所述第一扩增进行约9天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施方案中，激活第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约5天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约6天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约7天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约8天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约9天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约8-9天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约10天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约8-10天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约11天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约12天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约13天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约14天。
在一些实施方案中，所述第二扩增进行约15天。
在一些实施方案中，所述第二扩增是通过以下步骤来进行：
(i)在第二培养基中培养第四TIL群体约5天的第一时段，
(ii)将步骤(i)的培养物细分为多个继代培养物，其中所述多个继代培养物各自转移到提供第三透气表面的单独的密闭容器并且在包含IL-2的第三培养基中培养约4或5天的第二时段，其中从步骤(i)至步骤(ii)的转变在不开放所述系统的情况下进行，以及
(iii)将多个继代培养物合并以产生第五TIL群体，其中从步骤(ii)至步骤(iii)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
在一些实施方案中，所有步骤在约22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约19-20天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约20-22天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约23天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约24天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约25天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约26天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约27天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约28天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约29天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约30天的时段内完成。
在一些实施方案中，所有步骤在约31天的时段内完成。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少两种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤由介导至少两种基因编辑器转移的单个电穿孔事件组成。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤中至少两种基因编辑器中的每一者是通过电穿孔事件独立于任何其他基因编辑器的转移而单独转移。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤还包括每个电穿孔事件后的静息期。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括介导第一基因编辑器转移以调节第一蛋白质表达的第一电穿孔事件、第一静息期、介导第二基因编辑器转移以调节第二蛋白质表达的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约1至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约10小时至1天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约12小时至24小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约15小时至约18小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
在一些实施方案中，所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括介导第一TALE核酸酶系统转移的第一电穿孔事件、第一静息期、介导第二TALE核酸酶系统转移的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约1至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约10小时至1天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约12小时至24小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约15小时至约18小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
在一些实施方案中，所述基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶系统调节PD-1、CTLA-4、CISH、CBL-B、TIGIT和/或LAG-3的表达。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息的步骤。
在一些实施方案中，所述静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息约一天的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息约12小时至24小时的步骤。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括使第三或第四TIL群体静息约15小时至18小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括使第三或第四TIL群体静息约15小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在约30℃下将第三或第四TIL群体温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自由PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B组成的组，条件是第一蛋白质与第二蛋白质不同。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为TIGIT并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一基因编辑器下调第一蛋白质的表达并且所述第二基因编辑器下调第二蛋白质的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(e)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(f)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(e)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(d)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(e)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(d)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体，以产生肿瘤消化物；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天，以产生第四TIL群体的培养物；以及
(e)将所述第四TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天以产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(f)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3天，以产生第二TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养所述第二TIL群体2-4天以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天，以产生第五TIL群体的培养物；以及
(e)使所述第五TIL群体的培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天，并且将所述多个继代培养物合并以提供包含经扩增数目的TIL的第五TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对从患者或受试者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(b)使用抗CD3和抗CD28珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)，以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物来获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)，以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约1至8天的时段；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
在一些实施方案中，通过在第二细胞培养基中培养第三或第四TIL群体约1-7天的第一时段来进行快速第二扩增，在所述第一时段结束时培养物拆分为多个继代培养物，所述多个继代培养物各自在包含IL-2的第三培养基中培养约3-6天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述多个继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少两种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤由介导至少两种基因编辑器转移的单个电穿孔事件组成。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤中至少两种基因编辑器中的每一者是通过电穿孔事件独立于任何其他基因编辑器的转移而单独转移。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤还包括每个电穿孔事件后的静息期。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括介导第一基因编辑器转移以调节第一蛋白质表达的第一电穿孔事件、第一静息期、介导第二基因编辑器转移以调节第二蛋白质表达的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约1至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约10小时至1天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约12小时至24小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约15小时至约18小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
在一些实施方案中，所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
在一些实施方案中，所述电穿孔步骤包括介导第一TALE核酸酶系统转移的第一电穿孔事件、第一静息期、介导第二TALE核酸酶系统转移的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
在一些实施方案中，所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约1至3天。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约10小时至1天。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约12小时至24小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期为约15小时至约18小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
在一些实施方案中，对第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的步骤包括对第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。
在一些实施方案中，所述基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶系统调节PD-1、CTLA-4、CISH、CBL-B、TIGIT和/或LAG-3的表达。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH和CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B和LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B和TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节PD-1表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CISH表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述基因编辑器包含调节TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息的步骤。
在一些实施方案中，所述静息步骤包括在约30-40℃与约5％ CO2下温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息约一天的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括在基因编辑步骤之后并且培养第三或第四TIL群体的步骤之前使第三或第四TIL群体静息约12小时至24小时的步骤。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括使第三或第四TIL群体静息约15小时至18小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括使第三或第四TIL群体静息约15小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中温育第三或第四TIL群体。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括在包含IL-2的细胞培养基中在约30℃下将第三或第四TIL群体温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
在一些实施方案中，使第三或第四TIL群体静息的步骤包括将第三或第四TIL群体在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B，条件是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质不同。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CISH组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为TIGIT并且所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为PD-1。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CTLA-4。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为LAG-3。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CISH。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CBL-B。
在一些实施方案中，所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为TIGIT。
在一些实施方案中，所述第一基因编辑器下调第一蛋白质的表达并且所述第二基因编辑器下调第二蛋白质的表达。
在一些实施方案中，所述经扩增数目的TIL包含治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞(APC)为PBMC。
在一些实施方案中，所述PBMC是经照射并且同种异体的。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，所述IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在一些实施方案中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
在一些实施方案中，本文提供了通过本文中所描述的方法制造的经扩增数目的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含本文中所描述的经扩增数目的TIL或治疗性TIL群体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的本文中所描述的经扩增数目的TIL或治疗性TIL群体。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自所述患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将肿瘤消化物添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-8天以获得第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使所述第三TIL群体静息约1天；
(g)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体来进行第二扩增，以产生第四TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(h)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中步骤(a)至(h)中的一者或多者是在密闭、无菌系统中进行；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；
(j)使用基于二甲亚砜的冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体；以及
(k)将治疗有效剂量的所述经收集的TIL群体从所述输注袋施用至所述患者；
其中所述电穿孔步骤包括递送转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统以抑制PD-1、CTLA-4、CISH、CBL-B、TIGIT和/或LAG-3的表达。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统和用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统和用于抑制CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统和用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统和用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统和用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统和用于抑制CISH表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统和用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统和用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统和用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统和用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统和用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统和用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CBL-B表达的TALEN系统和用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制CBL-B表达的TALEN系统和用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括递送用于抑制LAG-3表达的TALEN系统和用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
在一些实施方案中，TIL的治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
在一些实施方案中，在步骤(k)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已对患者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在一些实施方案中，所述方法还包括用在步骤(k)中向患者施用TIL细胞之后第二天起始的高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，所述癌症为黑素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为转移性黑素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为NSCLC。
在一些实施方案中，所述癌症为转移性NSCLC。
在一些实施方案中，所述基因编辑引起治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。
实施例
现参考以下实施例描述本文中涵盖的实施方案。这些实施例仅出于说明的目的提供并且本公开决不应理解为限于这些实施例，而应理解为涵盖由于本文中提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
实施例1：制备用于预REP和REP过程的培养基
此实施例描述用于制备适用于涉及源自各种实体肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的培养的方案的组织培养基的程序。此培养基可用于制备本申请和其他实施例中所描述的任一TIL。
制备CM1。从冷藏库取出以下试剂并且使其在37℃水浴中升温：(RPMI1640、人类AB血清、200mM L-谷氨酰胺)。根据下表34，通过将各成分添加到适用于待过滤体积的0.2μm过滤器单元的顶部来制备CM1培养基。在4℃下储存。
表34.制备CM1
使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中预热并且添加6000IU/mL IL-2。
根据表35，可按需要进行额外补充。
表35.按需要对CM1的另外补充。
制备CM2
从冰箱取出已制备的CM1或制备新鲜CM1。从冰箱取出AIM-并且通过在无菌培养基瓶中混合已制备的CM1与等体积AIM-来制备所需量的CM2。在使用当天向CM2培养基中添加3000IU/mL IL-2。在使用当天用3000IU/mL IL-2制成足够量的CM2。将CM2培养基瓶标记上名称、制备者名字缩写、过滤/制备日期、两周的过期日期，并且在需要用于组织培养之前储存在4℃下。
制备CM3
在需要使用的当天，制备CM3。CM3与AIM-培养基相同，但在使用当天补充3000IU/mL IL-2。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备溶液，制备满足实验需求的量的CM3。通过轻微振荡进行充分混合。在添加到AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IU/mL IL-2”。如果存在过量CM3，则将其储存在处于4℃的瓶子中，标记上培养基名称、制备者名字缩写、制备培养基的日期和其过期日期(制备后7天)。储存在4℃下7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
制备CM4
CM4与CM3相同，但另外补充2mM GlutaMAXTM(最终浓度)。每1L CM3添加10mL的200mM GlutaMAXTM。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备溶液和GlutaMAXTM储备溶液，制备满足实验需求的量的CM4。通过轻微振荡进行充分混合。在添加到AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IL/mL IL-2和GlutaMAX”。如果存在过量CM4，则将其在4℃下储存于瓶子中，标记上培养基名称、“GlutaMAX”和其过期日期(制备后7天)。在4℃下储存超过7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
实施例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合液的使用
此实施例描述充当额外T细胞生长因子的IL-2、IL-15和IL-21细胞因子与本文中的任何实施例的TIL过程的组合的使用。
使用本文中所描述的过程，在开始培养时，TIL可在一个实验组中在存在IL-2的情况下并且在另一个组中在存在代替IL-2的IL-2、IL-15和IL-21的组合的情况下从肿瘤生长。在预REP完成时，评估培养物的扩增、表型、功能(CD107a+和IFN-γ)和TCR Vβ谱系。IL-15和IL-21在本文中的其他地方和Santegoets等人,J.Transl.Med.,2013,11,37中描述。
结果可表明，相对于仅IL-2条件，可观测到在IL-2、IL-15和IL-21处理条件下，CD4+和CD8+细胞中的增强的TIL扩增(>20％)。相对于仅IL-2培养物，在从经IL-2、IL-15和IL-21处理的培养物获得的TIL中，存在针对具有偏斜TCR Vβ谱系的显著CD8+群体的偏斜。与仅经IL-2处理的TIL相比，经IL-2、IL-15和IL-21处理的TIL中的IFN-γ和CD107a升高。
实施例3：对个别批次的经γ照射的外周单核细胞的量化
此实施例描述用于量化在本文中所描述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞的个别批次的经γ照射的外周单核细胞(PBMC，也称为单核细胞或MNC)的简化程序。
从个别供体制备各批次的经照射的MNC饲养细胞。针对在存在经纯化的抗CD3(克隆OKT3)抗体和白介素-2(IL-2)的情况下，在REP中扩增TIL的能力来个别地筛选各批次或供体。此外，在不添加TIL的情况下测试各批次的饲养细胞，以验证所接受的γ照射剂量足以使其不能进行复制。
TIL的REP需要经γ照射、生长受到阻滞的MNC饲养细胞。饲养细胞MNC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合并且与REP培养瓶中的TIL交联，刺激TIL扩增。由从个别供体获得的全血的白细胞清除术制备饲养细胞批料。白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上经历离心、洗涤、照射并且在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，不向接受TIL疗法的患者输注活饲养细胞，因为这可引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，饲养细胞的生长由于对细胞进行γ照射而受到阻滞，引起双链DNA断裂和在重新培养时MNC细胞的细胞存活率的损失。
根据两个标准评价饲养细胞批料：(1)其在共同培养中使TIL扩增>100倍的能力，和(2)其复制能力不足。
利用在立式T25组织培养瓶中生长的两个主要预REP TIL系，以微型REP格式测试饲养细胞批料。针对两个不同的TIL系测试饲养细胞批料，其中每个TIL系在REP中响应于激活而增殖的能力是独特的。作为对照，与测试批料一起操作许多先前已证实满足以上标准的经照射的MNC饲养细胞。
可获得足以测试所有条件和所有饲养细胞批料的相同预REP TIL系的储备液，以确保在单一实验中测试的所有批料接受等效测试。
对于所测试的各批次的饲养细胞，存在总共六个T25培养瓶：预REP TIL系#1(2个培养瓶)；预REP TIL系#2(2个培养瓶)；和饲养细胞对照(2个培养瓶)。含有TIL系#1和#2的培养瓶用于评价饲养细胞批料扩增TIL的能力。饲养细胞对照培养瓶用于评价饲养细胞批料的复制能力不足。
A.实验方案
第-2/3天，将TIL系解冻。制备CM2培养基并且使CM2在37℃水浴中升温。制备40mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2。保持温热直至使用。将20mL不含IL-2的预温热的CM2放置于用所使用的TIL系的名称标记的两个50mL锥形管中的每一者中。从LN2储存器取出两个指定的预REP TIL系并且将小瓶转移到组织培养室。通过将小瓶在经密封的拉链储存袋内放置于37℃水浴中直至剩余少量冰来解冻。
使用无菌移液管，将每个小瓶的内含物立即转移到准备好的经标记的50mL锥形管中的20mL CM2中。使用不含IL-2的CM2补足至40mL以洗涤细胞，并且在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液并重悬于补充有3000IU/mL IL-2的5mL温热CM2中。
一式两份地取出小等分试样(20μL)以使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管放置于加湿的37℃、5％ CO2温育箱中，其中将盖松开以允许气体交换。测定细胞浓度，并且将TIL在补充有3000IU/mL IL-2的CM2中稀释至1×106个细胞/毫升。
在加湿的37℃温育箱中，视需要在24孔组织培养板中的多个孔中以2毫升/孔进行培养，直至微型REP的第0天。在单独的24孔组织培养板中培养不同的TIL系以避免混淆和潜在的交叉污染。
第0天，起始微型REP。针对待测试的饲养细胞批料的数目制备足够的CM2培养基。(例如，对于一次性测试4份饲养细胞批料，制备800mL CM2培养基)。将上文所制备的CM2的一部分等分，并且向其中补充3000IU/mL IL-2以用于细胞培养。(例如，对于一次性测试4份饲养细胞批料，制备具有3000IU/mL IL-2的500mL CM2培养基)。
独立地与每个TIL系一起操作以防止交叉污染，从温育箱取出具有TIL培养物的24孔板并转移到BSC。
使用无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，从待使用的每个孔中的TIL取出约1mL培养基并且将其放置于24孔组织培养板的未使用的孔中。
使用新鲜的无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，将剩余培养基与孔中的TIL混合以将细胞重悬，并且然后将细胞悬浮液转移到标记有TIL批料名称的50mL锥形管中并且记录体积。
用保留的培养基清洗各孔并且将所述体积转移到相同的50mL锥形管中。以400×CF旋转细胞以收集细胞沉淀物。抽出培养基上清液并且将细胞沉淀物重悬于2-5mL含有3000IU/mL IL-2的CM2培养基中，待使用的体积是基于所收集的孔的数目和沉淀物的尺寸，即，体积应足以确保浓度>1.3×106个细胞/毫升。
使用血清移液管，将细胞悬浮液充分混合并且记录体积。取出200μL以使用自动细胞计数器进行细胞计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管放置于加湿的5％ CO2、37℃温育箱中，其中将盖松开以允许气体交换。记录计数。
从温育箱取出含有TIL细胞的50mL锥形管，并且将其中的细胞以1.3×106个细胞/毫升的浓度重悬于补充有3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将50mL锥形管放回温育箱中并且将盖子松开。
对于第二TIL系，重复以上步骤。
在将要将TIL涂布至用于实验的T25培养瓶中之前，如下所示将TIL以1:10稀释至最终浓度为1.3×105个细胞/毫升。
制备MACS GMP CD3纯(OKT3)工作溶液。从4℃冷冻器中取出OKT3的储备溶液(1mg/mL)并放置于BSC中。在微型REP的培养基中使用最终浓度为30ng/mL的OKT3。
在用于实验的每个T25培养瓶中，每20mL需要600ng OKT3；这等效于每20mL需要60μL的10μg/mL溶液，或者对于每个饲养细胞批料，所测试的全部6个培养瓶需要360μL。
对于所测试的每个饲养细胞批料，对于10μg/mL的工作浓度，制备400μL的1mg/mLOKT3的1:100稀释物(例如，对于一次性测试4份饲养细胞批料，制备1600μL的1mg/mL OKT3的1:100稀释物：16μL的1mg/mL OKT3+1.584mL具有3000IU/mL IL-2的CM2培养基)。
制备T25培养瓶。在制备饲养细胞之前，标记每个培养瓶并用CM2培养基填充培养瓶。将培养瓶放置于37℃加湿的5％ CO2温育箱中以保持培养基温热，同时等待添加其余组分。在制备饲养细胞后，将组分添加到每个培养瓶中的CM2中。
其他信息提供于表36中。
表36.溶液信息。
制备饲养细胞。对于此方案，所测试的每份批料需要至少78×106个饲养细胞。由SDBB冷冻的每个1mL小瓶在冷冻时具有100×106个活细胞。假设从液态N2储存器解冻后的复苏率为50％，建议每批次至少解冻两个1mL小瓶的饲养细胞，从而在每个REP中使用估计100×106个活细胞。或者，如果在1.8mL小瓶中供应，则仅一个小瓶就可提供足够的饲养细胞。
在将饲养细胞解冻之前，对于待测试的每个饲养细胞批料，预温热约50mL不含IL-2的CM2。从LN2储存器取出指定饲养细胞批料小瓶，放置于拉链储存袋中并放置于冰上。小瓶在密闭的拉链储存袋中通过浸没于37℃水浴中来解冻。从拉链袋取出小瓶，用70％ EtOH喷涂或擦拭，并转移到BSC。
使用移液管，将饲养细胞小瓶的内含物立即转移到50mL锥形管中的30mL温热CM2中。用小体积的CM2洗涤小瓶以去除小瓶中的任何残余细胞并在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液并重悬于4mL温热CM2加3000IU/mL IL-2中。取出200μL以使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。
将细胞以1.3×107个细胞/毫升重悬于温热CM2加3000IU/mL IL-2中。将TIL细胞从1.3×106个细胞/毫升稀释至1.3×105个细胞/毫升。
设置共培养物。将TIL细胞从1.3×106个细胞/毫升稀释至1.3×105个细胞/毫升。将4.5mL CM2培养基添加到15mL锥形管中。从温育箱取出TIL细胞并使用10mL血清移液管充分重悬。从1.3×106个细胞/毫升TIL悬浮液取出0.5mL细胞并且添加到15mL锥形管中的4.5mL培养基中。将TIL储备液小瓶放回温育箱中。充分混合。对第二TIL系重复上述操作。
将具有用于单一饲养细胞批料的预温热培养基的培养瓶从温育箱转移到BSC。通过用1mL移液器吸头向上和向下移液若干次来混合饲养细胞，并且将1mL(1.3×107个细胞)转移到用于所述饲养细胞批料的每个培养瓶中。向每个培养瓶中添加60μL OKT3工作储备液(10μg/mL)。将两个对照瓶放回温育箱中。
将1mL(1.3×105)各TIL批料转移到经相应标记的T25培养瓶中。将培养瓶放回温育箱中并直立温育。从第5天开始进行干预。对所测试的所有饲养细胞批料重复此程序。
第5天，培养基更换。制备具有3000IU/mL IL-2的CM2。每个培养瓶需要10mL。通过10mL移液管，将具有3000IU/mL IL-2的10mL温热CM2转移到每个培养瓶。将培养瓶放回温育箱中并直立温育至第7天。对所有所测试的饲养细胞批料重复上述操作。
第7天，收集。从温育箱中取出培养瓶并转移到BSC，注意避免干扰培养瓶底部上的细胞层。在不干扰培养瓶底部上生长的细胞的情况下，从每个测试瓶中取出10mL培养基并且从每个对照瓶中取出15mL培养基。
使用10mL血清移液管，将细胞重悬于剩余的培养基中并充分混合以打散任何细胞凝集块。在通过移液充分混合细胞悬浮液后，取出200μL以进行细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数。在第7天记录计数。对所测试的所有饲养细胞批料重复此程序。
评价饲养细胞对照瓶的复制能力不足，并且从第0天开始评价含有TIL的培养瓶的扩增倍数。
第7天，继续操作饲养细胞对照瓶至第14天。在第7天完成饲养细胞对照瓶的计数后，将15mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜CM2培养基添加到每个对照瓶中。将对照瓶放回温育箱中并以直立位置温育至第14天。
第14天，饲养细胞对照瓶的延长的非增殖期。从温育箱中取出培养瓶并转移到BSC，注意避免干扰培养瓶底部上的细胞层。在不干扰培养瓶底部生长的细胞的情况下，从每个对照瓶中取出约17mL培养基。使用5mL血清移液管，将细胞重悬于剩余的培养基中并充分混合以打散任何细胞凝集块。记录每个培养瓶的体积。
在通过移液充分混合细胞悬浮液后，取出200μL以进行细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数并且记录计数。对所测试的所有饲养细胞批料重复此程序。
B.结果和验收标准方案
结果。γ照射的剂量足以使饲养细胞不能进行复制。预期所有批料符合评价标准并且还显示与第0天相比，在REP培养的第7天剩余的活饲养细胞的总数减少。预期所有饲养细胞批料都符合以下评价标准：直至REP培养的第7天，TIL的生长扩增100倍。预期第14天的饲养细胞对照瓶的计数将持续第7天可见的非增殖趋势。
验收标准。针对每个批次的饲养细胞测试的每个复制TIL系符合以下验收标准。验收标准为两倍，如以下表37中所示。
表37.验收标准的实施方案。
评价当在存在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2的情况下培养时，照射剂量是否足以使MNC饲养细胞无法复制。经由如通过在REP的第7天和第14天的自动细胞计数测定的总活细胞计数(TVC)来评价复制能力不足。
验收标准为“无生长”，意指在第7天和第14天，总活细胞数目与在REP的第0天放入培养物中的初始活细胞数目相比未增加。
评价饲养细胞支持TIL扩增的能力。根据活细胞从REP的第0天开始的培养至REP的第7天的扩增倍数来测量TIL生长。在第7天，如通过自动细胞计数所评价，TIL培养物达到最小100倍扩增(即，超过在REP的第0天放入培养物中的活TIL细胞的总数的100倍)。
不符合验收标准的MNC饲养细胞批料的应急测试。在MNC饲养细胞批料不符合以上概述的验收标准中的任一者的情况下，将进行以下步骤以重新测试所述批料，以排除其起因是简单的实验者错误。
如果存在所述批料的两个或更多个剩余附属测试小瓶(satellite testingvial)，则再测试所述批料。如果存在所述批料的一个或不存在所述批料的剩余附属测试小瓶，则根据上文所列的验收标准，所述批料不合格。
为了合格，相关批料和对照批料必须达到以上验收标准。在符合这些标准之后，准许使用所述批料。
实施例4：制备IL-2储备溶液
此实施例描述将经纯化的冻干重组人类白介素-2溶解于适合用于其他组织培养方案(包括本申请和实施例中所描述的所有那些方案)的储备样品中的过程，包括涉及使用rhIL-2的那些过程。
程序。制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移到50mL锥形管中。向50mL锥形管中添加1mL 1N乙酸。通过倒转管2-3次进行充分混合。通过使用Steriflip过滤器进行的过滤将HAc溶液灭菌。
制备含1％ HSA的PBS。在150mL无菌过滤器单元中，向96mL PBS中添加4mL 25％HSA储备溶液。过滤溶液。储存在4℃下。针对制备的每一小瓶rhIL-2，填写表格。
制备rhIL-2储备溶液(6×106IU/mL最终浓度)。每一批次的rhIL-2不同，并且所需信息见于制造商的分析证书(COA)，例如：1)每小瓶rhIL-2的质量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)和3)推荐0.2％ HAc复原体积(mL)。
使用以下公式计算rhIL-2批次所需的1％ HSA的体积：
例如，根据rhIL-2批料10200121(Cellgenix)的COA，1mg小瓶的比活性为25×106IU/mg。推荐在2mL 0.2％ HAc中复原rhIL-2。
用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶的橡胶塞。使用连接至3mL注射器的16G针，将推荐体积的0.2％ HAc注射至小瓶中。请小心不要在拔出针头时取开塞子。将小瓶倒转3次并旋动直至所有粉末溶解。小心地取下塞子并搁置于酒精擦拭物上。向小瓶中添加所计算体积的1％HSA。
储存rhIL-2溶液。对于短期储存(<72小时)，将小瓶储存在4℃下。对于长期储存(>72小时)，将小瓶等分成较小体积，并且在准备使用之前储存在-20℃下的冷冻小瓶中。避免冷冻/解冻循环。在制备日期之后6个月过期。Rh-IL-2标签包括供应商和目录号、批号、过期日期、操作员首字母缩写、浓度和等分体积。
实施例5：冷冻保存过程
此实施例描述使用7454型CryoMed受控速率冷冻器(Thermo Scientific)的用于根据本文中所描述的程序制备的TIL的冷冻保存过程方法。
所使用的设备如下：铝制盒支架(与CS750冷冻袋相容)、用于750mL袋的冷冻盒、低压(22psi)液氮罐、冷冻器、热电偶传感器(用于袋子的带状型)和CryoStore CS750冷冻袋(OriGen Scientific)。
从成核至-20℃，冷冻过程提供0.5℃速率并且提供1℃/分钟的冷却速率直至-80℃终点温度。程序参数如下：步骤1—在4℃下等待；步骤2：1.0℃/min(样品温度)达至-4℃；步骤3：20.0℃/min(箱室温度)达至-45℃；步骤4：10.0℃/min(箱室温度)达至-10.0℃；步骤5：0.5℃/min(箱室温度)达至-20℃；并且步骤6：1.0℃/min(样品温度)达至-80℃。
实施例6：用确定培养基进行的肿瘤扩增过程
可用相应的确定培养基(例如，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，ThermoFisher，包括例如DM1和DM2)代替CM1和CM2培养基来进行上文所公开的过程。
实施例7：冷冻保存的TIL细胞疗法的示例性GEN 2制备
此实施例描述根据当前组织良好操作规范(current Good Tissue Practices)和当前良好制造规范(current Good Manufacturing Practices)在G-REX培养瓶中进行Iovance Biotherapeutics公司的TIL细胞疗法过程的cGMP制造。此实施例描述根据当前组织良好操作规范和当前良好制造规范在G-REX培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表38.过程扩增示例性计划。
表39.培养瓶容积
第0天，CM1培养基制备。在BSC中，向RPMI 1640培养基瓶添加试剂。添加以下试剂t，每瓶添加：热灭活人类AB血清(100.0mL)；GlutaMaxTM(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)
从BSC取出不必要的材料。从BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS保留在BSC以用于配制洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化为止。记录IL-2：批号和有效期
将IL-2储备溶液转移到培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备溶液转移到准备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-REX100MCS传递至BSC中。将G-REX100MCS(W3013130)无菌传递至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-REX100MCS培养瓶中。组织片段锥形管或G-Rex100MCS。
第0天，肿瘤洗涤培养基制备。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加到1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。经由1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理。获得肿瘤试样并立即转移到2-8℃下的套件中进行处理。等分肿瘤洗涤培养基。使用8”镊子(W3009771)进行肿瘤洗涤1。从试样瓶取出肿瘤并转移到所制备的“洗涤1”培养皿中。此后接着为肿瘤洗涤2和肿瘤洗涤3。测量并评估肿瘤。评估是否观测到整个肿瘤面积的>30％为坏死性和/或脂肪组织。在适用时清洁解剖。如果肿瘤较大并且观测到>30％组织外表为坏死性/脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合去除坏死性/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除分割”。解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤试样切割成偶数个适当大小的片段(至多6个中间片段)。转移中间肿瘤片段。将肿瘤片段分割成大小大致为3×3×3mm的片。储存中间片段以防脱水。重复中间片段分割。测定收集的小块数目。如果仅保留所需组织，则从“有利中间片段”6孔板选择另外的有利肿瘤片段来填充丢弃片段，使得最多达50个片段。
准备锥形管。将肿瘤片转移到50mL锥形管中。制备用于G-REX100MCS的BSC。从温育箱中取出G-REX100MCS。将G-REX100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤片段添加到G-REX100MCS培养瓶中。使小块均匀分布。
按以下参数温育G-REX100MCS：温育G-REX培养瓶：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。计算：温育时间；下限＝温育时间+252小时；上限＝温育时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余的温热培养基并解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备。监测温育箱。温育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
在温育箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。从温育箱中取出RPMI 1640培养基。准备RPMI 1640培养基。过滤培养基。解冻3×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)。从温育箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加到AIM-V。将10L Labtainer袋和中继泵转移装置无菌转移到BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。从Labtainer袋中取出自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基并放置于50mL锥形管中。制备细胞计数稀释液管。在BSC中，向四个15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。将试剂从BSC转移到2-8℃。准备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。温育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集。预处理表格。温育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。从温育箱中取出G-REX100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-REX100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶并且起始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移到300mL转移包中。检查膜上的粘附细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-REX100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL和“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样品。在BSC中，从1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，并分配到无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器从准备的标记有BacT的50mL锥形管中取出1.0mL样品并接种于厌氧瓶。
温育TIL。在需要之前将TIL转移包置于温育箱中。进行细胞计数和计算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限和下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积：计算取出细胞计数样品后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样品的体积(4.0mL)(B)经调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：如果活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样品的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，并且取出过量TIL并按需要将TIL置于温育箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的目标细胞浓度添加到过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/mL。按需要使过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。如果体积≤0.5mL，将CS10添加到小瓶中，直至体积为0.5mL。
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样品以进行冷冻保存。将TIL置于温育箱中。
样品的冷冻保存。观测锥形管，并且缓慢添加CS-10并且记录添加0.5mL CS10的体积。
第11天-饲养细胞。获得饲养细胞。从LN2冷冻器获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm处解冻饲养细胞约3-5分钟或直至冰刚好消失为止。从温育箱中取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加到转移包。将饲养细胞从注射器分配到转移包中。对合并饲养细胞进行混合，并且标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。取出细胞计数样品。针对每个样品使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口从饲养细胞悬浮液转移包抽吸4×1.0mL细胞计数样品。将每个样品等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，并且确定乘数、选定方案并且输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限，并确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样品后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4饲养细胞袋置于拉链袋中，并且在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻约3-5分钟并合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积并记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加到转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加到四个15mL锥形管中。准备细胞计数。针对每个样品使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口从饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样品。进行细胞计数和计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，并且计算取出细胞计数样品后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5x109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器和16G针头，吸取0.15mL OKT3并且添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-REX填充和接种设置G-REX500MCS。从温育箱中取出“完全CM2第11天培养基”并将培养基泵吸至G-REX500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封并将培养瓶温育。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-REX500MCS。将饲养细胞添加到G-REX500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加到G-REX500MCS。热封。将G-REX500MCS在37.0±2.0℃下温育，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
计算温育窗口。进行计算以确定在第16天从温育箱取出G-REX500MCS的适当时间。下限：温育时间+108小时。上限：温育时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存。适用：冷冻过量TIL小瓶。确证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶从受控速率冷冻器转移到适当储存器中。完成冷冻后，将小瓶从CRF转移到适当储存容器。将小瓶转移到适当储存器中。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备。预热AIM-V培养基。针对培养基袋1、2和3计算使培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12至24小时的持续时间。设定用于上清液的10L Labtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10L Labtainer并进行标记。设定用于上清液的10LLabtainer。确保在从BSC取出之前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，所述TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化为止。等分100.0mL GlutaMaxTM。向GlutaMaxTM中添加IL-2。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMaxTM+IL-2泵吸至袋中。监测参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP拆分。监测温育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。从温育箱中取出G-REX500MCS。准备1L转移包并且标记为TIL悬浮液并称重为1L。
G-REX500MCS的体积减小。将约4.5L培养上清液从G-REX500MCS转移到10LLabtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
起始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离，并且确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheREX，将细胞悬浮液转移到TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基为止。检查膜上的粘附细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量并计算悬浮液体积。准备用于样品取出的转移包。从细胞上清液取出测试样品。
无菌和BacT测试取样。从制备的15mL锥形标记的BacT取出1.0mL样品。取出细胞计数样品。在BSC中，针对每个样品使用单独的3mL注射器，从“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样品。
取出霉浆菌样品。使用3mL注射器，从TIL悬浮液转移包中取出1.0mL并置于准备的标记有“霉浆菌稀释剂”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于温育箱中。从BSC取出细胞悬浮液，并且在需要之前置于温育箱中。进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加到准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样品进行稀释，得到稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：稀释可以根据预期的细胞浓度进行调整。从进行的所有四次计数确定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样品后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出以用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-REX500MCS培养瓶的最大数目为五。如果计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外仍需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-REX-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一GREX-500M培养瓶，同时准备另外的培养基并使其升温。准备确定的所计算数目的其他培养基袋并使其升温。填充G-REX500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中。热封。重复填充。温育培养瓶。计算待添加到新G-REX500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。如果计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。从温育箱中取出G-REX500MCS。准备用于泵吸的G-REX500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。从温育箱中取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。泵吸所计算体积的TIL悬浮液至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测温育箱。温育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。温育培养瓶。
测定在第22天从温育箱中取出G-REX500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备。准备10L Labtainer袋。在BSC中，经由鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10L Labtainer袋。准备10LLabtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为待进行收集的每两个G-REX500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，并且通过翻转泵和操控袋子的位置以从3000mL Origen袋去除空气。将25％的人类白蛋白添加到3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的人类白蛋白25％。
制备IL-2稀释剂。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上的无针注入口去除5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配到50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，从无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化为止。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加到标记为“IL-2稀释剂”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2-8℃下，以对其进行预处理，以便用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个单独的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有批号和“用于细胞计数稀释”的AIM-V培养基。准备细胞计数。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1-4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集。监测温育箱。温育箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。从培养箱中取出G-REX500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。密闭额外的接头。体积减小：将约4.5L上清液从G-REX500MCS转移到上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。起始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞已剥落。起始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移到3000mL收集袋中。检查膜上的粘附细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子，并确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移到LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。去除4×1.0mL细胞计数样品
进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加到准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样品进行稀释。得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。测定计数的上限和下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备霉浆菌稀释剂。经由鲁尔样品口从一个上清液袋中取出10.0mL并置于15mL锥形管中。
进行“TIL G-REX收集”方案并测定最终产物目标体积。装载一次性试剂盒。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。确证已附接PlasmaLyte，并且观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，并且确证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制和填充。目标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加到最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作储备液：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接至制备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，从“IL-2 6×104”等分试样取出所测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加到设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
从最终产物袋去除空气并获得保留物。一旦已填充最后一个最终产物袋，就闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中并且更换设备上的注射器。将保留物分配到50mL锥形管中，并且将管标记为“保留物”和批号。针对每个袋子重复空气去除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2-8℃。
去除细胞计数样品。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物并置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数和计算。注意：仅将一个样品稀释至确证稀释度足够的适当稀释度。将另外的样品稀释至适当稀释因子并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并且收集样品。
表40.样品计划。
无菌性和BacT测试。测试取样。在BSC中，从使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样品，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存。准备受控速率冷冻器(CRF)。确证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物和样品放置于CRF中。测定要达到4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF操作。完成CRF并储存。完成操作后停止CRF。从CRF取出盒和小瓶。将盒和小瓶转移到气相LN2进行储存。记录储存位置。
最终药品的处理和分析包括以下测试：(第22天)通过流式细胞术测定第22天REP的CD3+细胞；(第22天)革兰氏染色方法(GMP)；(第22天)通过凝胶凝块LAL测定(GMP)进行细菌内毒素测试；(第16天)BacT无菌性测定(GMP)；(第16天)TD-PCR(GMP)检测霉浆菌DNA；可接受外观特质；(第22天)BacT无菌测定(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ测定。如本文中所描述的其他效能测定也用于分析TIL产物。
实施例8：GEN 3扩增平台的示例性实施方案
第0天
制备肿瘤洗涤培养基。在开始之前使培养基升温。将5mL庆大霉素(50mg/mL)添加到500mL HBSS瓶中。将5mL肿瘤洗涤培养基添加到15mL锥形瓶中，用于OKT3稀释。准备饲养细胞袋。将饲养细胞无菌转移到饲养细胞袋并在37℃下储存直至使用或冷冻。如果在37℃下，则对饲养细胞进行计数。如果冷冻，则解冻并且然后对饲养细胞进行计数。
饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/毫升之间。制备具有4.5mLAIM-V的四个锥形管。对于每次细胞计数，添加0.5mL细胞级分。如果总活饲养细胞数目≥1×109个细胞，则进行调节饲养细胞浓度。计算从第一饲养细胞袋取出的饲养细胞体积，以便将1×109个细胞添加到第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL的肿瘤洗涤培养基转移到OKT3等分试样(100μL)中。使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL OKT3并且添加到第二饲养细胞袋中。将培养基体积调节至2L的总体积。将第二饲养细胞袋转移到温育箱中。
OKT3制剂细节：可以100μL等分试样形式，以来自小瓶的原始储备液浓度(1mg/mL)将OKT3等分和冷冻。每个1mL小瓶具有约10X等分试样。在-80℃下储存。第0天：15微克/瓶，即，30ng/mL于500mL中，至多约60μL，1个等分试样。
向标记为过量肿瘤片状物的6孔板的所有孔中添加5mL肿瘤洗涤培养基。保存肿瘤洗涤培养基，以进一步用于在解剖期间保持肿瘤水合。将50mL肿瘤洗涤培养基添加到每个100mm皮氏培养皿(petri dish)中。
在解剖培养皿盖下用直尺作为参考，将肿瘤分割成27mm3片段(3×3×3mm)。解剖中间片段，直至达到60个片段。对最终片段的总数进行计数并且根据所产生的最终片段的数目来准备G-REX-100MCS培养瓶(通常为60个片段/瓶)。
在标记为片段管1至片段管4的锥形管中保留有利的组织片段。根据起始片段管的数目计算用饲养细胞悬浮液接种的G-REX-100MCS培养瓶的数目。
从温育箱中取出饲养细胞袋并且接种G-REX-100MCS。标记为D0(第0天)。
向G-REX-100 MCS中的培养物中添加肿瘤片段。在无菌条件下，拧开标记有肿瘤片段培养物(D0)1的G-REX-100MCS和标记有片段管的50mL锥形管的盖子。旋转打开的片段管1，并且同时略微抬起G-REX100MCS的盖子。在旋转的同时将培养基和片段一起添加到G-REX100MCS中。记录转移到G-REX100MCS中的片段的数目。
一旦片段位于GREX培养瓶的底部，就抽取7mL培养基并创建七个1mL等分试样，5mL用于扩展表征并且2mL用于无菌性样品。将用于扩展表征的5个等分试样(最终片段培养物上清液)储存在-20℃下直至需要为止。
分别用1mL最终片段培养物上清液接种一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶。对进行取样的每个培养瓶重复上述操作。
在第7-8天
准备饲养细胞袋。在冷冻的情况下，将饲养细胞袋在37℃水浴中解冻3-5分钟。如果冷冻，则对饲养细胞进行计数。饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/毫升之间。制备具有4.5mL AIM-V的四个锥形管。对于每次细胞计数，将0.5mL细胞级分添加到新的冷冻小瓶管中。将样品充分混合并且进行细胞计数。
如果活饲养细胞总数≥2×109个细胞，则进行下一个步骤以调节饲养细胞浓度。计算从第一饲养细胞袋移出的饲养细胞的体积，以便将2×109个细胞添加到第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL HBSS转移到100μL OKT3等分试样中。通过向上和向下移液3次进行混合。制备两个等分试样。
OKT3制剂细节：可以100μL等分试样形式，以来自小瓶的原始储备液浓度(1mg/mL)将OKT3等分和冷冻。每个1mL小瓶具有约10×等分试样。在-80℃下储存。第7/8天：30微克/瓶，即，60ng/mL于500mL中，至多120μl，2个等分试样。
使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL OKT3并添加到饲养细胞袋中，确保全部添加。将培养基体积调节至2L的总体积。对第二OKT3等分试样重复上述操作并添加到饲养细胞袋中。将第二饲养细胞袋转移到温育箱中。
制备具有饲养细胞悬浮液的G-REX100MCS培养瓶。根据第0天产生的G-REX培养瓶的数目记录待处理的G-REX100MCS培养瓶的数目。从温育箱中取出G-REX培养瓶并且从温育箱中取出第二饲养细胞袋。
在添加饲养细胞悬浮液之前去除上清液。将一个10mL注射器连接至G-REX100培养瓶并抽取5mL培养基。创建五个1mL等分试样，5mL用于扩展表征，并且将用于扩展表征的5个等分试样(最终片段培养物上清液)储存在-20℃下直至发起人提出要求。对每个G-REX100培养瓶进行标记并重复上述操作。
取决于培养瓶的数目，5-20×1mL样品用于表征：
●5mL＝1个培养瓶
●10mL＝2个培养瓶
●15mL＝3个培养瓶
●20mL＝4个培养瓶
继续将饲养细胞接种至G-REX100 MCS中，并且对每个G-REX100 MCS培养瓶重复上述操作。使用无菌转移方法，将500mL第二饲养细胞袋按重量(假设1g＝1mL)通过重力转移到每个G-REX-100MCS培养瓶中并记录转移量。标记为第7天培养物并且对每个G-REX100培养瓶重复上述操作。将G-REX-100MCS培养瓶转移到温育箱中。
第10-11天
取出第一个G-REX-100MCS培养瓶，并且在无菌条件下使用10mL注射器取出7mL预处理培养物上清液。创建七个1mL等分试样，5mL用于扩展表征并且2mL用于无菌性样品。
小心地混合培养瓶并且使用新的10mL注射器取出10mL上清液并转移到标记为D10/11霉浆菌上清液的15mL管中。
小心地混合培养瓶并且使用新的注射器根据待处理的培养瓶的数量取出以下体积：
●1个瓶＝40mL
●2个瓶＝20mL/瓶
●3个瓶＝13.3mL/瓶
●4个瓶＝10mL/瓶
应从所有培养瓶抽吸总共40mL，并且汇集在标有‘第10/11天QC样品’的50mL锥形管中，并且储存在温育箱中直至需要为止。进行细胞计数并且分配细胞。
将用于扩展表征的5个等分试样(预处理培养物上清液)储存在≤-20℃下直至需要为止。分别用1mL预处理培养物上清液接种一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶。
继续将细胞悬浮液转移到G-REX-500MCS并且对每个G-REX-100MCS重复上述操作。使用无菌条件，将每个G-REX-100MCS的内含物转移到G-REX-500MCS中，每次监测约100mL液体转移。当G-REX-100MCS的体积降低至500mL时，停止转移。
在转移步骤期间，使用10mL注射器并且从G-REX-100MCS抽吸10mL细胞悬浮液至注射器中。根据培养中的瓶的数目按照说明书进行操作。如果仅1个瓶：总共使用两个注射器取出20mL。如果2个瓶：每个瓶取出10mL。如果3个瓶：每个瓶取出7mL。如果4个瓶：每个瓶取出5mL。将细胞悬浮液转移到一个共同的50mL锥形管。保持在温育箱中直至细胞计数步骤和QC样品。QC所需的细胞总数为约20e6个细胞：4×0.5mL细胞计数(细胞计数首先非经稀释)。
测定所需的细胞量如下：
1.至少10×106个细胞用于效能测定，例如本文中所描述的测定，或用于IFN-γ或颗粒酶B测定
2.1×106个细胞用于霉浆菌
3.5×106个细胞用于CD3+/CD45+的流式细胞术
将G-REX-500MCS培养瓶转移到温育箱。
制备QC样品。在此实施方案中，测定需要至少15×108个细胞。测定包括：细胞计数和存活率；霉浆菌(1×106个细胞/平均存活浓度；)流式细胞术(5×106个细胞/平均存活浓度；)和IFN-g测定(5×106个细胞-1×106个细胞；IFN-γ测定需要8-10×106个细胞。
计算在10×106个细胞/毫升下冷冻保存的细胞级分的体积，并且计算需准备的小瓶的数目
第16-17天
洗涤缓冲液制备(1％ HSA Plasmalyte A)。将HSA和Plasmalyte转移到5L袋中以制备LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件，将总体积为125mL的25％ HSA转移到5L袋中。将10mL或40mL洗涤缓冲液取出并转移到‘IL-2 6×104IU/mL管’中(如果IL-2是预先制备的，则为10mL，或如果IL-2是新鲜制备的，则为40mL)。
计算添加到Plasmalyte+1％ HSA中的复原IL-2的体积：复原IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准测定)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出所计算的复原IL-2所需的初始体积的IL-2并转移到‘IL-26×104IU/mL’管中。将来自预先制备的等分试样的100μL IL-2 6×106IU/mL添加到含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为‘IL-2 6×104IU/mL’的管中。
从G-REX-500MCS培养瓶中取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液并且将细胞转移到细胞收集池袋中。对所有G-REX-500MCS培养瓶重复上述操作。
取出60mL上清液并添加到上清液管中以用于质量对照测定，包括霉浆菌检测。储存在+2-8℃下。
细胞收集。对细胞进行计数。制备四个具有4.5mL AIM-V的15mL锥形管。这些锥形管可预先制备。最佳范围＝介于5×104与5×106个细胞/毫升之间。(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向先前制备的4500μL AIM V中添加500μL CF。记录稀释因子。
计算预LOVO(存活+死亡)的TC(总细胞)＝
平均总细胞
浓度(预LOVO TC浓度)
(存活+死亡)
X
源袋的体积
计算预LOVO(存活)的TVC(总活细胞)＝
平均总活细胞
浓度(预LOVO TVC)
(存活)
X
LOVO源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞以冷冻保存为MDA保留样品。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝待取出的体积。
当总细胞(TC)数目≤5×109时，取出4×106个细胞以冷冻保存为MDA保留样品。4×106÷平均TC浓度＝待取出的体积。
当测定总细胞数目时，待取出的细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认预LOVO的TVC为5×108或4×106或不适用。计算待取出的细胞体积。
计算袋中剩余的剩余总细胞。计算预LOVO的TC(总细胞)。[平均总细胞浓度X剩余体积＝预LOVO剩余TC]
根据剩余的细胞的总数目，选择表41中的对应过程。
表41.细胞总数目。
选择与所用过程相对应的IL-2添加的体积。体积计算为：滞留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO袋后添加的IL-2体积。记录所有添加的体积。在冷冻小瓶中获得样品用于进一步分析。
充分混合细胞产物。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样品进行内毒素、IFN-γ、无菌性和其他测定。
实施例9：GEN 2和GEN 3示例性过程
此实施例说明Gen 2和Gen 3过程。过程Gen 2和Gen 3TIL通常由源自个别患者(经由手术切除肿瘤)并且然后离体扩增的自体TIL构成。Gen 3过程的启始第一扩增步骤为在存在白介素-2(IL-2)和单克隆抗体OKT3的情况下进行细胞培养，所述单克隆抗体靶向经照射的外周血单核细胞(PBMC)的骨架上的T细胞共受体CD3。
Gen 2TIL产物的制造由两个阶段组成：1)预快速扩增(预REP)，和2)快速扩增方案(REP)。在预REP期间，将切除的肿瘤切割成≤50个各维度为2-3mm的片段，这些片段用含血清的培养基(含有补充的10％ HuSAB的RPMI 1640培养基)和6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)培养11天的时段。在第11天，收集TIL并且将其引入大规模二级REP扩增中。REP由以下组成：在5L体积的补充有3000IU/mL rhIL-2的CM2中，在5×109个经照射的同种异体PBMC饲养细胞的共培养中激活≤200×106个来自预REP的活细胞持续5天，所述饲养细胞负载有150μg单克隆抗CD3抗体(OKT3)。在第16天，培养物体积降低90％并且将细胞级分以≥1×109个活淋巴细胞/瓶拆分至多个G-REX-500培养瓶中，并且用CM4补足至5L。将TIL再温育6天。在第22天收集REP，洗涤，配制并冷冻保存，然后在-150℃下运送至临床地点以用于输注。
Gen 3TIL产物的制造由三个阶段组成：1)启始第一扩增方案，2)快速第二扩增方案(也称为快速扩增阶段或REP)，和3)继代培养物拆分。为了实现启始第一扩增TIL增殖，将所切除的肿瘤切割成≤120个各维度为2-3mm的片段。在启始第一扩增的第0天，在3个100MCS器皿中的每一者中，在约100cm2的表面区域上建立约2.5×108个同种异体照射的PBMC饲养细胞的饲养层，所述饲养细胞负载有OKT-3。将肿瘤片段分布在3个100MCS器皿中并且在其中用含有500mL含血清的CM1培养基和6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)和15ug OKT-3培养7天的时段。在第7天，通过以下来起始REP：将约5×108个负载有OKT-3的同种异体照射的PBMC饲养细胞的额外饲养细胞层并入三个100MCS器皿中的每一者中的肿瘤片段化培养阶段中并且用500mL CM2培养基和6,000IU/mL IL-2和30μg OKT-3培养。通过激活同一器皿中的整个启始第一扩增培养物来增强REP起始，所述激活是通过使用密闭系统流体将负载OKT3的饲养细胞转移到100MCS器皿中来实现。对于Gen 3，TIL规模扩大或拆分涉及以下过程步骤：将整个细胞培养物经由密闭系统流体转移而针对较大器皿进行按比例缩放并转移(从100M培养瓶转移到500M培养瓶)并且添加额外4L CM4培养基。在第16天收集REP，洗涤，配制并冷冻保存，然后在-150℃下运送至临床地点以用于输注。
总体而言，Gen 3过程为更短、可缩放性更高并且易于修改的扩增平台，其将适应稳定制造和过程可比性。
表50.示例性Gen 2和示例性Gen 3制造过程的比较。
在第0天，对于两种过程，将肿瘤洗涤3次并且将片段随机分组并且分成两个池；每种过程一个池。对于Gen 2过程，将片段转移到一个GREX 100MCS瓶中，所述瓶具有含有6,000IU/mL rhIL-2的1LCM1培养基。对于Gen 3过程，将片段转移到一个G-REX100MCS培养瓶中，所述瓶具有含有6,000IU/mL rhIL-2、15ug OKT-3和2.5×108个饲养细胞的500mL CM1。根据每个过程在不同的日子进行Rep起始日的TIL的接种。对于其中G-REX-100MCS培养瓶的体积降低90％的Gen 2过程，在第11天将经收集的细胞悬浮液转移到新的G-REX-500MCS中，以在含有IL-2(3000IU/mL)加5×109个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP起始。根据方案，将细胞扩增并在第16天拆分到多个具有CM4培养基和IL-2(3000IU/mL)的G-REX-500MCS培养瓶中。然后根据方案，在第22天收集培养物并冷冻保存。对于Gen 3过程，在第7天进行REP起始，其中使用相同的G-REX-100MCS进行REP起始。简而言之，向每个培养瓶中添加500mL含有IL-2(6000IU/mL)以及5×108个饲养细胞和30ug OKT-3的CM2培养基。在第9-11天，将培养物的规模扩大。将整个体积的G-REX100M(1L)转移到G-REX-500MCS中，并且添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将瓶温育5天。在第16天收集培养物并冷冻保存。
比较中包括三种不同的肿瘤，两种肺肿瘤(L4054和L4055)和一种黑素瘤肿瘤(M1085T)。
对于L4054和L4055，CM1(培养基1)、CM2(培养基2)和CM4(培养基4)培养基是预先制备的并且保持在4℃。在不进行过滤的情况下制备CM1和CM2培养基，以比较在进行和不进行培养基的过滤的情况下的细胞生长。
对于L4055肿瘤，在REP起始和规模扩大时，将培养基在37℃下升温至多24小时。
结果。对于所实现的总活细胞，Gen 3的结果在Gen 2的结果的30％以内。在再刺激后，Gen 3最终产物表现出更高的IFN-γ产量。如通过存在的总独特CDR3序列所测量，Gen 3最终产物表现出增加的克隆多样性。Gen 3最终产物表现出更长的平均端粒长度。
Gen 2和Gen 3过程的预REP和REP扩增遵循上文所描述的程序。对于每个肿瘤，两个池含有相等数目的片段。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达到每个瓶的最大片段数目。在Gen 2过程的第11天和Gen 3过程的第7天收集总预REP细胞(TVC)并进行计数。为比较两个预REP组，将细胞计数除以培养物中所提供的片段的数目，以计算每个片段的活细胞的平均值。如以下表51中所指示，与Gen 3过程相比，以每个片段计，在Gen 2过程中始终生长更多细胞。Gen 3过程的第11天的预期TVC数目的外推计算，计算方法是将预REP TVC除以7并且然后乘以11。
表51.预REP细胞计数
*L4055，未经过滤的培养基。
对于Gen 2和Gen 3过程，根据过程条件对TVC进行计数并且产生过程中的每一天的活细胞百分比。在收集时，收集第22天(Gen 2)和第16天(Gen 3)细胞并且产生TVC计数。然后，将TVC除以第0天提供的片段数目，以计算以每个片段计的活细胞的平均值。通过将收集TVC除以REP起始TVC来计算扩增倍数。如表52所示，比较Gen 2和Gen 3，对于L4054，扩增倍数是类似的；在L4055的情况下，Gen 2过程的扩增倍数更高。特定而言，在这种情况下，在REP起始日之前使培养基升温24。对于M1085T，在Gen 3中也观测到较高扩增倍数。Gen 3过程的第22天的预期TVC数目的外推计算，计算方法是将REP TVC除以16并且然后乘以22。
表52.TIL最终产物的总活细胞计数和扩增倍数。
*L4055，未经过滤的培养基。
表53：TIL最终产物的存活百分比：在收集后，针对存活百分比的放行标准来比较最终TIL REP产物。Gen 2和Gen 3过程的所有条件都超过70％存活率标准，并且在各过程和肿瘤中是类似的。
在收集后，针对存活百分比的放行标准来比较最终TIL REP产物。Gen 2和Gen 3过程的所有条件都超过70％存活率标准，并且在各过程和肿瘤中是类似的。
表53.REP的存活百分比(TIL最终产物)
由于每个瓶的片段数目低于最大所需数目，因此针对每个肿瘤计算在收集日所估计的细胞计数。所述评估是基于以下预期：临床肿瘤在第0天足够大以接种2个或3个瓶。
表54.将估计细胞计数计算值外推至Gen 3过程的全尺寸2和3个瓶。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型标记比较。三种肿瘤L4054、L4055和M1085T在Gen 2和Gen 3过程中都经历TIL扩增。在收集后，对REP TIL最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标志物。对于所有条件，TCR a/b+细胞的百分比超过90％。
与从Gen 2过程收集的TIL相比，从Gen 3过程收集的TIL显示更高的CD8和CD28的表达。Gen 2过程显示较高的CD4+百分比。
与从Gen 2过程收集的TIL相比，从Gen 3过程收集的TIL显示更高的中央记忆室的表达。
在来自两个肿瘤L4054和L4055的TIL中分析激活和耗竭标志物，以比较来自Gen 2和Gen 3TIL扩增过程的最终TIL产物。Gen 2和Gen 3过程的激活和耗竭标志物是类似的。
再刺激时的干扰素γ分泌。在收集日，即Gen 2的第22天和Gen3的第16天，对于L4054和L4055，使用经涂布的抗CD3板对TIL进行再刺激过夜。使用抗CD3、CD28和CD137珠粒对M1085T进行再刺激。在所有条件下，在再刺激24小时后收集上清液并且冷冻上清液。使用相同ELISA板同时对来自两种过程的上清液评估通过ELISA进行的IFNγ分析。在所分析的三个肿瘤中观测到来自Gen 3过程的较高的IFNγ产量。
培养基中的IL-2水平的测量。为了比较Gen 2与Gen 3过程的IL-2消耗，对于肿瘤L4054和L4055，在REP起始、规模扩大和收集日收集细胞上清液。通过来自R&D的QuantitateELISA试剂盒测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。一般趋势指示当与Gen 2过程相比时，Gen 3过程中的IL-2浓度保持较高。这可能归因于Gen 3的REP起始时的IL-2浓度较高(6000IU/mL)以及整个过程中培养基的残留。
代谢底物和代谢物分析。测量代谢底物(例如D-葡萄糖和L-谷氨酰胺)的水平作为整体培养基消耗的代替物。测量其互逆代谢物，例如乳酸和氨。葡萄糖是培养基中的单糖，线粒体利用其以ATP形式产生能量。当葡萄糖氧化时，产生乳酸(乳酸酯为乳酸的酯)。在细胞指数生长期期间大量产生乳酸酯。高水平的乳酸酯会对细胞培养过程产生负面影响。
对于Gen 2和Gen 3过程，在REP起始、规模扩大和收集日收集L4054和L4055的用过的培养基。在Gen 2的第11天、第16天和第22天并且在Gen 3的第7天、第11天和第16天收集用过的培养基。用CEDEX生物分析仪分析上清液中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
L-谷氨酰胺是细胞培养基制剂中所需的一种不稳定的必需氨基酸。谷氨酰胺含有胺，和此酰胺结构基团可向细胞输送和递送氮。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞会产生有毒的氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，向Gen 2和Gen 3过程的培养基中补充GlutaMaxTM，其在水溶液中更稳定并且不会自发降解。在两个肿瘤系中，Gen 3组在过程期间显示L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM的减少，以及整个REP中氨的增加。在Gen 2组中，观测到恒定的L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度，以及氨产量略微增加。对于氨，Gen 2和Gen 3过程在收集日时是类似的，并且显示L-谷氨酰胺降解的略微差异。
通过Flow-FISH重复端粒。使用Flow-FISH技术测量在Gen 2和Gen 3过程中，L4054和L4055上的端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。Gen 3显示与Gen 2类似的端粒长度。
CD3分析。为了测定每个过程中产生的细胞产物的克隆多样性，对L4054和L4055的经收集的TIL最终产物进行取样，并且经由T细胞受体的CDR3部分的测序来分析以用于克隆多样性分析。
表55显示Gen 2和Gen 3之间的在TIL收集细胞产物上，共有L4054上的独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物共有199个序列，对应于Gen 2最终产物中的前80％的独特CDR3序列中的97.07％是与Gen 3最终产物共有。
表55.L4054上Gen 2与Gen 3过程之间的共有uCDR3序列的比较。
表56显示Gen 2和Gen 3之间的在TIL收集细胞产物上，共有L4055上的独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物共有1833个序列，对应于Gen 2最终产物中的前80％的独特CDR3序列中的99.45％是与Gen 3最终产物共有。
表56.L4055上Gen 2与Gen 3过程之间的共有uCDR3序列的比较。
在不进行过滤的情况下预先制备CM1和CM2培养基并且保持在4℃下，直至用于肿瘤L4055以用于Gen 2和Gen 3过程。
对于L4055肿瘤，在REP起始日，使培养基在37℃下升温24小时以用于Gen 2和Gen3过程。
在过程中收集的上清液中未测量到LDH。
用K2 cellometer细胞计数器进行M1085T TIL细胞计数。
在肿瘤M1085T上，样品不可用，例如用于代谢分析的上清液；用于激活和耗竭标志物分析、端粒长度和CD3-TCR vb分析的TIL产物。
结论。此实施例针对功能质量属性以及Gen 2和Gen 3过程的扩展表型表征和培养基消耗来比较3个独立供体肿瘤组织。
根据所产生的总活细胞和总有核细胞群体的存活率来评价Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较。Gen 2(22天)与Gen 3(16天)的收集日的TVC细胞剂量之间无可比性。Gen 3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时所收集的总活细胞的约40％。
假设在第11天而非第7天进行预REP收集并且在第22天而非第16天进行REP收集，计算Gen 3过程的外推细胞数目。在此两种情况下，与Gen 2过程相比，Gen 3显示更接近的TVC数目，表明早期激活增强TIL生长。
在外推Gen 3过程中的其他瓶(2或3个)的值的情况下，假设所处理的肿瘤的尺寸更大，并且达到如所描述的每个过程所需的最大片段数目。观测到，与Gen 2过程的第22天相比，Gen 3过程在第16天进行的收集可达到类似的TVC剂量。这种观测结果是重要的，并且指示培养物的早期激活可减少TIL处理时间。
根据所产生的总活细胞和总有核细胞群体的存活率来评价Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较。Gen 2(22天)与Gen 3(16天)的收集日的TVC细胞剂量之间无可比性。Gen 3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时所收集的总活细胞的约40％。
就表型表征而言，与Gen 2过程相比，在Gen 3过程中在三个肿瘤上观测到较高的CD8+和CD28+表达。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程显示略微较高的中央记忆隔室。
尽管Gen 3过程的持续时间较短，但Gen 2和Gen 3过程显示类似的激活和耗竭标志物。
在所分析的三个肿瘤中，Gen 3最终产物上的IFNγ产量比Gen 2高3倍。此数据表明，与Gen 2过程相比，Gen 3过程产生功能强大并且更有效的TIL产物，这可能归因于Gen 3上的CD8和CD28的表达更高。表型表征表明，在三个肿瘤上，与Gen 2过程相比，Gen 3的CD8+、CD28+表达的阳性趋势。
Gen 2和Gen 3的TIL最终产物的端粒长度类似。
Gen 2和Gen 3最终产物的葡萄糖和乳酸盐水平类似，表明Gen 3过程的培养基上的营养物水平未受到影响，因为与Gen 2相比，在过程中的每一天都未进行减量去除并且过程中的整体培养基体积较小。
与Gen 2过程相比，整个Gen 3过程的处理时间减少约两倍，这将显著降低通过Gen3过程扩增的TIL产物的商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2过程中的IL-2消耗的一般趋势，并且在Gen3过程中，由于未去除旧培养基，因此IL-2较高。
通过CDR3 TCRab序列分析，Gen 3过程显示较高的克隆多样性。
在预REP的第0天添加饲养细胞和OKT-3允许TIL的早期激活并且允许使用Gen 3过程进行TIL生长。
表57描述与当前Gen 2过程相比，Gen 3过程的各种实施方案和结果。
表57.示例性Gen 3过程特征。
实施例10：示例性GEN 3过程(也称为GEN 3.1)
此实施例描述关于“用于TIL扩增的Gen 2和Gen 3过程之间的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在所述过程早期包括激活步骤，从而增加最终总活细胞(TVC)输出，同时维持表型和功能概况。如下文所描述，将Gen 3实施方案修改为另一个实施方案并且在本文中在此实施例中称为Gen 3.1。
在一些实施方案中，Gen 3.1 TIL制造过程具有四次操作员介入：
1.肿瘤片段分离和激活：在过程的第0天，解剖肿瘤并且产生各自为约3×3mm的最终片段(总共至多240个片段)并且在1-4个G-REX100MCS培养瓶中培养。每个培养瓶含有至多60个片段、500mL CM1或DM1培养基，并且补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3和2.5×108个经照射的同种异体单核细胞。将培养物在37℃下温育6-8天。
2.TIL培养物再激活：在第7-8天，在两种情况下，经由缓慢添加补充有6,000IUrhIL-2、30μg OKT3和5×108个经照射的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基来补充培养物。注意不要干扰培养瓶底部的现有细胞。将培养物在37℃下温育3-4天。
3.培养规模扩大：在第10-11天进行。在培养规模扩大期间，在两种情况下，将G-REX100MCS的全部内含物转移到含有4L补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的G-REX500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下温育5-6天直至收集。
4.收集/洗涤/配制：在第16-17天，将培养瓶体积减小并合并。将细胞浓缩并用含有1％ HSA的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。经洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比率配制，并且补充rhIL-2至最终浓度为300IU/mL。
通过受控速率冷冻将DP冷冻保存并储存在气相液氮中。*完整标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可替代被称为确定培养基(DM1或DM2)的CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，如上文所提及。
过程描述。在第0天，将肿瘤洗涤3次，然后片段化成3×3×3的最终片段。在将整个肿瘤片段化后，然后将最终片段同等地随机化并分成三个池。将一个随机化片段池引入每个组，根据三种实验基质添加相同数目的片段。
在整个TIL扩增过程中，使用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，并且使用确定培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完全培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM GlutaMaxTM、10％人类AB血清、庆大霉素(50ug/mL)、2-巯基乙醇(55uM)。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM2完全培养基2：50％ CM1培养基+50％ AIM-V培养基。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM4完全培养基4：补充有GlutaMaxTM(2mM)的AIM-V。最终培养基制剂补充有3000IU/mL IL-2。
补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)的CTS OpTmizerCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)以及CTSTM免疫细胞SR(3％)和GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有6,000IU/mL IL-2。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)以及CTSTM免疫细胞SR(3％)和GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有3,000IU/mL IL-2。
预先制备所使用的所有类型的培养基，即，完全(CM)和确定(DM)培养基，保持在4℃下直至使用前一天，并且在处理日之前预先在温育箱中在37℃下升温长达24小时。
对于两种肿瘤，在第7天进行TIL培养物再激活。对于L4063在第10天并且对于L4064在第11天进行规模扩大。收集两种培养物并在第16天冷冻保存。
达到的结果。测定Gen 3.0和Gen 3.1过程的细胞计数和存活百分比。在所有条件下的扩增都遵循此实施例中所描述的细节。
对于每个肿瘤，将片段分成三个相等数目的池。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达到每个瓶的最大片段数目。对于三种不同的过程，评估在每个条件下的总活细胞和细胞存活率。细胞计数测定为在第7天进行再激活时的TVC、在第10天(L4064)或第11天(L4063)进行规模扩大时的TVC，以及在第16/17天进行收集时的TVC。
第7天和第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将在第16/17天进行收集时的TVC除以第7天再激活日的TVC来计算扩增倍数。为了比较三个组，将收集日的TVC除以在第0天添加到培养物中的片段的数目，以计算以每个片段计的活细胞的平均值。
对L4063和L4064进行细胞计数和存活率测定。在两个肿瘤上，以每个片段计，Gen3.1测试过程比Gen 3.0过程产生更多的细胞。
总活细胞计数和扩增倍数；在过程期间的存活百分比。在再激活、规模扩大和收集后，获得在所有条件下的存活百分比。在第16/17天收集后，针对存活百分比的放行标准来比较最终TIL。在所有过程和肿瘤中，所评估的所有条件都超过70％的存活率标准并且是类似的。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型表征。对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标志物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+和CD8+细胞的群体百分比是恒定的。
进行REP TIL的扩展表型分析。在两个肿瘤中，TIL产物显示与Gen 3.0相比，在Gen3.1条件下更高的CD4+细胞百分比，并且在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，在Gen 3.0下更高的来自CD8+群体的CD28+细胞百分比。
从Gen 3.0和Gen 3.1过程收集的TIL显示与CD4+和CD8+细胞上的CD27和CD56表达类似的表型标志物，以及CD4+门控细胞群体上的类似的CD28表达。TIL最终产物上的记忆标志物比较：
将在第16天收集的TIL的冷冻样品染色以用于分析。Gen 3.0和Gen 3.1过程的TIL记忆状态是类似的。TIL最终产物上的激活和耗竭标志物比较：
CD4+和CD8+细胞上门控的Gen 3.0和Gen 3.1过程的激活和耗竭标志物是类似的。
再刺激后的干扰素γ分泌。对于L4063和L4064，使用经涂布的抗CD3板对经收集的TIL进行再刺激过夜。在所分析的两个肿瘤中，与Gen 3.0过程相比，观测到来自Gen 3.1过程的较高的IFNγ产量。
培养基中的IL-2水平的测量。为比较在所有条件和过程下的IL-2消耗水平，在第7天的再激活起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)的规模扩大和第16天/第17天的收集时收集细胞上清液并冷冻。随后将上清液解冻并且然后分析。通过制造商方案测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。
在相同培养基条件下评估的整个过程期间，整个Gen 3和Gen 3.1过程的IL-2消耗是类似的。对经收集的L4063和L4064的用过的培养基进行IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析。对于每种条件，在L4063和L4064的第7天再激活起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大和第16天/第17天收集时从L4063和L4064收集用过的培养基上清液。用CEDEX生物分析仪分析上清液的葡萄糖、乳酸酯、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
与完全培养基(2g/L)相比，确定培养基中的葡萄糖浓度较高，为4.5g/L。总体而言，在每个培养基类型中，Gen 3.0和Gen 3.1过程的葡萄糖的浓度和消耗是类似的。
观测到乳酸酯的增加，并且Gen 3.0和Gen 3.1条件以及用于再激活扩增的两种培养基(完全培养基和确定培养基)的乳酸酯的增加是类似的。
在一些情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺并且补充有2mM GlutaMaxTM以补偿L-谷氨酰胺在培养条件下天然降解为L-谷氨酸和氨。
在一些情况下，所使用的确定(无血清)培养基与基础培养基相比不含L-谷氨酰胺，并且仅补充有最终浓度为2mM的GlutaMaxTM。GlutaMaxTM是L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，并且不会自发降解为谷氨酸和氨。相反，二肽逐渐解离成个别氨基酸，从而保持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以维持稳定的细胞生长。
在一些情况下，谷氨酰胺和GlutaMaxTM的浓度在规模扩大日略微降低，但在收集日显示增加，达到与再激活日相比类似或更接近的水平。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度在不同条件下显示以类似速率进行的略微降低。
与在含有2mM GlutaMaxTM的确定培养基中生长的样品相比，在含有2mM谷氨酰胺+2mM GlutaMaxTM的标准培养基中生长的样品中的氨浓度更高。此外，如所预期，在培养过程中，存在氨的逐渐增加或积聚。在三种不同测试条件下，不存在氨浓度的差异。
通过Flow-FISH重复端粒。使用Flow-FISH技术测量在Gen 3和Gen 3.1过程中，L4063和L4064上的端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。进行端粒测定。比较样品与对照细胞系(1301白血病)中的端粒长度。对照细胞系为具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞系。在两种肿瘤中评估的Gen 3和Gen3.1过程显示类似的端粒长度。
TCR Vβ谱系分析
为了测定在每个过程中产生的细胞产物的克隆多样性，经由对T细胞受体的CDR3部分进行测序来分析TIL最终产物以进行克隆多样性分析。
在三种条件之间比较三个参数：
●独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
●共有uCDR3百分比
●对于前80％的uCDR3：
○比较共有uCDR3拷贝百分比
○比较独特克隆型的频率
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上的共有独特CDR3序列的百分比：Gen 3和Gen 3.1测试最终产物共有975个序列，等同于Gen 3的前80％的独特CDR3序列中的88％与Gen 3.1共有。
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上的共有独特CDR3序列的百分比：Gen 3和Gen 3.1测试最终产物共有2163个序列，等同于Gen 3的前80％的独特CDR3序列中的87％与Gen 3.1共有。
不同过程的由在第16天收集时经收集的1×106个细胞鉴定的独特CD3序列的数目。基于样品内的独特肽CDR的数目，Gen 3.1测试条件与Gen 3.0相比显示略微更高的克隆多样性。
香农熵(Shannon entropy)多样性指数为可靠和常用的比较度量，因为在两种肿瘤中，Gen 3.1条件与Gen 3过程相比显示略微更高的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系的多克隆性高于Gen3.0过程。
此外，对于肿瘤L4063和L4064，Gen 3.1测试条件的TCR Vβ谱系显示与Gen 3.0过程的相应谱系的超过87％的重叠。
在再激活日，用于Gen 3.1测试L4064的用过的培养基上的IL-2浓度值低于预期值(与Gen 3.1对照和Gen 3.0条件类似)。
所述低值可能归因于移液误差，但由于采集的样品极少，因此不可能重复测定。
结论。与Gen 3.0和Gen 3.1对照相比，在第0天包括饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1测试条件在第16天收集时显示更高的细胞剂量的TVC。Gen 3.1测试条件下的最终产物的TVC比Gen 3.0高约2.5倍。
对于所测试的两种肿瘤样品，在第0天添加OKT-3和饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，如果在第0天起始最多4个瓶，则最终细胞剂量可在80-100×109个TIL之间。
在Gen 3.1测试和Gen 3.0过程之间保持所有质量属性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗竭、激活和记忆标志物。
在所分析的两种肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen3.1中的最终TIL产物的IFN-γ产生比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生有效的TIL产物。
在各测试条件下未观测到葡萄糖或乳酸酯水平的差异。在各种培养基条件下，未观测到Gen 3.0与Gen 3.1过程之间的谷氨酰胺和氨的差异。培养基中的较低谷氨酰胺水平未限制细胞生长，并且表明仅在培养基中添加GlutaMaxTM就足以提供细胞增殖所需的营养物。
分别在第11天和第10天进行规模扩大，并且在过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示显著差异，并且在两种情况下，在整个过程期间的代谢物消耗是类似的。此观测结果表明Gen 3.0优化过程可在处理天数方面具有灵活性，由此促进制造时程的灵活性。
通过CDR3 TCRab序列分析所测量，与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示更高的克隆多样性。
图32描述Gen 3过程(Gen 3优化过程)的实施方案。标准培养基和CTS Optimizer无血清培养基可用于Gen 3优化过程TIL扩增。在使用CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基上的GlutaMaxTM的最终浓度增加至4mM。
实施例11：使用TALEN在TIL中的PD-1基因敲除
所述实施例说明使用TALEN生成PD-1基因敲除(KO)TIL。在此实施例中，一般程序如下：
第0天-预REP
第7天-激活
第12天-电穿孔
第13天-REP
第18天-规模扩大
第22天-收集
概述：本研究使用基因工程技术，以使用mRNA构建体永久性基因敲除PDCD-1基因(PD-1表面蛋白)。从1个肺(L4256)和2个黑素瘤(M1207和M1209)肿瘤生成PD-1KO TIL，然后进行表征。
背景：免疫检查点受体与其配体之间的接合已证实可抑制T细胞功能。PD-1为一种由激活/耗竭的T细胞表达的关键抑制调节剂，已得到广泛研究，并且为免疫疗法的主要靶标。鉴于抗PD-1疗法在改善癌症患者临床结果方面的成功，靶向PD-1/PD-L1轴的方法可增强免疫疗法的效率。过继性TIL疗法为癌症的补救性免疫疗法，在黑素瘤患者中有56％的客观反应。由于PD-1在体内抗原刺激下在TIL中受到调节，因此PD-1与肿瘤细胞表达的PD-L1之间的相互作用可能会抑制TIL功能。的基因编辑已在人类和小鼠T细胞中证明具有永久性基因破坏的高度特异性。在B16鼠类模型中，PD-1T细胞的过继性转移揭露了优异肿瘤控制与肿瘤部位浸润T细胞的增强的效应功能和增殖能力。因此，检查介导的PD-1KO是否可在过继性转移后增强TIL的体内功能。
实验设计：如图34中的实验布局所示进行临床制造规模操作，并且表42和表43中提供临床制造PD-1KO TIL过程的概述。
所述方法也适用于PD-1/CTLA-4双基因敲除TIL、PD-1/LAG-3双基因敲除TIL、PD-1/CISH双基因敲除TIL、PD-1/TIGIT双基因敲除TIL和PD-1/CBL-B双基因敲除TIL的生成。在此类情况下，在电穿孔步骤期间，可通过分别用PD-1和CTLA-4TALEN mRNA、PD-1和LAG-3TALEN mRNA、PD-1和CISH TALEN mRNA、PD-1和TIGIT TALEN mRNA或PD-1和CBL-B TALENmRNA对TIL进行电穿孔来生成双基因敲除。
表42：预REP、激活、电穿孔和静息过程纲要(第I部分)
表43：REP、规模扩大和收集过程纲要(第II部分)
结果：表44指定用于评价全规模实验效能的验收标准，表45指定所执行的额外最终产物表征测试，并且表46列出本研究中使用的肿瘤和相关组织学。
表44：过程中和收集产物放行测试和验收标准
表45：最终产物表征
表46：本研究中使用的肿瘤
第5天预REP总活细胞计数(TVC)产生平均45×106个细胞，平均存活率为73％。激活后的细胞翻倍对于所有三种肿瘤都一致。黑素瘤与宫颈适应症都显示相似的激活状态，激活标志物具有>50％CD25+和CD71+。然而，肺肿瘤L4213显示较低的激活标志物CD71表达，为33％。在所有三个样品中，Ki67表达始终大于90％，表明细胞正积极增殖。表47中总结了研究中使用的三种肿瘤的预REP和激活后的输出。
表47：预REP和激活后细胞培养总结
| 参数 | 验收标准 | L4256 | M1207 | M1209 |
| 片段数目 | ≤100个片段 | 73 | 40 | 95 |
| <![CDATA[TVC(×10<sup>6</sup>)]]> | ≥5 | 26.9 | 13.4 | 69.2 |
| 存活率(％) | N/A | 97.9 | 88.6 | 97.5 |
| <![CDATA[TVC(×10<sup>6</sup>)]]> | N/A | 120.0 | 37.8 | 419.0 |
| 存活率(％) | N/A | 92.0 | 82.6 | 92.8 |
| 翻倍(D7至D12) | N/A | 2.2 | 1.5 | 2.6 |
| CD45+/CD3+％ | N/A | 80.4 | 83.1 | 60.1 |
| <![CDATA[CD25+％<sup>1</sup>]]> | N/A | 92.2 | 88.5 | 66.8 |
| <![CDATA[CD71+％<sup>1</sup>]]> | N/A | 75.6 | 87.8 | 48.9 |
| <![CDATA[Ki-67+％<sup>2</sup>]]> | N/A | 78.6 | 81.0 | 7.3 |
1第10天激活后小组的门控策略：淋巴细胞>SSC单峰>FSC单峰>活细胞>CD3+CD45>CD25+/CD71+
2Ki67小组的门控策略：淋巴细胞>SSC单峰>FSC单峰>活细胞>CD45+>Ki67+
在第13天(静息后)计算存活率和TVC复苏率以确定电穿孔的效率。对于所有条件，电穿孔后细胞的存活百分比的复苏率范围为82-92％。在电穿孔样品中，TVC的复苏率范围为16-30％。来自电穿孔和静息的数据总结于表48中。
表48：电穿孔和REP起始总结
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)
1通过将电穿孔后TVC或存活率除以电穿孔前TVC或存活率并乘以100来计算复苏率。
2接种至REP中的TVC为每个肿瘤的所有D11 TVC中最低者，以保持所有条件下的一致性。
在实验和对照条件下使用相同数目的细胞起始REP。在REP规模扩大时，所有实验和对照条件平均扩增4次细胞翻倍。在REP收集时，TriLink实验组TVC产量与模拟对照组类似(TVC差异≤20％)。非电穿孔TVC产量略高于TriLink和模拟对照组。在第11天至第20天之间观测到平均9.8次细胞翻倍。
使用TriLink组的最终产物剂量分别为16.5、28.5和28.7×109，具有>90％存活率和>98％ CD45+CD3+细胞。最终产物为高度富集的TIL产物。
来自REP起始和收集的数据总结于表49中。
表49：REP后和收集总结
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)
1接种至REP中的TVC为每个肿瘤的所有D11 TVC中最低者，以保持所有条件下的一致性。
2通过将LOVO后TVC除以LOVO前TVC并乘以100来计算复苏率。
3如果所有细胞都向前进行至实验和对照条件中的假设产量。在第12天(电穿孔之前)，分配细胞用于实验(TriLink mRNA)和对照条件(模拟)。假设产量是通过将收集物乘以3倍来计算。
4细胞翻倍是根据公式“＝LOG(第22天TVC/第11天TVC)/LOG(2)”计算。
5LOVO未按方案进行。
6批料规模小，未进行LOVO
所有TriLinkmRNA条件都符合验收标准。
评价介导的PD-1KO TIL产物的基因敲除效率的数据总结于表50中。
表50：TIL PD-1KO总结
评价收集物TIL功能的数据(包括IFNg、颗粒酶-B和CD107a释放输出)总结于表51中。
表51：TIL功能总结
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)
1针对活细胞/CD3+进行刺激门控
TIL的功能性是基于最终产物与抗CD3/抗CD28/抗CD137Dynabeads的过夜刺激来表征。刺激24小时后收集上清液并冷冻。进行ELISA以评估释放至上清液中的IFNg和颗粒酶B的浓度。IFNg释放量大于500pg/mL，并且所有TIL培养物在刺激后都分泌高水平(15036pg/mL-40185pg/mL)的颗粒酶B。
CD107a(LAMP-1)为淋巴细胞去颗粒作用的标志物，与抗原刺激或多克隆刺激后表达的细胞毒活性相关(Aktas E等人,2009)。通过流式细胞术，对CD4+和CD8+细胞分析CD107a响应于PMA刺激的细胞表面表达持续2小时。表51中呈现的结果是相比于未刺激条件的测量CD107A表达。与先前研究中生成的TIL产物类似，当用PMA/IO(CD4+与CD8+TIL)刺激时，最终产物中的大部分TIL表达CD107A。
多色流式细胞术用于表征TIL纯度、同一性、REP TIL的记忆子集。≤1％的可检测B细胞、单核细胞或NK细胞存在于最终收集的TIL中(表11)。REP TIL主要由具有效应记忆分化的TCRa/b组成。CD4/CD8比率在样品之间可变，但在单一样品的不同条件之间一致。在实验条件和对照条件之间未观测到明显差异。
显示TIL纯度、同一性和记忆表型的数据总结于表52中。
表52：TIL纯度、同一性和记忆表型表征
注释：TIL纯度的门控策略如下所示：
单核细胞：活细胞％，CD14+
NK(自然杀伤)细胞：活细胞％，CD14-，CD3-，CD56+CD16+
B细胞：活细胞％，CD14-，CD3-，CD19+
T-CM-中央记忆T细胞
T-EM-效应记忆T细胞
T-EFF/TEMRA-效应记忆和RA+效应记忆
显示TIL激活以及CD4+、CD8+和CD3+TIL耗竭水平的数据总结于表53-55中。
表53：CD4+TIL的激活和耗竭状态
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)NE＝非电穿孔
1上表10中报告的历史值(n＝64)取自REP-0112中TIL-2小组的分析-lifileucel的扩展表型表征以及表型与临床反应之间的相关性分析。
2历史范围的门控策略和层级如下：FSC单峰>SSC单峰2>活细胞>CD3+>CD4+>CD4+频率％
表54：CD8+TIL的激活和耗竭状态
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)NE＝非电穿孔
1上表10中报告的历史值(n＝64)取自REP-0112中TIL-2小组的分析-lifileucel的扩展表型表征以及表型与临床反应之间的相关性分析。
2历史范围的门控策略和层级如下：FSC单峰>SSC单峰2>活细胞>CD3+>CD8+>CD8+频率％
TriLink mRNA条件的CD4和CD8分化、激活和耗竭状态与对照条件相当。
表55：CD3+TIL的激活和耗竭状态
T＝TriLink M＝模拟物(在无TALEN mRNA下电穿孔)NE＝非电穿孔
1上表10中报告的历史值(n＝64)取自REP-0112中TIL-2小组的分析-lifileucel的扩展表型表征以及表型与临床反应之间的相关性分析。
2历史范围的门控策略和层级如下：FSC单峰>SSC单峰2>活细胞>CD3+>CD3+频率％
CD3+群体中TriLink mRNA条件的激活和耗竭状态与对照条件相当。
结论：PD-1KO TIL过程是以临床制造过程规模开发以在20天内将PD-1KO TIL扩增至>16e9。使用以开发规模制造的TriLink mRNA的所有三个批料都符合放行参数的验收标准。
使用PD-1-KO TIL过程生成的TIL的所有质量属性，例如表型表征(包括纯度、记忆、激活、耗竭标志物和功能)都与黑素瘤Gen 2相当。参见表56。
总之，这项工作表明，在使用TriLink mRNA的临床制造PD-1KO TIL过程中，可实现大于50％的PD-1KO效率，从而支持将TriLink mRNA用于临床制造。
表56：总结表
替代的PD-1基因敲除(KO)TIL过程示于图35和表57中。
表57：PD-1 TIL培养的替代全规模过程概述
实施例12：基因修饰PDCD-1基因敲除(KO)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞疗法的临床前活性和制造可行性
背景
使用自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL；lifileucel，LN-145)的过继性细胞疗法在晚期实体肿瘤患者的免疫检查点抑制剂(ICI)后和未接受过ICI的环境中都展现出令人鼓舞的功效和安全性。一次性lifileucel TIL细胞疗法在晚期/不可切除黑素瘤患者的ICI后环境中实现持久反应(Sarnaik AA,Hamid A,Khushalani NI等人,J Clin Oncol.2021；39(24):2656-2666；Larkin JMG,Sarnaik A,Chesney JA等人,JClin Oncol.2021；39(增刊15):摘要9505.)，客观反应率(ORR)为36％，并且在33.1个月随访后未达到反应持续时间(DOR)。在未接受过ICI治疗的晚期黑素瘤患者中，lifileucel加派姆单抗的早期组合治疗导致60％ORR，和30％完全反应率(O'Malley D,Lee S,Psyrri A等人,JImmunother Cancer.2021；9(增刊2):摘要492)。
尽管有效的抗程序性细胞死亡蛋白(PD)-1ICI疗法受肿瘤渗透、内化和内吞清除不良的限制(Thurber GM,Schmidt MM,Dane Wittrup K.Adv Drug Deliv Rev.2008；60(12):1421-1434；Less JR,Posner MC,Boucher Y,Borochovitz D,Wolmark N,JainRK.Cancer Res.1992；52(22):6371-6374；Netti PA,Baxter LT,Boucher Y,Skalak R,JainRK.Cancer Res.1995:55(22):5451-5458；Bordeau BM,Balthasar JP.Cancer BiolMed.2021；18(3):649-664；Saga T,Neumann RD,Heya T等人,Proc Natl Acad Sci U SA.1995；92(19):8999-9003)；相比之下，TIL被主动转运至肿瘤中，可根据化学吸引独立移动，并且不会被清除或内化(Restifo NP,Dudley ME,Rosenberg SA.Nat RevImmunol.2018；12(4):269-281)。抗PD-1抗体的施用与免疫相关不良事件(AE)相关，这是由于经由T细胞的全身激活和增殖对免疫途径的非特异性上调(Postow MA,Sildow R,Hellmann MD.N Engl J Med.2018；378:158-168)。
IOV-4001为PDCD-1基因敲除(KO)TIL细胞疗法，可增强TIL细胞疗法的功效并且消除全身抗PD-1疗法的需要，同时避免与抗PD-1/PD-L1疗法相关的短期和长期全身性AE。转录激活因子样效应核酸内切酶(TALEN)为由DNA结合域和FokI核酸酶组成的杂合分子。针对编码PD-1的PDCD-1基因的两个TALEN臂的组合介导DNA双链断裂，导致基因破坏和PD-1失活(Gautron AS,Juillerat A,Guyot V等人,Mol Ther Nucleic Acids.2017；9:312-321；Menger L,Sledzinska A,Bergerhoff K等人,Cancer Res.2016；76:2087-2093；Qasim W,Zhan H,Samarasinghe S等人,Sci Transl Med.2017；9(374):eaaj2013)。已建立一种过程来生成TALEN介导的PDCD-1KO TIL并且将其扩增至治疗相关的数目，具有强大效应功能和指示功能性TIL的表型标志物(Ritthipichai K,Machlin M,Lakshmipathi S等人,Presented at the ESMO Virtual Congress；2020年9月19-21日.摘要1052P)。
此实施例描述IOV-4001(1)体内临床前活性，(2)临床规模制造过程开发，以及(3)表型和功能表征
方法
简而言之，移植有黑素瘤肿瘤细胞的hIL-2NOG小鼠接受自体PD-1KO TIL(使用mRNA构建体生成)、模拟TIL(无TALEN下电穿孔)、模拟TIL+抗PD-1抗体的过继性转移，或无过继性转移(各n＝14)。每周2次测量肿瘤大小，持续39天。建立22天临床规模制造过程，包括预快速扩增方案(预REP)、激活、电穿孔、静息和REP，用于生成PD-1KO TIL。最终PD-1KO TIL产物的特征在于总活细胞(TVC)、纯度(存活百分比)、同一性(CD45+CD3+％)和功能(PD-1KO效率)。
制造：
建立22天临床规模IOV-4001制造过程，包括预快速扩增方案(预REP)、激活、电穿孔、静息和REP，用于生成PDCD-1KO TIL(使用mRNA构建体)。开发操作是在Iovance Process Development(Tampa,FL)以非良好制造规范(GMP)规模产生。制造操作是在合同制造组织(CMO)以GMP制造规模产生。
体内抗肿瘤活性：
在巨细胞病毒启动子(hIL-2NOG)15的控制下表达人类白介素2(hIL2)的小鼠被移植黑素瘤肿瘤细胞并且接受(A)自体PDCD-1KO TIL、(B)模拟TIL(无TALEN下的TIL电穿孔)、(C)模拟TIL+抗PD-1抗体的过继性转移，或(D)无TIL过继性转移；(各n＝14)。每周测量两次肿瘤大小，持续39天。
产物放行：
最终PDCD-1KO TIL产物如下表征：
●总活细胞(TVC)和纯度(存活百分比)，使用NC-200TM(ChemoMetec,Denmark)自动化细胞计数仪通过吖啶橙/4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染测定
●同一性(CD45+CD3+表型)，通过免疫荧光染色和流式细胞术分析
●效能(干扰素-γ[IFNγ]释放)，使用IFNγELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)通过ELISA测定
PDCD-1KO效率是通过流式细胞术基于与模拟TIL比较的PDCD-1KO TIL的PD-1表达进行评价。
表型：
使用2个多色流式细胞术小组对最终收集的PDCD-1KO TIL产物测定扩展表型标志物，以表征TIL纯度、同一性、记忆子集、激活和耗竭状态。
表征：
IL-2测定：为评估PDCD-1KO TIL产物的安全性，在28天的时段内评估最终产物在无IL-2的情况下的体外增殖能力。
核型测定：细胞遗传学检查由NeoGenomics Laboratories(Fort Myers,FL,USA)进行。简而言之，将冷冻保存的PDCD-1KO TIL样品静息并激活以收集中期细胞用于G显带细胞遗传学分析。对有丝分裂细胞的三个重复物进行分析、固定和染色以进行G显带。
统计分析：
未配对的Student t检验用于分析表型差异，并且Wilcoxon秩和检验用于检测小鼠体内研究的差异；p<0.05视为具有统计学显著性。
结果
简而言之，对于用PD-1KO TIL(6±2.8)处理的小鼠，第39天的平均值±SEM肿瘤大小(mm2)显示相对于模拟TIL(26±8.5，P<0.05)、模拟TIL+抗PD-1(33±8.8，P<0.01)和无过继性TIL转移(112±8.4，P<0.0001)的优异肿瘤控制。PD-1KO TIL的6次临床规模制造操作的产物属性是可接受的，中值(范围)TVC、纯度和同一性分别为8.3×109(0.9×109–35.7×109)、94％(91％–99％)和99％(98％–99％)。中值(范围)PD-1KO效率为48％(31％–84％)。PD-1KO TIL功能和表型(分化、记忆、激活和耗竭)与模拟TIL相当。
如图38所示，相对于单独用模拟TIL或模拟TIL+抗PD-1抗体处理的小鼠，在PDCD-1KO TIL处理的小鼠中观测到增强的体内抗肿瘤活性。
如图39所示，所有PDCD-1KO TIL产物都符合剂量、纯度、同一性、效能和PDCD-1KO效率的放行标准。在开发操作与制造操作之间未观测到统计学显著差异。开发操作与制造操作都产生具有相当剂量(A)和存活率(B)的最终PDCD-1KO TIL产物。开发操作和制造操作中最终TIL产物的中值(范围)同一性(CD45+CD3+％)分别为98.5％(98％-100％)和98.7％(96％-99％)(C)。最终PDCD-1KO TIL产物的开发和制造操作中的中值IFNγ释放分别为4015pg/mL和4725pg/mL(D)。开发和制造操作中的中值(范围)PDCD-1KO效率分别为63％(48％-81％)和62％(31％-91％)(E)。PDCD-1KO TIL产物在生长、纯度、同一性和效能方面与模拟TIL相当。如先前研究(Ritthipichai K,Machlin M,Lakshmipathi S等人,Presented at the ESMO Virtual Congress；2020年9月19–21日.摘要1052P)所示，在开发操作中模拟与PDCD-1KO之间的剂量、纯度、同一性和效能结果相当(数据未示出)。
如图40所示，CD28标志物在开发和制造样品中的PDCD-1KO和模拟TIL中均高度表达，而其他标志物如CD27、CD57和KLRG1则以低水平表达(A)。使用CD45RA和CCR7表达限定幼稚(TN)、中央记忆(TCM)、效应记忆(TEM)和效应记忆RA+(TEMRA)T细胞子集。大多数TIL批次主要显示效应记忆表型(B)。在开发和制造操作中，PDCD-1KO和模拟TIL之间未观测到TIL分化标志物或记忆表型的统计学显著差异。
如图41所示，多色流式细胞术用于表征CD4+(A)和CD8+TIL(B)上的TIL激活和抑制性受体表达。在开发和制造操作中，在PDCD-1KO与模拟TIL之间未观测到标志物表达的统计学显著差异。
如图42所示，使用IL-2非依赖性增殖测定，证明在TALEN介导的基因组编辑后，无任何PDCD-1KO TIL产物发生恶性转化。在不存在IL-2(A和B)的情况下，经刺激(抗CD3/CD28)或未经刺激的样品均未增殖。在IL-2存在下培养的所有样品都显示增殖(A和B)。
来自PDCD-1KO TIL产物的核型分析结果总结示于图43中。在G显带分析中未观测到克隆染色体异常，表明在TALEN介导的PDCD-1基因组编辑后无基因毒性。通过G显带分析的所有样品都产生足够的中期细胞以进行全面研究；观测到正常G显带模式。
结论
在存在或不存在抗PD-1的情况下，PDCD-1KO TIL的体内抗肿瘤活性优于模拟TIL(无TALEN下电穿孔)，表明内源性PD-1抑制可赋予TIL优于抗体组合的功能优势。PDCD-1KOTIL临床规模制造是可行的，并且TIL产物质量属性和表型是可接受的。所有开发和制造操作中的TIL属性相当，并且符合产品放行标准。如通过IL-2非依赖性增殖测定所确定，在TALEN介导的基因组编辑后，PDCD-1KO TIL产物均未发生恶性转化。通过G显带未鉴定出TALEN诱导的克隆染色体异常。重要的是，TIL产物中缺乏完整PDCD-1KO可保留其他PD-1依赖性体内细胞功能。总之，这些数据支持IOV-4001(一种自体PDCD-1KO TIL细胞疗法)的临床研究作为晚期实体肿瘤患者的潜在治疗选择。
实施例13：OKT3与TransAct刺激的比较
方法
来自不同适应症(头颈、肺和乳房)的预REP TIL系(N＝4)经解冻、激活、电穿孔，并且进行11天REP过程。
用板结合OKT3(300ng/ml)或TransAct(1:100)刺激预REP细胞两天，接着在4mm间距电穿孔反应杯中对重悬于称为“T缓冲液”的电穿孔缓冲液中的5e6个细胞进行电穿孔，右臂或左臂PD-1 TALEN各4ug/1e6个细胞。
电穿孔后，细胞在30℃下在含IL-2的CM1培养基中静息过夜，接着进行REP。以不同数目(100k、50k、20k、10k)接种起始数目的模拟细胞，并且进行测试以比较基因敲除效率。
结果
图44A和图44B显示电穿孔前细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图44A显示与用OKT3或TransAct刺激2天后相比在解冻后的细胞存活率，并且图44B显示解冻和用OKT3或TransAct刺激后的复苏倍数。
图45A和图45B显示电穿孔后细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图45A显示用OKT3或TransAct刺激的细胞在30℃过夜后的复苏倍数，并且图45B显示用OKT3或TransAct刺激的细胞在30℃过夜后的存活率。
图46A-46C表明，在CD3+、CD8+和CD4+细胞的情况下，经TransAct刺激的TIL与经OKT3刺激的TIL相比显示较低的KO效率。
实施例14：30℃与37℃过夜静息的比较
方法
来自不同适应症(头颈、肺和乳房)的预REP TIL系(N＝4)经解冻、激活和电穿孔。
用TransAct(1:100)刺激预REP细胞两天，接着在4mm间距电穿孔反应杯中对重悬于T缓冲液中的5e6细胞进行电穿孔，右臂或左臂PD-1 TALEN各4ug/1e6个细胞。
电穿孔后，将细胞以相同数目接种于96孔板中，并且在30℃或37℃下在含IL-2或IL-15的CM1培养基中静息过夜。然后对细胞进行计数以确定复苏倍数和存活率。
结果
图47A和图47B显示所有条件(IL-2或IL-15)电穿孔后细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图47A显示细胞在30℃或37℃过夜静息后的复苏倍数，并且图47B显示细胞在30℃或37℃过夜静息后的存活率。
图48A和图48B显示当使用6000IU/mL IL-2时电穿孔后细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图48A显示细胞在30℃或37℃过夜静息后的复苏倍数，并且图48B显示细胞在30℃或37℃过夜静息后的存活率。
图49A和49B显示当使用各种条件时电穿孔后细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图49A显示当使用各种浓度的IL-2或IL-15时细胞在30℃或37℃过夜静息后的复苏倍数，并且图49B显示当使用不同浓度的IL-2或IL-15时细胞在30℃或37℃过夜静息后的存活率。
如实施例13中评价基因敲除效率。TIL用抗CD3/CD28珠粒以1个珠粒对5个细胞的比率刺激过夜。图50A-50C表明，在推荐的1:100稀释度下，在非GMP TransAct刺激下观测到KO效率降低。
实施例15：TALEN mRNA浓度和温育条件的比较
方法
来自不同适应症(头颈和乳房)的预REP TIL系(N＝3)经解冻、激活、电穿孔并且进行10天REP过程。
用OKT3(300ng/mL板结合)刺激预REP细胞两天，接着在1mm间距电穿孔反应杯中对重悬于T缓冲液中的1e6细胞进行电穿孔，右臂或左臂PD-1 TALEN各4ug、2ug、1ug、0.5ug/1e6个细胞。
电穿孔后，将细胞以相同数目接种在48孔板中，并且在30℃或37℃下在含IL-2的CM1培养基中静息过夜，接着进行REP。
结果
图51和图52显示用不同浓度的PD-1 TALEN mRNA电穿孔后细胞的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图51显示用不同浓度的PD-1 TALEN mRNA电穿孔后的细胞存活率，并且图52显示用不同浓度的PD-1 TALEN mRNA电穿孔后的复苏倍数。在用不同浓度的PD-1TALEN mRNA电穿孔后观测到存活率或复苏率无显著变化。
图53A和图53B显示细胞在30℃下用37℃或30℃的预热培养基过夜培养时的细胞存活率和复苏倍数。具体而言，图53A显示在30℃或37℃的预热培养基中培养的细胞在30℃或37℃过夜后的复苏倍数，并且图53B显示在30℃或37℃的预热培养基中培养的细胞在30℃或37℃过夜后的细胞存活率。当用37℃或30℃的预热培养基在30℃培养细胞过夜时，未观测到存活率或复苏率的显著变化。
如实施例13中评价基因敲除效率。图54A-54C显示CD3+、CD8+和CD4+细胞中的PD-1KO效率。PD-1 TALEN的最佳KO效率是在4ug mRNA/百万个细胞和30℃下静息过夜时观测到。此浓度可为靶标特异性的，并且也取决于在电穿孔期间使用的细胞浓度。在电穿孔过程期间使用的TALEN mRNA浓度似乎不影响复苏率和存活率。
实施例16：洗涤步骤和离心速度的比较
方法
来自不同适应症(头颈和肺)的预REP TIL系(N＝4)经解冻、激活(OKT3板结合300ng/mL)，并且经受通常在即将电穿孔之前进行的洗涤步骤。
预REP细胞经刺激两天，然后以各5e6个细胞分到单独的管中。它们用PBS洗涤，沉淀，用细胞穿孔缓冲液洗涤，沉淀，然后重悬于细胞穿孔缓冲液中。将细胞重悬于500uL细胞穿孔缓冲液中，并且通过在CM1中按1:10稀释细胞进行计数。每次旋转后进行细胞计数以确定在洗涤步骤中损失的细胞百分比。
使用不同的离心速度(400g、300g、200g，持续5分钟)重复所述程序，以提高细胞复苏率。
结果
图55A和图55B显示在执行涉及以400g离心5分钟和旋转3次的洗涤步骤时，在各种洗涤步骤之后的细胞数目(图55A)和存活率(图55B)。
图56A和图56B显示在400g、300g和200g旋转条件下使用PBS洗涤或Cyto洗涤后的细胞数目。
图57A和图57B显示在400g、300g和200g旋转条件下使用PBS洗涤或Cyto洗涤后的细胞存活率。
图58A和图58B显示各种旋转条件后细胞的总旋转比较细胞数目和总旋转比较细胞存活率，并且图59显示各种旋转条件后的总旋转比较细胞损失百分比。
结果表明，细胞穿孔缓冲液洗涤导致细胞损失，并且当在细胞穿孔缓冲液中以300g而非400g离心细胞时，复苏率可能会提高。因此，一个细胞穿孔缓冲液洗涤步骤可为优选的。
实施例17：OKT3与TransAct刺激的比较
方法
来自不同适应症(头颈和乳房)的预REP TIL系(N＝3)经解冻并且用OKT3板结合300ng/mL、TransAct 1:10和TransAct 1:17.5激活2天，并用PD-1 TAL进行电穿孔。
结果
图60A-60C显示在使用各种刺激方法的电穿孔期间的百分比损失和存活率，具体而言，洗涤步骤中的细胞损失百分比(图60A)、电穿孔后的细胞损失百分比(图60B)和电穿孔后的细胞存活率(图60C)。结果表明，与OKT3相比，TransAct刺激在电穿孔后表现出更好的复苏率和存活率。
图61A-61C显示使用各种刺激方法在CD3+(图61A)、CD4+(图61B)和CD8+(图61C)细胞中的PD-1基因敲除效率。结果表明，用OKT3和TransAct激活导致类似KO效率。
图62A-62B显示使用各种刺激方法的REP收集物的细胞存活率(图62A)和扩增倍数(图62B)。
实施例18：电穿孔后温育温度的比较
方法
来自不同适应症(头颈和乳房)的预REP TIL系(N＝2)经解冻并且用OKT3板结合300ng/mL激活2天，并用PD-1 TAL电穿孔。
电穿孔后，将细胞在不同温度(25、28、30、32、35、37℃)下温育过夜，并且在第二天进行REP。在过夜温育后评价细胞的细胞损失和存活率以及PD-1基因敲除效率。
结果
图63A-63B显示使用不同温育温度进行电穿孔后的细胞损失百分比(图63A)和细胞存活率(图63B)。
图64A-64C显示使用不同温育温度在CD3+(图63A)、CD4+(图63B)和CD8+(图63C)细胞中的基因敲除效率。
图65A-65B显示使用不同温育温度的REP收集物的扩增倍数(图65A)和细胞存活率(图65B)。
实施例19：刺激日时间选择比较
方法
来自不同适应症(头颈和乳房)的预REP TIL系(N＝2)经解冻并且在不同日期用GMP TransAct 1:17.5激活。(第0、3、5、7天)。
在第9天和第12天用PD-1 TAL对细胞进行电穿孔，以确定应刺激预REP细胞以最大化PD-1KO效率和预REP细胞数目的最佳日期。
结果
图66A-66C显示使用在不同日期刺激的细胞的细胞生长(图66A)、第一电穿孔基因敲除效率(图66B)和第二电穿孔基因敲除效率(图66C)。
图67显示使用在不同日期刺激的细胞在3天静息时的生长百分比。
实施例20：PD-1KO TIL产物概述
“PD-1KO TIL产物”为自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)制剂，所述淋巴细胞已用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)进行基因组编辑以破坏程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)的基因。PD-1 TALEN经工程化以结合与PDCD1基因上的核酸溶解目标位点相邻的不同DNA序列。DNA结合导致两个分开的FokI核酸内切酶域二聚化，产生功能性DNA核酸内切酶，其可在外显子2(PDCD1的中心蛋白质编码区)中产生序列特异性双链断裂(DSB)。通过内源性易错DNA修复途径(例如非同源末端连接(NHEJ))修复此DSB，导致核苷酸插入或缺失，从而破坏PD-1的蛋白质编码序列。
4步PD-1KO TIL产物制造过程是用于生产自体TIL产物lifileucel(IND 16317和16819)的方法的修改版本。此过程由以下组成：在IL-2存在下TIL生长的第一步骤，接着用TransAct(一种与人源化CD3和CD28激动剂缀合的无珠粒胶体聚合物纳米基质)短暂激活T细胞，PD-1KO TALEN mRNA(左臂和右臂)的电穿孔，30℃静息过夜和最终快速扩增方案(REP)步骤。
跨研究的PD-1KO TIL产物表征数据(表58)以及过程开发研究的数据表明，制造过程的变化不会影响产物质量(特性、存活率、PD-1基因敲除效率)并且导致PD-1的KO效率平均为约60％，在PDX小鼠模型系统中，在派姆单抗存在的情况下，其抗肿瘤活性优于模拟对照TIL。
表58.非临床研究列表
缩写：GLP＝良好实验室规范；IL-2＝白介素2；KO＝基因敲除；OCA＝寡核苷酸捕获测定；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白-1；PDCD1＝程序性细胞死亡蛋白-1的基因；PDX＝患者来源的异种移植物；TALEN＝转录激活因子样效应物核酸酶；TCR＝T细胞受体；TIL＝肿瘤浸润淋巴细胞
1本研究评估不同批次的PD-1KO TIL产物，其中一些批次被评估为GLP合规研究的一部分。
概述
所进行的非临床研究通过以下支持PD-1KO TIL产物起始临床研究的安全性：
●确认TIL中PD-1 TALEN的表达在电穿孔后是短暂的；
●经由使用NGS进行表征，确认OCA分析中鉴定的排名最高的20个潜在脱靶位点中有19个无TALEN相关诱变。在一个候选位点(Cand 3)检测到最小脱靶活性。这不太可能对产物构成安全风险，因为突变频率低，并且所述位点对应于与疾病无已知关联的非编码RNA基因座；
●在PD-1KO TIL药物产品的核型分析中，未鉴定出克隆染色体畸变，因此无证据表明TALEN介导的基因组编辑具有显著基因毒性；
●未发现IL-2非依赖性增殖的证据，因此证明在所测试的任何PD-1KO TIL药物产品中均无恶性转化。
此外，非临床研究基于以下观测结果支持PD-1KO TIL产物的潜在抗肿瘤活性和作用机制：
●在自体TIL的基因组中实现可再现的高水平的TALEN介导的PDCD1诱变(平均约60％)，其中PDCD1诱变率与PD-1表达的降低相关。因此，PD-1KO TIL产物构成真正的PD-1KO基因治疗产品。
●认为对抗肿瘤活性至关重要的自体TIL的一般特征经证明不受PD-1KO影响或积极影响，包括存活率、增殖能力、分化状态、记忆T细胞子集、激活/耗竭状态、TCR Vβ多样性、T细胞效应功能和细胞溶解活性。
●在使用ACT与PD-1KO TIL产物治疗的PDX小鼠模型中观测到增强的肿瘤负荷控制，相对于不使用ACT、ACT与未修饰的自体TIL以及ACT与未修饰的自体TIL联合抗PD-1抗体的对照研究组。
总之，这些研究表明，从各种肿瘤中分离、扩增和基因工程化以基因敲除PD-1的T细胞是安全的，在体外和体内模型中都具有强大的抗肿瘤活性。这些观测结果表明，PD-1KOTIL产物具有作为自身免疫疗法的潜力与可管理的安全性概况，可用于治疗构成未满足医疗需求的患者群体。
结果
图68A-68C显示PD-1基因敲除效率。图68A显示通过流式细胞术测量PD-1KO TIL产物上PD-1受体表达而确定的PD-1KO效率。图68B显示通过NGS测量具有插入/缺失的PDCD1基因总数确定的PD-1KO效率。图68C显示通过流式细胞术评估的PD-1KO效率与利用NGS确定的PDCD1基因修饰之间的相关性。
图69显示TALEN基因组编辑后PDCD1的大部分插入/缺失为核苷酸缺失。
表型表征
使用源自五种不同类型肿瘤(乳房(n＝5)、肺(n＝2)、HNSCC(n＝2)、黑素瘤(n＝2)和卵巢(n＝1))使用研究规模过程评价PD-1KO TIL产物相对于未经修饰的自体TIL的增殖能力、存活率和免疫表型。
细胞存活率和增殖能力
PD-1KO TIL产物具有与非电穿孔(NE)TIL相当的细胞存活率，两种类型样品的平均存活率约为93％。PD-1KO TIL产物的增殖能力也与NE TIL相当，在生产过程的REP步骤期间平均扩增倍数分别为1217和1565。
PD-1KO TIL产物与NE TIL的分化状态
PD-1KO TIL产物具有与NE TIL相当的分化状态，如由CD27、CD28、CD56、BTLA和KLRG-1的类似表达水平所确定。因此，PD-1失活不会改变TIL的分化状态。
PD-1KO TIL产物和NE TIL中的记忆T细胞子集
在本研究中，超过98％的PD-1KO TIL产物和NE TIL为T效应细胞(CD45RA-CCR7-)，而TCM子集(CD45RA-CCR7+)占所分析细胞的不到1％。重要的是，终末分化T细胞的比例可忽略不计。
PD-1KO TIL产物和NE TIL中的激活和耗竭状态
如CD69、CD25和DNAM的表达水平所指示，PD-1KO TIL产物的激活状态相对较高并且与NE TIL相当。与其最近的激活一致，PD-1KO TIL产物与NE TIL都表达高水平的共抑制分子(TIGIT和TIM-3)。这些结果表明激活和耗竭状态不会因PD-1失活而改变。
总之，PD-1的基因敲除不会显著影响TIL存活率、增殖能力或免疫表型，表明与这些生物学特性相关的PD-1KO TIL产物活性与未经修饰的自体TIL观测值相似。
图70A-70B显示CD3+PD-1-子集中TCR Vβ亚型在主体PD-1KO TIL产物和NE TIL中的分布。从肺肿瘤L4022(图70A)和乳腺肿瘤EP11017(图70B)生成的主体TIL用PD-1 TALENmRNA(PD-1KO)电穿孔或未电穿孔(NE)。在CD3+PD-1-T细胞子集中通过流式细胞术评估24个TCR Vβ家族。TCR Vβ亚型的百分比绘制于圆饼图中。所有未通过流式细胞术鉴定的剩余亚型经汇集并以浅蓝色(其他)显示。颜色代表各TCR Vβ亚型，如圆饼图下方的图例所示。
图71A-71B显示通过MLR和多功能性测量的PD-1KO TIL效应功能。对于图71A，从黑素瘤(n＝3)、乳腺癌(n＝1)和肺癌(n＝1)样品生成TIL，一式两份操作。测试NE TIL(黑色圆圈)和PD-1KO TIL(白色圆圈)对人类白细胞抗原(HLA)错配淋巴细胞的反应性。使用ELISA评估上清液的IFN-γ分泌。横条和竖条分别表示平均值和标准误差。通过配对student t检验评估统计学显著性。ns＝无统计学显著性。对于图71B，TIL是从黑素瘤(n＝1)和乳腺癌(n＝3)样品生成。多功能强度指数(PSI)为在单细胞水平上产生多种细胞因子的能力的测量值，在经激活的主体PD-1KO与NE TIL中进行测量。结果显示为涉及炎性(粉红色)、调节(米色)、化学吸引(紫色)、刺激(蓝色)和效应(绿色)途径的细胞因子的平均值与相关标准误差的条形图。通过配对student t检验评估统计学显著性。ns＝无统计学显著性。
体内研究：患者来源的异种移植(PDX)小鼠模型研究
本研究比较PD-1KO TIL产物与未经修饰的TIL在hIL-2转基因小鼠中生长的患者来源异种移植(PDX)模型中的抗肿瘤活性。本研究中使用源自新鲜切除的人类黑素瘤病灶(n＝1；M1152)的配对自体PDX肿瘤细胞系/TIL制剂。PD-1KO效率水平为75％。在M1152 PD-1KO与模拟TIL之间未观测到细胞存活率、增殖能力、分化、记忆T细胞子集或耗竭状态的差异。
PDX来源的黑素瘤肿瘤细胞系的表征
M1152 PDX肿瘤细胞系是从植入有黑素瘤肿瘤片段的NSG小鼠中生长的PDX肿瘤生成。PDX黑素瘤细胞系是通过经由流式细胞术测量称为黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)的黑素瘤肿瘤特异性标志物和PD-L1表达来表征。大约80％的肿瘤细胞表达MCSP蛋白，表明这些细胞中大部分为黑素瘤来源的。IFN-γ治疗在48小时内诱导PD-L1从13％上调至82％。这概括了肿瘤细胞在肿瘤细胞溶解期间响应于T细胞分泌IFN-γ而增加PD-L1表达的体内抗药机制，并且支持M1152 PDX模型评估M1152 PD-1KO TIL活性的相关性。
M1152 PD-1KO TIL的体内肿瘤负荷控制
为确定PD-1KO TIL对肿瘤生长的影响，将PD-1KO或模拟TIL过继性转移到植入有自体黑素瘤细胞的hIL-2NOG小鼠。包括抗PD-1和模拟TIL的组合作为PD-1/PD-L1途径阻断的对照。PD-1KO TIL的体内功效通过肿瘤负荷降低进行评估。
图72显示M1152 PD-1KO TIL产物的体内抗肿瘤活性。移植有黑素瘤肿瘤细胞的hIL-2NOG小鼠(每个治疗组n＝14)用PD-1KO或模拟TIL进行过继性转移。与模拟TIL组合的抗PD-1抗体治疗作为PD-1/PD-L1阻断的对照包括在内。通过长度×宽度计算肿瘤体积，并且将其绘制为肿瘤植入后时间的函数。通过Wilcoxon秩和检验评估统计学显著性，*、**和****分别指定P值<0.05、<0.01和<0.0001，并且视为统计学显著性的。
在接受或不接受抗PD-1抗体治疗的PD-1KO和模拟TIL治疗的小鼠中观测到肿瘤缩减。这表明TIL可识别并溶解移植的肿瘤细胞，从而验证TIL经由MHC和TCR的接合对肿瘤的特异性识别。此外，即使与抗PD-1治疗组合，PD-1KO TIL也能引起相对于模拟TIL的优异肿瘤控制。由于hIL-2NOG小鼠具免疫缺陷，并且缺乏初级和次级淋巴器官，因此抗PD-1未能提高模拟TIL的体内功效表明，全身性PD-1抑制的体内机制可能需要完整的免疫系统。相反，PD-1KO TIL的抗肿瘤活性相比于模拟TIL有所改进，表明内源性PD-1抑制赋予TIL功能优势。
因此，所述研究表明，TALEN介导的PD-1KO赋予TIL功能优势。此发现与若干已发布研究一致，所述研究描述PD-1KO T细胞相对于未经修饰的T细胞控制肿瘤生长的能力增强(Menger 2016，Marotte 2020)。
图73A-73B显示通过蛋白质印迹法测量的自体TIL中的TALEN蛋白持久性作为时间的函数。从黑素瘤(n＝6；M1011、M1017、M1025、M1030、M1034、M1040)生成的TIL用PD-1TALEN mRNA进行电穿孔。NE TIL用作基线对照。在电穿孔后第8、10、12、14、18小时(图73A)和第1、2、4、6天(图73B)时，通过蛋白质印迹法在来自TIL的全细胞提取物中检测到TALEN蛋白。TALEN特异性条带的强度通过光密度测定法进行量化，所得OD值按时间点取平均并且背景针对NE TIL的平均值进行校正。平均值绘制为条柱，并且标准误差显示为垂直线。
PD-1 TALEN中靶位点和候选脱靶位点的诱变的量化
关于每个候选(cand)脱靶位点的信息包括于表59中。
表59.脱靶位点分析
IL-2非依赖性增殖测定
至分析的第28天，在不存在IL-2的情况下，使用CD3/CD28激活评价的PD-1KO TIL产物样品均未增殖。在存在IL-2的情况下培养的所有样品至第28天均增殖，最少扩增1.7倍并且最多扩增407倍。值得注意的是，配对的TALEN编辑的TIL和从同一肿瘤分离的未经修饰的TIL具有跨样品可比的总体扩增倍数。结果通过证实在不存在IL-2的情况下无细胞增殖而证实PD-1KO TIL药物产品的安全性，表明此产品中无细胞发生恶性转化。
细胞遗传学/核型分析
观测到两种异常核型，其中在分析中的20个中期扩散中有4-5个检测到X染色体单体性。这些结构异常在非基因组编辑的TIL样品和TALEN编辑的TIL样品中均检测到，因此这种异常不能归因于TALEN介导的基因组编辑。此外，如在200个中期细胞的细胞遗传学分析中所评估，与未经修饰的TIL相比，用PD-1 TALEN编辑的TIL未观测到诱变的显著增加。根据结果得出结论为，在任何测试的样品中均无TALEN诱导的克隆染色体畸变的证据，因此在TALEN介导的基因组编辑后未鉴定出显著基因毒性。
实施例21：示例性TIL制造过程
图74A-F中描绘了示例性TIL制造过程。简而言之，在第0天，分离hypothermosol中的肿瘤组织，将生物负载样品储存于运输培养基中，并且将肿瘤片段接种至多个(2、3或4个)G-Rex 100MCS培养瓶中，密度≤50个片段/瓶。过量片段被快速冷冻。在一些实施方案中，可将激活步骤并入预REP步骤中，其为玫瑰花结/肿瘤ME内的TIL提供更好的共刺激环境。例如，在第3天，将60ug OKT3或TransAct添加到多个G-Rex 100MCS培养瓶中的每一者中，并且细胞进行第一次激活。在第7/8天，体积减小，样品经过滤并转移到汇集的EXP1000。取出样品用于细胞计数/存活率分析。将细胞洗涤，以400g、20℃离心10分钟，并且按≥9:1的比率分成TALEN样品和对照样品。将细胞重悬于T缓冲液中，并且以10×106个/反应杯用TALEN mRNA(TALEN样品)或无RNA(对照样品)进行电穿孔。将来自每个反应杯的电穿孔对照和TALEN样品接种于装有100mL培养基(含6000IU/mL IL-2)的G-Rex100M培养瓶中，并且在37℃下温育1小时。饲养细胞经照射、解冻、汇集并与IL-2一起温育。取出样品用于细胞计数和存活率分析。将饲养细胞和额外的IL-2和OKT3添加到G-Rex 100MCS培养瓶中的温育对照和TALEN样品中以生成REP培养物(1x G-Rex 100MCS用于对照REP培养，≤9x G-Rex100MCS用于TALEN REP培养)。在第10/11天，将500mL培养基连同3000IU/mL IL-2一起添加到REP培养物的每个培养瓶中。或者，可将细胞培养基完全更换为新培养基。这个步骤无需转移细胞悬浮液，并且不使用G-Rex 500MCS。第16天体积减小，并且将样品汇集。样品经由血液过滤器转移，并且取出样品用于细胞计数/存活率分析。将对照样品离心，并且生成对照最终制剂并在受控速率冷冻下冷冻保存。TALEN样品经由LOVO系统进行处理，并且生成TALEN滞留物最终制剂并在受控速率冷冻下冷冻保存。然后对配制的产物样品进行质量控制分析。
此过程具有以下优点：a)去除用于在袋中激活的悬浮液转移步骤；b)允许1/10规模控制；c)去除至G-Rex10的过程内转移；d)去除30℃的过夜温育步骤，而进行环境温度培养基立即再激活(REP)；和e)去除1个处理日。
实施例22：评价输注PD-1KO TIL的功效和安全性的1/2期研究
引言
PD-1基因敲除肿瘤浸润淋巴细胞(PD-1KO TIL)产物的1/2期开放标签研究在患有不可切除或转移性黑素瘤或III期或IV期非小细胞肺癌的参与者中进行。
PD-1KO TIL产物为一种历经转录激活因子样效应物核酸酶基因组编辑以破坏编码PD-1的基因PDCD1的自体TIL产物。此方案将评价PD-1KO TIL产物作为具有不可切除或转移性黑素瘤或III期或IV期NSCLC的参与者的治疗方法。
研究原理
本研究为PD-1KO TIL产物的首次人体研究。评价了PD-1KO TIL产物的抗肿瘤活性和其以类似于非基因组编辑的自体TIL产物的方式直接靶向和杀死肿瘤细胞的能力，但由于PDCD1破坏而具有增强抗肿瘤活性的潜力。
与假设一致，在源自患者的异种移植小鼠模型中，观测到PD-1KO TIL产物相对于非基因组编辑的自体TIL的抗肿瘤活性有所提高。PD-1KO TIL产物的概念验证非临床研究进一步表明，TALEN介导的PDCD1诱变水平可再现，与PD-1细胞表面表达的降低相关，并且表明被视为对抗肿瘤活性至关重要的自体TIL的一般生物学特性未受PD-1基因敲除影响或受到积极影响。在不存在与人类TIL测试相关的传统非临床动物模型的情况下，体外研究支持PD-1KO TIL产物的安全性。在排名最高的20个潜在脱靶位点中的1个检测到低脱靶活性。由于突变频率低并且此位点对应于与疾病不具有已知关联的非编码RNA，因此这不太可能成为产物的安全风险。额外的体外研究表明，在TALEN介导的基因组编辑后，没有与TALEN相关的克隆染色体异常。
背景
不可切除或转移性黑素瘤以及III期和IV期NSCLC都是医疗需求显著未满足的恶性疾病。尽管最近黑素瘤治疗取得进展，包括ICI(例如，抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4[CTLA-4]和抗PD-1单克隆抗体[mAb])和靶向疗法(例如，原癌基因B-Raf[BRAF]和丝裂原激活蛋白激酶[MEK]抑制剂)，但不可切除或转移性黑素瘤仍难以治疗并且仍为一个重大的公共卫生问题(Howlader 2020；Steininger 2021)。虽然目前有几种有效的NSCLC疗法，包括ICI(即纳武单抗和派姆单抗)、铂双重化学疗法和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其他针对驱动突变阳性肿瘤的靶向疗法，但均未能提供足够的活性和持久性癌症控制。最终，经由可用的最初有效疗法，大多数肿瘤进展。因此，尽管ICI获得批准，但在可用护理标准疗法上取得进展的黑素瘤和NSCLC患者仍存在显著未满足的医疗需求。
自体TIL已证实持久反应并且有可能解决具有转移性黑素瘤的临床试验参与者在批准疗法后的主要未满足的需求，所述参与者治疗选择有限，包括抗PD-1/PD-L1疗法的原发性难治性患者(Rosenberg2011；Larkin 2021；Sarnaik 2021)。类似地，初步数据表明，TIL在先前接受过包括ICI在内的一系列治疗中出现疾病进展的NSCLC参与者以及患有表皮生长因子受体(EGFR)驱动突变阳性肿瘤的参与者中引起具有临床意义的反应(Creelan2021；Schoenfeld 2021)。
TIL的抗肿瘤活性可通过淋巴细胞与肿瘤微环境之间的相互作用来抑制。特别是，当T细胞表面上的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合时发生的信号传导会对T细胞抗肿瘤活性产生负面影响。与此发现一致，特异性阻断PD-1/PD-L1途径的多种抗体疗法，例如抗PD-1抗体派姆单抗和纳武单抗，作为单一药剂以及与非基因组编辑的自体TIL组合都显示出在实体肿瘤中的强大活性。值得注意的是，除了有希望的抗癌活性外，用非基因组编辑的自体TIL疗法与抗PD-1抗体的组合在不可切除或转移性黑素瘤、复发性和/或转移性头颈部鳞状细胞癌以及持续性、复发性或转移性宫颈癌中的临床研究为在TIL过继性细胞疗法(ACT)情形下使PD-1信号传导失活的安全性提供初步证据，表明安全性概况与个别疗法的概况一致(O'Malley 2021)。这与迄今为止在转移性黑素瘤参与者中进行的其他研究(其评价TIL疗法与免疫检查点抑制的组合)(Besser 2013；Mullinax 2018)以及一项调查在NSCLC参与者中施用TIL疗法与纳武单抗的组合的研究(Creelan2021)的结果一致。
由于经由T细胞的激活和增殖对免疫途径进行非特异性上调，因此抗PD-1抗体的全身施用产生AE。作为这种治疗的潜在替代方案，TALEN基因组编辑技术用于使自体TIL中的PDCD1特异性失活，从而制成PD-1KO TIL产物PD-1基因敲除产物。通过限制对治疗性肿瘤源T细胞的PD-1信号传导的抑制，期望PD-1KO TIL产物疗法应提供一种更安全的替代方案，以代替ICI治疗，ICI赋予PD-1途径的系统性抑制作用。此外，与需要重复施用的抗PD-1抗体方案相比，PD-1KO TIL产物疗法有可能作为一次性治疗提供临床效益。
效益/风险评估
目前尚无PD-1KO TIL产物的临床安全性数据可用，因为这是PD-1KO TIL产物的首次人体研究。无来自ACT与经基因组编辑以基因敲除PD-1的自体TIL的研究的临床安全性数据；然而，有来自单独施用或与抗PD-1抗体组合施用的非基因组编辑的TIL方案的安全性数据。来自非基因组编辑的TIL产物研究的安全性数据视为相关的，因为它是使用PD-1KO TIL产物制造过程的衍生过程制造的，具有与PD-1KO TIL产物相同的配方，并且作为类似于PD-1KO TIL产物提议方案的方案的一部分进行施用。
下文呈现的风险和效益评估是基于与NMA-LD和IL-2施用相关的观测结果，如其相应处方信息中所报告，以及与PD-1KO TIL产物类似治疗的临床经验，特定而言单独施用或与抗PD-1抗体组合施用的非基因组编辑的自体TIL产物，作为类似于PD-1KO TIL产物提议方案的方案的一部分。
效益评估
对参与者的潜在效益包括接受研究干预的可能性，所述干预可能会停止、减缓或逆转缺乏有效治疗选择的患者群体的癌症进展。
总体效益风险结论
考虑到以下，PD-1KO TIL产物治疗方案的效益-风险概况适合计划纳入研究IOV-GM1-201中的参与者：
●单独或与抗PD-1抗体组合施用的非基因组编辑的自体TIL方案(即NMA-LD、IL-2和非基因组编辑的自体TIL产物)的已知毒性为可监测和可管理的，
●为将参与者的风险降至最低而采取的措施，
●缺乏为研究人群提供持久效益的有效治疗选择，以及
●这种新疗法有可能改进现有的基于TIL的实体肿瘤治疗方案和PD-1抑制剂治疗的抗肿瘤活性和安全性概况
目标和终点
研究设计
总体设计
这是一项具有安全性导入期的1/2期、开放标签、非随机、多队列、多中心研究，在患有不可切除或转移性黑素瘤(队列1)或III或IV期NSCLC(队列2)的参与者中评价使用PD-1KO TIL产物的自体TIL方案。在每个队列中，从每名参与者切除肿瘤样品并进行离体培养以制造IOV-4001。在包括环磷酰胺和氟达拉滨的淋巴细胞耗竭化学疗法后，参与者被输注PD-1KO TIL产物，并且接着为IL-2。在安全性导入期间，2个队列中任一队列的前3名参与者将以交错方式接受治疗。一旦每名参与者成功完成28天DLT观测期(在PD-1KO TIL产物输注时开始)，下一名参与者可能会获得继续进行NMA-LD的授权。后续招募将遵循标准3+3降级设计，允许额外参与者在评价新兴PD-1KO TIL产物安全性和耐受性数据时加入。这些安全性数据将由SRC审查，所述SRC由赞助商代表和所有已招募DLT可评价参与者的研究人员组成，以关于剂量水平决策提出建议。总体安全性将由独立DSMB进行监测。在前3至6名参与者通过DLT观测期并获得DSMB批准后，两个队列的研究招募将继续进行，参与者之间不会实施交错期。
研究设计的科学原理
所述研究的设计无对照组，因为这些经大量预治疗的参与者没有替代性有效治疗选择可为研究人群提供持久效益。尽管不存在比较者，但考虑到参与者的晚期难治性疾病的性质以及研究干预(自体TIL方案)作为一次性单一疗法施用的事实，研究期间观测的任何主要肿瘤消退都可推测为归因于研究干预。
本研究第2阶段部分的主要功效终点，即根据RECIST v1.1的ORR，为用于在单臂研究中评价肿瘤反应的已验证方法。
研究人群
不允许对招募标准的方案偏差进行前瞻性批准，也称为方案弃权或豁免。
关键纳入标准
只有符合以下所有标准，参与者才有资格被纳入研究：
1.参与者在签署知情同意书时年满18岁。
2.经组织学或病理学确诊为IIIC、IIID或IV期不可切除或转移性黑素瘤(队列1)或III期或IV期NSCLC(队列2)的参与者。
3.曾接受过以下先前疗法的参与者：
队列1(黑素瘤)：在使用PD-1/PD-L1阻断抗体进行全身治疗期间或在最后一剂PD-1/PD-L1阻断抗体后12周内经历有记录的影像学疾病进展的参与者。如果肿瘤为BRAF V600突变阳性，则参与者也接受BRAF抑制剂加或不加MEK抑制剂。
队列2(NSCLC)：先前已接受不超过3线先前疗法的参与者，和
●无致癌基因驱动肿瘤的参与者在使用PD-1/PD-L1阻断抗体进行全身治疗期间或在最后一剂PD-1/PD-L1阻断抗体后12周内经历有记录的放射学疾病进展
●或对于具有可用有效靶向疗法(例如，EGFR、间变性淋巴瘤激酶[ALK]、ROS原癌基因[ROS]或编码MET酪氨酸受体激酶[MET]的原癌基因)的致癌基因驱动肿瘤的参与者，参与者在至少1线适当靶向疗法和铂类双重化学疗法期间或之后，或在使用PD-1/PD-L1阻断抗体的全身治疗期间或在最后一剂PD-1/PDL1阻断抗体后12周内经历有记录的放射学疾病进展。
4.ECOG体能状态为0或1的参与者。
5.被评估为具有至少一个可切除病灶的参与者
6.先前经照射的病灶在收集前必须有放射学进展。
7.有生育能力的参与者或有生育能力伴侣的参与者必须愿意在治疗期间和接受所有方案相关治疗后的12个月内实施经批准的高效节育方法
关键排除标准
如果符合以下任何标准，则参与者被排除在研究之外：
1.患有严重心脏病的参与者。
2.患有葡萄膜/眼源性黑素瘤的参与者。
3.有症状并且未经治疗的脑转移的参与者。
4.具有任何形式的原发性免疫缺陷的参与者。
5.在之前3年内患有另一种原发性恶性疾病的参与者。
6.在NMA-LD开始前28天内已接受或将要接受活疫苗或减毒疫苗的参与者。
实施例22的参考文献
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实施例23：氙电穿孔仪评价
进行一项研究以确定氙电穿孔仪(Thermo)是否可用于生成PD-1KO TIL的过程。研究结果总结于图76中。
方法概述
激活的REP或预REP TIL用于实验
●REP TIL：演示日，氖实验1，氙实验1
●预REP TIL：氙实验3、氙实验4
●使用TransAct激活5天
电穿孔的细胞准备日(跨实验相同)：
●将缓冲液平衡至室温
●1x PBS洗涤TIL
●1x电穿孔缓冲液(Thermo-CTSTM氙TM基因组编辑缓冲液)洗涤TIL
●离心并重悬于最终体积的电穿孔缓冲液中
○单次注射需要每个样品1ml的精确体积(最大100e6/ml)
○氖体积可为10ul或100ul(最大20e6/ml)
●添加mRNA(GFP 1ug/1e6个细胞，TALEN 4ug/1e6个细胞)
●电穿孔
●在G-Rex10(如果使用>10e6，则拆分成2个G-Rex10)中的CM2+3000IU/ml IL-2中静息过夜
●37℃，对于GFP mRNA
●30℃，对于TALEN mRNA
●使用150um细胞滤器收集静息样品和菌株
●进行细胞计数并进行流动式染色或REP(氙实验4)
实验1：演示日，Thermo
●用GFP mRNA测试激活的REP TIL(L4346)
●解冻(第0天)和激活(第1天)50e6+TransAct
●1ug/1e6个细胞的GFP mRNA(储备液，1mg/ml)
●使用Thermo推荐的优化方案进行电穿孔
●单次注射(范围为每1ml 2e7-1e8个细胞)–20e6/ml
●氖–2e6/100ul
●测试参数：
○复苏率和存活率
○24小时后根据流式细胞术的GFP(L/D aqua和FITC，对于GFP)
○24小时后根据流式细胞术的Annexin V
如图77所示，结果表明24小时后，1700/20/1和2300/3/4显示更高的GFP表达和复苏率。
实验2：氖实验1
●目的：使用氖优化氙演示期间确定的2种电穿孔设置，并且与BTX进行比较
●细胞浓度：氖-100μl中2e6个细胞
●氙的骨干电穿孔设置：
○1700/20/1
○2300/3/4
●改变持续时间(ms)和脉冲数，同时保持电压设置不变
●测试参数：
○复苏率和存活率
○24小时后根据流式细胞术的GFP(L/D aqua和FITC，对于GFP)
○24小时后根据流式细胞术的Annexin V
如图78所示，结果表明2300/3/4Thermo推荐设置(5*)具有最高GFP表达和60％复苏率，并且复苏率在2300V电压设置下得以改进，持续时间更短(2ms)并且更少脉冲(3)，GFP表达减少。
实验3：氙实验1
●目的：确定细胞浓度对氙GFP表达和复苏率的影响
●N＝1个激活的REP TIL样品(EP11231)
●氙与BTX
●电穿孔条件：2300/3/4，根据最高GFP表达和60％复苏率选择
●使用单次注射测试细胞浓度
○1e6/ml
○5e6/ml
○10e6/ml
○25e6/ml
●BTX对照
○10e6+GFP(于400μl中，因此浓度为25e6/ml)
○2e6模拟物
●测试参数：
○复苏率和存活率
○24小时后根据流式细胞术的GFP(L/D aqua和FITC，对于GFP)
如图79所示，结果表明与BTX相比，使用氙时GFP表达略有降低，GFP表达不受细胞浓度影响，细胞浓度较低时复苏率降低并且细胞浓度较低时细胞凋亡增加。24小时后，2300/3/4似乎对低细胞浓度有毒。
实验4：氙实验3
目的：使用展现最高复苏率的EP设置确定细胞浓度(低/高)对氙GFP表达和复苏率的影响。
●N＝1个激活的预REP TIL样品(K7136)
●氙与BTX
●电穿孔条件：
○1400/30/1
○1700/20/1
○2300/2/3
○2500/2/5
●使用单次注射测试细胞浓度
○5e6/ml
○25e6/ml
●BTX对照
○5e6+GFP(于200μl中，因此浓度为25e6/ml)
○1e6模拟物
●测试参数：
○复苏率和存活率
○24小时后根据流式细胞术的GFP(L/D aqua和FITC，对于GFP)
如图80所示，结果表明样品间存在高GFP表达，与BTX相当，并且5e6与25e6之间的差异极小。对于EP设置1400/30/1和2300/2/3，5e6与25e6之间有类似复苏率，并且24小时后，2300/2/3复苏率与BTX相当。
实验5：氙实验4
●目的：使用TALEN mRNA比较氙电穿孔仪与BTX电穿孔仪。
●N＝1个激活的预REP TIL样品(L4374)
●氙与BTX
●电穿孔条件：
○2300/2/3
●条件：
○氙Talen(25e6)
○氙模拟物(5e6)
○BTX Talen(25e6)
○BTX模拟物(5e6)
●测试参数：
○复苏率和存活率
○根据流式细胞术的PD-1KO
■电穿孔后的静息样品(未经REP)上操作的PD-1期中KO流式数据
■REP收集样品的最终PD-1KO流式数据
如图81所示，结果表明氙与BTX的复苏率在5e6与25e6之间相似，并且使用氙的复苏率略高，期中PD-1KO效率(电穿孔后的静息细胞)在氙(89％)与BTX(86％)之间相似，并且对于REP样品的PD-1表达和KO效率分析，使用氙(83％)的KO效率略高于BTX(76％)。
结论
所述研究确定关于氙的电穿孔设置2300/2/3，其导致在低细胞浓度和高细胞浓度下的高细胞复苏率(与BTX相当)、在低细胞浓度和高细胞浓度下的高GFP表达(与BTX相当)和高PD-1KO效率(与BTX相当)。
提供上述实施例以向本领域技术人员提供如何制得并使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开内容和描述，并且并不旨在限制本发明人视为其发明的范围。对于本领域技术人员显而易见的进行本发明的上文所描述模式的修改旨在落在以下权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和公开指示本发明所属领域的技术人员的技能水平。
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本文中引用的所有参考文献都通过引用并出于所有目的整体并入本文，其引用程度如同每一个别公开或专利或专利申请被特定且个别地指示出于所有目的通过引用整体并入本文一般。
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Claims (223)
1.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
2.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(c)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
3.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)在第二细胞培养基中对所述第四TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
4.一种将肿瘤浸润淋巴细胞扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从通过手术切除、穿刺活检、空芯针活检、小型活检或其他用于获得来自患者或受试者的肿瘤组织的手段产生的肿瘤组织样品获得和/或接收第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤组织添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-9天以获得所述第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或CD3激动剂和CD28激动剂珠粒或抗体激活所述第二TIL群体1-7天，以产生第三TIL群体；
(d)对所述第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第四TIL群体；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体来进行第二扩增，以产生第五TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得所述第五TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第五TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(f)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中步骤(b)至(f)中的每一者是在密闭、无菌系统中进行，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变、从步骤(c)至步骤(d)的转变、从步骤(d)至步骤(e)的转变和/或从步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放所述系统的情况下进行。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述酶介质包含DNA酶。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述酶介质包含胶原酶。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述酶介质包含中性蛋白酶。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述酶介质包含透明质酸酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中培养或快速第二扩增所述第四TIL群体的步骤是通过以下来进行：在所述第二细胞培养基中培养所述第四TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时所述第四TIL群体拆分为多个继代培养物，所述继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL或所述治疗性TIL群体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一培养时段为约5天。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述第二培养时段为约4天。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中所述第二培养时段为约5天。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中使用抗CD3激动剂珠粒或抗体进行激活所述第二TIL群体的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中使用OKT-3进行激活所述第二TIL群体的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中使用300ng/mL的OKT-3进行激活所述第二TIL群体的步骤。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中使用抗CD3激动剂和抗CD28激动剂珠粒或抗体进行激活所述第二TIL群体的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中使用TransAct进行激活所述第二TIL群体的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其中使用1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct进行激活所述第二TIL群体的步骤。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中激活所述第二TIL群体的所述步骤进行约2天。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中激活所述第二TIL群体的所述步骤进行约3天。
22.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中激活所述第二TIL群体的所述步骤进行约4天。
23.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中激活所述第二TIL群体的所述步骤进行约5天。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约3天。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约5天。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约7天。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中培养所述第四TIL群体的所述步骤进行约8天。
28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中培养所述第四TIL群体的所述步骤进行约9天。
29.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中培养所述第四TIL群体的所述步骤进行约8-9天。
30.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中培养所述第四TIL群体的所述步骤进行约10天。
31.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中培养所述第四TIL群体的所述步骤进行约8-10天。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所有步骤在约22天的时段内完成。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所有步骤在约19-22天的时段内完成。
34.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所有步骤在约19-20天的时段内完成。
35.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所有步骤在约20-22天的时段内完成。
36.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3-9天以产生第二TIL群体；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
37.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
38.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收第一TIL群体；
(b)在第一细胞培养基中对所述第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(c)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(d)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
39.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞培养基中对从自受试者或患者切除的肿瘤组织获得和/或接收的第一TIL群体进行初始扩增(或启始第一扩增)以获得第二TIL群体，其中所述第一细胞培养基包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)，其中所述启始第一扩增进行约3至8天的时段；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在第二细胞培养基中对所述第三TIL群体进行快速第二扩增以获得经扩增数目的TIL，其中所述第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC；并且其中所述快速扩增进行14天或更短的时段，任选地所述快速第二扩增可在所述快速第二扩增起始后进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在酶介质中消化所述肿瘤组织以产生肿瘤消化物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述酶介质包含DNA酶。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述酶介质包含胶原酶。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述酶介质包含中性蛋白酶。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述酶介质包含透明质酸酶。
45.一种用于制备经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养通过在酶介质中消化从自受试者或患者切除的肿瘤组织以产生肿瘤消化物而获得的第一TIL群体约3-9天，以产生第二TIL群体；
(b)对所述第二TIL群体的至少一部分进行基因编辑，以产生第三TIL群体；以及
(c)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约5-15天，以产生经扩增数目的TIL。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中培养或初始扩增所述第一TIL群体的所述步骤包括在包含IL-2的所述第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，接着在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体2-6天。
47.如权利要求36-46中任一项所述的方法，其中培养或快速第二扩增所述第三TIL群体的步骤是通过以下来进行：在所述第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体约1-7天的第一时段，在所述第一时段结束时所述第三TIL群体拆分为多个继代培养物，所述继代培养物各自在包含IL-2的第三细胞培养基中培养约3-7天的第二时段，并且在所述第二时段结束时将所述继代培养物合并以提供经扩增数目的TIL。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述第一培养时段为约5天。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述第二培养时段为约4天。
50.如权利要求47或48所述的方法，其中所述第二培养时段为约5天。
51.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约3天。
52.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约5天。
53.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中培养所述第一TIL群体的所述步骤进行约7天。
54.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中培养所述第三TIL群体的所述步骤进行约8天。
55.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中培养所述第三TIL群体的所述步骤进行约9天。
56.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中培养所述第三TIL群体的所述步骤进行约8-9天。
57.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中培养所述第三TIL群体的所述步骤进行约10天。
58.如权利要求36-53中任一项所述的方法，其中培养所述第三TIL群体的所述步骤进行约8-10天。
59.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约22天的时段内完成。
60.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约20天的时段内完成。
61.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约22天的时段内完成。
62.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约19-22天的时段内完成。
63.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约19-20天的时段内完成。
64.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约20-22天的时段内完成。
65.如权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所有步骤在约16-18天的时段内完成。
66.如权利要求36-65中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基中培养或初始扩增所述第一TIL群体的步骤中还包含抗CD3和抗CD28珠粒或抗体。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含TransAct。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含以1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct。
69.如权利要求36-68中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含300ng/mL的OKT-3。
70.如权利要求36-69中任一项所述的方法，其中培养或初始扩增所述第一TIL群体的所述步骤包括在包含IL-2和抗CD3和抗CD28珠粒或抗体的所述第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体约3天，接着在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体2-4天。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含TransAct。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述抗CD3和抗CD28珠粒或抗体包含以1:10、1:17.5或1:100稀释的TransAct。
73.如权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含300ng/mL的OKT-3。
74.如权利要求1-3或5-68中任一项所述的方法，其中所述经扩增数目的TIL包含治疗性TIL群体。
75.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中对所述第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的所述步骤包括对所述第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移。
76.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中对所述第二或第三TIL群体的至少一部分进行基因编辑的所述步骤包括对所述第二或第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少两种基因编辑器的转移。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述电穿孔步骤由介导所述至少两种基因编辑器的转移的单个电穿孔事件组成。
78.如权利要求76所述的方法，其中在所述电穿孔步骤中所述至少两种基因编辑器中的每一者通过电穿孔事件独立于任何其他基因编辑器的转移而单独转移。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述电穿孔步骤还包括每个电穿孔事件后的静息期。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括介导用于调节第一蛋白质表达的第一基因编辑器的转移的第一电穿孔事件、第一静息期、介导用于调节第二蛋白质表达的第二基因编辑器的转移的第二电穿孔事件和第二静息期，其中所述第一静息期与所述第二静息期相同或不同。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含IL-2和/或IL-15的所述第二细胞培养基中温育所述第三或第四TIL群体。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含300IU/mL、1000IU/mL或6000IU/mL的IL-2的所述第二细胞培养基中温育所述第三或第四TIL群体。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期包括在包含15ng/mL的IL-15的所述第二细胞培养基中温育所述第三或第四TIL群体。
84.如权利要求80-78中任一项所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期包括在约30-40℃与约5％CO2下温育所述第三或第四TIL群体。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期包括在约25、28、30、32、35或37℃与约5％CO2下温育所述第三或第四TIL群体。
86.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至5天。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述第一静息期和所述第二静息期独立地为约10小时至3天。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述第一静息期为约1至3天。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述第一静息期为约3天。
90.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期为约10小时至1天。
91.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期为约12小时至24小时。
92.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期为约15小时至约18小时。
93.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期包括在约30℃下在包含IL-2的细胞培养基中温育所述第三或第四TIL群体约15小时至23小时。
94.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育所述第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至23小时。
95.如权利要求87-89中任一项所述的方法，其中所述第二静息期包括在包含IL-2的细胞培养基中在37℃下温育所述第三或第四TIL群体约一小时，接着在约30℃下温育约15小时至22小时。
96.如权利要求87所述的方法，其中所述第一静息期为约3天并且所述第二静息期为约10至16小时。
97.如权利要求75-96中任一项所述的方法，其中所述电穿孔步骤之前为在细胞穿孔缓冲液中洗涤所述第二或第三TIL群体。
98.如权利要求75或97所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器为用于调节至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节PD-1表达的TALE核酸酶系统。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节CTLA-4表达的TALE核酸酶系统。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节LAG-3表达的TALE核酸酶系统。
102.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节CISH表达的TALE核酸酶系统。
103.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节CBL-B表达的TALE核酸酶系统。
104.如权利要求98所述的方法，其中所述至少一种基因编辑器包含调节TIGIT表达的TALE核酸酶系统。
105.如权利要求76-97中任一项所述的方法，其中所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和/或CBL-B的表达。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CTLA-4的表达。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和LAG-3的表达。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CISH的表达。
110.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和CBL-B的表达。
111.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节PD-1和TIGIT的表达。
112.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和LAG-3的表达。
113.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和CISH的表达。
114.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CTLA-4和CBL-B的表达。
115.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节LAG-3和CISH的表达。
116.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节LAG-3和CBL-B的表达。
117.如权利要求105所述的方法，其中所述第一TALE核酸酶系统和所述第二TALE核酸酶系统调节CISH和CBL-B的表达。
118.如权利要求105所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自由PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B组成的组，条件是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质不同。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
120.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
121.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
122.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
123.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
124.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
125.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
126.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
127.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CISH组成的组。
128.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
129.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
130.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
131.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为PD-1。
132.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为LAG-3。
133.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为PD-1。
134.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CISH。
135.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为PD-1。
136.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为CBL-B。
137.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为PD-1。
138.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为PD-1并且所述第二蛋白质为TIGIT。
139.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为TIGIT并且所述第二蛋白质为PD-1。
140.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为LAG-3。
141.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
142.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CISH。
143.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
144.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CTLA-4并且所述第二蛋白质为CBL-B。
145.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CTLA-4。
146.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CISH。
147.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为LAG-3。
148.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为LAG-3并且所述第二蛋白质为CBL-B。
149.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为LAG-3。
150.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CISH并且所述第二蛋白质为CBL-B。
151.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质为CBL-B并且所述第二蛋白质为CISH。
152.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为PD-1。
153.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CTLA-4。
154.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为LAG-3。
155.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CISH。
156.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为CBL-B。
157.如权利要求118所述的方法，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质为TIGIT。
158.如权利要求76-97或105-157中任一项所述的方法，其中所述第一基因编辑器下调所述第一蛋白质的表达并且所述第二基因编辑器下调所述第二蛋白质的表达。
159.如权利要求1-158中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞(APC)为PBMC。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述PBMC是经照射并且同种异体的。
161.根据权利要求1-158中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
162.根据权利要求1-161中任一项所述的方法，其中所述IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
163.根据权利要求1-162中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基还包含4-1BB激动剂和/或OX40激动剂。
164.根据权利要求1-163中任一项所述的方法，其中所述肿瘤组织被加工成多个肿瘤片段。
165.根据权利要求164所述的方法，其中将所述肿瘤片段添加到所述密闭系统中。
166.根据权利要求165所述的方法，其中将150个或更少的所述片段、100个或更少的所述片段、或50个或更少的所述片段添加到所述密闭系统中。
167.一种经基因编辑的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，所述TIL群体包含经扩增的TIL群体，其中至少一种蛋白质的表达受转移到所述经扩增的TIL群体的至少一部分中的基因编辑器调节。
168.如权利要求167所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述基因编辑器为用于调节所述至少一种蛋白质的表达的TALE核酸酶系统。
169.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为PD-1。
170.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为CTLA-4。
171.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为LAG-3。
172.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为CISH。
173.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为CBL-B。
174.如权利要求168所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述至少一种蛋白质为TIGIT。
175.如权利要求167所述的经基因编辑的TIL群体，其中至少两种蛋白质的表达受转移到所述经扩增的TIL群体的至少一部分中的至少两种基因编辑器调节，其中所述至少两种基因编辑器包括包含用于调节第一蛋白质表达的第一TALE核酸酶系统的第一基因编辑器和包含用于调节第二蛋白质表达的第二TALE核酸酶系统的第二基因编辑器。
176.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质独立地选自由PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和CBL-B组成的组，条件是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质不同。
177.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CTLA-4组成的组。
178.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和LAG-3组成的组。
179.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CISH组成的组。
180.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和CBL-B组成的组。
181.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由PD-1和TIGIT组成的组。
182.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和LAG-3组成的组。
183.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CISH组成的组。
184.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CTLA-4和CBL-B组成的组。
185.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一TALE蛋白和所述第二TALE蛋白选自由LAG-3和CISH组成的组。
186.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由LAG-3和CBL-B组成的组。
187.如权利要求175所述的经基因编辑的TIL群体，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自由CISH和CBL-B组成的组。
188.如权利要求167-187中任一项所述的经基因编辑的TIL群体，所述TIL群体是通过权利要求1-166中任一项所述的方法制造。
189.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求167-188中任一项所述的经基因编辑的TIL群体和药学上可接受的载体。
190.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的权利要求167-188中任一项所述的经基因编辑的TIL群体或权利要求189所述的药物组合物。
191.如权利要求190所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
192.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段，从自所述患者切除的肿瘤获得第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加到密闭系统中并且通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3-8天以获得所述第二TIL群体；
(c)使用抗CD3激动剂珠粒或抗体、或抗CD3和抗CD28激动剂珠粒或抗体，激活所述第二TIL群体1-6天，以产生第三TIL群体；
(e)对所述第三TIL群体进行无菌电穿孔步骤，其中所述无菌电穿孔步骤介导至少一种基因编辑器的转移；
(f)使所述第三TIL群体静息约1天；
(g)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第三TIL群体来进行第二扩增，以产生第四TIL群体，其中所述第二扩增进行约5-15天以获得所述第三TIL群体，其中所述第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(h)收集从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体以提供经收集的TIL群体，其中步骤(a)至(h)中的一者或多者在密闭、无菌系统中进行；
(i)将所述经收集的TIL群体转移到输注袋中，其中从步骤(h)至(i)的转移在不开放所述系统的情况下进行；
(j)使用基于二甲亚砜的冷冻保存培养基来冷冻保存所述经收集的TIL群体；以及
(k)将治疗有效剂量的经收集的TIL群体从所述输注袋施用至所述患者；
其中所述电穿孔步骤包括递送转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统以抑制PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、TIGIT和/或CBL-B的表达。
193.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1表达的TALEN系统。
194.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4表达的TALEN系统。
195.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3表达的TALEN系统。
196.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH表达的TALEN系统。
197.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CBL-B表达的TALEN系统。
198.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制TIGIT表达的TALEN系统。
199.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CTLA-4表达的TALEN系统。
200.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和LAG-3表达的TALEN系统。
201.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CISH表达的TALEN系统。
202.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和CBL-B表达的TALEN系统。
203.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制PD-1和TIGIT表达的TALEN系统。
204.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和LAG-3表达的TALEN系统。
205.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和CISH表达的TALEN系统。
206.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和CBL-B表达的TALEN系统。
207.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CTLA-4和TIGIT表达的TALEN系统。
208.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和CISH表达的TALEN系统。
209.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和CBL-B表达的TALEN系统。
210.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制LAG-3和TIGIT表达的TALEN系统。
211.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH和CBL-B表达的TALEN系统。
212.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CISH和TIGIT表达的TALEN系统。
213.如权利要求192所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送用于抑制CBL-B和TIGIT表达的TALEN系统。
214.如权利要求192-213中任一项所述的方法，其中TIL的所述治疗有效剂量为约1×109至约1×1011个TIL。
215.如权利要求192-214中任一项所述的方法，其中在步骤(k)中施用治疗有效剂量的所述经收集的TIL群体之前，已向所述患者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
216.如权利要求192-215中任一项所述的方法，所述方法还包括用在步骤(k)中向所述患者施用所述治疗有效剂量的所述经收集的TIL群体之后第二天起始的高剂量IL-2方案治疗所述患者的步骤。
217.如权利要求192-216中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、转移性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
218.如权利要求192-216中任一项所述的方法，其中所述癌症为黑素瘤。
219.如权利要求218所述的方法，其中所述癌症为转移性黑素瘤。
220.如权利要求192-216中任一项所述的方法，其中所述癌症为NSCLC。
221.如权利要求220所述的方法，其中所述癌症为转移性NSCLC。
222.如权利要求192-221中任一项所述的方法，其中所述基因编辑引起所述治疗性TIL群体的至少一部分中一种或多种免疫检查点基因的表达沉默或减少。
223.包含通过本文中所描述的任何方法产生的TIL的组合物、产物、过程或系统的用途，所述用途包括TIL在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其特征在于本申请中所公开的一种或多种要素。
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