HRP20040194A2 - GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d] PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY - Google Patents

GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d] PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY Download PDF

Info

Publication number
HRP20040194A2
HRP20040194A2 HR20040194A HRP20040194A HRP20040194A2 HR P20040194 A2 HRP20040194 A2 HR P20040194A2 HR 20040194 A HR20040194 A HR 20040194A HR P20040194 A HRP20040194 A HR P20040194A HR P20040194 A2 HRP20040194 A2 HR P20040194A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
amino
pyrimidine
thieno
mixture
phenyl
Prior art date
Application number
HR20040194A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Gerard Jules Ma Hanssen
Cornelis Marius Timmers
Jan Kelder
Original Assignee
Akzo Nobel Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel Nv filed Critical Akzo Nobel Nv
Publication of HRP20040194A2 publication Critical patent/HRP20040194A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Izum se odnosi na spojeve koji posjeduju agonističku aktivnost prema glikoproteinskim hormonima, posebice na spojeve koji imaju agonističku aktivnost i prema luteinizirajućem hormonu (LH) i hormonu koji stimulira folikule (FSH). Nadalje, izum se odnosi na farmaceutske pripravke koji sadrže iste, kao i upotrebu ovih spojeva u medicinskoj terapiji, naročito za upotrebu u kontroli plodnosti.
Gonadotropini imaju ključne funkcije u različitim tjelesnim funkcijama, uključujući metabolizam, regulaciju temperature i reproduktivni proces. Hipofizni gonadotropini FSH i LH, na primjer, igraju ključnu ulogu u stimulaciji razvoja folikula i njihovog sazrijevanja dok je LH uključen u indukciju procesa ovulacije (Sharp, R.M. Clin. Endocrinol 33:787-807, 1990; Dorrington i Armstrong, Recent Prog. Horm. Res 35: 301-342, 1979; Levy i sur., Human Reproduction 15:2258-2265, 2000).
Trenutno, LH se koristi u klinici, u kombinaciji s FSH, za stimulaciju ovarija, tj. hiperstimulaciju ovarija u svrhu oplodnje in vitro (IVF, prema engl. «in vitro fertilisation») i indukciju ovulacije kod neplodnih anovulatornih žena (Insler, V., Int. J. Fertility 33:85-97, 1988, Navot i Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5:3-13, 1988), kao i za hipogonadizam kod muškaraca i neplodnost muškaraca.
Gonadotropini djeluju na specifične tipove stanica gonada i potiču diferencijaciju ovarija i testisa kao i steroidogenezu. Djelovanje ovih pituitarnih i placentalnih hormona posredovano je specifičnim receptorima u plazmatskoj membrani koji su članovi velike obitelji receptora povezanih s G-proteinima. Oni se sastoje od jednog polipeptida sa sedam transmembranskih domena i mogu stupati u interakciju s proteinom Gs, što dovodi do aktivacije adenil ciklaze.
Gonadotropini, koji će se koristiti u terapeutske svrhe, mogu se izolirati iz humanog urina i vrlo su niske čistoće (Morse i sur., Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17:143, 1988). Alternativno, mogu se pripraviti kao rekombinantni gonadotropini. Uz ove proteine, gonadotropinske receptore mogu aktivirati ili deaktivirati sintetski spojevi malih molekulskih masa. Biciklički heteroaromatski spojevi opisani su u WO 00/615586. U in vitro i in vivo eksperimentima, pokazano je da su korisni kao agonisti LH.
U normalnih žena, otpuštanje pituitarnih LH i FSH karakterizira porast u sredini ciklusa, koji prethodi ovulaciji. Ovulaciju karakteriziraju tri različita fiziološka fenomena tj. sazrijevanje oocita, pucanje folikula i luteinizacija. Dok je uloga porasta LH u in vivo indukciji ovih fenomena neosporna, uloga je porasta FSH manje jasna. Međutim, nedavno je pokazano da FSH inducira sazrijevanje oocita in vitro tako što inducira stanice kumulusa da proizvode faktor koji pozitivno prevlada zastoj mejoze do kojeg je došlo uslijed indukcije hipoksantinom (Lu i sur., Mol. Cell. Endocrinol. 164:191-196, 2000). Smatra se da je ovaj faktor sterol koji aktivira mejozu (MAS, prema engl. «meiosis activating sterol»).
Ovaj izum opisuje spojeve male molekulske mase koji pokazuju aktivnost LH. Uz LH aktivnost, neočekivano posjeduju i FSH aktivnost. u načelu, ovi su spojevi tieno[2,3-d]pirimidini koji su na poziciji 4 pirimidinskog prstena supstituirani s fenilnom grupom koja je supstituirana na meta poziciji. Supstituent se sastoji od troatomnog dijela (NH-C(O)-CH2), koji je nadalje ima kao funkcionalnu skupinu supstituiranu amino grupu. Općenito ovi spojevi posjeduju FSH agonističko djelovanje u različitog stupnja, ali tipično - slabije od LH agonističkog djelovanja.
Ovaj izum odnosi se na glicinom supstituirane tieno[2,3-d]pirimidinske derivate prema općoj formuli I,
[image]
ili njihovu farmaceutski prihvatljivu sol, gdje
X označava O ili H,H
A je S, NH, N(R6), O ili veza;
R1 je (1-4C)alkil, (2-4C)alkenil, fenil ili (2-5C)heteroaril, s tim da fenilni ili heteroarilni prsten može biti supstituiran s jednim ili više skupina supstituenata: hidroksi, halogen, nitro, trifluorometil, cijano, amino ili (1-4C)(di)alkilamino i
R2 je H, (1-4C)alkil, (1-4C)alkoksi(2-4C)alkil ili hidroksi (2-4C)alkil;
R3 i R4 mogu se neovisno odabrati iz skupine H, (1-4C)alkil, hidroksi (1-4C)alkil;
R5 je H ili (1-4C)alkil;
R6 se može odabrati iz istih skupina, kako je opisano za R1.
Pojam (1-4C)alkil kao što je upotrijebljen u definiciji formule I znači razgranjenu ili nerazgranjenu alkilnu skupinu koja ima 1-4 atoma ugljika, što je: metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, sec-butil ili tert-butil.
Pojam (2-4C)alkenil kao što je upotrijebljen u definiciji formule I znači razgranjenu ili nerazgranjenu alkenilnu skupinu koja ima 2-4 atoma ugljika, što je: vinil, 1-propenil, 2-propenil, 1-metil-vinil, 1-butenil, 2-butenil, 3-butenil, 2-metil-1-propenil, 2-metil-2-propenil, 1-metil-1-propenil, 1-etil-vinil.
Pojam (1-4C)alkoksi(1-4C)alkil označava alkilnu skupinu koja ima 1-4 atoma ugljika, koji su putem atoma kisika spojeni s drugom alkilnom skupinom koja ima 1-4 atoma ugljika, gdje alkilni ostaci imaju isto značenje, kao što je prethodno definirano.
Pojam (1-4C)alkoksi(2-4C)alkil označava alkilnu skupinu koja ima 1-4 atoma ugljika, koji su putem atoma kisika spojeni s drugom alkilnom skupinom koja ima 2-4 atoma ugljika, gdje alkilni ostaci imaju isto značenje, kao što je prethodno definirano.
Pojam hidroksi(1-4C)alkil označava hidroksilnu skupinu koja je vezana na alkilnu skupinu s 1-4 ugljikovih atoma, gdje alkilni ostaci imaju isto značenje, kao što je prethodno definirano.
Pojam hidroksi(2-4C)alkil označava hidroksilnu skupinu koja je vezana na alkilnu skupinu koj aima 2-4 ugljikova atoma, gdje alkilni ostaci imaju isto značenje, kao što je prethodno definirano.
Pojam (1-4C)(di)alkilamino označava jednu ili više alkilnih skupina koje imaju 1-4 ugljikova atoma kako je prethodno definirano, vezane na dušikov atom.
Pojam (2-5C)heteroaril označava, moguće i supstituiranu, aromatsku skupinu koja ima 2-5 ugljikova atoma, uključujući najmanje jedan heteroatom odabran od N, O i/ili S, kao što su imidazolil, tienil, furil ili piridil.
Pojam halogen označava fluor, klor, brom ili jod.
Pokazano je da spojevi gore spomenute formule I imaju agonističku aktivnost u odnosu na LH i FSH. U in vitro biološkom pokusu sa CHO stanicama koje su stabilno tranficirane s humanim LH ili FSH receptorom, pronađeno je da je EC50 u odnosu na LH receptor manja od 5.10-8 M dok je EC50 u odnosu na FSH receptor manja od 10-5 M. Tipično, aktivnost FSH kreće se u rasponu od aktivnosti od približno 1% agonističke stimulacije LH do približno 10% agonističke stimulacije LH.
Izum se također odnosi na farmaceutske pripravke koji sadrže tieno[2,3-d]pirimidinske derivate ili njihove soli koji imaju opću formulu I.
Stoga se spojevi, prema ovom izumu mogu upotrebljavati u terapiji. Drugi od aspekata izuma odnosi se na upotrebu tieno[2,3-d]pirimidinskih spojeva koji imaju opću formulu I u proizvodnji medicinskih pripravaka za kontrolu plodnosti, poželjnije indukcije ovulacije. Ovi se spojevi upotrebljavaju kako bi se aktivirali kako LH tako i FSH receptori. Spojevi iz ovog izuma se mogu stoga upotrebljavati u postupku kojim se tretiraju žene s problemima u plodnosti.
Tieno[2,3-d]pirimidinski spojevi ovog izuma mogu imati jedan ili više kiralnih ugljikovih atoma. Stoga je moguće dobiti spojeve kao kiralno čiste supstance ili kao mješavine dijastereoizomera i/ili enantiomera. Postupci za dobivanje kiralno čistih molekula dobro su poznati u struci, npr. kristalizacija ili kromatografija.
Soli spojeva formule I za terapeutske svrhe su one gdje je ion suprotnog naboja farmaceutski prihvatljiv. Međutim, soli koje daju baze formule I dodatkom kiseline, mogu također naći primjenu, na primjer, u pripravi ili pročišćavanju farmaceutski prihvatljivog spoja. Sve soli, bilo da su farmaceutski prihvatljive ili ne, uključene su u opseg ovog izuma.
Primjeri soli koje nastaju dodatkom kiselina uključuje one koje su nastale od mineralnih kiselina kao što su klorovodična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina, poželjno klorovodična kiselina, i organske kiseline kao što su limunska kiselina, vinska kiselina, ocetna kiselina, mliječna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, fumarna kiselina, glikolna kiselna, sukcinična kiselina i slično.
Prikladni načini davanja spojeva formule I ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, također ovdje spomenutih i kao aktivni sastojci, su intramuskularne injekcije, subkutane injekcije ili intraperitonealne injekcije, oralna i intranazalna primjena. Poželjno, spojevi se daju oralno. Točna doza i način davanja aktivnog sastojka, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog pripravka, nužno će ovisiti o željenom terapeutskom učinku (liječenje nepolodnosti; kontracepcija) i može varirati za pojedini spoj, način davanja, dob i stanje individualnog subjekta kojem se medicinski pripravak daje.
U načelu, parenteralni način davanja zahtijeva niže doze nego druge načini primjene koji su u većoj mjeri ovisni o apsorpciji. Međutim, doze kod ljudi poželjno sadrže 0,0001-25 mg po kilogramu tjelesne težine. Željena doza može se postaviti kao jednokratna doza ili kao višekratne subdoze koje se daju u odgovarajućim intervalima u toku dana. U slučaju ženskih recipijenata, doze se mogu davati u odgovarajućim dnevnim razmacima kroz menstrualni ciklus za folikularnu zaštitu ili za indukciju ovulacije. Doziranje i režim davanja može biti različit za muške i ženske recipijente.
U slučaju in vitro ili ex vivo primjene, kao u IVF primjeni, spojevi se mogu upotrijebiti u inkubacijskom mediju u koncentraciji približno od 0,01-5 μg/ml.
Ovaj izum se također odnosi na farmaceutske pripravke koje sadrže tieno[2,3-d]pirimidinske spojeve prema formuli I u smjesi s farmaceutski prihvatljivim pomoćnim tvarima, i moguće i s drugim terapijskim agensima. Pomoćne tvari moraju biti «prihvatljive» u smislu kompatibilnosti s drugim sastojcima pripravka i njihove neškodiljvosti za recipijenta.
Farmaceutski pripravci uključuju one prihvatljive za oralnu, rektalnu, nazalnu, topikalnu (uključujući transdermalnu, bukalnu i sublingvalnu), vaginalnu ili parenteralnu (uključujući subkutanu, intramuskularnu, intravenoznu i intradermalnu) primjenu. Pripravci se mogu pripraviti bilo kojim postupkom poznatom u farmaceutskoj struci, na primjer, upotrebom postupaka kao što su oni opisani u Gennaro i sur., Remington's Pharaceutical Sciences (18th ed., Merck Publishing company, 1990, vidi naročito odjeljak 8: «Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture»).
Ovakvi postupci uključuju korak povezivanja aktivnog sastojka s pomoćnom tvari. Pomoćna tvar(i), nazivaju se također i dodatni sastojci, uključuju one koji su uobičajeni u struci (Gennaro, supra), kao što su: punila, veziva, otapala, dezintegransi, lubrikanti, bojila, poboljšivači okusa i agensi za bolje otapanje.
Farmaceutski pripravci prikladni za oralnu primjenu mogu se oblikovati kao određene jedinične doze, kao što su pilule, tablete ili kapsule, ili kao prah ili granule, ili kao otopina ili suspenzija. Aktivni se sastojak također može oblikovati kao bolus ili pasta. Pripravci se nadalje mogu prevesti u supozitorij ili enemu za rektalnu upotrebu.
Prikladni pripravci za parenteralnu primjenu uključuju vodene i ne-vodene sterilne injekcije. Pripravci se mogu stavljati u posude u jediničnim dozama ili multiplim dozama, na primjer zataljene bočice ili ampule, i mogu se pohranjivati u stanju osušenom, uz smrzavanje (liofiliziranom stanju) koje zahtjeva jedino dodatak sterilnog nosača, na primjer vode, prije upotrebe.
Pripravci, ili formulacije, prikladne za primjenu nazalnom inhalacijom uključuju fine prašine ili suspenzije koje se mogu dobiti kao doze pod pritiskom s mjeračem u vidu aerosola, raspršivača i insuflatora.
Tieno[2,3-d]pirimidinski spojevi ovog izuma mogu se također davati u obliku farmaceutskih uređaja za implantaciju, koji se sastoje od srži od aktivnog sastojka, umotanog u membranu kojom se regulira brzina otpuštanja. Ovakvi implantati su za subkutanu ili lokalnu primjenu i otpuštaju aktivni sastojak približno konstantnom brzinom tijekom relativno dugih vremenskih perioda, na primjer od tjedana do godina. Postupci za pripravu implantirajućih farmaceutskih uređaja poznati su u struci, na primjer, kako je opisano u European Patent 0,303,306 (AKZO N.V.)
Stoga se spojevi, prema ovom izumu, mogu upotrebljavati u iste kliničke svrhe kao i nativni LH, uz prednost da posjeduju i aktivnost FSH, pokazuju promijenjena svojstva stabilnosti i mogu se primjenjivati na drugačije načine.
Spojevi se iz ovog izuma, predstavljeni formulom (I) mogu, u načelu, pripraviti nukleofilnom supstitucijom spojeva opće formule (II) gdje je Q = Cl ili Br s aminima opće formule (III) u prikladnom otapalu kao što je N,N-dimetilformamid ili THF na sobnoj temperaturi u prisutnosti tercijarne baze kao što je N,N-diizopropiletilamin. Mnogi su amini opće formule (III) komercijalno dostupni.
[image]
Derivati formule (II) gdje je Q = Cl ili Br mogu se pripraviti regioselektivnim aciliranjem meta anilinskih derivata formule (V-a) s acil kloridima tipa (IV), gdje je Q= Cl ili Br u prisutnosti tercijarne baze kao što je N,N- diizopropiletilamin u prikladnom otapalu kao što je diklorometan ili THF.
[image]
Spojevi formule (V) mogu se dobiti u struci poznatoj redukciji nitro skupine u derivatima formule (VI), upotrijebivši prikladan reducirajući agens kao što je vodik u prisutnosti metalnog (Pd/Pt) katalizatora. Ovakve redukcije opisane su u P.M. Carabateas, P.R. Brundage, K.O. Gelotte, M.D. Gruett, Lorenz R.R., J. Heterocycl. Chem. 21, 1849 (1984). Alternativno, redukcija se može postići kositar(II) kloridom u protoničkom otapalu kao što je etanol u prisutnosti klorovodične kiseline na povišenoj temperaturi (J. Heilbron, J. Chem. Soc, 1279 (1940)).
[image]
Tienopirimidini opće formule (VI) mogu se dobiti kondenzacijom karboksilnih kiselina (VII) s tert-butil aminom s agensom za povezivanje kao što je O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrameturonij tetrafluoroborat (TBTU) ili bromotripirolidinofosfonij heksafluorofosfat (PyBrOP) i tercijarna baza, npr. N,N-diizopropiletilamin.
[image]
Saponifikacija odgovarajućih etilnih estera (VIII) do karboksilnih kiselina (VII), odvija se u prisutnosti baze kao što je litij hidroksid, kalijev hidroksid ili natrijev hidroksid u vodenom dioksanu na povišenoj temperaturi (80°C do refluksa).
[image]
Biciklički sustavi opće formule (VIII) formiraju se supstitucijom klorida formule X s etil merkatpoacetatom uz djelovanje N,N-diizopropiletilamina, nakon čega dolazi do zatvaranja prstena, kataliziranog bazom, intermedijernih tioetera (IX). Ovaj tip formiranja tieno[2,3-d]pirimidinskih prstenova, opisan je u S.A. Abdel-Hady, M.A. Badawy, Y.A. Ibrahim, Sulfur Lett. 9, 101 (1989) i S. Tumkevicius, Liebigs Ann., 1703 (1995).
[image]
Prikladni uvjeti za ciklizacijsku reakciju su natrijev etoksid u etanolu ili N,N-diizopropiletilamin u toluen/etanol (1/1, volumen/volumen) na temperaturi refluksa.
[image]
Spojevi formule (X) mogu se sintetizirati slijedeći literaturne postupke kao što je opisano na primjer u A.A. Santili, D.H. Kim i S.V. Wanser, J. Heterocycl. Chem. 8, 445, 1971. U tipičnom eksperimentu, amid opće strukture (XI) tretira se s POCl3 na povišenoj temperaturi (80°C do refluksa). Dodatakom prikladnog otapala, npr. dioksana, i/ili dodatkom bilo PCl5 ili N,N-diizopropiletilamina u reakcijsku smjesu, može se skratiti vrijeme reakcije i povećati prinos klorida (X).
[image]
Općeniti put do laktama formule (XI) sasatoji se od etilcijanoacetata s 3-nitro-benzaldehida i spoja (XII), koji može biti izotiourea (XII-a), izourea (XII-b), monosupstituirani gvanidini (XII-c), disupstituirani gvanidini (XII-d) ili amini (XII-e).
[image]
U tipičnom eksperimentu, etil cijanoacetat, 3-nitrobezaldehid i derivati (XII) se suspendiraju u prikladnom otapalu, npr. etanolu, metanolu, N,N-dimetilformamidu, N-metilpirolidinonu, tetrahidrofuranu ili piridinu i dodaju baze kao što su kalijev karbonat, natrijev acetat, natrijev metoksid ili natrijev etoksid. Reakcija se odvija na povišenoj temperaturi (70°C do refluksa). Nakon filtracije, ostaci se prevedu u vodu i zakisele (pH 2) nakon čega produkti (XI) precipitiraju (S. Kambe, K. Saito i H. Kishi, Synthesis, 287 (1979); A.M. Abd-Elfattah, S. M. Hussain i A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39, 3197 (1983); S.M. Hussain, A.A. El-Barbary i S.A. Mansour, J. Heterocycl. Chem. 22, 169 (1985)).
[image]
Alternativno se spojevi ovog izuma gdje je A = N, predstavljeni formulom (I-a) mogu pripraviti iz sulfoksidnih derivata opće formule (XIII) putem nukleofilne supstitucije s aminskim nuklefilima opće formule (XIV). Reakcija se tipično provodi na povišenoj temperaturi u prisutnosti tercijarne baze kao što je N,N-diizopropiletilamin u prikladnom otapalu kao što je 1,4-dioksan.
[image]
Slično, spojevi ovog izuma gdje je A = O, predstavljeni formulom (I-b) mogu se pripraviti iz sulfoksidnih derivata opće formule (XIII) putem nukleofilne supstitucije s alkoksidnim nukleofilima opće formule (XV). Reakcija se izvodi u prisutnosti kalijevog tert-butoksida s alkoholom R1-OH u suvišku.
[image]
Sulfoksidni derivati opće formule (XIII) mogu se dobiti oksidacijom spojeva opće formule (I), gdje je R1 = Me i A = S, predstavljenih formulom (I-c). Oksidacija se postiže 3-kloroperbenzojevom iselinom u trifluoracetatnoj kiselini. Kisela priproda otapala sprečava oksidaciju 5-amino skupine u odgovarajućem 5-nitrozo derivatu.
[image]
Postupci za određivanja vezivanja receptora kako u in vitro tako i u in vivo pokusima za određivanje biološke aktivnosti, dobro su poznati. U načelu, eksprimirani receptor je u kontaktu sa spojem koji se testira i mjeri se vezivanje ili stimulacija ili inhibicija funkcionalnog odgovora.
Kako bi se izmjerio funkcionalni odgovor izolirane DNA, gen koji kodira za receptor LH ili FSH, poželjno humani receptor, eksprimira se u pogodnim stanicama domaćinima. Takve stanice mogu biti stanice ovarija kineskog hrčka, ali i druge stanice su također prikladne. Poželjno stanice su porijeklom stanice sisavaca (Jia i sur., Mol. Endocrin., 5:759-776, 1991).
Metode za konstrukciju rekombinantnih staničnih linija koje eksprimiraju LH i FSH, dobro su poznate u struci (Sambrook i sur., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, posljednje izdanje). Ekspresija receptora postiže se ekspresijom DNA koja kodira željeni protein. Tehnike ciljane mutageneze, ligacije dodatnih sekvenci, PCR, i konstrukcije prikladnih ekspresijskih sustava su svi, do sada, vrlo dobro poznate u struci. Dijelovi ili cijela DNA koja kodira za željeni protein, mogu se konstuirati sintetički, upotrebom standardnih tehnika čvrste faze, poželjno uključujući restrikcijska mjesta kako bi se olakšala ligacija. Kodirajućoj se sekvenci DNA mogu pridodati prikladni elementi za kontrolu u transkripciji i translaciji uključene kodirajuće sekvence. Kako je dobro poznato, danas je moguće nabaviti ekspresijske sustave koji su kompatibilni s vrlo velikim brojem domaćina, uključujući prokariotske domaćine kao što su bakterije i eukariotske domaćine kao što su kvasci, biljne stanice, stanice insekata, stanice sisavaca, ptičje stanice i slične.
Tada se stanice koje eksprimiraju receptor stave u kontakt s spojem koji se testira kako bi se promatralo vezivanje, ili stimulacija ili inhibicija funkcionalnog odgovora.
Alternativno, mogu se koristiti izolirane stanične membrane koje sadrže eksprimirani receptor, kako bi se izmjerilo vezivanje spoja.
Za mjerenje vezivanja mogu se koristiti radioaktivno ili fluorescentno obilježeni spojevi. Kao referentni spojevi mogu se upotrijebiti humani rekombinantni LH ili FSH. Alternativno se mogu, također, raditi i testovi kompeticije vezivanja.
Drugi testovi uključuju pretraživanje na spojeve agoniste receptora za LH ili FSH, određivanjem akumulacije cAMP-a do koje dolazi stimulacijom receptora. Stoga, takva metoda uključuje ekspresiju receptora na staničnoj površini stanice domaćina i izlaganje spoju koji se testira. Tada se mjeri količina cAMP-a. Nivo cAMP-a će se smanjivati ili rasti, ovisno o inhibicijskom ili stimulirajućem učinku testiranog spoja nakon vezivanja na receptor.
Uz direktno mjerenje, na primjer, nivoa cAMP-a u eksponiranim stanicama, mogu se upotrijebiti i stanice kod kojih je uz transfekciju s DNA koja kodira za receptor također i napravljena transfekcija s drugom DNA koja kodira za gen reporter čija ekspresija odgovara nivou cAMP-a. Takvi geni reporteri mogu biti inducibilni s cAMP-om ili mogu biti konstruirani tako da su povezani s novim elementima koju su senzitivni na cAMP. Prikladni geni reporteri su npr. LacZ, alkalna fosfataza, luciferaza iz krijesnice i zeleno fluorescirajući protein. Principi takvih transaktivacijskih testova vrlo su dobro pozanti u struci i opisani su npr. u Stratowa, Ch, Himmler, A i Czernilofsky, A.P. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:574.
Da bi se selekcionirali spojevi aktivni na receptor za LH ili FSH, testiranje 10–5 M mora dovesti do aktivnosti koja je veća od 20% od maksimalne aktivnosti referentnih LH ili FSH. Drugi kriterij može biti vrijednosti EC50, koja mora biti < 10–5 M, poželjno < 10–7 M.
Stručnjak u području će prepoznati da su željene vrijednosti EC50 ovisne o testiranom spoju. Na primjer, spoj koji ima manju vrijednost EC50 od 10–5 M, općenito se smatra kandidatom u selekciji lijekova. Poželjno je ova vrijednost manja od 10–7 M. Međutim, spoj koji ima veću vrijednosti EC50, ali je selektivan za određeni receptor, može biti čak i bolji kandidat.
Pretraživanje na spojeve s agonističkom aktivnosti na receptore za LH može se, također provoditi koristeći test s mišjim Leydigovim stanicama (Van Damme, M., Robersen, D. i Diczfalusy, E. (1974). Acta Edocrinol. 77:655-671. Mannaerts, B., Kloosterboer, H. i Schuurs A. (1987). Neuroendocrinology of reproduction. R. Rolland i sur. ur., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58). Ovim se testom, može mjeriti proizvodnja testosterona u Leydigovim stanicama izoliranim iz muških miševa, do koje dolazi zbog stimulacije receptora za LH.
Agonistička aktivnost sojeva na FSH, također se može određivati u ex vivo modelu koristeći mišje folikule u kulturi prema Nayudu, P. i Osborn, S. (1992, J. Reproduction and Fertility 95:349-362). Stoga, mišji se ovarijski folikuli mogu izolirati i kultivirati u prisutnosti spojeva agonista FSH da bi se inducirao rast folikula. Mjerenja dijametra folikula i estradiola u mediju za kultivaciju, indikativna su za rast folikula.
Da bi se mjerila in vivo aktivnost LH, može se proučavati indukcija ovulacije u nezrelim miševima. U ovom se pokusu nezrele mišje ženke tretiraju s urinarnim FSH i približno 48 sati kasnije tretiraju s LH agonističkim spojem. Životinje se žrtvuju nakon tretmana s agonistom LH i mikroskopski se izbroje jajašaca u jajovodu.
Da bi se izmjerila aktivnost FSH in vivo, nezrele se ženke štakora tretiraju u 0, 8, 24 i 32 sata s agonističkim FSH spojem kako bi se inducirao rast folikula. Kod 52 sata nakon početka eksperimenta, životinje se injiciraju s hCG da bi se inducirala ovulacija. Životinje se žrtvuju 72 sata nakon početka eksperimenta i mikroskopski odredi broj jajašaca u jajovodu. Dodatno, izmjeri se i težina jajnika.
Spojevi iz ovog izuma mogu se primijeniti klinički s istim načinom doziranja kojim se sada daju LH i cCG. U ovo su uključeni i supstitucija LH kod subjekata s hipogonadalnim hipogonadizmom bilo muških ili ženskih, primjenu u sredini ciklusa da bi se inducirala ovulacija (indukcija ovulacije (OI) ili kontrolirana hiperstimulacija (COH) ili stimulacija žutog tijela.
Slijedeći primjeri ilustrativni su za izum i ni na koji način ih ne treba tumačiti kao ograničavajuće za predmet izuma.
PRIMJERI
Primjer 1
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-hidroksi-pirimidin
Mješavina S-metilizotiourea sulfata (69,0 g), 3-nitrobenzaldehida (75,0 g), etil cijanoacetata (56,0 ml) i kaljevog karbonata (72,5 g) u apslutnom EtOH (1500 ml) se miješa na 60°C tijekom 16 sati. Reakcijska se mješavina ohladi na 0°C u ledenoj kupelji. Precipitat koji nastane se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 54,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 289,0
TLC: Rf = 0,3; siliKa gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) 6-Kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidin
U izmiješanu otopinu 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-hidroksi-pirimidina,doda se POCl3 (100 ml) (primjer 1(a), 25,0 g) u suhom 1,4-dioksanu (300 ml). Nakon 3 sata na 90°C, mješavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira pod amanjenim tlakom. Ostatak se otopi u 1,4-dioksanu (100 ml) i nastala otopina se ohladi na 0°C. Kontinuirano se dodaje ledena voda. Nastali se precipitat filtrira i ispere s vodom. Ostatak vode u precipitatu se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 26,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 307,0
TLC: Rf = 0,5; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(c) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidin
DIPEA (15,7 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 2-merkaptoacetata (9,3 ml) i 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-pirimidina (primjer 1(b), 26,0 g) u mješavini EtOH (250 ml= i DCM (250 ml). Nakon 1 sata na sobnoj temperaturi, u smjesu se doda 0,1 N HCl u vodi (500 ml) i ekstrahira s DCM (3 x 500 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 28,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 391,4
TLC: Rf = 0,5; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(d) Etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
Mješavina etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidina (primjer 1(c), 28,0 g) i DIPEA (30 ml= u smjesi toluena (150 ml) i EtOH (150 ml) se miješa na temperaturi refluksa (100°C) tijekom 16 sati. Mješavina se tada ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostaci DIPEA se uklone koevaporacijom s toluenom.
Prinos: 28,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 391,4
TLC: Rf = 0,6; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(e) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
EtOH (400 ml) se doda u mješavinu Etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio- tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 1(d), 28,0 g), koncentrira s vodenom HCl (15 ml) i kositar(II) kloridom (41,0 g) u 1,4-dioksanu (400 ml). Mješavina se tada miješa na 90°C tijekom 16 sati. Mješavina se tada ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se tada suspendira u EtOAc (1000 ml). Doda se vodena otopina 4N NaOH da se dobije pH 10-11. Mješavina se snažno miješa i odvoji organski sloj, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 21,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 361,0
TLC: Rf = 0,6; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(f) 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina
Kalijev hidroksid (32,4 g) se doda u otopinu Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio- tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 1(e), 21,0 g) u mješavini 1,4-dioksana (300 ml) i vode (100 ml). Nakon 16 sati na 90°C, mješavina se ohladi na 10°C i doda vodena 2N limunska kiselina (300 ml) uz snažno miješanje. Nastali precipitat se filtrira, ispere s vodom (180 ml) i osuši in vacuo.
Prinos: 14,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 333,0
TLC: Rf = 0,5; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(g) tert-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
TBTU (16,1 g) se doda u otopinu 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-metiltio- tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (primjer 1(f), 14,0 g) DIPEA (17,4 ml) i tert-butalamina (7,3 g) u DCM/DMF (1/1, v/v, 250 ml). Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3 (3 x 100 ml), vodenom 0,1 N HCl (100 ml) i vodom (100 ml). Organski se sloj koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi produkt se pročisti kristalizacijom iz vrućeg apsolutnog etanola (300 ml).
Prinos: 10,5 g
MS-ESI: [M+H]+ = 388,0
HPLC: Rt 0 30,72 min, Luna c-18(2), 2 μm, 250 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent voda/ACN/meOH = 90/9,5/0,5 do 0/95/5, vrijeme protoka = 50 min.
(h) tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Bromoacetil klorid (615 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(g), 1,08 g) i DIPEA (2,43 ml) u suhom DCM (20 ml). Nakon 3 sata n asobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM, ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na silika gelu koristeći heptan/EtOAc =3/2 (v/v) kao eluent.
Prinos: 910 mg
MS-ESI: [M+H]+ = 510,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(i) tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
N-metil-2-amino-etanol (250 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim radijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 112 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 503,2
HPLC: Rt = 11,45min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 2
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-(1-hidroksi-2-metil-prop-2-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
2-amino-2-metil-propanol (250 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 67 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 517,2
HPLC: Rt = 12,67 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 3
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-(metokarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Glicin metil ester hidroklorid (200 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) i N,N-diizopropiletilamin (0,20 ml) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 133 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 517,2
HPLC: Rt = 11,87 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 4
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
N-(2-metoksietil)-etilamin (266 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 84 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 531,2
HPLC: Rt = 12,62 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 5
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-R-1-metoksikarbonil-2-metil-prop-1-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
D-Valine metil ester hidroklorid (250 mg) se doda su otopinu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) i N,N-diizopropiletilamin (0,20 ml) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 77 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 559,2
HPLC: Rt = 13,22 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 6
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N,N-bis-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
N,N-bis-(2-metoksietil)-amin (400 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 166 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 561,3
HPLC: Rt = 13,62 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 7
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((2,3-dihidroksi-prop-1-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
3-Amino-2-hidroksi-propanol (250 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 164 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 519,2
HPLC: Rt = 12,62 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 8
tert-Butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((1,3-dihidroksi-prop-2-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
2-Amino-2-hidroksi-propanol (250 mg) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(h), 250 mg) u DCM-u (5 ml). Nakon 16 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 117 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 519,2
HPLC: Rt = 12,62 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 9
tert-Butil 5-amino-2-fenil-4-(3-((N-etil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-6-hidroksi-pirimidin
Mješavina se benzamin hidroklorida (16,4 g), 3-nitrobenzaldehisa (15,1 g), etil cijanoacetata (11,2 ml) i kalijevog karbonata (16,6 g) u apsolutnom EtOH (250 ml) miješa na 60°C tijekom 8 sati- Reakcijska se mješavina ohladi do 0°C u ledenoj kupelji. Nastali se precipitat filtrira, ispere s apsolutnim EtOH i zagrijava u vodi (100°C) sve dok se ne dobije bistra otopina. Otopina se tada ohladi na 50°C, zakiseli do pH 2 dodatkom vodene 2N HCl i ohladi do 0°C u ledenoj kupelji. Nastali se precipitat filtrira i ispere s ledenom vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 15,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 319,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) 6-Kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-pirimidin
POCl3 (50 ml= se doda u izmješanu otopinu 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-6-hidroksi-pirimidina (primjer 9(a), 15,0 g) i dimetilanilina (0,5 ml) u suhom 1,4-dioksanu p.a. (200 ml). Nakon 3 sata na 90°C, vruća se otopina filtrira i filtrat se koncentrira pod reduciranim tlakom. Ostatak se otopi u 1,4-dioksanu i doda ledena voda. Nastali se precipitat filtrira i ispere s vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 15,8 g
MS-ESI: [M+H]+ = 337,4
TLC: Rf = 0,8; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(c) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidin
DIPEA (8,71 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 2-merkaptoacetata (5,15 ml) i 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-pirimidina (primjer 9(b); 15,8 g) u mješavini EtOH (125 ml) i DCM (125 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi mješavina se razrijedi s DCM-om sve dok se potpuno ne otopi, ispere s vodenom 2N HCl, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 19,7 g
MS-ESI: [M+H]+ = 421,2
TLC: Rf = 0,7; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(d) Etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-tieno [2,3-d] pirimidin-6-karboksilat
DIPEA (20,0 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidina (primjer 9(c); 19,7 g) u mješavini apsolutnog EtOH (100 ml) i toluena p.a. (100 ml). Nakon 48 sati na 100°C, mješavina se ohladi na 0°C. Nastali se precipitat filtrira , ispere s hladnim EtOH i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 17,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 421,2
TLC: Rf = 0,5; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(e) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2- fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
Otopina kositar (II) klorida (23,0 g) u apsolutnom EtOH (250 ml) se doda u otopini etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-fenil-tieno [2,3-d] pirimidin-6-karboksilata (primjer 9(d), 16,6 g) u 1,4-dioksana p.a. (250 ml). Doda se 37% vodene HCl (6,9 ml) i mješavina se zagrijava pod refluksom (90°C) tijekom 16 sati. Mješavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira u uvjetima smanjenog tlaka. Ostatak se suspendira u EtOAc (500 ml). Doda se vodena 4N NaOH kako bi se dobio pH 10-11. Mješavina se razrijedi dodatkom zasićene vodene NaCl. Organski se sloj odvoji, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 17,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 421,2
TLC: Rf = 0,5; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(f) 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina
Kalijev se hidroksid (20,0 g) doda u otopinu etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 9(e), 17,0 g) u mješavini 1,4.dioksana (210 ml) i vode (80 ml). Nakon 16 sati na 90°C, mješavina se ohladi na 0°C. Nastali se precipitat filtrira, suspendira u vodi (300 ml) i ohladi na 0°C. Mješavina se zakiseli do pH 3 dodatkom 2N vodene limunske kiseline i miješa na 0°C sve do sobne temperature tijekom 2 sata. Nastali se precipitat filtrira, ispere s vodom i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 13,3 g
MS-ESI: [M+H]+ = 363,0
TLC: Rf = 0,2; silika gel, DCM/MeOH = 95/5 (v/v)
(g) tert-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
DIPEA (15,3 ml), tert-butamin (9,3 ml) i TBTU (14,1 g) se dodaju u mješavinu 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (primjer 9(f), 13,3 g) u mješavini DCM (250 ml) i DMF (50 ml) u atmosferi dušika. Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM i ispere sa zasićenim vodenim NaHCO3, vodene 0,1N HCl i zasićene vodene NaCl. Organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na slika gelu, koristeći heptan/EtOAc = 3/7 do 1/1 (v/v) kao eluent.
Prinos: 14,7 g
MS-ESI: [M+H]+ = 418,4
TLC: Rf = 0,4; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Bromoacetil klorid (2,80 ml) se dodje kap po kap u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-fenil- tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 9(g), 5,8 g) i DIPEA (12,2 ml) u DCM (50 ml). Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi mješavin ase razrijedi s DCM, ispere s zasićenim vodenim NaHCO3 osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na slika gelu, koristeći heptan/EtOAc = 3/7 (v/v) kao eluent. Dobije se mješavina od 1:1 (mol/mol) tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida i tert-butil 5-amino-4-(3-(2-kloroacetamido)-fenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida.
Prinos: 2,6 g
MS-ESI: [M+H]+ = 540,2; [M'+H]+ = 494,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(i) tert-Butil 5-amino-2-fenil-4-(3-((N-etil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid (primjer 9(h), 500 mg) u DCM-u (5 ml), doda se N-etil-2-amino-etanol (500 mg). Nakon miješanja tijekom 17sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se mješavina razrijedi s DCM-om (100 ml), ispere s vodenim NaHCO3 (1M, 2 x 50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 271 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 547,2
HPLC: Rt = 11,88 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 10
tert-Butil 5-amino-2-fenil-4-(3-(N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-fenil-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid (primjer 9(h), 500 mg) i N,Ndiizopropiletil amina (DiPEA, 1 ml) u DCM-u (5 ml), doda se glicin metil ester hidroklorid (700 mg). Nakon miješanja tijekom 17sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se mješavina razrijedi s DCM-om (100 ml), ispere s vodenim NaHCO3 (1M, 2 x 50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 321 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 547,2
HPLC: Rt = 12,54 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 11
tert-Butil 5-amino-2-(2-furil)-4-(3-((N-metil-N(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) 2-amidinofuran
Zasićena i ohlađena (0°C) etanolna HCl (40), doda se u ohlađenu (ledena kupelj, 0°C) reakcijsku posudu koja sadrži 2-furonitril (13 ml). Nastalu se otopinu ostavi da dosegne ambijentalnu temperaturu i miješa u uvjetima dušikove atmosfere tijekom 48 sati. Nakon što se reakcijska smjesa koncentrira in vacuo, ostatak koji sadrži odgovarajući 2-furil etil imidat, otopi se u etanolu (20 ml) i miješa na 0°C u uvjetima dušikove atmosfere. Nakon toga se doda etanolni amonijak (40 ml) i reakcijska se smjesa miješa u zataljenoj reakcijskoj posudi tijekom 48 sati. Nakon filtracije reakcijske mješavine, filtrat se koncentrira u uvjetima smanjenog tlaka. Sirovi se produkt koristi, bez daljnje purifikacije, u slijedećem koraku.
Prinos: 15,0 g
(b) 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-6-hidroksi-pirimidin
Mješavina 2-amidinofurana (primjer 11(a), 15 g), 3-nitrobenzaldehida (24 g), etil cijanoacetata (17 ml) i kalijevog karbonata (25 g) u apsolutnom EtOH (300 ml) i miješa na 60°C tijekom 16 sati. Reakcijska se mješavina ohladi na 0°C u ledenoj kupelji. Nastali se precipitat filtrira, ispere s apsolutnim EtOH i zagrijava u vodi (100°C) i miješa dok se ne dobije mliječna suspenzija. suspenzija se ohladi do 50°C, zakiseli na pH 2 dodatkom vodene 2N HCl i ohladi na 0°C u ledenoj kupelji. Nastali precipitat se filtrira i ispere s ledenom vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 16,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 309,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(c) 6-Kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-pirimidin
POCl3 (50 ml) se doda u izmješanu otopinu 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-6-hidroksi-pirimidina (primer 11(b), 16,o g) i dimetilanilina (0,5 ml) u suhom 1,4-dioksanu p.a. (250 ml). Nakon 2 sata na 90°C, vruća se otopina filtrira i filtrat se koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se otopi u 1,4-dioksanu i doda se ledena voda. Nastali precipitat se filtrira i ispere s vodom. Ostatak se vode ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 16,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 327,2
TLC: Rf = 0,75;silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(d) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidin
DIPEA (9,1 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 2-merkaptoacetata (5,4 ml) i 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-pirimidina (primjer 11(c), 16,0 g) u mješavini EtOH (125 ml) u uvjetima dušikove atmosfere. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrjedi s DCM-om sve dok se potpuno ne otopi, ispere s vodenom 0,5 N HCl, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 20,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 411,2
TLC: Rf = 0,7; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(e) Etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
DIPEA (20,0 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidina (primjer 11(d), 20,0 g) u mješavini apsolutnog EtOH (100 ml) i toluena p.a. (100 ml). Nakon 48 sati na 100°C, mješavina se ohladi na °C. Nastali se precipitat filtrira, ispere s hladnim EtOH i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 20,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 411,2
TLC: Rf = 0,6; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(f) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
Otopina kositar (II) klorida (28.0 g) u apsolutnom etanolu (250 ml) doda se u otopinu etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 11(e), 20,0 g) u1,4-dioksanu p.a. (250 ml). Doda se 37%-tna vodena HCl i mješavina se zagrijava u uvjetima refluksa (90°C) tijekom 16 sati. Mješavina se ohladi do sobne temperature i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se suspendira u EtOAc (500 ml). Doda se vodeni 4N NaOH da se dobije pH 10-11. Mješavina se razrijedi dodatkom zasićene otopine NaCl. Organski se sloj odvoji, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 17,5g
MS-ESI: [M+H]+ = 381,2
TLC: Rf = 0,4; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(g) 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina
Kalijev hidroksid (23.0 g) se doda u otopinu etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 11(f), 17,5 g) u mješavini 1,4-dioksana (210 ml) i vode (80 ml). Nakon 8 sati na 90°C, mješavina se ohladi na 0°C. Nastali precipitat se filtrira, suspendira u vodi (300 ml) i ohladi na 0°C. Mješavina se tada zakiseli do pH 3 dodatkom vodene 2N limunske kiseline i miješa na 0°C do sobne temperature tijekom 2 sata. Nastali se precipitat filtrira, ispere s vodom i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 16,9 g
MS-ESI: [M+H]+ = 353,2
TLC: Rf = 0,2; silika gel, DCM/MeOH = 95/5 (v/v)
(h) tert-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
DIPEA (19,2 ml), tert-butilamin (11,6 ml) i TBTU (17,7 g) se doda u otopinu 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (primjer 11(g), 16,9 g) u mješavini DCM (250 ml) i DMF (50 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, formira se značajna količina žutog precipitata, koji se profiltrira. Ostatak se ispere s dietil eterom i osuši i in vacuo na 40°C.
Prinos: 17,5g
MS-ESI: [M+H]+ = 381,2
TLC: Rf = 0,4; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(i) tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Bromoacetil klorid (100 l) dodaje se kap po kap u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 11(h), 250 mg) i DIPEA (0,5 ml) i DCM (5 ml). Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM, ispere sa zasićenim vodenim NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na silika gelu koristeći heptan/EtOAc = 3/2 (v/v) kao eluent. Dobije se mješavina 1:1 (mol/mol) od tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida i tert-butil 5-amino-4-(3-(2-kloroacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida i
Prinos: 124 mg
MS-ESI: [M+H]+ = 540,2; [M'+H]+ = 494,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(j) tert-Butil 5-amino-2-(2-furil)-4(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 11(i), 130 mg) u DCM (5 ml), doda se N-metil-2-amino-etanol (200 mg). Nakon 17 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3(1M, 2x 10 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 81 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 532,2
HPLC: Rt = 11,01 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 12
tert-Butil 5-amino-2-(2-furil)-4(3-(N-(1-hidroksi-2-metil-prop-2-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 11(i), 130 mg) u DCM (5 ml), doda se 2-amino-2-metil-propanol (260 mg). Nakon 17 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3(1M, 2x 10 ml), 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-pirimidin in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 54 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 537,2
HPLC: Rt = 11,15 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 13
tert-Butil 5-amino-2-(2-furil)-4(3-(N-(metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(2-furil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 11(i), 130 mg) i DiPEA (0,5 ml) u DCM (5 ml), doda se glicin metil ester hidroklorid (324 mg). Nakon miješanja tijekom 17 sati na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM (50 ml), ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3(1M, 2x 10 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 74 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 537,2
HPLC: Rt = 12,09 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 14
tert-Butil 5-amino-2-(2-thienil)-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-6-hidroksi-pirimidin
Mješavina se 2-aminotiofen hidroklorida (10,0 g), 3-nitrozobenzaldehid (9,7 g), etilcijanoacetat (6,81 ml) i kajiev karbonat (10,1 g) u apsolutnom EtOH (200 ml) miješa na 60°C tijekom 8 sati. Reakcijska se mješavina ohladi na 0°C u ledenoj kupelji, filtrira i spere s ledenom vodom. Ostaci vode uklone se koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 10,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 325,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-pirimidin
POCl3 (30 ml) se doda u izmješanu otopinu 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-6-hidroksi-pirimidina (primjer 14(a), 10,0 g) i dimetilanilina (nekoliko kapi) u suhom 1,4-dioksanu (150 ml). Nakon 3 sata na 90°C, mješavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira pod reduciranim tlakom. Ostatak se otopi u 1,4-dioksanu i oprezno se doda ledena voda. Nastali se precipitat filtrira i ispere s vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 9,8g
MS-ESI: [M+H]+ = 343,2
TLC: Rf = 0,8; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(c) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidin
DIPEA (5,57 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 2-merkaptoacetata (3,28 ml) i 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-pirimidina (primjer 14(b), 9,8 g) u mješavini EtOH (80 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM sve dok se potpuno ne otopi, ispere s vodenom 0,5 N HCl, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 12,9 g
MS-ESI: [M+H]+ = 427,2
TLC: Rf = 0,7; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(d) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)- tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
DIPEA (13,0 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidina (primjer 14(c), 12,9 g) u mješavini apsolutnog etanola (75 ml) i toluena p.a. (75 ml). Nakon 48 sati na 100°C, mješavina se ohladi na 0°C. Nastali se precipitat filtrira, ispere s hladnim EtOH i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 11,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 427,2
TLC: Rf = 0,6; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(e) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
Otopina kositar (II) klorida (15 g) u apsolutnom EtOH (150 ml) se doda u otopinu Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 14(d), 10,86 g) u 1,4-dioksanu (150 ml). Doda se 37%-tna vodena HCl i mješavina zagrijava pod refluksom tijekom 16 sati. Mješavina se ohladi do sobne temperature i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se suspendira u EtOAc (400 ml) i doda se THF dok se potpuno ne otopi. Doda se vodeni 4N NaOH da se dobije pH 10-11. Mješavina se razrijedi dodatkom zasićene vodene NaCl. Organski se sloj odvoji, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 12,0g
MS-ESI: [M+H]+ = 397,2
TLC: Rf = 0,4; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(f) 5-Amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina
Kalijev hidroksid (13 g) se doda u otopinu etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 14(e), 10,1 g) u mješavini 1,4-dioksana (150 ml) i vode (50 ml). Nakon 16 sati na 90°C, mješavina se ohladi na 0°C. Nastali se precipitat filtrira, suspendira u vodi (180 ml) i ohladi na 0°C. Mješavina se zakiseli dodatkom vodene 2N limunske kiseline i miješa na 0°C tijekom 2 sata. Nastali se precipitat filtrira, ispere s vodom i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 6,3 g
MS-ESI: [M+H]+ = 369,2
TLC: Rf = 0,2; silika gel, DCM/MeOH = 95/5 (v/v)
(g) tert-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
DIPEA (7,1 ml), tert-butilamin (4,3 ml) i TBTU (6,6 g) dodaju se u mješavinu 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (primjer 14(f), 6,3 g) u mješavini DCM (125 ml) i DMF (N,N-dimetilformamid) (25 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM i ispere sa zasićenom vodenom NaHCO3, vodenom 0,1 N HCl i zasićenom vodenom NaCl. Organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na silika gelu, koristeći heptan/EtOAc = 3/7 do 1/1 (v/v) kao eluent.
Prinos: 6,45 g
MS-ESI: [M+H]+ = 343,2
TLC: Rf = 0,8; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(h) tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Bromoacetil klorid (2,40 ml) se doda u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 14(g), 5,0 g) i DIPEA (10,5 ml) u DCM (50 ml). Nakon 3 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM, ispere sa zasićenom vodenom otopinom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski na silika gelu, koristeći heptan/EtOAc = 3/2 kao eluent. Dobije se mješavina tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida i tert-butil 5-amino-4-(3-(2-kloroacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida.
Prinos: 3,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 546,2; [M'+H]+ = 500,2
TLC: Rf = 0,2; silika gel, toluen/EtOAc = 7/1 (v/v)
(i) tert-Butil 5-amino-2-(2-tienil)-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanui otopinu tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 14(h), 100 mg) u DCM (5 ml) doda se N-metil-2-aminoetanol (140 mg). nakon miješanja tijekom 17 sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se smjesa razrijedi s DCM (50 ml), ispere s vodenim NaHCO3 (1 M, 2 x 10 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 59 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 539,2
HPLC: Rt = 11,01 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 15
tert-Butil 5-amino-2-(2-tienil)-4-(3-((N-(metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 14(h), 100 mg) i DiPEA (0,5 ml) u DCM (5 ml) se doda u glicin metil ester hidroklorid (250 mg). Nakon miješanja tijekom 17 sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se mješavina razrijedi s DCM-om (50 ml), ispere s vodenim NaHCO3 (1M, 2 x 10 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 74 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 553,0
HPLC: Rt = 12,57 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 16
tert-Butil 5-amino-2-(2-tienil)-4-(3-((N,N-di-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetoamido)-fenil)-2-(2-tienil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 14(h), 100 mg) u DCM (5 ml) doda se N;N-di-(2-metoksietil)-amin (200 mg). Nakon miješanja na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM-om (50 ml), ispere s vodenim NaHCO3 (1M, 2 x 10 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 59 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 597,4
HPLC: Rt = 13,84 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 17
tert-Butil 5-amino-2-etilamino-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) tert-Butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid (primjer 4, 1,0 g) u trifluorocetnoj kiselini (TFA, 25 ml), doda se 3-klorperbenzoična kiselina (m-CPBA, 1,0 g). Nakon 17 sati, reakcijska se mješavina koncenrira u uvjetima smanjenog tlaka na ambijentalnoj temperaturi (20°C), ponovno se otopi u DCM (100 ml), oprezno ispere sa zasićenim s vodenim NaHCO3 (1M, 2 x 50 ml),i vodom (50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Sirovi ekstrakt se bez daljnjeg pročišćavanja koristi u slijedećem koraku.
Prinos: 820 mg
MS-ESI: [M+H]+ = 547,3
TLC: Rf = 0,2; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) tert-Butil 5-amino-2-etilamino-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Etil amin hidroklorid (150 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-etilamino-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 17(a), 100 mg) i DiPEA (0,5 ml) u 1,4-dioksanu (5 ml) i reakcijska se miješavina zagrijava na 60°C kroz 3 sata. Nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere sa zasićenom otopinom NaCl (1M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga se organski sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 36 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 528,4
HPLC: Rt = 10,21 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 18
tert-Butil 5-amino-2-(N,N-dimetilamino)-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) tert-Butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 1(i), 1,0 g) u trifluoroctenoj kiselini (TFA, 25 ml), doda se 3-klorperbenzojeva kiselina (m-CPBA, 1,0 g). Nakon 17 sati, reakcijska se mješavina koncentrira pod smanjenim tlakom na ambijentalnoj temperaturi (20°C), ponovno otopi u DCM (100 ml), oprezno ispere zasićenim vodenim NaHCO3 (2 x 50 ml)i vodom (50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Sirovi se ostatak, bez daljnjeg pročišćavanja, koristi u slijedećem koraku.
Prinos: 910 mg
MS-ESI: [M+H]+ = 519,2
TLC: Rf = 0,15; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) tert-Butil 5-amino-2-(N,N-dimetilamino)-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Dimetil amin hidroklorid (150 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-Butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-metil-N-(2-hidroksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 18(a), 100 mg) i DiPEA (0,5 ml) u 1,4-dioksanu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 60°C tijekom 3 sata. Nakon što se reakcijska mješavina koncentrira pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml), ispere s zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 36 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 500,2
HPLC: Rt = 10,03 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 19
tert-Butil 5-amino-2-etilamino-4-(3-((N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) tert-Butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metiltio-4-(3-((N-(metokarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 3, 1,0 g) u trifluoroctenoj kiselini (TFA, 25 ml) se dodaju 3-kloroperbenzojevu kiselinu (m-CPBA, 1,0 g). Nakon 17 sati, reakcijska se mješavina koncentrira pod smanjenim tlakom na ambijentalnoj temperaturi (20°C), ponovno otopi u DCM (100 ml), oprezno ispere zasićenim vodenim NaHCO3 (2 x 50 ml)i vodom (50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Sirovi se ostatak, bez daljnjeg pročišćavanja, koristi u slijedećem koraku.
Prinos: 680 mg
MS-ESI: [M+H]+ = 533,6
TLC: Rf = 0,17; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) tert-Butil 5-amino-2-etilamino-4-(3-((N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Etil amin hidroklorid (150 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 19(a), 100 mg) i DiPEA (0,5 ml) u 1,4-dioksanu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 60°C tijekom 3 sata. nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod reduciranim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere sa zasićenom otopinom NaCl (1M, 25 ml) i vode (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 57 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 514,2
HPLC: Rt = 12,56 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 20
tert-Butil 5-amino-2-izopropilamino-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Izopropil amin (150 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid (primjer 17(a), 100 mg) i DiPEA (0,5 ml) u 1,4-dioksanu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 60°C tijekom 3 sata. Nakon što se reakcijska mješavina koncentrira pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere sa zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 57 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 514,2
HPLC: Rt = 11,01 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 21
tert-Butil 5-amino-2-alilamino-4-(3-((N-(metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Alil amin (200 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-metoksikarbonilmetil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida i DiPEA (0,5 ml) u 1,4-dioksanu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 60°C tijekom 3 sata. Nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere sa zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 65 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 526,4
HPLC: Rt = 13,18 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 22
tert-Butil 5-amino-2-metoksi-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Kalijev tert-butoksid (100 mg) se doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 17(a), 200 mg) u metanolu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 50°C tijekom 3 sata. Nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere s vodenim amonijevim kloridom (1 M, 25 ml), zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 92 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 515,4
HPLC: Rt = 12,21 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 23
tert-Butil 5-amino-2-aliloksi-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Kalijev se tert-butoksid (100 mg) doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 17(a), 200 mg) u alilnom alkoholu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 50°C tijekom 3 sata. Nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere s vodenim amonijevim kloridom (1 M, 25 ml), ), zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 63 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 541,4
HPLC: Rt = 12,71 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 24
tert-Butil 5-amino-2-izopropoksi-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Kalijev se tert-butoksid (100 mg) doda u izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-2-metansulfinil-4-(3-((N-etil-N-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 17(a), 200 mg) u izopropanolu (5 ml) i reakcijska se mješavina zagrijava do 50°C tijekom 3 sata. Nakon koncentriranja reakcijske mješavine pod smanjenim tlakom, ostatak se prevede u DCM (50 ml) i ispere s vodenim amonijevim kloridom (1 M, 25 ml),), zasićenom otopinom NaCl (1 M, 25 ml) i vodom (25 ml). Nakon toga, organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Tako dobiveni ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 32 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 543,4
HPLC: Rt = 12,93 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 25
tert-Butil 5-amino-2-(4-piridil)-4-(3-((N-(1-hidroksi-2-metil-prop-2-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
(a) 5-Cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-6-hidroksi-pirimidin
Mješavina 4-amidino-piridin hidroklorida (16,5 g), 3-nitrobenzaldehid (15,1 g), etil cijanoacetat (11,2 ml) i kalijev karbonata (16,6 g) u apsolutnom EtOH (250 ml), miješa se na 60°C tijekom 16 sati. Reakcijska se mješavina ohladi na 0°C u ledenoj kupelji. Nastali se precipitat filtrira i ispere s ledenom vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 18,3 g
MS-ESI: [M+H]+ = 320,2
TLC: Rf = 0,2; silika gel, DCM/MeOH = 9/1 (v/v)
(b) 6-Kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)- pirimidin
POCl3 (50 ml) se doda u izmješanu otopinu 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-6-hidroksi-pirimidina (primjer 25(a), 18,3 g) i dimetilanilina (0,5 ml) u suhom 1,4-dioksanu p.a. (200 ml). Nakon 3 sata na 90°C, topla se mješavina filtrira i filtrat koncentrira pod smanjenim tlakom. Nastali se precipitat filtrira i ispere s vodom. Ostatak vode se ukloni koevaporacijom s 1,4-dioksanom.
Prinos: 17,2 g
MS-ESI: [M+H]+ = 338,4
TLC: Rf = 0,7; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(c) Etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidin
DIPEA (9,8 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 2-merkaptoacetata (5,7 ml) i 6-kloro-5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)- pirimidina (primjer 25(b), 17,2 g) u mješavini EtOH (125 ml) i DCM (125 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM sve do potpunog otapanja, ispere s 0,5 N vodenom HCl, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 20,5 g
MS-ESI: [M+H]+ = 422,0
TLC: Rf = 0,6; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(d) Etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
DIPEA (20,0 ml) se doda u izmješanu otopinu etil 5-cijano-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-6-(etoksikarbonilmetiltio)-pirimidina (primjer 25(c), 20,5 g) u mješavini apsolutnog EtOH (100 ml) i toluena p.a. (100 ml). Nakon 48 sati na 100°C, mješavina se ohladi do 0°C. Nastali se precipitat filtrira, ispere s hladnim EtOH i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 15,7 g
MS-ESI: [M+H]+ = 422,0
TLC: Rf = 0,5; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(e) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat
Otopina kositar (II) klorida (21,0 g) u apsolutnom EtOH (250 ml), doda se u otopinu etil 5-amino-4-(3-nitrofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 25(d), 15,7 g) u 1,4-dioksanu p.a. (250 ml). Doda se 37%-tna vodena HCl (6,9 ml) i mješavina se zagrijava pod refluksom (90°C) tijekom 16 sati. Mješavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentrira pod smanjenim tlakom.Ostatak se suspendira u EtOAc (500 ml). Doda se 4N vodena NaOH da se dobije pH između 10-11. Mješavina se razrijedi dodatkom zasićene vodene NaCl. Organski se sloj odvoji, osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom.
Prinos: 12,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 392,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(f) Etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina
Kalijev hidroksid (15,7 g) se doda u otopinu etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata (primjer 25(e), 12,0 g) u mješavini 1,4-dioksana (210 ml) i vode (80 ml). Nakon 16 sati na 90°C, mješavina se ohladi na 0°C. Mješavina se zakiseli na pH 3 dodatkom 2N vodene limunske kiseline i miješa na 0°C sve do sobne temperature tijekom 2 sata. nastali se precipitat filtrira, ispere s vodom i osuši in vacuo na 40°C.
Prinos: 12,0 g
MS-ESI: [M+H]+ = 364,2
TLC: Rf = 0,1; silika gel, DCM/MeOH = 95/5 (v/v)
(g) tert-Butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
DIPEA (12,9 ml), tert-butalamin (7,8 ml) i TBTU (11,9 g) se dodaju u mješavinu etil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (primjer 25(f), 12,0 g) u mješavini DCM (250 ml) i DMF (50 ml) u dušikovoj atmosferi. Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, mješavina se razrijedi s DCM i ispere sa zasićenom NaHCO3, 0,1 N vodenom HCl i zasićenom vodenom NaCl. Organski se sloj osuši (MgSO4) i koncentrira pod smanjenim tlakom. Sirovi se produkt pročisti kromatografski n asilika gelu, koristeći dklormetan/metanol = 1/0 do 95/5 (v/v) kao eluent.
Prinos: 12,2 g
MS-ESI: [M+H]+ = 419,4
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(h) tert-Butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
Otopina bromacetil bromida (0,59 ml) u THF (25 ml), doda se kap po kap u otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-aminofenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 25(g), 2,0 g) i N,N-dimetil anilina (3,0 ml) u THF (50 ml). Nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi, mješavina se koncentrira pod smanjenim tlakom, nakon čega se otopi u DCM (100 ml), ispere sa zasićenom NaHCO3, osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se koristi bez daljnjeg prošišćavanja u slijedećem koraku.
Prinos: 2,3 g
MS-ESI: [M+H]+ = 539,2
TLC: Rf = 0,3; silika gel, heptan/EtOAc = 3/2 (v/v)
(i) tert-Butil 5-amino-2-(4-piridil)-4-(3-((N-(1-hidroksi-2-metil-prop-2-il)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid (primjer 25(h), 200 mg) u DCM (5 ml), doda se 2-amino-2-metil-propanol (300 mg). Nakon miješanaj tijekom 17 sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se mješavina ispere s vodenom NaHCO3 (1M, 2 x 50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 73 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 548,2
HPLC: Rt = 9,65 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 26
tert-Butil 5-amino-2-(4-piridil)-4-(3-((N,N-bis-(2-metoksietil)-glicinil)-amino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamid
U izmješanu otopinu tert-butil 5-amino-4-(3-(2-bromoacetamido)-fenil)-2-(4-piridil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-karboksamida (primjer 25(h), 200 mg) u DCM (5 ml), doda se bis-(2-metoksietil)-amin (300 mg). Nakon miješanaj tijekom 17 sati na sobnoj temperaturi, reakcijska se mješavina razrijedi s DCM (100 ml), ispere s vodenom NaHCO3 (1M, 2 x 50 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira in vacuo. Ostatak se pročisti HPLC-om koristeći Luna C-18 kolonu sa slijedećim gradijentom: 0,1% vodene TFA + 10% vodenog ACN/ACN = 90/10 do 10/90 (v/v) kroz 30 minuta. Spoj iz naslova se tada liofilizira iz mješavine 1,4-dioksana, 0,1% vodene TFA i vode.
Prinos: 170 mg (sol TFA)
MS-ESI: [M+H]+ = 592,2
HPLC: Rt = 12,02 min, kolona Luna C-18(2), 3 μm, 100 x 2,0 mm, detekcija UV = 210 mm, temperatura peći = 40°C, protok = 0,25 ml/min., eluent fosfatni pufer 50 mM pH 2,1/voda/ACN = 10/80/10 do 10/10/80 (v/v/v), vrijeme protoka = 20 min.
Primjer 27
In vitro biološka aktivnost CHO-LH i CHO-FSH
Agonistička aktivnost spojeva prema LH, testirana je u stanicama ovarija kineskog hrčka (CHO stanice, prema engl. «Chinese Hamster Ovary cells») na kojima je izvršena stabilna tranfekcija s humanim receptorom za LH i kotranfekcija s elementom osjetljivim na cAMP (CRE, prema engl. cAMP responsive element) / promotorom s kojega se eksprimira reporter gen za luciferazu iz krijesnice. Signal koji potiče od luciferaze je kvantificiran na luminiscentnom brojaču. Za spojeve koji se testiraju, izračunaju se EC50 vrijednosti (koncentracija testiranog spoja koja dovodi do polovične maksimalne (50 %)stimulacije). U tu je svrhu korišten program GraphPadPRISM, verzija 3.0 (GraphPad software Inc., San Diego).
Na sličan način je testirana agonistička aktivnost spojeva prema FSH, u stanicama CHO na kojima je izvršena tranfekcija s reporterskim genom za luciferazu i humanim genom za receptor FSH. Rezultati su prikazani u Tablici 1.
In vivo biološka aktivnost
Kako bi izmjerii in vivo aktivnost spojeva s agonističkim djelovanjem na LH/FSH receptore, ispitana je indukcija ovulacije u nezrelih miševa. U ovom su biološkom testu nezrele ženke miša tretirane s FSH iz urina (Humegon 12,5 IU/životinji). Približno 48 sati kasnije, životinje se tretiraju s LH/FSH agonističkim spojem, priprava kojih je opisana u primjerima 1, 4, 9 i 17, u dozama od 50 mg/kg. Životinje se žrvtuju 24 sata nakon tretmana s LH/FSH agonističkim spojevima i mikroskopski se odredi broj jajašaca u jajovodu. Prosječno se testira 10-15 životinja. Srednja vrijednost broja jajašaca, bila je 8 uz iznimku kod spoja iz primjera 17 (koja je iznosila 0,4).
Tablica 1
[image] [image]

Claims (10)

1. Tieno[2,3-d]pirimidinski derivat prema općoj formuli I, [image] ili njegova farmaceutski prihvatljivu sol, naznačen time da X označava O ili H,H A je S, NH, N(R6), O ili veza; R1 je (1-4C)alkil, (2-4C)alkenil, fenil ili (2-5C)heteroaril, s tim da fenilni ili heteroarilni prsten može biti supstituiran s jednim ili više skupina supstituenata: hidroksi, halogen, nitro, trifluorometil, cijano, amino ili (1-4C)(di)alkilamino i R2 je H, (1-4C)alkil, (1-4C)alkoksi(2-4C)alkil ili hidroksi (2-4C)alkil; R3 i R4 mogu se neovisno odabrati iz skupine H, (1-4C)alkil, hidroksi (1-4C)alkil; R5 je H ili (1-4C)alkil; R6 se može odabrati iz istih skupina, kako je opisano za R1.
2. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time da je X H,H.
3. Spoj prema zahtjevima 1 ili 2, naznačen time da je R5 (1-4C)alkil.
4. Spoj prema zahtjevima 1-3, naznačen time da R3 = R4.
5. Spoj prema zahtjevima 1-4, naznačen time da R3 = R4 =H.
6. Spoj prema zahtjevima 1-5, naznačen time da je R2 (1-4C)alkil.
7. Spoj prema zahtjevima 1-6, naznačen time da je za upotrebu u terapiji.
8. Farmaceutski pripravak koji sadrži tieno[2,3-d]pirimidinski spoj prema zahtjevima 1-6 ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol, naznačen time da je u smjesi s farmaceutski prihvatljivim pomoćnim tvarima.
9. Upotreba tieno[2,3-d]pirimidinski spojeva prema zahtjevima 1-6 ili njihovih farmaceutski prihvatljiva soli ili solvata, naznačena time da se koristi za proizvodnju lijekova za kontrolu plodnosti.
10. Postupak za liječenje poremećaja u plodnosti u pacijenata kojima je ono potrebno, naznačen time da se primjenjuje učinkovita količina spoja prema zahtjevima 1-6.
HR20040194A 2001-09-04 2002-08-29 GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d] PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY HRP20040194A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01203328 2001-09-04
PCT/EP2002/009648 WO2003020727A1 (en) 2001-09-04 2002-08-29 GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d]PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20040194A2 true HRP20040194A2 (en) 2004-08-31

Family

ID=8180877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20040194A HRP20040194A2 (en) 2001-09-04 2002-08-29 GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d] PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY

Country Status (27)

Country Link
US (1) US7375109B2 (hr)
EP (1) EP1427734B1 (hr)
JP (1) JP4263094B2 (hr)
KR (1) KR100891630B1 (hr)
CN (1) CN1261437C (hr)
AR (1) AR036408A1 (hr)
AT (1) ATE309251T1 (hr)
AU (1) AU2002333750B2 (hr)
BR (1) BR0212173A (hr)
CA (1) CA2457212C (hr)
CY (1) CY1106052T1 (hr)
DE (1) DE60207280T2 (hr)
DK (1) DK1427734T3 (hr)
EC (1) ECSP044990A (hr)
ES (1) ES2252540T3 (hr)
HR (1) HRP20040194A2 (hr)
HU (1) HUP0401443A3 (hr)
IL (2) IL160194A0 (hr)
IS (1) IS2419B (hr)
MX (1) MXPA04002046A (hr)
NO (1) NO328792B1 (hr)
NZ (1) NZ531375A (hr)
PE (1) PE20030467A1 (hr)
PL (1) PL368388A1 (hr)
RU (1) RU2294331C2 (hr)
WO (1) WO2003020727A1 (hr)
ZA (1) ZA200401459B (hr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6890923B2 (en) * 2002-12-16 2005-05-10 Astrazeneca Ab Compounds
KR100666484B1 (ko) * 2005-02-04 2007-01-09 삼성전자주식회사 반도체 메모리 장치의 입출력 회로 및 입출력 방법
WO2010047674A1 (en) 2008-10-20 2010-04-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Low molecular weight thyroid stimulating hormone receptor (tshr) agonists
CN101762915B (zh) * 2008-12-24 2013-04-17 北京京东方光电科技有限公司 Tft-lcd阵列基板及其驱动方法
JP5965387B2 (ja) 2010-04-08 2016-08-03 アメリカ合衆国 Ｔｓｈ受容体用のインバースアゴニストおよびニュートラルアンタゴニスト
PL2900675T3 (pl) * 2012-09-28 2019-08-30 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sposób wytwarzania pochodnej tienopirymidyny
JP2022551316A (ja) 2019-10-10 2022-12-08 ミオバント サイエンシズ ゲーエムベーハー Ｎ－（４－（１－（２，６－ジフルオロベンジル）－５－（（ジメチルアミノ）メチル）－３－（６－メトキシ－３－ピリダジニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロチエノ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル）フェニル）－Ｎ’－メトキシ尿素の結晶形

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0303306B1 (en) 1987-08-08 1993-03-10 Akzo N.V. Contraceptive implant
DE19632423A1 (de) * 1996-08-12 1998-02-19 Merck Patent Gmbh Thienopyrimidine
TW564247B (en) 1999-04-08 2003-12-01 Akzo Nobel Nv Bicyclic heteraromatic compound

Also Published As

Publication number Publication date
CN1551883A (zh) 2004-12-01
AU2002333750B2 (en) 2008-02-21
NZ531375A (en) 2005-06-24
HUP0401443A3 (en) 2008-05-28
DE60207280T2 (de) 2006-05-18
CA2457212C (en) 2011-02-15
US7375109B2 (en) 2008-05-20
RU2004110036A (ru) 2005-10-10
WO2003020727A1 (en) 2003-03-13
IL160194A0 (en) 2004-07-25
PE20030467A1 (es) 2003-05-26
CN1261437C (zh) 2006-06-28
ZA200401459B (en) 2004-11-22
IS2419B (is) 2008-10-15
IS7152A (is) 2004-02-13
DK1427734T3 (da) 2006-03-06
KR20040029135A (ko) 2004-04-03
IL160194A (en) 2009-06-15
ATE309251T1 (de) 2005-11-15
US20040180907A1 (en) 2004-09-16
NO328792B1 (no) 2010-05-18
EP1427734B1 (en) 2005-11-09
RU2294331C2 (ru) 2007-02-27
HUP0401443A2 (hu) 2004-11-29
ECSP044990A (es) 2004-04-28
KR100891630B1 (ko) 2009-04-03
MXPA04002046A (es) 2004-07-16
EP1427734A1 (en) 2004-06-16
ES2252540T3 (es) 2006-05-16
AR036408A1 (es) 2004-09-08
JP2005504784A (ja) 2005-02-17
BR0212173A (pt) 2004-07-20
CY1106052T1 (el) 2011-04-06
PL368388A1 (en) 2005-03-21
JP4263094B2 (ja) 2009-05-13
CA2457212A1 (en) 2003-03-13
NO20040922L (no) 2004-03-03
DE60207280D1 (de) 2005-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6569863B1 (en) Bicyclic heteroamatic compounds useful as LH agonists
AU2002337035B2 (en) Thieno[2,3-d]pyrimidines with combined LH and FSH agonistic activity
AU2002337035A1 (en) Thieno[2,3-d]pyrimidines with combined LH and FSH agonistic activity
EP1322651B1 (en) Bicyclic heteroaromatic compounds
HRP20040194A2 (en) GLYCINE-SUBSTITUTED THIENO [2,3-d] PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY
AU2002333750A1 (en) Glycine-substituted thieno[2,3-d]pyrimidines with combined LH and FSH agonistic activity
TWI314861B (en) Glycine-substituted thieno [2,3-d] pyrimidines with combined lh and fsh agonistic activity
HK1054942B (en) Bicyclic heteroaromatic compounds

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
PPPP Transfer of rights

Owner name: N.V. ORGANON, NL

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20090803

Year of fee payment: 8

OBST Application withdrawn