HU201799B

HU201799B - Process for producing microcarrier suitable for cell-breeding processes

Info

Publication number: HU201799B
Application number: HU865467A
Authority: HU
Inventors: Viktor Pavlovich Grachev; Andris Ekabovich Gutmanis; Mikhail Aleksandrovi Zavalnijj; Andris Khugovich Zicmanis; Maris Karlovich Kljavinsh; Valentina Dmitrievna Popova
Original assignee: N Proizv Ob Edinenie Biolar; Inst Poliomielita I Virusnykh
Priority date: 1985-10-03
Filing date: 1986-09-16
Publication date: 1990-12-28
Also published as: CS334586A1; EP0239648A1; DK279587A; HUT46058A; JPS63501474A; DD274336A3; DK279587D0; WO1987002056A1; EP0239648A4

Description

A találmány tárgya eljárás sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti eljárással előállított mikrohordozó készítmény. A találmány a mikrobiológiai iparban alkalmazható.

A sejtek nagyipari tenyésztésének területén a világon Összegyűlt, jelenlegi kísérleti és gyakorlati tapasztalatok tanúsítják a felülettől függő sejtek mikrohordozón történő pszeudoszuszpenziós tenyésztési módszerének előnyeit és perspektíváját. A módszer elve az, hogy a tápoldatban szuszpendált mikrohordozón rögzített sejtek szaporodnak és növekszenek.

Mikrohordozón jelenleg például a következő sejtek tenyészthetők: zöldmajmok veséinek sejtjei, primer és szekunder kultúrák; csirkeembrió sejtek, primer és szekunder kultúrák.

Ismert olyan eljárás a sejttenyésztésre mikrohordozók előállítására W082/0060 sz. PCT közzétételi iratban (nyilvánosságra hozve: 1982.03.04) leírtak szerint, amely eljárásnál a duzzasztott, szférikus zselatin-részecskék előállítása zselatin oldat szuszpendáltatásával történik. A zselatin oldatot először 100 μ,ιη lyukbőségű szitán erőteljes keverés közben, toluol-kloroform elegyben, felületaktív anyag jelenlétében átszitálják. Acetonos mosás és szárítás után a leválasztott, 100 μΐη-nél kisebb zselatin-részekcskéket vízben szuszpendálják, duzzasztják, glutáraldehiddel kezelik, és ismét 100 μηι lyukbőségű szitán átszitálják. AZ így leválasztott részecskéket szuszpendálják és autoklávban sterilizálják. A kapott mintát 250 μη lyukbőségű szitán átszitálják, a leválasztott részecskéket pedig 100 μΐη lyukbőségű szitán ismét szitálják és újra autoklávban kezelik.

Az eljárás hátránya, hogy bonyolult, amely abból ered, hogy a zselatinoldatot egy speciálisan erre a célra kialakított reaktorban kell szuszpendálni, és bonyolult összetételű, háromkomponensű elegy szükséges az eljáráshoz. Ezen kívül hátrányos még, hogy ez az ismert eljárás az előállítandó termék többlépéses kezelését igényli, tűzveszélyes és mérgező oldószereket kell használni, és a fő reagensből, a glutáraldehidből nagy mennyiség szükséges.

Másik ismert eljárást ír le a 1161 548 sz. szovjet szabadalmi leírás (nyilvánosságra hozva: 1985.06.15.). A sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozót ebben az eljárásban úgy állítják elő, hogy a zselatin oldatot intenzív keverés közben apoláris szerves oldószerek elegyében szuszpendálják és a folyamat közben az elegyhez dialdehid térhálósítószert adnak. A kapott szférikus részecskéket, azaz a mikrohordozót szitán átszitálják, szerves oldószerrel, majd felületaktív anyag jelenlétében vízzel mossák. Ezután regeneráló szerrel, pl. 10%-os hidrogén-peroxid oldattal kezelik a keletkező Schiffbázis regenerálása, a használati és tárolási stabilitás kialakítása, valamint színtelenítés céljából.

A regenerálást követő mosás után leválasztják a 100-250 μΐη közötti méretű részecskéket.

Az eljárás hátránya, hogy kivitelezése bonyolult, amely abból ered, hogy a szuszpendáláshoz speciálisan kialakított reaktorra van szükség és többkomponensű reakcióközeget kell alkalmazni. Az eljárásban bonyolult az előállított mikrohordozóból a diszpergáló szer kimosása is.

Az ismert eljárások szférikus alakú mikrohordozó előállítását teszik csak lehetővé, ez a sejttenyésztésnél nem optimális, mivel a sejtek nehezen rögződnek a mikrohordozó felületére.

Célul tűztük ki, hogy a technológiai munkafolyamat megváltoztatásával a mikrohordozó előállítási technológiáját az ismert eljárásokhoz képest leegyszerűsítjük és egyben az előállított mikrohordozó minőségét javítjuk úgy, hogy az a sejtek effektív fejlődését segítse elő.

A cél elérése érdekében a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására olyan eljárást alkalmazunk, amelyben a részecskéket a térhálósító szerrel kezelt zselatinból alakítjuk ki és a végterméket stabilizáljuk. A találmány szerint az eljárást úgy végezzük, hogy a szelatin részecskék kialakításához zselatin oldatot térhálósító-szerrel kezelünk, a keletkező zselatin blokkpolimert szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és az optimális sejtfejlődést lehetővé tevő 75-350 μΐη méretű részecskéket leválasztjuk, illetve száraz zselatint szabálytalan alakú részecskékké aprítunk, az optimális sejtfejlődést lehetővé tevő 75-35 μηι méretű részecskéket leválasztjuk és ezeket kezeljük térhálósító szerrel. A részecskék kialakítása után, stabilizálásukat megelőzően proteolitikus enzimmel kezeljük azokat a felületük lesimítása érdekében.

A találmány szerinti eljárással nagy tisztaságú jó minőségű mikrohordozót lehet előállítani, azaz a szuszpendáló közegből eredő szennyeződések amelyek jelenléte a tenyésztendő sejtekre korábban mérgező hatást gyakorolt - nem fordulnak elő. Az előállítási technológia lépései is csökkentek az ismert eljárásokhoz képest és így egyszerűbbé vált az eljárás is. Szükségtelenné váltak a szuszpendálásnál alkalmazott komplikált berendezések is.

A találmány szerinti térhálósító szerek lehetnek dialdehidek, illetve formaldehid.

A mikrohordozó minőségének javítása és a tárolási stabilitásának növelése érdekében dialdehid térhálódítószer alkalmazásánál a találmány szerint célszerűen úgy stabilizáljuk a kialakított részecskéket, hogy ismételten dialdehiddel, majd redukáló reagensekkel kezeljük azokat.

A találmány szerinti előnyös redukáló reagensek az alkálifémek bórhidridjei, illetve a hidrogén-peroxid. A találmány szerinti eljárás másik változatánál formaldehid térhálósítószert alkalmazunk és a kialakított részecskéket ismételt formaldehides kezeléssel stabilizáljuk, és lehetővé teszi a végtermék előállítási költségeinek csökkentését a jó minőségi jellemzők megtartása mellett.

A találmány szerinti előnyös proteolitikus enzimek a tripszin, illetve a kollagenáz.

A találmány tárgya a találmány szerinti eljárással előállított, sejttenyésztésre alkalmas olyan mikrohordozó készítmény is, amely szabálytalan alakú, 75-350 μΐη szemcseméretú, 1,03-1,15 g/cm³ sűrűségű zselatin-blokkpolimer részecskékből áll.

A találmány szerinti mikrohordozó készítmény részecskéinek szabálytalan alakja és sima felülete nagyon alkalmassá teszi a készítményt arra, hogy a sejtek megtapadjanak, fejlődjenek és szaporodjanak rajta. A találmány szerinti mikrohordozó ezenkívül transzparens, ez a tulajdonsága megkönnyíti

-2HU 201799 Β a sejttenyésztés ellenőrzését.

A találmány további előnyeit a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására szolgáló eljárás és a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó készítmény itt következő részletes leírásában világítjuk meg.

A részecskéket mindenekelőtt zselatinból alakítjuk ki. A zselatint szárazon szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és leválasztjuk a sejtek optimális fejlődését lehetővé tevő méretű frakciót, amelyet térhálósító szerrel kezelünk. Térhálósító szerként előnyösen formaldehidet, illetve dialdehideket, például glutáraldehidet, glioxált alkalmazunk.

A térhálósító szerrel történő kezelésnél zselatin blokkpolimer keletkezik, ez adja a mikrohordozó mechanikai, kémiai és termikus stabilitását.

Kiindulhatunk különböző zselatin oldatokból is, például vízben, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban vízmentes ecetsavban vagy más fehérjeoldószerben oldott zselatinból. Előnyös a zselatin vizes oldata. A részecskék kialakítása érdekében a zselatin oldatot térhálósító szerrel kezeljük és a keletkező zselatin blokkpolimert aprítjuk olyan szabálytalan alakú részecskékké, amelyek mérete a sejtek optimális fejlődését teszi lehetővé.

Formaldehid térhálósító szer alkalmazásakor a zselatin molekulák térhálósodása úgy történik, hogy a formaldehid először a zselatinban levő lizin ε-amino csoportjával reagál és a keletkező hidroximetil-származék egy másik szabad aminocsoporttal kapcsolódik össze. így a zselatin molekulákat a formaldehid molekulákból származó metilén csoportok kapcsolják egymáshoz, ez a termék átlátszóságát és stabilitását biztosítja.

Dialdehid térhálósítószer alkalmazásakor a dialdehid mindegyik aldehid csoportja Schiff-bázist képez a zselatinmolekulák szabad amino-csoportjával. A keletkező N=CH-kötése stabilitása és a színtelen végtermék előállítása érdekében az előállított zselatin blokkpolimert regeneráló reagenssel kezeljük.

A zselatin blokkpolimerből kialakított, szabálytalan alakú részecskék felülete is szabálytalan, nem síklapokkal határolt, ez pedig kedvezőtlen a sejtek megtapadása, növekedése és szaporodása szempontjából. A sima felületű részecskéket proteolitikus enzimmel, például tripszinnel, kollagenázzal történő kezeléssel alakítjuk ki.

A részecskék kimosása után következik a stabilizálásuk. Ha térhálósítószerként dialdehidet használunk, akkor a stabilizálást úgy végezzük, hogy a részecskéket ismételten dialdehiddel, majd regeneráló reagenssel kezeljük. Regeneráló reagensként olyan vegyületeket használunk, amelyek a C=N kötéseket és az aldehid csoportokat reagáltatják, például alkálifémek bórhidridjeit, hidrogénperoxidot stb. Ha térhálósító-szerként formaldehidet használunk, akkor a térhálősítást úgy végezzük, hogy a zselatin blokkpolimer részecskéket ismételten formaldehiddel kezeljük.

Az eljárással olyan mikrohordozó készítményt kapunk, amely szabálytalan alakú, mechanikailag, kémiailag és termikusán stabil, 75-350 μ,ιη méretű, 1,03-1,15 g/cm³ sűrűségű zselatin blokkpolimer ré4 szecskákból áll. A találmány szerinti mikrohordozó készítmény a tenyésztendő sejtek felületével effektív, biospecifikus kölcsönhatásba lép. A mikrohordozó törésmutatója és átlátszósága lehetővé teszi a sejtfejlődés kényelmes ellenőrzését. A mikrohordozó sima felülete és szabálytalan alakja a sejtek jó tapadását, rögződését és fejlődését eredményezi. A mikrohordozót a szokásos tenyészközegek nem károsítják és a sejtek tenyésztésére alkalmas mind laboratóriumi, mind nagyipari körülmények között.

A találmány szerinti mikrohordozó készítmény sokkal nagyobb tisztasági fokú, mint az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozók, mivel az ismert eljárásokban alkalmazott szuszpendáló közegből (olaj, szénhidrogének) eredő szennyeződések teljesen elmaradnak. Ezek a szennyeződések azért károsak, mert a sejtekre mérgezőek. A találmány szerint mikrohordozó készítmény minősége azért is jobb az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozókénál, mert a szemcsenagyság-megoszlása homogénebb (a részecskék 98%-ának a mérete 100250 gm között van). Az ismert eljárásokkal előállított mikrohordozók részecskéinek csak 75-80%-a 100-250 p,m méretű.

A találmány szerinti eljárás technológiai folyamata az ismert eljárásokhoz képest egyszerűbb, mivel elmarad a diszpergálás és a többszöri mosás folyamata, továbbá ennek megfelelően az eljárás készülékei is egyszerűbbek.

A továbbiakban példákban mutatjuk be a sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítási eljárásának alkalmazását és a mikrohordozó készítmény vizsgálatát.

1. példa

400 ml 50 °C hőmérsékleten előállított, 25%-os vizes zselatinoldatot szobahőmérsékleten intenzíven összekeverünk 150 ml 25%-os vizes glioxál oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 250 μΐη-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 250 μηιnél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os, pH=7,6 értékű foszfát-puffer-oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,5 liter tripszin-oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal mossuk a tripszin és a zselatin blokkpolimer fermentációs hasításánál keletkezett oldható termékek eltávolítása érdekében. A kimosott részecskékhez 100 ml 25%-os glioxál oldatot adunk és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A részecskékről a glioxál oldatot 100 μΐη-es szitán leszűrjük, a szitán fennmaradt részecskéket 1 liter 3%-os vizes hidrogén-peroxidoldatban szuszpendáljuk és 30 percig állni hagyjuk. Ezután a mikrohordozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal mossuk. A 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált mikrohordozót autoklávban 120 °C hőmérsékleten 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,07 g/cm³ sűrűségű, 200250 μΐη részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót zöldmajmok felületfüggő vesesejtjeinek tenyésztésénél vizsgáljuk.

A tenyésztést 20 ml-es rázott lombikban végezzük, a lombikba 150 ml 5% borjúszérummal ellátott

-3HU 201799 Β

Eagle-táptalajt helyezünk. A mikrohordozó koncentrációja 8.10³ részecske/táptalaj ml. A tenyésztés eredményét az 1-10. példák eredményeit öszszefoglaló táblázatban adjuk meg.

2. példa

200 ml 50 °C hőmérséklelten előállított, 35%-os vizes zselatin oldatot szobahőmérsékleten intenzíven összekeverünk 100 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 200 μΐη-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 200 μηιnél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os foszfátpuffer oldattal készített 0,5%-os kollagenáz oldattal 37 ± 1 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 270 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 230 ml kollagenáz oldatot alkalmazunk.

Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal mossk. A kimosott részecskéket egymást követően szobahőmérsékleten 130 ml 25%-os glutáraldehid oldattal, az átalakulatlan glutáraldehid eltávolítására 0,15 mól-os NaCl oldattal, majd 0,5 liter 2%-os nátrium-bórhidrid oldattal kezeljük, végül bő vízzel mossuk, míg a mosófolyadék pH-értéke semleges lesz.

A mikrohordozót ezután 0,5 liter 0,15 mól-os NaCl-oldatban újra szuszpendáljuk, 10-15 perc múlva egy friss adag izotóniás NaCl-oldattal kimossuk, majd 120 °C hőmérsékleten, autoklávban, 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 250 g szabálytalan alakú, 1,05 g/cm³ sűrűségű, 150-200 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg.

3. példa

A mikrohordozót a 2. példában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de kiindulási oldatként 20%-os zselatin oldatot, proteolitikus enzimként 0,75%-os kimotripszin oldatot és regeneráló reagensként 3%-os hidrogén-perojüd-oldatot alkalmazunk. Az eljárással 250 ml szabálytalan alakú, 1,06 g/cm³sűrűségű, 150-200 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

4. példa

A zselatin blokkpolimer részecskéket az 1. példában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de a részecskéket 0,7510,15 mól-os, pH=7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal 25 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A többi kezelési lépés megegyezik az 1. példában leírtakkal. Az eljárással 475 g szabálytalan alakú, 1,06 g/cm³ sűrűségű, 200-250 μ részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

5. példa

A zselatin blokkpolimer részecskéket az 1. pél4 dában leírtakhoz hasonlóan állítjuk elő, de a részecskéket 1,25 1 0,06 mól-os, pH = 6,4 értékű foszfát-puffer oldattal készült 0,75%-os kimotripszin oldattal 20 °C hőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A többi kezelési lépés megegyezik az 1. példában leírtakkal. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,08 g/cm³ sűrűségű, 200-250 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

6. példa

200 g aprított és szitált, 75-90 μ részecskeméretű száraz zselatint vízben való duzzasztás után 10 percig 500 ml 40%-os formaldehid oldattal kezelünk. A formaldehid feleslegét vízzel kimossuk, és a zselatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,51 tripszin-oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl oldattal kimossuk és 10 percig 500 ml 40%-os formaldehid oldattal kezeljük. A mikrohordozót ezután leszűrjük és 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mól-os NaCl oldatban szuszpendált mikrohordozót 120 °C hőmérsékleten, autoklávban 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 550 g szabálytalan alakú, 1,15 g/cm³ sűrűségű, 160-200 μ részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

7. példa

200 g aprított és légsugaras szitálással szitált, 8-100 száraz részecskeméretű száraz zselatint 500 ml 20%-os formaldehid oldattal kezelünk. A továbbiakban az előállítási folyamat hasonló az 1. példában leírtakhoz, de proteolitikus enzimként 25%-os kimotripszin oldatot alkalmasunk és a részecskéket 20%-os formaldehid oldattal stabilizáljuk. Az eljárással 590 g szabálytalan alakú, 1,02 g/cm³ sűrűségű 180-250 pm részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

8. példa

200 g aprított és szitált, 70-90 μ száraz részecskeméretű száraz zselatint 500 ml 30%-os formaldehid oldattal 10 percig kezelünk. A formaldehid feleslegét vízzel kimossuk, és a szelatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. A kezelésnél 550 g zselatin blokkpolimer részecskére számítva 0,5 1 tripszin oldatot alkalmazunk. Ezután a részecskéket 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk és 500 ml 30%-os formaldehid oldattal kezeljük. A mikrohordozót ezután leszűrjük és 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mólos NaCl-oldatban szuszpendált mikrohordozót

-4HU 201799 Β

120 °C hőmérsékleten, autoklávban 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 510 g szabálytalan alakú,

1,07 g/cm³ sűrűségű, 160-200 pjn részecskeméretű mikrohordozót kapunk.

A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz ha- 5 sonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg.

9. példa

400 ml 50 °C hőmérsékleten előállított, 25%-os 10 vizes zselatin oldatot intenzíven összekeverünk 100 ml 35%-os vizes formaldehid oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 200 μΐη-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 200 μπι-nél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát- 15 puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük.

Ezután a részecskéket a tripszin eltávolítása érdekében 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A kimosott részecskékhez 100 ml 35%-os formaldehid 20 oldatot adunk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A formaldehid oldatot szűréssel eltávolítjuk, a mikrohordozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk és a 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált mikrohordozót 120 ’C hőmérsékleten, autoldávban 25 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,09 g/cm³ sűrűségű 150-200 μιη részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák 30 eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg.

10. példa

200 g aprított és szitált, 40-50 μΐη száraz részecskeméretű száraz zselatint vízben való duzzasztás után 500 ml 25%-os glutáraldehid oldattal kezelünk. A glutáraldehid feleslegét vízzel kimossuk és a zselatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH=7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. Ezután a részecskéket desztillált (ionmentesített) vízzel mossuk a tripszin és a zselatin fermentáció hasításánál keletkezett oldható termékek eltávolítása érdekében. A kimosott részecskékhez 100 ml 25%-os glutáraldehid oldatot adunk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk a rendszert.

Ezután a glutáraldehid oldatot eltávolítjuk és a részecskéket vízzel kimossuk, majd 1 liter 1%-os nátriura-hidrogén-szulfit oldatban szuszpendáljuk és 30 percig állni hagyjuk. Ezt követően a mikrohorodozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált mikrohorodozót 120 ’C hőmérsékleten autoklávban, 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,07 g/cm³ sűrűségű, 80-120 μιη részecskenagyságú mikrohordozót kapunk.

Az 1-10. példákban leírt mikrohordozók vizsgálati eredményei

A mikrohordozó fajtája	Kiindulási sejtkoncentráció (sejt/ml)	Tenyésztett sejtkoncentráció (sejt/ml)	Szaporodási tényez
1. példában leírt	2.10⁵	10,4.10⁵	5,2
2. „ „	2.10⁵	9,6.10⁵	4,8
3· „ „	2.10⁵	6,2.10⁵	3,1
4.	0,15.10⁵	1,5.10⁵	10
	0,15.10⁵	1,5.10	10
6· „ „	2.10⁵	8,6.10⁵	4,3
7· „ „	2.10⁵	7,9.10⁵	4,0
8· ,, „	2.10⁵	9,4.10⁵	4,7
9. „ „	2.10⁵	8,1.10⁵	4,0
10. „ „	2.10⁵	8,2.10⁵	4,1

11. példa

A 2. példában leírt mikrohordozót alkalmazzuk primer csirkeembriósejtek tenyésztésére. A mikrohordozót konzisztens maradékának 5000 cm² tenyészfelületet biztosító 18 ml-ét 50 ml Henk-féle sóoldatban szuszpendáljuk. A Henk-féle sóoldatot 10 perc múlva leöntjük és a mikrohordozót 5% boíjúszérumot 0,25% laktalbumin hidrolizátumot

0,1% galaktózt, 20 mmól HEPES-puffer oldatot és antibiotikumot tartalmazó 50 ml-nyi 199 sz. tápoldatban szuszpendáljuk. A199 sz. tápoldatot összetételét R.Adams „Methoden dér Zellkultur für Biochemiker” ismerteti. Az összetétel a következő:

199 sz. tápközeg

Morgan és munkatársai, 1950,1955 előirata

Aminosavak mg/1

L-alanin 50,0

L-arginin-HCl 70,0

DL-aszparaginsav 60,0

L-cisztein-HCl 0,1

L-cisztein 20,0

	mg/1
DL-izoleucin	40,0
DL-leucin	120,0
L-lizin-HCl	70,0
DL-metionin	30,0
DL-fenil-alanin	50,0

-5HU 201799 Β

9	10	mg/1
Aminosavak	mg/1
L-glutaminsav-H2O	150,0	L-prolin	40,0
L-glutamin	100,0	DL-szerin	50,0
glicin	50,0	DL-treonin	60,0
L-hisztidin-HCl	20,0	DL-triptofán	20,0
L-hidroxi-prolm	10,0	L-tirozin	40,0
		DL-valin	50,0
		Vitaminok
	mg/1		mg/1
aszkorbinsav	0,050	niacin	0,025
d-biotin	0,010	niacin-amid	0,025
kalciferol	0,100	n-amino-benzoesav	0,050
Ca-pantotenát	0,010	piridoxál-HCl	0,025
kolin-klorid	0,500	piridoxin-HCl	0,025
folsav	0,010	roboflavin	0,010
i-inozit	0,050	tiamin-HCl	0,010
menadion	0,010	vitamin A (acetát)	0,14

Szervetlen sók

CaCb (vízmentes)	mg/1 140,0
Fe(NO₃)3	0,1
KC1	400,0
KH2PO4	60,0
MgSO4.7H₂O	200,0

NaCl NaHCO₃ NaH₂PO4.H2	mf/1 8000,0 350,0
Na2HPO₄.2H₂O	60,0

Az előállított szuszpenziót egy alkalmas keverő, 35 rázógép 250 ml-es lombikjába töltjük. A mikrohordozó szuszpenizójáboz 50 ml, a fenti összetételű tápoldatban szuszpendált primer, 9 napos csirkeembrió sejteket adunk és a lombik tartalmát a tápoldattal 100 ml-re egészítjük ki. így a sejtek inoku- 40 lációs koncentrációja 0,5 millió sejt/ml és a mikrohordozó koncentrációja 50 cm²/ml tenyészfelületet biztosít.

A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten és a mikrohordozó szuszpenziójának enyhe keverése mellett 45 végezzük. A keverés intenzitása a tenyésztés első napján 10 fordulat/perc, a másik és harmadik napont 20 fordulat/perc, a továbbiakban pedig 50-60 fordulat/perc. A tenyésztés második napjától kezdődően a tápoldat egy részét naponta kicseréljük, 50 a második és harmadik napont a tápoldat 50%-át, a továbbiakban a tápoldat 70%-át. A tenyésztés kezdetétől eltelt 6-6. napon a mikrohordozó részecskéin primer csirkeembrió sejtek tenyészete kifejlődik. A tenyészet sűrűsége a tenyésztés végére 55 (a 6. napon) eléri az 5,8 ± 0,3 millió sejt/ml sűrűséget, azaz a primer csirkeembrió sejtek száma 11-szeresre növekszik. A mikrohordozón kifejlődött sejtek számának meghatározását a következő módszer szerint végezzük. A tenyésztés befejezése 60 után 10 ml térfogatú mintát veszünk (előzőleg a mikrohordozót gondosan eloszlatjuk a teljes térfogatban). A mintában kiülepítjük a mikrohordozót és leöntjük a rajta levő folyadékot, majd mikrohordozón levő tenyészetet 0,15 mól-os foszfát-puffer 65 oldattal többször kimossuk.

12. példa

A 2. példában leírt mikrohordozót alkalmazzuk zöldmajmok szekunder vesesejtjeinek tenyésztésére. A zöldmajmok szekunder vesesejtjeinek koncentrációja a mikrohordozót tartalmazó szuszpenzióban 2.10⁵ sejt/ml, a mikrohordozó konzisztens maradékánál 5,5 ml-t mérünk be 100 ml tápoldatba, ez a bemérés 15 cm²/ml tenyésztési felületet biztosít. A felhasznált tápoldat összetétele: maximális Eagle-tápoldat 10% borjúszérummal, 0,25% laktalbumin-hidrolizátum, 0,1% galaktóz, 20 mmól HEPES-puffer oldat és antibiotikum, A mikrohordozó és a sejtek tápoldatos szuszpenziójából 350 ml-t mérünk be egy 1 literes tenyésztő lombikba. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten és a mikrohordozó szuszpenziójának enyhe keverése mellett végezzük. A keverés intenzitása a tenyésztés első napján 10 fordulat/perc, a második és harmadik napon 20 fordulat/perc, a továbbiakban pedig 5060 fordulat/perc. A tenyésztés 72. órjában a tápoldat 30%-át, a 120. órában pedig a tápoldat 70%-át cseréljük ki friss tápoldatra. A tenyésztés 6. napján a mikrohordozó majdnem mindegyik részecskéjén sűrű sejttenyészetet figyelhetünk meg. Ebben az időpontban a sejtek koncentrációja eléri a 3,8 millió sejt/ml értéket.

13. példa

A 2. példában leírt mikrohordozó alkalmazásá-6HU 201799 Β val vizsgáljuk a sejtek mikrohordozón történő hosszúidejű tenyésztését.

Zöldmajmok szekunder vesesejtjeit tenyésztjük a 12. példában leírtakkal teljesen azonos módon. A sűrű tenyészet kifejlődése után a mikrohordozót 0,5 l-es forgó lombikba visszük át. Ezt megelőzően a lombikok belső falát szilikonvegyülettel vonjuk be. Minden lombikba 175 ml kifejlődött sejttenyésztet tartalmazó mikrohordozó szuszpenziót teszünk. A tenyésztést 37 ’C hőmérsékleten, 10 fordulat/perc keverési intenzitással végezzük. A tápoldat összetétele hasonló a 12. példában leírt tápoldatéhoz, de a szérum koncentrációja csak 3%. Hetente kétszer cseréljük a tápoldat 50%-át friss tápoldatra. Minden hétem meghatározzuk a sejtek számát a 11. példában leírt módszerrel és a mikrohordozón levő tenyészet kivett mintájának mikroszkópos vizsgálatával. A megfigyelések azt mutatják, hogy a sejtek kilenc héten át (megfigyelési időtartam) transzparensek maradtak, erős kontúrjukat és tipikus alakjukat megtartották és a mikrohordozóról látható módon nem váltak le. A megfigyelés teljes időtartama alatt a sejtek száma 3,6 ± 0,36 millió sejt/ml értéken maradt.

14. példa

Egy átoltási vonal sejtjeit a 12. példában leírtak szerint előállított mikrohordozón, szokásos és csökkentett koncentrációjú szérumot tartalmazó tápoldatban tenyésztjük. A mikrohordozó konzisztens maradékából 5,5 ml-t mérünk be 100 ml tápoldatba, ez a bemérés 15 cm²/ml tenyésztési felületet biztosít. A 4647-es vonal egészséges, felnőtt zöldmajmok veséjéből nyert sejtjeit tenyésztjük, a sejtek inokulációs koncentrációja 15.10⁴ sejt/ml. A 12. példában megadott összetételű tápoldatot alkalmazzuk, de az egyik esetben 10/ borjúszérummal, a másik esetben viszont 1% borjúszérummal. Mindkét esetben adunk még a tápoldathoz nátrium-piruvátot (olyan mennyiségben, hogy a végkoncentrációja 10 mmól legyen) és metil-cellulózt (olyan mennyiségben, hogy a végkoncentrációja 0,3% legyen). Összehasonlításul ugyanezt a sejtkultúrát 0,1 Űteres síkfenekű üveglombik felületén is tenyésztjük, a sejtkultúra inokulációs sűrűsége az üveglombikban ugyanaz, mint mikrohordozón tenyésztett kultúráé, ez jelen esetben 10.10³sejt/ml koncentrációt jelent. A szokásos és csökkentett szérumkoncentrációjú tápoldatban, a szokásos eljárással (üvegfelületen) és mikrohordozón történő sejttenyésztésnél a 10% szérumot tartalmazó tápoldat esetében az üvegfelületen tenyésztett sejtek száma egyébként azonos körülmények között 80,2%, az 1% szérumot tartalmazó tápoldat esetében pedig a mikrohordozón tenyésztett sejtek száma 42,2%.

15. példa

Egy diploid vonal sejtjeit az 1. példában leírtak szerint előállított mikrohordozón tenyésztjük. Az M-21 vonal humán embrió szövetből nyert diploid sejtjeit a 12. példában leírthoz hasonló mikrohordozón tenyésztjük, a sejtek inokulációs koncentrációja jelen esetben 3.10⁵ sejt/ml. A tenyésztés negyedik napján a sejtek száma eléri a 1,8 millió sejt/ml értéket, azaz számuk 96 óra alatt 6-szoros lesz, és emellett a mikrohordozó részecskéinek nagy hányada sejtréteggel borítottá válik.

16. példa

A találmány szerinti mikrohordozón tenyésztett sejtek kinyerése.

Primer csirkeembrió sejteket a 11. példában leírtak szerint tenyésztünk. A tenyésztés befejezése után 10 ml mintát veszünk (előzőleg a mikrohordozót gondosan eloszlatjuk, hogy egyenletes eloszlású szuszpenzióból vegyiüt a mintát), és a 11. példában leírtak szerint meghatározzuk a sejtek számát. A sejtszám meghatározása 5,7 millió sejt/ml mértéket ad. A mikrohordozó fő tömegét ezután kimossuk és 50 ml 0,25%-tripszint és 0,02% etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó 0,15 mól-os foszfát-puffer-oldatban újra szuszpendáljuk. 5 perc múlva a kiülepedett mikrohordozóról az oldatot óvatosan leöntjük és a visszamaradó szuszpendáló oldatban óvatosan leöntjük és a visszamaradó szuszpendáló oldatban levő mikrohordozót 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 0,5% laktalbumin-hidrolizátumot tartalmazó foszfát-puffer oldatot adunk a mikrohordozó szuszpenzióhoz és többször felrázzuk a lombikot. A mikrohordozóról szemmel láthatóan levált sejtek számát meghatározzuk. A sejtek száma így 5,25 millió sejt/ml értékű, azaz a kitermelés kb. 92%-os a sejtmagok számlálása alapján.

A találmány ipari alkalmazhatósága:

A találmány a gyógyászatban, az állatgyógyászatban, vírusvakcinák és különböző biológiailag aktív hatóanyagok, például nagy aktivitású interferon készítmények, hormonok, enzimek és más specifikus termékek előállításánál alkalmazható.

Claims

1. Eljárás sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására, amelyben a mikrohordozó részecskét térhálósító-szerrel kezelt zselatinból alakítjuk ki és a végterméket stabilizáljuk, azzal jellemezve, hogy a zselatin részecskék kialakításához zselatin oldatot térhálósító-szerrel kezelünk, a keletkező zselatin blokkpolimert szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és a 75-350 méretű részecskéket leválasztjuk, vagy száraz zselatint szabálytalan alakú részecskékké aprítunk, a 75350 μΐη méretű részecskéket leválasztjuk és ezeket kezeljük térhálósító-szerrel, majd a mikrohordozó részecskéket kialakulásuk után, stabilizálásukat megelőzően, a felületük lesimítása érdekében proteolitikus enzimmel kezeljük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy térhálósító-szerként dialdehideket, illetve formaldehideket alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti ejárás, azzal jellemezve, hogy dialdehid térhálósító-szer alkalmazásakor a kialakított részecskék stabilizálását ismételt dialdehides és ezt követően redukáló reagenssel történő kezeléssel végezzük.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukáló reagensként alkáli-fémek bórhid7

-7HU 201799 Β ridjeit, illetve hidrogén-peroxidot alkalmazunk.

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy formaldehid térhálósító-szer alkalmazásakor a kialakított részecskék stabilizálását ismételt formaldehides kezeléssel végezzük.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proteolitikus enzimként tripszint, illetve kollagenázt alkalmazunk.