HUP0001059A2 - Gyógyhatású vegyületek - Google Patents

Abstract

A jelen találmány a T-sejt módősításőkban, a T-sejt-antigén prezentálósejt (APC) kölcsönhatásőkban és a patőgén szervezetek, és a gazdaimműnőkőmpetens sejtjei közötti kölcsönhatásőkban alkalmazőtt terápiásvegyületek használatával kapcsőlatős. Részletesebben, a jelentalálmány a Nőtch-prőteinek és ligandűmaik közötti kölcsönhatásőkmódősításában használt ezen vegyületek alkalmazásával és az ilyenvegyületek transzplantátűm kilökődés, aűtőimműnitás, allergia ésasztma, és fertőző betegségek terápiájában való használatávalkapcsőlatős. ŕ

Description

PCb. 1 ű 5 9

S.B.G. λ K.

Nemzetközi

67.915/SZE Szabadalmi Iroda

Budapest, Andrássy út 113.

Jclefoi. 34-24-950, U: 34-24-323

KÖZZÉTÉTELI

Gyógyhatású vegyületek

A jelen találmány terápiás vegyületek T-sejt aktiválás módosításában való használatával kapcsolatos. Részletesen, a találmány a Notch protein család tagjai és ligandumaik közötti kölcsönhatások módosításában való használatukkal kapcsolatos, valamint az ilyen vegyületek betegségi állapotok - például transzplantátum kilökődés, autoimmunitás, allergia, asztma, fertözéses betegségek és tumorok terápiájában való részvételével.

A T sejtek közötti kölcsönhatások, valamint az antigént prezentáló sejtek (APC) és T sejtek közötti kölcsönhatások lényegesek a humán immunrendszer működéséhez. Azonban bizonyos patológiai állapotokban terápiásán hatékony lehet az ilyen jellegű kölcsönhatások pozitív vagy negatív irányba való módosítása. Például, az autoimmun, allergiás és transzplantátum kilökődés! állapotokban kívánatos lehet az immunválasz lefelé irányuló szabályozása a negatív T sejtek vagy T sejt-APC kölcsönhatások stimulálásával. A fertőzés tolerancia és a kapcsolt szuppresszió modelljei azt sugallják, hogy a tolerancia kis számú T sejtek esetében indukálható és ezek a T sejtek ezután átadjak ezt a toleranciát más T sejteknek és így megakadályozzák a hatékony immunológiai támadást. Más patológás állapotokban, például a tumor indukálta immunoszuppresszióban, a parazita vírus és baktérium fertőzésben az immunoszuppresszió általános jellemző. Ilyen körülmények között kívánatos lenne a T sejt kölcsönhatások gátlása a fertőzési tolerancia továbbadásához.

~ Azonban ezideig az ilyen T sejt és T sejt - APC kölcsönhatások alapjául szolgáló mechanizmusokat nem ismerték.

- 2 A WO 92/19734 szabadalom magába foglalja a humán Notch és Delta gének nukleotid szekvenciáinak és az általuk kódolt proteinek aminosav szekvenciáinak leírását. A leírás megmutatja, hogy a Notch gén családot jól jellemezték, mint a rovarok, például a Drosophila megfelelő embriológiai sejtvonalának kifejlődéséhez szükséges géncsaládot.

A Notch családba tartozó proteinek transzmembrán receptorok, melyek számos konzervált peptid motívumot tartalmaznak. A családon belül az egyes proteinek jellegzetes extracelluláris EGF (epidermális növekedési faktor)-szerű ismétléseket és egy juxtamembrán Lin-12//Vofc/7 motívumot mutatnak. Ezenkívül, minden egyes protein 6-8 ankyrin ismétlődő motívummal rendelkezik a citoplazmás farkon egy PEST szekvenciával együtt. A Notch ligandumok rendelkeznek egy diagnosztikai DSL doménnel (D. Delta, S, Serrate, L, Lag2), mely 20-22 aminosavat tartalmaz a protein amino terminusánál és a 3-8 EGF-szerű ismétlések között az extracelluláris felszínen. A proteinek egy rövid citoplazmás farkat tartalmaznak, amiben nincsenek konzervált funkcionális domének.

A legújabb bizonyítékok azt sugallják, hogy a Notch jelzés hozzájárul a csecsemőmirigyben levő éretlen T sejtek vonal elkötelezettségéhez, melyek eltolják a thymocita fejlődést a CD8+ vonal felé, mely az MHC felismeréstől független (Robey, E. et al., Cell 1996, 87:483-492). A csecsemőmirigyben való érés során a T sejtek szert tesznek arra a képességre, hogy megkülönböztessék a saját antigéneket az idegen antigénektől, ezt a folyamatot hívják ön-toleranciának (von Boehmer H. et al., Ann. Rev. Immunol. 1990, 8:531). Mechanizmusok léteznek a periférián is a tolerancia indukálására és fenntartására és számos szempontból ezek fontosságát alábecsülik. Számos transzplantátum kilökődési, autoimmun betegségi és allergénekre adott specifikus válaszolás! kísérleti modell létezik, melyek világosan jelzik egy specifikus érzéketlenségi (tolerancia vagy energiahiány) állapot indukálására való képességüket a recipiensben egy antigénnel való

- 3 immunizálás hatására. Ezekből az eredményekből két lényeges dolog emelkedik ki. Először, egy antigén egy peptid fragmentjével való immunizálás szelektív körülmények között gátolhatja a specifikus válaszokat nem csupán saját magával szemben, de ugyanezen molekulában más régiókkal szemben is, feltéve, ha az intakt proteint használjuk az aktív immunizáláshoz (kapcsolt szuppresszió; Hoyne GF, et al., J. Exp. Med. 1993; 178:183 és Metzler B., Wraith DC. Int. Immunoi. 1993, 5:1159). Másodszor, a transzplantációs kísérleti modellekben legjobban a fertőzés tolerancia jelenségét írták le, ahol követelmény, hogy egy specifikus antigénnel szemben toleránssá tett immunokompetens sejtek képesek legyenek megakadályozni más sejtek válaszait ezenkívül az, hogy ez a második sejt populáció szabályozóvá és toleránssá váljon (Qin SX, et al., Science 1993, 258:974). Az ezen jelenséget alátámasztó immunológiai mechanizmust ezideig nem jellemezték.

A jelen találmány abból a felfedezésből ered, hogy a Notch receptor család és ligandumaik a Delta és a Serrate a perifériás immunrendszer normális, kifejlődött sejtjeinek felszínén expresszálódnak.

Ennélfogva, a jelen találmány szerint biztosítjuk egy Notchligandum használatát az immunoterápiában használt gyógyszer előállításában.

A normális perifériás felnőtt immunrendszerben a receptorok és ligandumaik Notch családjának expressziós mintája korábban nem került leírásra, de a jelen találmány leírói kimutatták, hogy a T sejtek Notch 1 mRNS-t expresszálnak konstitutívan, míg a Delta expresszió csupán egy T sejt részhalmazra korlátozódik a perifériás limfoid szövetekben. A Serrate expresszió úgy tűnik az antigént prezentáló sejtek (APC-k) perifériában levő részhalmazára korlátozódik. Ezért ez a receptor ligandum család továbbra is szabályozhatja a sejtek sorsának meghatározását az immun rendszerben, ahogy azt más szövetekben kimutatták, az embrionális fejlődésen túl (Ellisen LW, et al., Cell 1991, . 4 66:649). A Notch jeladás központi szerepet játszik a perifériás érzéketlenség indukálásában (Tolerancia vagy energiahiány) és fizikai magyarázatot adhat a kapcsolt szuppresszióra és fertőzés toleranciára.

A jelen találmány továbbá kapcsolatos egy A/oíc/bligandum használatával egy T-sejt által közvetített reakció kezelésében. Megfigyeltük, hogy a natív T sejtek egy populációjának az APC által expresszált Λ/ofcMgandumnak allergén vagy antigén jelenlétében való kitevésével, a /Vo/c/7-ligandum képes toleránssá tenni a T sejt populációt az említett allergénnel vagy antigénnel szemben. Ezenkívül, ez a T sejt populáció, amikor ezt követően egy második natív T sejt populáció hatásának tesszük ki, képes a második populációt is toleránssá tenni az említett allergénnel vagy antigénnel szemben.

így a jelen találmány kapcsolatos a A/o/c/7-ligandum a kapcsolt tolerancia és/vagy készenléti (a tudomány e területén fertőzés toleranciaként is ismert) tolerancia befolyásolására való felhasználásával.

A találmány egy további megvalósulása kapcsolatos egy Notchligandum használatával a funkcionális Λ/o/ch-protein vagy Notch-}eladó reakcióutak expressziójának módosításában.

A jelen találmány fent leírt megvalósulásában a /Vofc/?-ligandum kitehető a T sejteknek oly módon, hogy a T sejteket antigént prezentáló sejtekkel (APC) vagy más hasonló sejtekkel inkubáljuk/keverjük össze, mely expresszálja vagy tűlexpresszálja a /VofcMgandumot egy allergén vagy antigén jelenlétében. A Λ/ofc/bligandum gén (túl)expresszálása megvalósítható APC-kkel, melyeket egy a A/ofcMgandum expresszálására képes génnel transzfektáltunk, vagy olyan APC-kkel, melyeket az endogén A/ofc/7-ligandum gén(ek) expresszióját felfelé szabályozni képes anyag hatásának tettünk ki.

A A/ofc/i-ligandumok expresszióját befolyásoló megfelelő anyagok közé tartoznak azok, melyek hatással vannak a Delta és/vagy Serrate génekre. Például, a Delta expresszióhoz, az extracelluláris BMP-k (Csont morfogenetikus proteinek, Wilson, P.A. and Hemmati-Brivanlou A. 1997

- 5 Neuron 18:699-710, Hemmati-Brivanlou A. and Melton, D. 1997 Cell 88:13-17) receptoraikhoz való kötődése lefelé szabályozott Delta transzkripcióhoz vezet az Achaete/Scute Komplex transzkripciós faktor expressziójának gátlása következtében. Az a nézet, hogy ez a komplex közvetlenül részt vesz a Delta expresszió szabályozásában. így bármely anyag, mely gátolja a BMP-k receptoraikhoz való kötődését képes a Delta és/vagy Serrate expresszió növekedését eredményezni. Ezen anyagok közé tartoznak a Noggin, a Chordin, a Follistatin, az Xnr3, az FGF-ek és ezek származékai és variánsai (a noggin referenciához lásd Smith W.C. and Harland, R.M. Cell, 70:829-840, a chordinhoz Sasai, Y. et al., 1994 Cell, 79:779-790). A Noggin és a Chordin a BMP-khez kötődik, így megakadályozza a csökkent Delta transzkripciót eredményező jeladó kaszkádjuk aktiválását.

Néhány betegségi állapotban a test immun kompromisszumos lesz és kívánatos lehet a Delta és/vagy Serrate expressziójának lefele irányuló szabályozása a kialakult immunoszuppresszió legyőzése céljából. A Delta és/vagy Serrate expresszióját gátló anyagok ilyen körülmények között felhasználhatók. A Delta és/vagy Serrate expresszióját gátló anyagokra példák a Toll protein (Medzhitov, R. et al., 1997 Nature 388:394-397) a BMP-k és más anyagok, melyek csökkentő hatást fejtenek ki vagy közbeavatkoznak a Noggin, Chordin, Follistatin, Xnr3, FGF-ek és Fringe termelésével. így a jelen találmány egy olyan anyag használatával is kapcsolatos, mely képes lefelé szabályozni a Delta vagy Serrate proteinek expresszióját a bakteriális fertőzésben vagy tumor által indukált immunszuppresszió visszafordításában használt gyógyszerek előállításában.

A fent megvitatottak szerint a jelen találmány a Notch-prote’in expresszió módosításával vagy a sejt membrán vagy jeladó reakcióutakban való prezentációjával is kapcsolatos. Ezekről kimutatták, hogy részt vesznek a T sejtek által közvetített válaszokban, melyek részt vesznek a tolerancia indukálásában (kapcsolt és/vagy készenléti). Azok

- 6 közé az anyagok közé - melyek fokozzák egy teljesen funkcionális Notchprotein sejt felszínen való prezentációját - tartoznak a mátrix metalloproteinázok, mint például a Drosophila Kuzbanian génjének (Dkuz, Pan, D and Rubin, G.M. 1997 Cell 90:271-280) és más ADAMALYSIN gén család tagjainak terméke. Azok az anyagok, melyek ennek teljesen funkcionális sejt membrán proteinként való prezentációját csökkentik, vagy befolyásolják magukba foglalhatják az MMP inhibitorokat, például a hidroximát-alapú inhibitorokat.

A találmány szerinti használatban az antigén prezentáló sejt vagy hasonló kifejezést nem szándékozzuk az APC-kre korlátozni. A tudomány e területén képzett szakember megérti, hogy bármely a kívánt /Wc/7-ligandum T sejt populációhoz való prezentálására képes hordozó felhasználható, a kényelem kedvéért az APC-k fogalma ezekre mindre vonatkozik. így a megfelelő APC-k közé tartoznak a dendrikus sejtek, az L sejtek, a hibridómák, a limfómák, a makrofágok, a B sejt vagy szintetikus APC-k, mint például a lipid membránok.

Amikor az APC-ket egy olyan génnel transzfektáljuk, mely képes expresszálni a A/ofóh-ligandumot, a transzfekció megvalósítható egy vírussal, például egy retrovírussal vagy adenovírussal, vagy bármely más eszközzel vagy módszerrel, mely képes a sejtekhez gént szállítani. Ezek közé bármelyik hordozó vagy módszer tartozhat, mely hatékonynak bizonyul a génterápiában és ide tartoznak a retrovírusok, a liposzómák, az elektroporáció, más vírusok, például az adenovirus, az adeno-rokon vírus, a herpes vírus, a vaccinia, a kalcium foszfáttal kicsapatott DNS, a DEAE dextrán kapcsolt transzfekció, a mikroinjektálás, a polietilén glikol, a protein-DNS komplexek.

Az ilyen eszközök vagy módszerek magában vagy kombinációban való használatával lehetőség van a hely irányított gén szállításra egy adott sejt populációhoz, így a jelen találmány módszere elvégezhető in vivo is. Például, egy vírus használható liposzómákkal kombinációban a DNS felvétel hatékonyságának fokozására. A szállítás hely specifitása

- 7 elérhető a specifikus proteinek részvételével (például egy CD11c-vel reakcióképes, egyedüli láncú antitest a dendrikus sejtek/makrofágok esetében) a virális burokban vagy liposzómában.

Előnyösen, azok a szerkezetek kerülnek felhasználásra, melyeken keresztül a gén (például serrate) expressziója egy antigén expresszióhoz kötődik. A Serrate-ot (túl)expresszáló APC-k ezért szintén magas szinten expresszálnák a vonatkozó antigént és így kedvezően befolyásolnák a megfelelő specifitású T sejteket.

A jelen találmány egy további megvalósulása egy T sejt allergénhez vagy antigén egységhez működőképesen kapcsolódó Wch-ligandum egységet tartalmazó molekulával kapcsolatos, mely esetben a T sejteknek való kitevés hatására mindkét egység képes a megfelelő helyére kötődni. Egy ilyen molekula képes egy antigén/allergén specifikus T sejt toleránst biztosítani az allergénnek vagy antigénnek, melyre az allergén vagy antigén egység alapszik, mivel a A/ofch-ligandum egységhez szükséges specifitást az allergén vagy antigén egység szoros közelsége biztosítja.

Az antigén vagy allergén egység például lehet egy szintetikus MHCpeptid komplex. Egy az MHC molekula fragmentje, mely az antigén egy elemét hordozó antigén rovátkát hordoz. Ilyen komplexek kerültek leírásra Altman J.D. et al., munkájában (Science 1996 274:94-6).

Egy további előnyben részesített megvalósulásban a vegyület egy fúziós protein, mely a Notch vagy A/ofc/i-ligandum extracelluláris dómén egy szegmentjét és egy immunoglobulin F_c szegmentet, előnyösen az lgGF_c-t vagy lgMF_c-t tartalmazza.

A jelen találmány összes fent leírt megvalósulásában előnyös, ha a A/otch-ligandum a proteinek Serrate családjából vagy a proteinek Delta családjából vagy ezek származékaiból vagy analógjaiból származik.

Azok a betegségek vagy fertőző állapotok közé, melyek úgy kerülhetnek leírásra, hogy ezeket a T sejtek közvetítik, tartoznak az alábbiak közül egy vagy több: asztma, az allergia, a transzplantátum, az autoimmunitás, tumor által indukált T sejt rendszer aberrációk és fertőző

- 8 betegségek, mint például a Plazmodium fajok, a Mikrofiliariae, Helminthek, Mycobacteriumok, HIV, Cytomegalovirus, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza B típus, kanyaró, Hepatitis C vagy Toxicara által okozott betegségek. így a megfelelő allergén vagy antigén használatával egy A/ofc/i-ligandum használható a jelen találmánnyal összhangban az említett betegség vagy fertőzés kezelésére.

A jelen találmány egy olyan módszert is biztosít, mellyel a behatoló kórokozó által indukált immun szuppresszió detektálható. Az ilyen szervezetek a Serrate, Notch és/vagy Delta család tagjainak vagy származékainak vagy proteinjeinek oldható formáit hozhatják létre, melyek hatással vannak expresszióikra in vivo, így fertőzés tolerancia immunoszuppressziót indukálhatnak. A módszer magába foglal egy olyan vizsgálatot, mellyel in vivo megállapítható a nem membránhoz között Serrate, Delta, Notch és ezek származékainak jelenléte és előnyösen tartalmaz egy a Serrate, Delta, Notch és ezek származékaihoz való antitestet.

A fokozott vagy csökkent, Notch, Delta/Serrate expresszió detektálásához és/vagy feldolgozáshoz való szkrínelő vizsgálat használatához való módszerek közé tartoznak:

1. A Delta/Serrate, Notch és Fringe expressziót az izolált sejtek teszt vegyületeknek való kitevése után állapítjuk meg tenyészetben például a következőket használva:

(a) protein szinten specifikus antitest festéssel immunohisztokémiát vagy áramlásos citometriát használva.

(b) RNS szinten mennyiségileg - reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakciót (RT-PCR) használva. Az RT-PCR elvégezhető egy kontroll plazmiddal, beépített standardekkel az endogén gén expresszió

- 9 méréséhez a Notch 1-re és Notch 2-re, Serrate 1-re és Serrate 2-re, Delta 1-re és Delta 2-re, Delta 3-ra és Fringe-re specifikus primerekkel. Ez a szerkezet módosítható, ahogy új ligandum tagokat azonosítunk.

(c) funkcionális szinten sejt adhéziós vizsgálatokban.

A fokozott Delta/Serrate vagy Notch expresszió a Notch-ot expresszáló sejtek és Delta/Serrate ligandumaik közötti fokozott adhézióhoz vezetne. A teszt sejteket egy adott kezelésnek vetjük alá tenyészetben és radioaktív jelölésű vagy fluoreszcensz jelölésű cél sejteket (Notch/Delta/Serrate proteinnel transzfektált) rétegezünk rájuk. A sejt keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán keresztül. A nem adherens sejteket lemossuk és az adherencia mértékét a lemez felszínen levő radioaktivitás/immunofluoreszcencia mérésével határozzuk meg.

Ilyen módszerek alkalmazásával lehetőség van olyan vegyületek vagy Λ/otch-ligandumok detektálására, melyek hatással vannak egy A/o/c/7-protein vagy Λ/otch-ligandum expressziójára vagy feldolgozására. A találmány olyan vegyületekkel vagy /Votc/7-ligandumokkal is kapcsolatos, melyek ilyen vizsgálati módszerekkel detektálhatók.

A jelen találmány magába foglal egy olyan vizsgálati módszert is, mellyel kapcsolatba hozunk (a) egy A/ofch-proteint és egy a Notchproteinhez kötődni képes ligandumot (b) egy vegyülettel; és meghatározzuk, hogy a vegyület hatással van-e a ligandum Notchproteinhez való kötődésére, előnyösen, amikor a A/otch-protein egy T sejttel kapcsolódik.

A jelen találmányban használt A/otcMgandumok előnyösen a Delta vagy Serrate család tagjai közül való, proteinek vagy ezek polipeptidjei vagy származékai. Ezeket előnyösen a tudomány e területén képzett szakember számára ismert rekombináns technológia standard technikáit használva nyerjük. A megfelelő gén szekvenciák, melyek felhasználhatók a jelen találmány ilyen vegyületeinek létrehozásához olyan publikációkból

- 10nyerhetők, mint például a WO97/01571, a WO 96/27610 és a WO 92/19734. A jelen találmányt azonban semmilyen módon nem korlátozzák az ezen publikációkban leírt Notch, Delta és Serrate szekvenciák. Még előnyösebben, az ilyen Notch, Delta és Serrate vagy ezen család tagjai, vagy ezek proteinjei vagy polipeptidjei vagy származékai a Notch, Delta és Serrate vagy ezen család tagjainak extracelluláris doménjei fragmentjei vagy ezen fragmentek származékai. A jelen találmány szerinti használatban a ’Wofóft-ligandum magába foglal még bármilyen ligandumot vagy ligandum család tagját, mely kölcsönhatásba lép a A/ofc/?-protein család tagjaival és magába foglalja a toporithmikus proteinekének nevezett protein csoportot, azaz a Delta, Serrate, Deltex és a hasított gének enhancereit, valamint ezen gén család más tagjait, melyek azon képességük alapján lehet azonosítani, hogy gén szekvenciájuk képes hibridizálódni, vagy homológjai a Notch, Delta vagy Serrate proteinekkel, vagy génjeik azon képessége alapján, hogy fenotipusos kölcsönhatásokat mutatnak.

A Notch, Delta vagy Serrate először a Dosophilában került leírásra és így a sorrendben a Notch receptor és Notch-ligandum család tagjainak fenotipusos proteinjeit foglalják magukba. A többszörös Notch-proteinek és ligandumok leírásra kerültek számos gerinctelen és gerinces fajban, nomenklatúrájuk azonban eltérhet a légy esetében használttól. Például, a Notch a Lin 12 és Glp 1 homológja, a Serrate/Delta a Jagged, Apx1 és Lag-2 homológjai.

A jelen találmány gyógyszerészeti készítményei a tudomány e területén jól ismert elvek alapján hozhatók létre. így a kötőanyagok tulajdonságai és az aktivitás mennyisége a jelen találmány formulázandó vegyületétől függ.

Előnyösen a gyógyszerészeti készítmények egység dózis formában vannak.

- 11 A jelen találmány betegnek adandó vegyületeinek gyógyszerészeti készítmény formájában levő dózisait a megfelelő orvos meg tudja határozni.

A jelen találmány készítményének előnyben részesített alkalmazási módja a szokásos alkalmazási módszerek bármelyike lehet, ideértve az intramusculáris és intraperitoneális, intravénás injekciókat, az intranazális inhalálást, a tüdő inhalálást, a szubkután, intradermális, intraartikuláris, intrathekális, topikális utakat és az emésztőcsatornán keresztül való felvételt (például a Peyers foltokon keresztül).

A találmány szerinti használatban a származék kifejezés a jelen találmány proteinjeivel vagy polipeptidjeivel kapcsolatban magába foglalja egy (vagy több) aminosav maradék helyettesítését, variációját, módosítását, helyettesítését, delécióját vagy addicióját egy szekvenciához vagy egy szekvenciából, feltéve, hogy a kapott protein a polipeptiden képes módosítani a Notch-Notch ligandum kölcsönhatásokat.

A találmány szerinti használatban a variáns kifejezés a jelen találmány proteinjeivel vagy polipeptidjeivel kapcsolatban magába foglalja egy (vagy több) aminosav maradék helyettesítését, variációját, módosítását, helyettesítését, delécióját vagy addicióját egy szekvenciához vagy egy szekvenciából, feltéve, hogy a kapott protein a polipeptiden képes módosítani a Notch-Notch ligandum kölcsönhatásokat.

A találmány szerinti használatban az analóg kifejezés a jelen találmány proteinjeivel vagy polipeptidjeivel kapcsolatban magába foglal bármilyen peptidmimetikus anyagot, mely egy olyan kémiai vegyület, mely a szülői proteinhez vagy polipeptidhez hasonló módon képes módosítani a Notch-Notch ligandum kölcsönhatásokat. Ezek közé tartoznak azok a vegyületek, melyek agonizálhatják, vagy antagonizálhatják egy Notchprotein vagy Λ/ofc/bligandum expresszióját vagy aktivitását.

Egy vegyületről akkor tartják úgy, hogy módosítja a Notch-Notch ligandum kölcsönhatásokat, ha képes a Notch ligandumával való

- 12kölcsönhatásának gátlására vagy fokozására, előnyösen olyan mértékben, hogy terápiás hatékonyságot biztosítson.

A Notch-Notch ligandum kifejezés a találmány szerinti használatban a Notch család tagjainak és egy vagy több ilyen taghoz kötődni képes ligandum közötti kölcsönhatást jelent.

A terápia kifejezés a találmány szerinti használatban a diagnosztikai és profilaktikus alkalmazásokat kell magába foglalja.

Az orvosi kifejezés humán és állatorvosi alkalmazást jelent.

A találmány szerinti használatban a protein és polipeptid kifejezés szinonimként használható, a protein csak általános értelemben használható egy a polipeptidben jelenlevőnél viszonylag hosszabb aminosav szekvencia jelzésére.

A jelen találmányt a következőkben nem korlátozó példákkal írjuk le, a csatolt rajzokra való hivatkozással, melyekben:

Az 1. ábra az 1. példában leírtak szerint végrehajtott in situ hibridizáció eredményeit mutatja be.

A 2. ábra a 4. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 3. ábra az 5. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 4. ábra a 6. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 5. ábra a 7. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 6. ábra a 8. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 7. ábra a 9. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

A 8a és 8b. ábrák a 10. példában leírt kísérlet eredményeit mutatják be.

-13A 9. ábra a 11. példában leírt kísérlet eredményeit mutatja be.

1. PÉLDA

A Notch, Delta és Serrate a perifériás immunrendszerben expresszálódik

A Notch 1-re, Delta 7-re és Serrate 1-re specifikus antisense RNS próbákat szintetizáljuk és digoxigeninnel jelölt UTP-t építünk be. Az egyes próbákat hibridizációs pufferben oldjuk, 70 °C hőmérsékletre melegítjük 510 percig és TESPA borítású tárgylemezre helyezzük, melyen 10 mm lép vagy csecsemőmirigy szeletek vannak, melyeket korábban 4 %-os paraformaldehiddel + PBS-sel rögzítettünk. A tárgylemezeket egy éjszakán át 65 °C hőmérsékleten hibridizáltatjuk. A következő napon a tárgylemezeket kétszer mossuk 65 °C hőmérsékleten és kétszer szobahőmérsékleten (RT) 1 x SSC/50 % Formamid/0,1 % Tween 20 elegyében. A tárgylemezeket kétszer mossuk 0,1 M maleinsav/0,15 NaCI/0,1 % Tween 20 pH 7,5 (MABT) pufferrel RT, majd 2 órán keresztül MABT + 20 % kecske szérum + 296 Boehringer blokkoló reagenssel (BBR) blokkoljuk. A tárgylemezeket egy éjszakán át RT blokkoljuk antidigoxidenin F_ab fragmentekkel. MABT-tal való négy mosás után a tárgylemezeket még kétszer mossuk alkalikus szubsztrát pufferrel. A kötött anti-sense RNS próbák jelenlétét úgy detektáljuk, hogy a tárgylemezeket NBT + BCIP-et tartalmazó szubsztrát pufferben inkubáljuk sötétben. A tárgylemezeket ellenfestjük haemotoxilinnel és a tárgylemezt Depx preparációs tápközegben preparáljuk.

Eredmények: Ezen hibridizációk eredményeit az 1. ábrán mutatjuk be, mely megmutatja, hogy a 3 hónapos egér lépében a Deltát és Serrateot expresszálták az izolált sejtek a periarterioláris hüvelyben és a germinális (csíra) centrumban (gc) nem. A Notch számos sejtben expresszálódik szintén a periarterioláris hüvelyben.

2. PÉLDA

A Delta-Fn fúziós protein termelése

A plG-1 [D. Simmons, Cloning cell surface molecules by transient surface expression in mammalian cells pp. 93-128, Cellular Interactions in Development Ed. D. Hartley, pub. Ox. Uni. Press (1993)] expressziós vektor lehetővé teszi egy olyan fúziós protein termelését, mely a humán lgG1-F_c doménhez kapcsolódó Delta 1 extracelluláris részét tartalmazza. Egy restrikciós enzim fragmentet, mely csak a Delta 1 protein extracelluláris doménjét tartalmazza klónozunk a plG-1 vektorba. A kapott plazmidot E. coli MC 1061-be transzformáljuk és 10 μg/ml tetraciklin/ampicillin tartalmú SOC-ban szaporítjuk. Tisztított vektort használunk a COS sejtek in vitro transzfektálásához. A COS sejteket 50 75 % konfluenciáig szaporítjuk és 10 pg plazmid DNS-sel transzferáljuk petri-csészénként DEAE-dextrán módszerrel. A transzfekció után 24 órával a tenyész tápkőzeget 1 % FCS-t tartalmazó tenyész tápközegre cseréljük és a sejteket további 3 - 6 napig in vitro szaporítjuk. A sejteket 5 percig 5000 rpm fordulatszámon centrifugáljuk a sejtek és törmelékek pelletizálása céljából, a felülúszót eltávolítjuk és a felhasználásig tároljuk. A Delta-F_c fúziót a felülúszókból kitisztítjuk oly módon, hogy hozzáadunk 2 ml 50 %-os protein szuszpenziót egy Sepharose-t (Pharmacia) és egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten rázatjuk. A Sepharose gyöngyöket úgy távolítjuk el, hogy a felülúszót 0,45 mm-es szűrőn engedjük át, mossuk és egy 10 ml-es műanyag oszlopba visszük át. A Delta-F_c fúziós szerkezetet 2 ml elúciós pufferrel (pH 4,0) eluáljuk. Az eluátumot 1 M tris bázis hozzáadásával semlegesítjük.

3. PÉLDA

Modell példák, melyekben a /Votch-ligandum ieladási reakcióút vizsgálható

A saját antigénekkel szembeni perifériás tolerancia a T sejt receptor (TCR) transzgenikus egerekben vizsgálható, melyekben a TCR ligandum

- 15saját antigénként expresszálódik csak a periférián. A transzplantációs antigénekkel szembeni perifériás tolerancia számos módon indukálható, ideértve a recipiens T sejt antitestekkel való előkezelését vagy a kostimuláció blokkolásával. így tehát lehetőség van a kapcsolt szuppresszió és a fertőzés tolerancia bemutatására is. Az allergénekkel szembeni perifériás tolerancia indukálható allergén eredetű peptidek intranazális bejuttatásával is. A Notch-NotchJigandumok expresszióját a légutakba és/vagy limfoid szövetekbe juttatott sejteken mérjük az allergén belégzése után és a tolerancia módosulását bemutatjuk. Ezenkívül, a fertőzés kísérleti modelljeiben fertőző anyagokkal, a Notch-Notchligandumok expressziója mérhető a szervezeteken (patogének) és a gazda immunokompetens sejtjein.

4. PÉLDA

A hibridómákat expresszáló Delta gátolhatja az antigénnel beindított limfociták reakcióját,

Egereket immunizálunk a házipor atka allergén (HDM), a Dér 1, immunodomináns epitópját tartalmazó szintetikus pepiiddel vagy ovalbuminnal (ÓVA, tyúk tojás fehérje protein). Egy héttel később a nyirokcsomó sejteket (LNC-k) eltávolítjuk és sejt szuszpenziót készítünk. A különböző antigénekkel immunizált állatokból származó nyirokcsomókart elkülönítve tároljuk. Ezekre a sejtekre provokált LNCkként utalunk.

T sejt hibridómákat transzferálunk vagy teljes hosszúságú Deltával vagy egy kontroll plazmiddal, oly módon, hogy a delta egy membrán proteinként expresszálódik. A tenyészetben töltött két nap után a hibridómákat besugározzuk, hogy megakadályozzuk a szaporodásukat, vagy a citokinek termelését. Ezért a vizsgálat során mért egyetlen reagálás a nyirokcsomó sejtekből származik.

A besugárzott hibridómákat növekvő számban adjuk hozzá a beindított LNC-ket tartalmazó tenyész tápközeghez. A megfelelő antigént

- 16(azaz a p110-131 vagy OVA) hozzáadjuk és a sejteket 24 órán keresztül szaporítjuk. A felülúszó folyadékot ezután összegyűjtjük és IL-2 (egy fontos T sejt növekedési faktor) tartalomra vizsgáljuk. A nyirokcsomó sejtek proliferációs válaszát is mérjük 72 óra után.

Eredmények: A kontroll plazmidot expresszáló, besugárzott hibridómák jelenlétében szaporított nyirokcsomó sejtek még mindig szaporodtak, ahogy azt a 2. ábrán bemutatjuk és IL-2-öt szekretáltak, amikor tenyészetben a megfelelő antigénnel stimuláltuk. Válaszadási képességüket LNC:hibridóma arányban tartották fenn. Ezzel szemben a nyirokcsomó sejtek proliferációs képessége és IL-2 termelése legalább 88 %-kal csökkent a megfelelő antigénnel rendelkező, teljes hosszúságú Deltát expresszáló (1:1 arányban) hibridómák jelenlétében való szaporítás során. A hibridómákat kontroll vírussal (üres kör) és delta vírussal (üres négyzet) transzfektáltuk. A 2. ábra a szaporítás megkezdése után 72 órával a percenkénti ³H-Tdr beépülési számkén (cpm) mutatja be az adatokat. A delta vagy kontroll szerkezeteket tartalmazó hibridómákkal szaporított nyirokcsomó sejtek (LNC) percenkénti beépülési száma, az üregenként! sejtek száma = 4 x 10⁵ (azaz az LCN-ek száma a hibridóma:LNC aránnyal változik, így változik a cpm is). A p110-131 LNC Dér p1-gyel (p110-131) aktivizált sejtek, az ÓVA LNC OVA-val aktivizált sejteket jelent. A 2BB11 és 2BC3 két különböző Dér p1 reakcióképes hibridóma.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a T sejteket expresszáló Delta válaszainak gátlása megvalósítható transzban. Bár ebben a tenyésztési rendszerben a Derp 1-re specifikus T hibridómákat expresszáló Delta képes volt gátolni az ÓVA prímelt T sejtek válaszait, a specifitás ezen látszólagos hiánya a szaporítási rendszerrel kényszerített szoros sejt közelségnek köszönhető. Valójában, a 8a és 8b ábrákon bemutatott eredmények azt jelzik, hogy állatokban a deltát expresszáló hibridómának osztoznia kell az antigén specifitáson az immunogénnel, ahhoz, hogy módosító hatást fejthessen ki arra az immunogénre adott

- 17immunválaszra. Ebben az esetben úgy tűnik, hogy a deltát expresszáló T sejtek csak a reagáló T sejtekkel hozhatók közelségbe, ha felismerik ugyanazt az antigént ugyanazon az APC-n.

5. PÉLDA

A Serrate-ot expresszáló dendrikus sejtek megakadályozzák a T limfociták antigén prímelését

A dendrikus sejtek (DC-k) a primer antigént prezentáló sejtek az immunrendszerben és létfontosságúak a T sejt válaszok stimulálásában. A DC-ket lépből szerezzük és vagy a teljes hosszúságú Serrate protein expresszióját lehetővé tevő retrovírussal vagy egy kontroll retrovírussal transzfektáljuk. A DC-ket HDM peptid p110-131-gyei pulzáljuk 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. Ezután a DC-ket mossuk és természetes egerek immunizálására használjuk szubkután módon 10⁵ sejt/egér dózist használva. Hét nap után a kimerülő LCN-eket újra stimuláljuk tenyészetben a pepiiddel 4 x 10⁵ sejt/üreg dózissal. Miután az egereket csak a pepiiddel pulzált DC-kel immunizáltuk, ez a vizsgálat ezen sejtek azon képességének mérését teszi lehetővé, hogy kiváltanak-e immunválaszt.

Eredmények: A 3. ábra az LNC-k 72 órával a tenyésztés megkezdése után cpm-ként prezentált adatokat mutatja olyan állatokból, melyeket kontroll transzfektált (üres kör) vagy serrate transzfektált (üres négyzet) dendrikus sejtekkel (DC-k) immunizáltunk.

Az egerek Serrate-ot expresszáló DC-kkel való immunizálása tízszeres csökkenést eredményez a nyirokcsomókból nyert sejtek számában, amikor a kontroll DC-kkel immunizáltakkal hasonlítjuk össze. A továbbiakban azt találtuk, hogy a DC-k + Serrate-tal immunizált egerekből származó LNC-k nem szaporodtak (93 % csökkenés a kontroll értéken, 3. ábra), vagy IL-2-őt szekretáltak ha a kontroll DC-kkel immunizált egerekből származó sejtekhez hasonlítottuk.

6. PÉLDA

A Deltát expresszáló T sejt hibridómák képesek gátolni a Per p 1 antigénnel szembeni immunitás kialakulását állatokban.

A T sejt hibridómákat (Dér p 1-gyel reakcióképes) transzfektálunk egy egér Delta-t tartalmazó retrovírussal oly módon, hogy a Delta a sejt felszínén expresszálódik, vagy egy kontroll retovírussal. A C57 BL egereket 10 millió besugárzott hibridómával injektáljuk i.p. és Komplett Freund-féle Hatásjavítóban (CFA) emulgeált 50 pg Dér p 1-gyel immunizáljuk subcután módon. Hét nap után a kimerülő nyirokcsomó sejteket összegyűjtjük és 4 x 10⁵ sejt/üreg sűrűségben szaporítjuk Dér p 1-gyel (10 pg/ml), a Dér p 1 peptid 110-131-ével (10 pg/ml), vagy a Dér p 1 peptid 91-102-jével (10 úg/ml). A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán keresztül és tritiált timidint adunk hozzá a tenyésztés utolsó 8 órájára. A kontroll transzfektált (puro) vagy Delta transzfektált (Delta-FL) oltású állatokból származó sejtek proliferációs vizsgálatának eredményeit a 4. ábra mutatja.

Eredmények: A kontroll vírussal transzfektált hibridómákkal oltott állatokból származó LNC az IL-2 magas szintjeit termelte és a Dér p 1, a peptid 110-131 vagy a peptid 81-102 jelenlétében szaporodott a tenyészetben. Ezzel szemben a Deltá-t expresszáló hibridómákkal oltott állatokból származó sejtek nem reagáltak egyik Dér p 1 antigénre sem (4. ábra)

7. PÉLDA

A Delta-t expresszáló humán T sejtek gátolhatják a normál T sejtek reakcióját

Egy influenza-reaktív humán T sejt kiónt (HA1,7) transzfektálunk egér Delta-val retrovirális szerkezetet használva, hogy lehetőség legyen a Delta protein sejt felszíni expressziójára. Ezen sejt populáció normális Ha1,7-tel való keverése megakadályozza az ezen normál Ha1,7 sejtek ezt követő HA306-318 peptidekkel és antigént prezentáló sejtekkel szembeni

- 19reagálását. 5 x 10⁵ Ha1,7 sejtet keverünk 1 x 10⁶ besugárzott DRB1*0101 perifériás vér mononukleáris sejtekkel (PBMC) + 1 pg HA306-318-cal és 37 °C hőmérsékleten szaporítjuk. Hat órával később, 5% limphocultot (IL2-őt tartalmazó tápközeg) adunk hozzá összesen 1 ml térfogatban. 24 órával a tenyésztés megkezdése után Delta-t, vagy kontroll retrovírust vagy semmit nem adunk hozzá. A tenyésztés elkezdése után 7 nappal a sejteket összegyűjtjük, mossuk és a transzfektált sejteket besugározzuk. A transzfektált sejteket 2:1 arányban keverjük kezeletlen Ha1,7 sejtekkel és 2 napig szaporítjuk. A kevert tenyészetet összegyűjtjük, mossuk és 2 x 10⁴ élő sejt/üreg mennyiségben szélesztjük együtt

a) 2,5 x 10⁴ DRB1*0101 PMBC-kkel (tápközeg)

b) 2,5 x 10⁴ DRB1*0101 PMBC-k + pepiiddel (Ag + APC)

c) 5 % limphocult (IL-2)

A sejteket 68 órával később összegyűjtjük tritiált thimidin hozzáadásával az utolsó 8 órában. Az eredményeket az 5. ábra mutatja be.

Eredmények: A magába vagy a kontroll vírussal transzfektált HA1,7 való szaporítás után a kezeletlen Ha 1,7 jól reagál a pepiid + antigén prezentáló sejtekre. A Delta-val transzfektált besugárzott HA1,7 inkubálása teljesen magakadályozta a kezeletlen HA1,7 antigén + APC-re való reagálását. Azonban az ilyen sejtek reagálnak akár a kezeletlen vagy kontroll vírussal inkubált HA1,7 sejtek az IL-2-re, azt jelezve, hogy nem csupán egyszerűen szaporodni képesek (5. ábra).

8. PÉLDA

Az antigént prezentáló sejtek Serrate expressziója megakadályozza a T sejt válaszokat

A Ha1,7 kiónt összekeverjük a HA306-318 pepiiddel (1,0 pg/ml) HLA-DRB1*0101-et expresszáló L sejtek (antigént prezentáló sejtekként) jelenlétében 2 x 10⁴ mennyiséget használva az egyes sejttípusokból. Az L sejteket vagy kontroll (puro) vagy serrate-ot (serrate L sejtek) expresszáló retrovírussal transzfektáljuk. A proliferációs választ 72 órával a tritiált • · · · · · · ··· ······ ·· -20thimidin jelenlétében legalább 8 óráig tartó szaporítása után mérjük. Az eredményeket a 6. ábra mutatja a HA1,7 tenyészetek esetében: a) magában - négyzet pontokkal

b) + IL-2 - négyzet ferde csíkokkal

c) + pepiid + DRB1*0101-L sejtek - négyzet hullámvonalakkal

d) + pepiid + kontroll vírussal transzfektált DRB1*0101-L sejtek - csíkos négyzet

e) + pepiid + serrate vírussal transzfektált DRB1*0101-L sejtek - ferde csíkos négyzet

Eredmények: A serrate-ot expresszáló L sejtekkel stimulált HA1,7 gyengén reagált a antigénre, amikor összehasonlítottuk a kontroll transzfektált L sejtekkel való stimulálásra adott reakcióval (6. ábra).

9. PÉLDA

A Serrate-ot expresszáló antigént prezentáló sejtek indukálják a szabályozó T sejteket

A HA1,7 kiónt a HA306-318 pepiiddel és L sejtekkel (DRB1*0101-et expresszálnak antigént prezentáló sejtekként) összekeverjük 2 % IL-2 jelenlétében. Az L sejteket vagy kontroll vagy serrate expresszáló retrovírussal transzfektáljuk. Hét napig tartó szaporítás után a HA1,7 kiónokat összegyűjtjük, mossuk és besugározzuk mielőtt friss HA1,7 klónokkal keverjük (2 x 10⁴ mennyiséget használva az egyes populációkból). A sejteket további két napig inkubáljuk mielőtt a pepiiddel (1,0 μg/ml) + normál antigént prezentáló sejtekkel (DRB1*0101 PBMC-k) stimulálnánk. A proliferációs reakciót 72 órával azután mérjük, hogy a tenyésztés utolsó 8 órájára tritiált timidint adunk hozzá. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be a friss HA1,7 tenyészet esetében: a) magában - négyzet pontokkal b) + IL-2 - négyzet ferde csíkokkal c) + kontroll vírussal indukált HA1,7, majd pepiid + DRB1*0101 PBMC négyzet csíkokkal

d) + serrate vírussal indukált HA1,7, majd peptid + DRB1*0101 PBMC négyzet ferde csíkokkal

Eredmények: A serrate expresszáló L sejtekkel indukált HA1,7 (Serrate indukált HA1,7) megakadályozta a normál HA1,7 normál antigenikus stimulusra adott reakcióját (7. ábra). Ez azt mutatja, hogy a serrate-nak kitett toleralizált sejtek képesek átadni toleranciájukat egy natív sejt populációnak (fertőzés/bystander tolerancia).

10. PÉLDA

A delta expresszáló T sejtek által indukált szabályozás antigén specifikus

Egereket injektálunk vagy deltával vagy kontroll retrovírussal transzdukált 10⁷ T sejt hibridóma sejtekkel. Az a hibridóma, mely a Dér p1 110-131 peptidjével szemben specifitást mutat a 2BC3. Ugyanakkor az állatok Dér p1-et vagy Komplett Freund-féle hatásjavítóban emulgeált ovalbumint is kaptak. Hét nappal később a nyirokcsomó sejteket eltávolítjuk és 4 x 10⁵ sejtet tenyésztünk Dér p1 vagy ovalbumin jelenlétében (ugyanazt az antigént használtuk, mint amivel már korábban immunizáltuk őket).

Az IL-2 termelést 24 órával a tenyésztés megkezdése után mérjük. Az IL-2 termelés stimulációs indexeit a 8a. (a Dér pl-gyei immunizált állatok válaszai) és a 8b. ábra (OVA-val immunizált állatok válaszai) ábra mutatja olyan állatok esetében, melyeket kontroll (puro) vagy Delta (delta) retrovírussal transzfektált hibridómákkal injektáltuk.

Eredmények: A Dér p1-re adott válasz a deltát expresszáló 2BC3 hibridómával injektált állatokban gyakorlatilag teljesen megszűnt, míg az ovalbuminra adott válaszra nem volt hatással. Ezeket az eredményeket a 8a. és 8b. ábrák mutatják, ahol az egyes pontok az egyes egerek által az antigénre adott IL-2 termelést képviselik, a kontroll válaszok (nem adtunk hozzá antigént) stimulációs indexeként (Sl).

11, PÉLDA

A delta expresszálódik a T sejteken a tolerancia indukálása során.

HA1,7 kiónokat tenyésztünk HA306-318 peptid (50 pg/ml) jelenlétében APC-k hiányában. Az ilyen körülmények tolerancia állapotot eredményeznek a HA1,7 kiónokban. 0,30, 120, 240 vagy 360 perc múlva a sejteket (1,5 x 10⁶) összegyűjtjük, pelletizáljuk és megfagyasztjuk. RNSt állítunk elő a sejt pelletekböl, homogenizálással guanidium tiocianát oldatban CsCI denzitás centrifugálás után. Egy pg RNS-t konvertálunk cDNS-sé oligo dT prímért használva. A kapott cDNS közül 1/20 mennyiséget használunk PCR-hoz (40 ciklus) a humán delta homológra specifikus primereket használva. A PCR mintákat gél elektroforézissel analizáljuk (9. ábra), ahol az l.sáv, marker, 2-es sáv, t=1, 3-as sáv, t= 30 perc, 4-es sáv, t = 120 perc, 5-ös sáv, t = 240 perc, 6-os sáv, t = 360 perc, és 7-es sáv a negatív kontroll.

Eredmények: A kapott HA1,7 nem expresszál Delta mRNS-t, azonban a transzkriptek a tolerizációs eljárás megkezdésétől számított 2 órán belül megjelennek.

12. PÉLDA

A Notch 1, Serrate 1 és Delta 1 expresszió analízise az immunohisztolóqiával végzett tolerancia indukció és a hely hibridizáció során

C57 BL/6J egereket kezelünk intranazálisan vagy 100 pg Dér p 1 110-131 pepiiddel vagy egy kontroll oldattal (foszfát puffereit sóoldat, PBS) három egymást követő napon. Az antigén ily módon történő intranazális alkalmazásáról ismert, hogy toleranciát indukál az antigénnel szemben. Ezután néhány állatot 2 hétig érintetlenül hagyunk az antigénnel való emlékeztető oltás előtt (50 pg Dér p1/CFA, szubkután, a farok tövében). Az állatok felszíni nyirokcsomóit és lépjét ezután különböző időpontokban összegyűjtjük (dO az intranazális kezelés vagy az antigénnel való újult provokálás első napja) és feldolgozzuk

-23immunohisztológiával vagy in situ hibridizációval. Az immunohisztológiához a szöveteket megfagyasztjuk és 3 gm-es szekciókat vágunk jéghideg acetonban fixáljuk és a Notch 1-re és Serrate 1-re specifikus poliklonális antitestekkel megfestjük. A kötött antitesteket szubsztrátként diaminobenzidinnel előhívott torma peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl antitestet használva detektáljuk. A Delta 1 specifikus antitestek nem elérhetők a vizsgálathoz. Az in situ hibridizációhoz a fagyasztott szöveteket szekcionáljuk és 4 % paraformaldehidben fixáljuk. A szekciókat a Notch 1-re, Serrate 1-re és Delta 1-re specifikus digoxigeninnel kapcsolódott antisense RNS próbákkal hibridizáltatjuk, 65 °C hőmérsékleten. A kötött próbát alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-digoxigenin antitesttel detektáljuk és szubsztrátként NBT-t és BCIP-et használva hívjuk elő. Az 1. és 2. táblázatokban bemutatott eredmények sorrendben a hisztológiai és in situ hibridizációk eredményei. Az eredmények 5 különböző egérből származó szövet analízisét képviselik a peptid (PBS/p110-131) egyedüli intranazális alkalmazása után, vagy az intranazális és szubkután antigénnel (PBS/p110-131) való újra provokálás után.

+ gyenge festődés, ++ mérsékelt festődés, +++ erős festődés.

Eredmények: A Notch, Delta és Serrate alap szintjei a csupán PBSt kapó kontroll egerekben expresszálódnak. Az intranazálisan PBS-sel és szubkután antigénnel dozírozott egerekben mérsékelten nőtt mindhárom molekula expressziója a újult provokáció 8 napján belül. Azok az állatok, melyek csak intranazális pepiidet vagy intranazális pepiidet kapó, majd ezt követően antigénnel újra provokált állatok ugyanazt a Notch, Delta és Serrate expresszió növekedési mintát mutatják, mely gyorsabb és nagyobb mértékű volt a kontroll egerekben.

-241. táblázat

A Notch és Serrate proteinek expressziója a tolerancia indukálása során

	Kezelés	0. nap	1. nap	4. nap	8. nap	12. nap
Notch 1	PBS primer	+	+	+	+	+
	PBS újra provokálás	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primer	+	+	++	+++	+++
	p110-131 újra provokálás	+	+	+ +	+++	++ +
Serrate 1	PBS primer	+	+	+	+	+
	PBS újra provokálás	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primer	+	+	++	+ + +	+++
	p110-131 újra provokálás	+	+	+ +	+++	+ + +

2. táblázat

A Notch, Delta és Serrate transzkriptek expressziója a tolerancia indukálása során

	Kezelés	0. nap	1. nap	4. nap	8. nap	12. nap
Notch 1	PBS primer	+	+	+	+	+
	PBS újra provokálás	+	+	++	+/++	+ /+ +
	p110-131 primer	+	+	++	+++	+ + +
	p110-131 újra provokálás	+	+	+ +	+ + +	+ + +

2. táblázat folytatása

Serrate 1	PBS primer	+	+	+	+	+
	PBS újra provokálás	+	+	+	4-4-	+/++
	p110-131 primer	+	+	4-4-	4*4-4-	4-4-4-
	p110-131 újra provokálás	+	+	4*4*	4* 4-4-	4-4-4*
Delta 1	PBS primer	+	+	+	+	+
	PBS újra provokálás	+	+	+	+/++	+/++
	p110-131 primer	+	+	4-4*	4-4-4-	4-4-4·
	p110-131 újra provokálás	+	+	4*4	4-4-4*	+++

A jelen találmány más módosításai nyilvánvalóak lesznek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára

Claims (26)

1. -26SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy /Vofcfr-ligandum használata azzal jellemezve, hogy az immunoterápiában használható gyógyszer előállításához használjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti használat azzal jellemezve, hogy az immunoterápia egy T-sejt által közvetített betegség vagy fertőzés kezelését is magába foglalja.
3. 3. A 2. igénypont szerinti használat azzal jellemezve, hogy a T-sejt által közvetített betegség vagy fertőzés az allergia, az autoimmunitás, a szerv kilökődés, a tumor által indukált (ezek közül az egyik vagy több indukálja) T sejt rendszer aberrációit és olyan fertőző betegségeket jelent, mint amiket a Plasmodium fajok, a Microfiliariae, Helmintek, Mycobacteriumok, HIV, Cytomegalovirus, Pseudomonas, Toxoplasma, Echinococcus, Haemophilus influenza B típus, kanyaró, Hepatitis C vagy Toxicara okoznak.
4. 4. Az 1 - 3. igénypontok szerinti használat azzal jellemezve, hogy a Λ/otcMgandumot a Serrate-ból, Delta-ból vagy ezek fragmentjeiböl származékaiból vagy analógjaiból szelektáljuk.
5. 5. Egy A/ofc/7-ligandum vagy ennek fragmentjei, származékai vagy analógjai azzal jellemezve, hogy a kapcsolt szuppresszió befolyásolására használjuk.
6. 6. Egy A/otch-ligandum vagy ennek fragmentjei, származékai vagy analógjai azzal jellemezve, hogy a fertőzés tolerancia befolyásolására használjuk.

   -27.··.: .^ι.' • · · · · · · • ···· · * · · · · ⁴ *
7. 7. A T sejtek allergénnel vagy antigénnel szemben toleránsa tételére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy az említett allergén vagy antigén jelenlétében az említett T sejteket egy /Wch-ligandumot expresszáló vagy túl expresszáló antigént képviselő sejtekkel inkubáljuk/azok hatásának kitesszük.
8. 8. A 7. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Notchligandumot (túl)expressziója az APC-nek köszönhető, melyet az említett ligandumot expresszálni képes vírussal transzfektáltunk.
9. 9. A 7. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Notchligandumot (túl)expressziója az APC-nek köszönhető, melyet egy olyan anyaggal stimuláltunk, mely a A/ofch-ligandumot expresszáló gén expresszióját felfelé szabályozza.
10. 10. A 9. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az anyagot a Noggint, Chordint, Follistatint, Xnr3-at fibroblaszt növekedési faaktort vagy ezek származékait vagy fragmentjeit magába foglaló csoportból szelektáljuk.
11. 11. A 7., 8., 9. vagy a 10. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az APC-t a dendrites sejtekből, az L sejtekből, a hibridómákból, a limfómákból, makrofágokból, B sejtekből vagy szintetikus APC-kböl, például lipid membránokból szelektáljuk.
12. 12. A 7 - 11. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a A/ofch-ligandumot a Serrate-ből, Delta-ból vagy ezek fragmentjeiből, származékaiból vagy analógjaiból szelektáljuk.
13. 13. Egy molekula azzal jellemezve, hogy egy Λ/ο/ch-ligandum egységet tartalmaz, mely működőképesen kapcsolódik egy T sejt allergén

    vagy antigén egységhez oly módon, expresszió esetén a T sejthez megfelelő helyeikkel mindkét egység képes kapcsolódni.
14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a A/otch-ligandum egységet a Serrafe-ből, De/ía-ból vagy ezek fragmentjeiből, származékaiból vagy analógjaiból szelektáljuk.
15. 15. Egy fúziós protein azzal jellemezve, hogy egy Λ/οΟ-ligandum extracelluláris doménjét és egy immunoglobulin F_c szegmentet tartalmaz.
16. 16. A 15. igénypont szerinti fúziós protein azzal jellemezve, hogy a A/ofch-ligandum extracelluláris dómén a Notch-bó\, a Delta-bó\ vagy a Serrate-bó\ származik.
17. 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti fúziós protein azzal jellemezve, hogy az F_c szegment lgGF_c-t vagy lgMF_c-t jelent.
18. 18. Egy kit azzal jellemezve, hogy egy immobilizált Notch-ot, vagy ezen család tagjait tartalmazza, hogy a patogénekből, transzplantátumokból vagy gazdasejtekből származó oldható Notchligandumok mérését lehetővé tegye.
19. 19. Egy vizsgálati módszer azzal jellemezve, hogy (a) egy Notchproteint és egy a Λ/ofch-proteinhez kötődni képes ligandumot érintkezésbe hozunk (b) egy vegyülettel; és meghatározzuk, hogy a vegyület a ligandum A/otch-proteinhez való kötődését befolyásolja-e.
20. 20. Egy Delta vagy Serrate proteinhez vagy származékaikhoz kötődni képes patogén szervezetek, tumorok vagy transzplantátumok által szekretált ligandum azzal jellemezve, hogy orvosi terápiában használjuk.
21. 21. Vizsgálati eljárás azzal jellemezve, hogy a szabad Serrate Notch vagy Delta család tagjainak vagy ezek formáinak in vivo szintjét meghatározzuk.
22. 22. Egy vegyület funkcionális /Vofc/j-protein vagy Λ/ofcMgandum expresszióra vagy feldolgozásra való hatásának megállapítására szolgáló vizsgálati módszer azzal jellemezve, hogy a Notch-proteint vagy Notchligandumot expresszáló sejteket egy vegyülettel hozzuk érintkezésbe; és nyomon követjük, hogy az említett protein vagy ligandum expressziója vagy feldolgozása nő vagy csökken.
23. 23. Vegyületek, /\/ofc/?-ligandumok, vagy ezek származékai, fragmentjei vagy analógjai azzal jellemezve, hogy azokat a 22. igénypont szerinti vizsgálattal detektáljuk.
24. 24. Egy anyag azzal jellemezve, hogy képes a Delta vagy Serrate proteinek expressziójának lefelé történő szabályozására, vagy sejt membrán proteinként való jelenlétének csökkentésére egy olyan gyógyszer előállításában, mely a baktériumok, a fertőzések vagy tumor által indukált immunoszuppresszió megfordítására használható.
25. 25. A 24. igénypont szerinti használat azzal jellemezve, hogy az anyag egy Toll proteint vagy csont morfogenetikus proteint jelent.
26. 26. Egy A/ofc/?-ligandum használata azzal jellemezve, hogy egy funkcionális A/ofc/?-protein expressziójának vagy Notch jeladó reakcióutak módosítására használjuk.

    A meghatalmazott