HUP0200114A2

HUP0200114A2 - Bioaktív komplexek kapszulázása liposzómákba

Info

Publication number: HUP0200114A2
Application number: HU0200114A
Authority: HU
Inventors: Patrick Ahl; Donna Cabral-Lilly; Andrew Janoff; Paul Meers; Tong Shangguan
Original assignee: The Liposome Company, Inc.
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2002-05-29
Also published as: NO20014231L; ATE376413T1; CZ20013103A3; IL145117A0; DE60036861T2; EP1156783A1; PL351487A1; EP1156783B1; DE60036861D1; EA200100856A1; KR20010112301A; AU3715900A; CA2362485A1; WO2000051565A1; ZA200107205B; ES2295018T3; BR0008711A; JP2002538096A; WO2000051565A9; US7491409B1

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy biológiai hatóanyag-komplex liposzómábatörténő kapszulázására, amely az alábbi lépésekből áll: a) legalábbegy amfipatikus lipidet egy vagy több szerves oldószerben feloldanak;b) egy biológiai hatóanyagot tartalmazó elsővizes szuszpenziót az a)lépésben kapott lipidtartalmú szerves oldattal kombinálnak, így egybiológiai hatóanyagot és a lipidet tartalmazó emulziót kapnak; c) a b)lépésben kapott emulzióhoz egy második vizes szuszpenziót adnak, amelyegy komplexképző ágenst tartalmaz; d) a c) lépésben kapott emulziótinkubálják, hogy a komplexképző ágens a biológiai hatóanyaggalérintkezve a lipiddel stabilizált vízcseppek belsejében komplexetképezzen; és e) a d) lépésben kapott szuszpenzióból a szervesoldószert eltávolítják, így kialakulnak a komplexbe vitt biológiaihatóanyagot és a lipidet tartalmazó liposzómák. A találmány szerintieljárással előállított liposzómák jól használhatók különböző biológiaihatóanyagok, elsősorban nukleinsavak, például DNS célzottbejuttatására a megfelelő szövetekbe vagy sejtekbe. Ó

Description

pCc c l 11 H ,.

'' KÖZZÉTÉTELI.? ü 1

Η !(y>2 Budapest. Andrássy út 113. PÉLDÁNY Teld J , 34-24-323

73.280/SM

Bioaktív komplexek kapszulázása liposzómákba

A találmány tárgya egy eljárás komplexek - például polikation-kondenzációs nukleinsavak - liposzómákba történő kapszulázására, amelyben a komplex kialakításához egy amfipatikus lipidekkel stabilizált emulziót alkalmazunk közegként. A találmány további tárgyát képezik az így kialakított liposzómákba kapszulázott komplexek. A találmány szerinti eljárás alkalmas sokféle olyan vegyülettel töltött liposzómák előállítására, amelyeket eddig nehéz volt liposzómákba tölteni úgy, hogy a vegyület és a lipidek aránya magas legyen.

Hogy gyógyszerkészítményként használhatók legyenek, a biológiai hatóanyagoknak terápiásán hatásos mennyiségben el kell jutniuk a kezelés helyére. Sok biológiai hatóanyag és drog stabil az élő szervezetben, mások viszont elbomlanak Ha ez a bomlás még az előtt következik be, hogy a drog vagy a biológiai hatóanyag elérné a megcélzott helyet, akkor a célhelyre a drog nem terápiásán hatásos mennyiségben fog megérkezni. Más drogok vagy biológiai hatóanyagok nem a megcélzott szervekben szívódnak fel, ami szintén veszteséget okoz a célhelyre megérkező drogból vagy biológiai hatóanyagból. Bizonyos poláris drogok egyáltalán nem jutnak be a sejtekbe, mert nem képesek áthatolni a célsejt membránján. Az ilyen poláris drogok bejuttatásának egyetlen módja, hogy a sejt a benne jelenlévő lizoszomális enzimek lebontó hatása révén endocitózissal felvegye őket. A drogok vagy biológiai hatóanyagok terápiás alkalmazásának egy további problémája, hogy nem lehet őket a terápiás hatás eléréséhez elegendő koncentrációban alkalmazni, és ugyanakkor elkerülni a drogoknál vagy biológiai hatóanyagoknál gyakran fellépő toxicitást. Ezeket a problémákat sokféle módon közelítették meg. Ha a drog vagy biológiai hatóanyag nem toxikus, akkor elég nagy dózisban lehet beadni, hogy figyelembe vegyük

- 2 a lebomlást, a nem megcélzott szervekbe való bejutás és azon hely megcélzásának hiányossága által okozott veszteséget, ahol a drogra vagy biológiai hatóanyagra szükség van. Sok drog vagy biológiai hatóanyag viszont vagy túl drága ahhoz, hogy ilyen veszteségeket engedjünk meg, vagy toxikus, ami megengedhetetlenné teszi ilyen nagy dózisok beadását. A drogok vagy biológiai hatóanyagok terápiás mennyiségben történő beadásával kapcsolatos problémák leküzdésére sokféle módszert alkalmaznak.

Az egyik ilyen módszer a drogok vagy biológiai hatóanyagok kapszulázása liposzómákba. Egyes drogok vagy biológiai hatóanyagok terápiásán hatásos menynyiségben liposzómákba kapszulázhatok passzív vagy gradiens betöltéssel, de ezek a módszerek olyan speciális kémiai tulajdonságokat mutató drogokra vagy biológiai hatóanyagokra korlátozódnak, amelyeket csak viszonylag kis koncentrációkban lehet beadni. Bizonyos bioaktív vegyületek, például gyenge savak vagy gyenge bázisok közvetve betölthetők előzetesen előállított liposzómákba erősen koncentrált komplexek kialakítására. Az ilyen típusú, úgynevezett közvetett vagy gradiens betöltéshez az szükséges, hogy a drog vagy biológiai hatóanyag időlegesen át tudjon hatolni a liposzóma lipid kettősrétegén. De erre nem minden bioaktív molekula képes, sok közülük nem tud áthatolni a liposzomális kettősrétegen.

A génterápia az egyik olyan terület, amelyen a drogok vagy biológiai hatóanyagok terápiás mennyiségben való beadására irányuló kísérletek csak részleges sikerrel jártak. A génterápiai módszerek közé tartozik egy exogén (idegen) gén bevitele a megfelelő típusú sejtbe, majd annak megoldása, hogy a sejtben a gén expressziója terápiásán hatásos szinten menjen végbe. Ez a terápia az alapkutatástól viszonylag rövid idő alatt eljutott odáig, hogy sokféle gént vittek be sejtekbe, például a rák kezelésére alkalmazható géneket, amelyek bevitelét például Duque és munkatársai [Histol Histopathol, 13: 231-242 (1998)] valamint Runnebaum és munkatársai

73.280/SM

- 3 [Anticancer Res., 17: 2887-2890 (1997)] ismertetik. Bár egyes esetekben, például a Wolff és munkatársai [Science, 247:1465-1468 (1990)] által leírt eljárásban a csupasz DNS-t vitték be a sejtekbe, ez a DNS nagy mérete és nagy negatív töltése miatt általában nem járható út; ezen kívül a csupasz DNS-t nem lehet úgy megtervezni, hogy bizonyos sejteket meg lehessen vele célozni. Ezért a génterápia sikere általában a DNS és egyéb nukleinsavak sejtekbe történő bevitelére alkalmas „vektorokon” múlik.

Jelenleg a DNS bevitelére szolgáló rendszerek két főcsoportba oszthatók: virális és nem-virális rendszerek. A génbeviteli eszközök közül eddig a legszélesebb körűen a virális vektorokat - például a replikáció-deficiens vírusokat, így például a retrovírusokat, adenovírusokat és adeno-asszociációs vírusokat - ismertetették, például Robbins és munkatársai [Trends in Biotech, 16: 35-40 (1998)]. Alkalmazásukat azonban korlátozta víruskomponenseik immunogenitása, egy replikációs komponens állapotba való visszatérés kockázata, tumorkeltő mutációk esetleges bevitele, a célzó mechanizmusok hiánya, a DNS-kapcitás korlátjai, a nagyüzemi gyártás nehézségei és egyéb tényezők, amelyeket például Lee és Huang [J Bioi Chem, 271: 84818487 (1996)] ismertet.

A virális vektorok alternatívájaként a nem-virális génbeviteli eszközök két főtípusát fejlesztették ki. A gének bevitelére alkalmazott virális vektoroknak mindeddig a legszélesebb körben ismertetett alternatíváját képezik a Feigner és munkatársai [Proc NatlAcad Sci USA, 84: 7413-7417 (1987)] által „lipoplexek”-nek nevezett kationos liposzóma-DNS komplexek, amelyek kationos lipidekből és DNS-ből állnak. Az ilyen lipoplexek génterápiai alkalmazása azonban súlyos hátrányokkal jár, például: csekély stabilitás, nagy citotoxicitás, rossz biológiai lebonthatóság, a kondenzáció és a DNS védelmének gyengesége, szérumérzékenység, nagy méret és a szövetspecifikusság hiánya. Továbbá, minthogy a lipoplexek pozitív töltésűek, rendszerint nem

73.280/SM

- 4 specifikus kölcsönhatásba lépnek a legtöbb sejt negatív töltésű felületével; ezért az ilyen lipoplexeket általában nem lehet meghatározott helyekre in vivo eljuttatni.

Lee és Huang [J Bioi Chem, 271: 8481-8487 (1996)] ismerteti a lipoplexek és a DNS egy másik variációját, amely polilizinnel kondenzált DNS-t tartalmaz anionos liposzómákhoz kötve. Ezekhez bizonyos anionos lipidek szükségesek az aktív szerkezet kialakítására. Az így előállított lipoplexek vagy nem zárják teljesen magukba a DNS-t, vagy pedig a kondenzált DNS körül két vagy több kettősréteget képeznek. Ez utóbbi esetben a citoplazmába történő bejutáshoz a DNS-nek legalább három membránon kell áthaladnia. Ez várhatóan rontani fogja a transzfekció hatékonyságát. Az előbbi esetben a stabilitást veszélyeztetheti az, hogy a DNS a fiziológiai sóoldatban különböző tényezők hatásának van kitéve.

A nem-virális vektoroknak egy további változatát képezik a liposzómák, amelyek ebben a felhasználásban bizonyos előnyöket mutatnak a lipoplexekhez viszonyítva. Például a nukleinsavak körül liposzomális kettősrétegek alakulnak ki, ezáltal megvédve a nukleinsavakat a lebomlástól és a környezetben előforduló nukleázoktól; ezzel szemben a lipoplexek nem burkolják be a nukleinsavakat, így nem tudják azokat teljesen elzárni a környezetben jelenlévő nukleázoktól. Továbbá a liposzómák a nukleinsavakon kívül más biológiai hatóanyagokat is tartalmazhatnak a vizes részükbe zárva, míg a lipoplexek erre nem képesek, mert vizes részt nem tartalmaznak. Ezen kívül a liposzómák előállíthatok semleges vagy anionosan töltött változatban, szemben a fent említett lipoplexekkel, amelyek csak ionos természetűek lehetnek. Tehát a liposzómák úgy tervezhetők, hogy elkerüljük a citotoxicitást, amit maga a hordozóanyag indukál, és elősegítsük a felhalmozódásukat a szóban forgó helyen.

Bár a biológiai hatóanyagok liposzómákba történő kapszulázásának elve nem új, sok hatóanyagot nehéz tetszőleges mennyiségben, másokat pedig terápiásán

73.280/SM

- 5 hatásos mennyiségben liposzómákba kapszulázni. Sok olyan kis molekula van, amelyek liposzómákba kapszulázhatok, de kiszivárognak. Hasonlóképpen mindeddig nehéznek bizonyult egyes biológiai hatóanyagokat liposzómákba kapszulázni, és terápiásán hatásos ideig terápiásán hatásos mennyiségben a kapszulában tartani. Például különösen nagy molekulákat nehéz egy liposzómában jelenlévő komplexbe bevinni. Ugyancsak nehéznek bizonyult sok vízoldható vegyület alkalmazása terápiás hatóanyagként, mert ezek nem tudnak áthatolni a sejtmembránon. Ha liposzómákba vannak kapszulázva, amelyek be tudnak olvadni a sejtmembránba, akkor ezeket a hatóanyagokat terápiásán hatásos mennyiségben be tudjuk vinni a célsejtekbe. A találmány szerinti eljárással olyan liposzómákat állíthatunk elő, amelyek az ilyen drogokat vagy biológiai hatóanyagokat terápiásán alkalmazható formában tartalmazzák.

Különböző kísérleteket végeztek nukleinsavaknak liposzómákba történő kapszulázására, például Fraley és munkatársai [J Bioi Chem, 255: 10431-10435 (1980)] fordított fázisú elgőzölögtetéssel, Alizó és munkatársai [J Microencap, 7: 497-503 (1990)] a dehidratálás-rehidratálás módszerével, Monnard és munkatársai [Biochem Biophys Acta, 1329: 39-50 (1997)] pedig fagyasztással-kiolvasztással állítottak elő liposzómákat. De mindezen módszereknek vannak bizonyos korlátái, például a nukleinsavak alacsony kiindulási koncentrációi - ami által nagy mennyiségű üres liposzóma képződik a kapott termékben -, továbbá nem lehet olyan mennyiségű DNS-t reprodukálható módon liposzómákba kapszulázni, hogy az a megcélzott helyen terápiásán hatásos legyen, valamint nehéz megtalálni azt a hordozót, amely a kapszulázott nukleinsavaknak optimális védelmet nyújt a nukleáz-mediált lebomlással szemben.

Végeztek olyan kísérleteket, hogy DNS-t komplexképző ágensekkel komplexbe vittek, majd a komplexált DNS-t liposzómákba kapszulázták. Komplexképző ágensek

73.280/SM

- 6 az olyan vegyületek, amelyek más vegyületekkel csapadékot vagy kondenzációs terméket képeznek. A találmány megvalósításában alkalmazható komplexképző ágenseket az olyan töltéssel rendelkező molekulák közül választjuk, amelyek a biológiai hatóanyaggal ellentétes töltésűek. Komplexképző ágensként alkalmazhatók olyan, töltéssel rendelkező molekulák, mint például a spermin, spermidin, kobalthexamin, kalciumionok, magnéziumionok, polilizinek, polihisztidinek protaminok, polianionok, például heparin- és dextrán-szulfát, citrátionok vagy szulfátionok. így például Chattoraj és munkatársai [J Mól Bioi, 121: 327337 (1978)]; Gosule LC és Schellman JA. [Nature 259: 333-335 (1976)]; Vitello és munkatársai [Gene Therapy, 3: 396-404 (1996)]; Widom és munkatársai [J. Mól. Bioi., 144: 431-453 (1980)];

Arscott és munkatársai [Biopolymers, 30: 619-630 (1990)]; valamint Wilson és munkatársai [Biochem, 18: 2192-2196 (1979)] leírják, hogy +3 vagy nagyobb töltésű polikationok, például poliaminok, polilizin és kobalt(lll)-hexamin a DNS többszörös negatív töltéseivel való kölcsönhatás révén alkalmasak DNS molekulák kondenzálására. Többek között Ames és Dubin [J Bioi Chem, 253: 769-775 (I960)]; valamint Tabor és Tabor [Annu Rev Biochem, 53: 749-790 (1984)] szerint poliaminok, például spermidin (3+) és spermin(4+) más típusú polikationokkal ellentétben a természetben minden élő sejtben előfordulnak. Ames and Dubin [J Bioi Chem, 253: 769-775 (I960)]; Tabor és Tabor [Annu Rev Biochem, 53: 749-790 (1984)]; Hafner és munkatársai [J Bioi Chem, 254:12419-12426 (1979)]; valamint Pegg [Biochem J, 234: 249262 (1986)] leírják, hogy az aktívan proliferáló állati sejtekben magasak a poliamin-szintek, és ezt alapvetőnek tartják a normális sejtszaporodás fenntartásához.

Tikchonenko és munkatársai [Gene, 63: 321-330 (1988)] megkísérelték sperminnel kondenzált lineáris DNS kapszulázását liposzómába, de a kiindulási DNS-koncentráció alacsony volt, aminek eredményeként a kapott liposzómában a

73.280/SM

- 7 kapszulázott DNS aránya a liposzomális lipidhez viszonyítva kicsi lett (0,02 -0,2 pg / DNS pmol). Továbbá ahhoz, hogy a lineáris DNS-molekulák kondenzálása intermolekuláris DNS-aggregáció nélkül menjen végbe, a sperminkoncentrációt a célszerűnél nagyobb pontossággal kellett szabályozni. Baeza és munkatársai [Orí Life Evol Biosphere, 21: 225-252 (1992)] valamint Ibanez és munkatársai [Biochem Cell Bioi, 74: 633-643 (1996)] arról számolnak be, hogy 1-4 pg/pmol sperminkondenzált SV40 plazmid DNS-t kapszuláztak liposzómákba. De a liposzóma előállítása után egyik készítményt sem dializálták nagy sótartalmú pufferrel szemben, így a kapszulázottként megadott DNS valójában nagy százalékarányban tartalmazhat kapszulázatlan DNS-t. Minthogy ezeket a liposzóma-készítményeket nem tették ki DNS-bontó enzimek hatásának a liposzómákba ténylegesen bezárt DNS százalékának meghatározására, a megadott nagy mennyiségek valószínűleg nem a ténylegesen kapszulázott DNS-re vonatkoznak.

Liposzómákba zárt nukleinsavak hatékony előállításához és felhasználásához a nukleinsavakat nagy koncentrációjú szuszpenziókban kell alkalmazni, hogy az eljárással kapott üres liposzómák arányát minimálisra csökkentsük, és a DNS-nek a liposzomális lipidhez viszonyított arányát maximalizáljuk. De ha a DNS kondenzálását nagy koncentrációban, a liposzómaképzés ismert módszereivel végezzük, az általában intermolekuláris aggregációt eredményez, amely génbevitelre alkalmatlan nukleinsav-alapú szerkezetek képződéséhez vezet. Ha a DNS kondenzálását közvetlenül egy komplexképzö ágenssel végezzük, az így kapott nagy méretű aggregátumokat nem könnyű liposzómákba kapszulázni, és ezek a nagy (a sejtekkel azonos nagyságrendű) aggregátumok nem képesek hatékonyan bejuttatni az anyagokat a célsejtekbe. Ha például az aggregátumok átmérője 500 nm-nél nagyobb, akkor méretük miatt az intravénás beadás után gyorsan kiürülnek a vérkeringésből. Másrészt

73.280/SM .t. — * -*

- 8 a nagyobb aggregátumok in vitro is bevihetők a sejtekbe. Néha azonban az aggregátumok olyan nagyok, hogy a sejtek nem képesek felvenni őket.

Tehát ahhoz, hogy sokféle drogot juttassunk a célsejtekbe terápiásán hatásos mennyiségben, szükséges volt egy eljárás olyan liposzómák előállítására, amelyek a biológiai hatóanyagot komplex alakjában tartalmazzák, hogy az kevésbé hatoljon át a lipid kettősrétegen, ugyanakkor az eljárás korlátozza a liposzóma-kapszulába zárandó komplex méretét, hogy a kapott terápiás termék a terápiás mérettartományba essen.

Tehát a találmány tárgya eljárás egy biológiai hatóanyag-komplexnek liposzóma-kapszulába történő bevitelére, amely az alábbi lépésekből áll:

a) legalább egy amfipatikus lipidet egy vagy több szerves oldószerben feloldunk;

b) legalább egy vizes szuszpenziót - amely egy biológiai hatóanyag és egy komplexképző ágens közül választott első vegyület vizes oldatát tartalmazza - az a) lépésben kapott lipidtartalmú szerves oldattal kombinálva egy reverz micella formájú emulziót készítünk, amely az első vegyületet és a lipidet tartalmazza;

c) a b) lépésben kapott emulzióhoz egy második vizes szuszpenziót adunk, amely egy második - egy biológiai hatóanyag és egy komplexképző ágens közül választott - vegyületet tartalmaz úgy, hogy ha az első vegyület egy biológiai hatóanyag, akkor a második vegyület egy komplexképző ágens és viszont;

d) a c) lépésben kapott emulziót inkubáljuk, hogy a komplexképző ágens a biológiai hatóanyaggal érintkezve komplexet képezzen a lipiddel stabilizált vízcseppek belsejében, amely komplex átmérője nem nagyobb a vízcseppekénél; és

73.280/SM

e) a d) lépésben kapott szuszpenzióból a szerves oldószert eltávolítjuk, így kialakul a komplexbe vitt biológiai hatóanyagot és a lipidet tartalmazó liposzóma.

A találmány szerinti eljárás felhasználható terápiás célú liposzómák készítésére, amelyek a liposzómában a biológiai hatóanyagok széles körét tartalmazhatják valamilyen komplexképző ágenssel komplexálva. A liposzómák előnyösen fuzogén liposzómák, amelyek a találmány szerinti eljárással sokféle molekulát zárhatnak magukba. A fuzogén liposzómák képesek összeolvadni a sejtmembránnal, és biológiai hatóanyagokat terápiásán hatásos mennyiségben bevinni sejtekbe és szervekbe. A találmány szerinti eljárással egy liposzómába több biológiai hatóanyag is bevihető. A találmány szerinti eljárással tehát egyazon liposzómába egyidejűleg egy vagy több biológiai hatóanyag kapszulázható. Ha a találmány szerinti eljárással egy liposzómába többféle biológiai hatóanyagot kapszulázunk, akkor nem szükséges, hogy mindegyik biológiai hatóanyag komplex alakban legyen jelen.

Egyes biológiai hatóanyagok könnyen áthatolnak a lipid kettősrétegen, tehát nincsenek stabilan bezárva a liposzómákba. Ha a biológiai hatóanyag a komplexképző ágenssel komplexet képez, akkor benn marad a liposzómákban. Mindeddig jelentős akadályt képezett a komplexált biológiai hatóanyag kapszulázása a liposzómákba. Ha a biológiai hatóanyagot és a komplexképző ágenst oldatban keverjük össze a liposzómákba történő kapszulázás előtt, akkor a liposzómák hatásos töltéséhez szükséges koncentrációknál sok szabálytalanul nagy komplex képződik. A bioaktív komplexben a biológiai hatóanyag úgy kötődik a komplexképző ágenshez, hogy a komplexképzés változásokat okoz a fizikai tulajdonságokban, például csökkenti a bioaktív molekula méretét, csökkenti az oldhatóságát, kicsapja vagy kondenzálja a biológiai hatóanyagot, vagy megnöveli a komplex méretét. A sejtmembránba beolvadó liposzómák nagyon sokféle molekulát képesek bevinni a sejtekbe. A talál

73.280/SM :::-.»·

- 10 mány egyik előnye, hogy mivel a biológiai hatóanyag a reverz micellákban komplexet képez, nem kell olyan feleslegesen nagy méretű komplexeket képezni, amelyeket nem lehet terápiásán alkalmazható liposzómákba kapszulázni.

A biológiai hatóanyagot tartalmazó komplexek képzése a liposzómákban azzal az előnnyel jár, hogy az ilyen komplexek kevésbé hajlamosak kiszivárogni a liposzómából mielőtt még a kívánt célt elérnék. Továbbá a komplexképzés olyan nagy mennyiségű biológiai hatóanyagot képes koncentrálni a liposzómákban, hogy a biológiai hatóanyagnak a lipidhez viszonyított aránya magas, a szállítás pedig hatékony lesz. A találmány szerinti eljárással a biológiai hatóanyagokat komplexképző ágensekkel úgy lehet komplexbe vinni, majd liposzómába kapszulázni, hogy eközben a biológiai hatóanyag a komplexképző ágenssel nem képez rendkívül nagy, káros, néhány mikronnál nagyobb aggregátumokat.

A találmány egyik előnyös megvalósítása egy eljárás nukleinsav-komplexek kapszulázására. A nukleinsavakat, például DNS-t a reverz (fordított) micellákban egy kondenzálószerrel komplexbe visszük, majd a micellákból liposzómák képződnek. Bár, mint mondottuk, már korábban is végeztek kísérleteket DNS-nek liposzómákba való kapszulázására, egyetlen ilyen módszer sem bizonyult sikeresnek terápiásán hasznosítható liposzomális DNS hatékony előállításában.

A találmány tárgya eljárás olyan liposzóma előállítására, amely 1 mól liposzomális lipidre vonatkoztatva körülbelül 0,5 pg kondenzált nukleinsavaz tartalmaz.

A liposzómák lipidkomponense előnyösen egy foszfolipid-származékból és egy járulékos lipidből áll, általában olyan arányban, hogy körülbelül 20-80 mól% foszfolipid-származékra körülbelül 20-80 mól% járulékos lipid esik. Előnyösen alkalmazható foszfolipid-származékok például a foszfatidil-etanol-aminok (PE) biotinnal alkotott konjugátumai, az N-acilezett foszfatidil-etanol-aminok (NAPE-k), például NC12 DOPE, valamint a peptid-foszfatidil-etanol-amin konjugátumok, például Ala-Ala73.280/SM · · ····

- 11 ProVal-DOPE. A járulékos lipid a liposzómákban szokásosan alkalmazott sokféle lipid bármelyike lehet, de ha foszfolipid-származékként NAPE-t alkalmazunk, akkor a járulékos lipid előnyösen egy foszfatidil-kolin (például DOPC). A nukleinsav előnyösen DNS.

A találmány további tárgya eljárás olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely a liposzóma mellett egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz; ez a készítmény alkalmazható nukleinsav bevitelére állati sejtekbe.

A találmány további céljait, jellemzőit és előnyeit az alábbi példákban mutatjuk be, amelyek a találmány részletesebb ismertetésére szolgálnak, annak oltalmi körét nem korlátozzák.

A rajzok rövid ismertetése

1. Ábra: Spermin-mediált DNS-aggregáció mikroszkópos felvételei (200 pg plazmid DNS-t 125 pl LSB-ben (kis sótartalmú puffer) óvatosan összekeverünk 125 μΙ 7 LSB-ben jelenlévő 7 mM sperminnel). (A) fénymikroszkópos felvétel szobahőmérsékleten 15 percig végzett inkubálás után (a pálca hossza 10 mikron); (B) Cryo TEM felvétel (a pálca hossza 100 nm).

2. Ábra: A DNS-kapszulázási módszer vázlata. A szerves oldószeres közegben végbemegy a DNS kondenzálása a körülette kialakult, foszfolipiddel stabilizált vízcseppekben (I). A spermintartalmú cseppeket elválasztjuk (II), a spermint időleges érintkezéssel és cserével bevisszük a DNS-tartalmú cseppekbe (III). Az emulzióval végzett kondenzálás (IV) után az oldószer elpárologtatósa révén apró üregek képződnek, ezek méretét extrudálással tovább csökkentjük (V).

3. Ábra: Liposzomális N-C12 DOPE hatása plazmid DNS aggregációjára. Egy háromkamrás dializáló berendezésben egyensúlyi dialízist végzünk a 4. példában leírt módon. A bal oldali görbét liposzóma nélküli dialízisekből, a jobb oldali görbét

73.280/SM ”*· ·.? J. — ’ -*

- 12 pedig olyan dialízisekből kaptuk, amelyekben az egyik kamra liposzómákat tartalmazott. X tengely: sperminkoncentráció (mM); Y tengely: zavarosság (optikai sűrűség 400 nm-nél).

4. Ábra: 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC készítményekkel védett plazmid DNS agarózgéles elemzése - mindegyik készítményből extrudálás és dialízis után aliquot mennyiségeket megosztottunk, és az egyik részt a 9. példában leírt módon Dnase l-gyel emésztettük. 1. sáv: spermin nélküli készítmény; 2. sáv: ugyanaz, mint az 1. sáv, csak Dnase l-gyel emésztve; 3. sáv: spermintartalmú készítmény; 4. sáv: ugyanaz, mint a 3. sáv, csak Dnase l-gyel emésztve.

5. Ábra: Fénymikroszkópos felvétel a szemcsékről 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC mintában, amelyet a 3. példa szerinti módon pZeoLacZ plazmiddal és sperminnel készítettünk (A) 267 ± 7 nm átmérőjű polisztirol gyöngyökkel (B) összehasonlítva (a pálcák hossza 10 nm).

6. Plazmiddal és sperminnel a 3. példa szerinti módon készített 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC minta fagyasztva tört felületének TEM mikroszkópos felvétele (lásd a 7. példát). A nyíllal jelzett részecske láthatólag kapszulázott anyagot tartalmaz (a pálca hossza 400 nm).

7. Ábra: Cryo TEM felvétel (lásd a 8. példát) a 3. példa szerinti módon N-C12 DOPE/DOPC-vel és pZeoLacZ plazmiddal spermin nélkül (a) illetve sperminnel (b) készített liposzómákról. Az (a) ábrán szálszerű szerkezet láthatók a liposzómákon kívül (csillag) és a liposzómák belsejében (nyíl). A (b) ábrán a nyíl egy toroidra mutat, amely polikation-kondenzált plazmid DNS-re emlékeztet (a pálcák hossza mindkét ábrán 100 nm). A (c) fénymikroszkópos felvétel egy sperminnel készített EPC mintát mutat. A nyíllal jelzett toroid és a csillaggal jelzett hajlított rúd alakú szerkezetek multilamellás liposzómákkal (fontjel) vannak összehasonlítva (a pálcák hossza 50 nm).

73.280/SM .».* *·»* J· —- ·*

8. Ábra: Konfluens (összeolvadó) OVCAR3 sejtek floresszencia-mikroszkópos felvétele 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC készítménnyel végzett transzfektálás után (lásd a 11. példát). A liposzomális mintákat a 3. példa szerinti módon pEGFPC1 plazmid DNS-sel, (a) sperminnel vagy (b) spermin nélkül készítettük, és ezeken kívül vizsgáltunk egy 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC üres liposzómákból + a kész liposzómákhoz kívülről hozzáadott szabad pEGFP-C1 plazmid DNS-böl álló, spermin nélküli (c) mintát. Ez utóbbiban az üres liposzómákhoz adott plazmid DNS összes mennyisége ugyanannyi volt, mint a többi készítményekben. A kísérletekben azonos liposzóma-koncentrációkat alkalmaztunk.

9. Ábra: EGFP expressziójának mennyiségi meghatározása EGFP fluoresszcencia mérésével pEGFP-C1-gyel transzfektált OVCAR 3 sejtekben. A transzfekciós kísérleteket (a, b, és c, lásd: 11. példa) az előző ábránál leírt módon végeztük. Ezen kívül vizsgáltunk egy d) tojás PC liposzómákból álló, sperminnel és pEGFP-C1 plazmiddal készített (lásd 3. példa) és egy e) készítményt, amely utóbbihoz semmit nem adtunk hozzá. A sejteket kimostuk, CBAM-mel jelöltük, majd az EGFP és calcein blue (kalceinkék) fluoresszcencia méréséhez detergensben oldottuk [lásd 10. példa, a pálcák a ± szórást (standard deviációt) mutatják],

10, Ábra: Sperminnel és pEGFP-C1 plasmid DNS-el a 3. példa szerinti módon készített N-C12 DOPE/DOPC lipid üledék transzfekciós aktivitása; a kiindulási plazmid DNS- és spermin-oldatok 200 mM szacharózt tartalmaztak. Extrudálás és dializálás után a minta egyik felét további kezelés nélkül transzfektáláshoz használtuk (a), a minta másik felében pedig transzfektálás előtt a lipidrészecskéket centrifugálással ülepítettük, és HBBS-sel egyszer átmostuk (b). Készítettünk egy olyan 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC mintát is, amely csak 200 mM szacharózt tartalmazott, és a plazmid DNS-t és a spermint csak a dialízis előtt, külsőleg adtuk hozzá a többi mintánál alkalmazott mennyiségben. Ebből a mintából a fenti módszerrel üle-

73.280/SM

- 14 déket készítettünk (c), majd a transzfektáláshoz a többi mintával azonos mennyiségű lipidet alkalmaztunk az előző ábráknál leírt körülmények között. A mintákat egy éjszakán át inkubáltuk, majd a sejteket CBAM-mel jelöltük, és mértük az EGFP és calceinkék fluoreszcenciát (a pálcák a ± szórást mutatják).

11. Ábra: 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómák transzfektálása egér ascites (hasvízkór) folyadékban és összehasonlító pufferoldatban. Az ascites folyadékot tumoros SCID egerek mosófolyadékából kaptuk a 13. példa szerinti módon. A sejteket plazmid DNS-t tartalmazó (nem ülepített) liposzómákkal inkubáltuk 10 mM végkoncentrációjú lipiddel HBSS-ben vagy HBSS és ascites folyadék elegyében, 3,5 mg/ml végső proteinkoncentráció mellett (lásd: 11. példa). Három órás inkubálás után a transzfekciós oldatot szérum- és butirát-tartalmú oldatra cseréltük, és ezzel az inkubálást még 20 órán át folytattuk. Az EGFP-expressziót a fluoreszcencia alapján mértük (a pálcák a ± szórást mutatják).

10. Ábra: A 11. példa szerinti módon 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákkal transzfektált OVCAR-3 sejtek fluoresszencia-mikroszkópos felvételei pufferben illetve ascites folyadékban. A 12. példa szerinti módon kezelt sejteket lefényképeztük. A 12a felvétel a peritoneális ascites folyadék nélkül, a 12b felvétel pedig a peritoneális ascites folyadék jelenlétében végzett transzfekciót mutatja; a felvételeken a sejtek összeolvadnak.

13. Ábra: A liposzóma lamellaritásának fluoreszcenciás meghatározása.

14. Ábra: pEGFP-C1-et tartalmazó 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákkal in vivo transzfektált OVCAR-3 tumorsejtek fluoresszencia-mikroszkópos felvételei. Az A ábra az EGFP-expressziót, a B ábra pedig a rodaminnal jelzett liposzómák vörös fluoreszcenciáját mutatja.

15. Ábra: A 14. ábrán láthatótól eltérő helyről vett és pEGFP-C1-et tartalmazó .70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákkal in vivo transzfektált OVCAR-3

73.280/SM

- 15 tumorsejtek floresszencia-mikroszkópos felvételei. Az A ábra az EGFP-expressziót, a B ábra pedig a rodaminnal jelzett liposzómák vörös fluoreszcenciáját mutatja.

16. Ábra: Kontroll tumorszövetek floresszencia-mikroszkópos felvételei. Az A ábrán diffúz zöld fluoreszcencia látható, a B ábra pedig a rodaminnal jelzett liposzómák vörös fluoreszcenciájának hiányát mutatja.

17. Ábra: A β-galaktozidáz-expresszió aktivitása izomszövetben in vivo transzfekció után.

A találmány részletes ismertetése

A leírásban a következő rövidítéseket alkalmazzuk: PE = foszfatidil-etanolamin; PC = foszfatidil-kolin; EPC = tojás foszfatidil-kolin; DO- = dioleoil-; DOPC = dioleoil- foszfatidil-kolin; DOPE = oleoil-foszfatidil-etanol-amin; NAPE = N-acilezett foszfatidil-etanol-amin; -C12 DOPE= N-dodekanoil-dioleoil-foszfatidil-etanol-amin; AAPV-DOPE = Alala-Pro-Val-dioleoil-foszfatidil-etanol-amin; CBAM = kalceinkékacetoxy-metil-észter; PBS = foszfát-puffersó; LSB = kis sótartalmú puffer; HBSS = Hank-féle kiegyenlített sóoldat; EGFP = enhanced (erősített) zöld fluoreszcenciaprotein; SPLV = stabil unilamelláris (egyrétegű) liposzómák; MLV-k = multilamelláris liposzómák; ULV-k = unilamelláris liposzómák; LUV-k = nagy unilamelláris liposzómák; SUV-k = apró unilamelláris liposzómák; ds DNS = kettős szálú DNS; TEM = transzmissziós (áteső fényes) elektronmikroszkópia.

A találmány tárgya eljárás egy bioatív komplexnek liposzómába történő kapszulázására, amely a következő lépésekből áll:

b) legalább egy vizes szuszpenziót - amely egy biológiai hatóanyag és egy komplexképző ágens közül választott első vegyület vizes oldatát tartal

73.280/SM

- 16 mázzá - az a) lépésben kapott lipidtartalmú szerves oldattal kombinálva egy reverz micella formájú emulziót készítünk, amely az első vegyületet és a lipidet tartalmazza;

d) a c) lépésben kapott emulziót inkubáljuk, hogy a komplexképző ágens a biológiai hatóanyaggal érintkezve komplexet képezzen a lipiddel stabilizált vízcseppek belsejében, amely komplex átmérője nem nagyobb a vízcsep pékén él; és

A találmány szerinti eljárás felhasználható terápiás célú liposzómák készítésére, amelyek a liposzómában a biológiai hatóanyagok széles körét tartalmazhatják valamilyen komplexképzö ágenssel komplexálva. A liposzómák előnyösen fuzogén liposzómák, amelyek a találmány szerinti eljárással sokféle molekulát zárhatnak magukba. A fuzogén liposzómák képesek összeolvadni a sejtmembránnal, és biológiai hatóanyagokat terápiásán hatásos mennyiségben bevinni sejtekbe és szervekbe. A találmány szerinti eljárással egy liposzómába több biológiai hatóanyag is bevihető. A találmány szerinti eljárással tehát egyazon liposzómába egyidejűleg egy vagy több biológiai hatóanyag kapszulázható. Ha a találmány szerinti eljárással egy liposzómába többféle biológiai hatóanyagot kapszulázunk, akkor nem szükséges, hogy mindegyik biológiai hatóanyag komplex alakban legyen jelen.

73.280/SM * · «··

‘.ή

- 17 A „biológiai hatóanyag” bármely olyan vegyületet vagy anyagkeveréket jelent, amely állatoknak, előnyösen embernek terápiás vagy diagnosztikai célokból beadható. A találmány szerinti eljárás alkalmazható biológiai hatóanyagok, például olyan vízoldható, membránon áthatolni nem képes ágensek, mint nukleinsavak, nukleotidvagy nukleozid-analógok - például citozin-pDarabinofuranozid-5’-trifoszfát (araCTP) -, proteinek - például citokróm c -, poláris rákellenes szerek - például cisplatin, Nfoszfonoacetyl-L-aszparaginsav vagy 5-fluor-orotsav - rákellenes szerek poláris vagy töltéssel bíró származékai, poláris peptidek, hiszton dezacetilezett inhibitorok, például butirát és hasonlók kapszulázására. Bioaktív ágensek lehetnek továbbá - az oltalmi kör korlátozása nélkül - a nukleinsavak közül választott hatóanyagok - például DNS vagy RNS vírusellenes szerek, például acyclovir, zidovudin és az interferonok; baktériumellenes szerek, például amino-glikozidok, cephalosporinok és tetraciklinek; gombaölő szerek, például polién antibiotikumok, imidazolok és triazolok; antimetabolikus ágensek, például folsav, továbbá purin- és pirimidinanalógok; daganatellenes szerek, például az antraciklin antibiotikumok és növényi alkaloidák; szénhidrátok, például cukrok és keményítők; aminosavak, peptidek, proteinek, például sejtreceptor-proteinek, immunglobulinok, enzimek, hormonok, neurotranszmitterek és glikoproteinek; színezékek; radioaktív jelölő anyagok, például sugárzó izotópok és ilyen izotópokkal megjelölt vegyületek; radioopak (röntgensugárzás számára átlátszatlan) vegyületek; fluoreszcens vegyületek; pupillatágító vegyületek; hörgőtágítók; helyi érzéstelenítőszerek és hasonlók.

A „bioaktív komplex” kifejezés bármely biológiai hatóanyagot jelenthet, amely egy komplexhez úgy kötődik, hogy a komplexképzés változásokat okoz a fizikai tulajdonságokban, például csökkenti a bioaktív molekula méretét, csökkenti az oldhatóságát, kicsapja vagy kondenzálja a biológiai hatóanyagot, vagy megnöveli a komplex méretét.

73.280/SM

- 18 Reverz micellákat tartalmazó, víz az olajban típusú emulziókon vizsgálták az enzimek kinetikáját például Bru és munkatársai [Biochem J, 310: 721-739 (1995)] továbbá a liposzómaképzödést például Szoka és munkatársai [Proc NatAcad Sci USA, 75: 4194-4198 (1978)] valamint Gruner és munkatársai [Biochem, 24: 28332842 (1984)], de ilyen emulziók alkalmazása két vegyület közötti komplexképzés modulálására liposzómák töltése céljából mindeddig nem szerepelt az irodalomban.

Emulziók előállítására az átlagosan művelt szakember sokféle módszert ismer: ultrahangos, vortexes, mechanikus keverés, statikus keverés, homogenizálás, injekció, mikrofluidizálás, kolloidmalmok, nyomás alatti emulgeátor és/vagy Kady malmok alkalmazhatók különböző típusú emulziók előállítására, beleértve az anyagok különböző beadagolás! sorrendjét. A találmány szerinti emulziókat két lépésben állítjuk elő, úgy, hogy a biológiai hatóanyag és a komplexképző ágens közül legalább az egyik komponenst előzetesen a lipiddel stabilizált emulzió vízcseppjeibe zárjuk, mielőtt a másik komponens vizes diszperzióját hozzáadnánk.

A „liposzómák” önépítő szerkezetek, amelyek egy vagy több lipid kettősréteget tartalmaznak, ezek mindegyike két egyszeres rétegéből áll, amelyekben az amfipatikus molekulák egymással ellentétes irányban helyezkednek el. Az amfipatikus molekulák egy vagy két nem-poláris (hidrofób) acillánchoz kovalensen kapcsolódó poláris (hidrofil) fejrészt tartalmaznak. A hidrofób acilláncok és a környező vizes közeg között fennálló, energetikailag kedvezőtlen kapcsolat miatt az amfipatikus lipid molekulák úgy rendeződnek el, hogy poláris fejrészeik a kettősréteg külső felülete felé, acilláncaik pedig a kettősréteg belseje felé forduljanak. így egy energetikailag stabil szerkezet alakul ki, amely az acilláncokat hatásosan védi attól, hogy a környező vizes közeggel érintkezzenek.

Többek között Cullis és munkatársai [Biochim. BiophysActa, 559: 399-420 (1987); New, 1995] leírják, hogy a liposzómáknak lehet egy vagy több kettősrétege

73.280/SM

- 19 (előbbiek unilamilláris liposzómák, ULV-k, utóbbiak a multilamilláris liposzómák, MLV-k vagy SPLV-k). Mindegyik kettősréteg egy vizes cellát vesz körül illetve zár magába. Minthogy a vizes térfogatrészt a lipid molekuláknak ez a védőgátja veszi körül, a liposzómák képesek elzárni a bekapszulázott molekulákat, például nukleinsavakat a külső környezetben jelenlévő tényezők, például nukleáz enzimek lebontó hatásától. A kapszulázott tartalom védelmét nukleinsavmolekulák esetében mutatják például a 9. példában szereplő agarózgéles elemzések, amelyek eredményei a 4. ábrán láthatók.

A liposzómák különböző méretűek lehetnek, például átlagos átmérőjük akár 25 nm és 10 000 nm vagy még nagyobb között változhat. A méretet sokféle tényező befolyásolja, például a lipid összetétele és az előállítás módszere, ezeket az átlagosan művelt szakember képes meghatározni és figyelembe venni; meghatározásukra sokféle módszer ismert, például a kvázi-elasztikus fényszórás.

Az átlagosan művelt szakember ismereteinek körébe tartozik számos olyan megoldás is, amellyel nagyobb méretű liposzómákból kisebb méretűeket lehet készíteni; ilyenek például az ultrahang, homogenizálás, franciaprés alkalmazása és aprítás hengerszéken. Az 5,008,050 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás szerint extrudálás is alkalmazható liposzómák méretének csökkentésére, vagyis meghatározott átlagos átmérőjű liposzómák előállítására oly módon, hogy a liposzómákat egy meghatározott, választható pórusméretű szűrőn átnyomják. A W089/008846 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett tangenciális szűrés ugyancsak alkalmazható liposzómák méretének szabályozására, vagyis egy kevésbé heterogén, azaz homogénebb méreteloszlású liposzóma-halmaz előállítására.

A találmány szerinti liposzómák lehetnek egylamellásak vagy néhány lamellásak, és méretük megegyezhet a fenti módszerek bármelyikével előállított

73.280/SM

- 20 liposzómákéval. De a találmány előnyös megvalósításaiban a liposzómák méretének szám szerinti átlaga 50 és 300 nm közé esik.

A liposzómák sokféle, természetes vagy szintetikus forrásból származó amfipatikus vagy nem amfipatikus lipidből állhatnak. Az alkalmas liposzomális lipidek közé tartoznak - a találmány oltalmi körének korlátozása nélkül - a foszfatidil-kolinok (PC-k), a foszfatidil-etanol-aminok (PE-k), foszfatidil-szerinek (P-ek), foszfatidilglicerinek (PG-k), foszfatidil-inozitok (Pl-k) és foszfatidinsavak (PA-k). Az ilyen foszfolipidek általában két acilláncot tartalmaznak, lehet mindkettő telítetlen, vagy egyik teített, a másik telítetlen; a lánc lehet - az oltalmi kör korlátozása nélkül mirisztát, palmitát, sztearát, oleát, linoleát, linolenát, arachidát, arachidonát, behenát vagy lignocerát lánc.

A foszfolipidekhez egy alkalmas reakcióképes csoportot is kapcsolhatunk. Ilyen általában az aminocsoport, ezért a foszfolipid-származékok rendszerint foszfatidiletanol-aminok. A PE-khez kapcsolható molekularészek - az oltalmi kör korlátozása nélkül - az acilláncok (W098/16199), amelyek növelik a liposzómák és a biológiai membránok közötti összeolvadási hajlamot; a peptidek (W098/16240), amelyek a célsejt közelében destabilizálják a liposzómákat; a biotin és malimidocsoportok (az 5,059,421 és 5,399,331 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás), amelyek a megcélzott részeket, például antitesteket a liposzómákhoz kapcsolják; és különböző egyéb molekulák, például gangliozidok, poli(alkil-éterek), polietilénglikolok és szerves dikarbonsavak (lásd például az 5,013,556, 4,920,016 és 4,837,028 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírást).

Tehát a találmány legelőnyösebb megvalósításaiban a találmány szerinti módon előállított liposzómák egy olyan foszfolipid-származékot tartalmaznak, amely úgy van kialakítva, hogy elősegítse a liposzómák tartalmának célbajuttatását. A liposzómák adott esetben járulékos lipideket is tartalmazhatnak, ezek bevitelének

73.280/SM

- 21 sokféle, a liposzómák terén átlagosan művelt szakember előtt jól ismert célja lehet. Ilyen cél lehet például a liposzómák stabilizálása vagy célbajuttatása, vagy a liposzómák farmakokinetikai viselkedésének további módosítása. Járulékos lipidként alkalmazható bármely, a liposzómákhoz alkalmasként ismert lipid, például foszfolipidek, glikolipidek és szterolok.

A találmány szerinti liposzómák lipidkomponense előnyösen egy foszfolipidszármazékból és egy járulékos lipidből állnak. A foszfolipid-származék általános képlete

CHrR¹

CH-R²

CH₂-O-P(O)₂-O-CH₂CH₂NH-Z_t amelyben

Z jelentése maleimid-csoport, R vagy X-Y általános képletű csoport, amelyben

X egy összekötő rész, éspedig egyszeres kötés vagy egy R csoport; és

Y jelentése egy enzimmel lehasítható pepiid, amely egy olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely a sejt által kiválasztott peptidáz szubsztrátját képezi. 12 3 4

R , R , R és R mindegyikének jelentése -OC(O)(CH2)_n1(CH=CH)_n2(CH2)n₃(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)_n6(CH2)_n7(CH=CH)_n8(CH2)n9CH₃ általános képletű csoport, amelyben n1 értéke nulla vagy 1 és 22 közötti egész szám;

n3 értéke nulla vagy 1 és 19 közötti egész szám;

n5 értéke nulla vagy 1 és 16 közötti egész szám;

n7 értéke nulla vagy 1 és 13 közötti egész szám;

n9 értéke nulla vagy 1 és 10 közötti egész szám;

73.280/SM .:. J.’*

- 22 n2, n4, n6 és n8 mindegyikének értéke nulla vagy 1, és n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 and n9 értéke minden helyen lehet azonos vagy különböző.

2

R és R jelentésében az n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 összeg értéke egymástól függetlenül 12 és 22 közötti egész szám, míg R és R⁴ jelentésében az n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 összeg értéke egymástól függetlenül 2 és 22 közötti egész szám.

Az ilyen foszfolipid-származékok előnyösen körülbelül 20 - 80 mol% liposzomális lipidet tartalmaznak.

Ha R³ jelentése -OC(O)(CH₂)ni(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)_n5(CH=CH)n6(CH2)n7-(CH=CH)n8(CH2)n9CH3 általános képletű csoport, akkor a foszfolipid-származék egy N-acilezett foszfatidil-etanol-amin (NAPE, lásd a W098/16199 3 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben). R jelentése ilyenkor előnyösen OC(O)(CH₂)niCH₃, általános képletű csoport, még előnyösebben -OC(0)(CH₂)ioCH₃ csoport.

A foszfolipid-származék előnyösen egy N-acilezett PE. Az ilyen NAPE-k felhasználhatók fuzogén liposzómák előállítására, és előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti drog- vagy biológiai hatóanyag-komplexeket tartalmazó liposzómák előállítására.

Shangguan és munkatársai [Biochim Biophys Acta, 1368: 171-183 (1998)] szerint a kettősréteg a NAPE által előidézett destabilizáció folytán összeolvad a szomszédos biológiai membránokkal, tehát növekszik a kettősréteg fuzogenitása. A megnövekedett fuzogenitás pedig - azáltal, hogy a sejteket bizonyos körülmények között, például megfelelő Ca²⁺- és Mg²⁺-koncentrációk mellett összeköti a liposzómákkal - felhasználható kapszulázott biológiai hatóanyagok, például nukleinsavak vagy más olyan ágensek szállítására, amelyek nem tudnak áthatolni a sejt

73.280/SM

- 23 membránon. A liposzóma és a sejt érintkezése következtében a liposzómákba kapszulázott biológiai hatóanyag a sejtek közelében és/vagy a liposzóma és a sejtmembrán összeolvadása folytán közvetlenül a sejtek citoplazmájába bejutva szabadul fel. Ez a szállítás in vivo és in vitro is megoldható.

Ha R jelentése acillánc vagy pepiid, tehát a foszfolipid-származék egy NAPE 1 2 vagy peptid-lipid konjugátum, akkor R és R közül előnyösen egyiknek a jelentése egy telítetlen acillánc, vagyis n2, n4, n6 és n8 közül legalább egynek az értéke 1. A telítetlen acillánc - az oltalmi kör korlátozása nélkül - lehet például palmitoleát-, oleát-, linoleát-, linolenát- vagy arachidonát-lánc. A telítetlen acillánc előnyösen a 1 2

-OC(O)(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 képletű oleátlánc. Még előnyösebben R és R jelentése egyaránt oleátlánc, tehát a foszfolipid-származék

CH2-OC(O)(CH2)7CH=CH(CH₂)₇CH3

I

CH-OC(O)(CH₂)7CH=CH(CH₂)7CH3 I

CH2-O-P(O)2-O-CH2CH₂NH-Z képletű vegyület, amelyben

Z jelentése R vagy X-Y általános képletű csoport.

Még előnyösebben a foszfolipid-származék

CH2-OC(O)(CH2)7CH=CH(CH₂)7CH3

I

CH-OC(O)(CH₂)7CH=CH(CH2)₇CH3

I

CH2-O-P(O)2-O-CH2CH₂NH-OC(O)(CH2)i0CH3 képletű vegyület, vagyis N-C12 DOPE.

Ha a foszfolipid-származék NC-12 DOPE, akkor a liposzomális lipid előnyösen egy foszfatidil-kolint is tartalmaz, még előnyösebben egy olyan PC-t, amelynek legalább egy telítetlen acillánca van, a legelőnyösebben dioleoil-foszfatidil-kolint. A liposzomális lipid előnyösen körülbelül 70 mol% NC-12 DOPE-t és körülbelül 30 mol% DOPC-t tartalmaz (vagyis 70:30 arányú NC-12 DOPE / DOPC készítmény, amelynek

73.280/SM ··· * ·»»· ···

- 24 liposzomális lipid koncentrációit az arányszámmal adjuk meg, és ezek az arányszámok az adott lipid százalékát jelentik a liposzomális lipidben).

A liposzomális lipid egy „fejcsoportban módosított lipid”-et is tartalmazhat, vagyis olyan lipidet, amelynek poláris csoportjához egy olyan molekularész kapcsolódik, amely gátolja a szérumfehérjék kötődését a lipidet tartalmazó liposzómához. Tehát egy fejcsoportban módosított lipid bevitele a liposzómákba úgy változtatja meg azok farmakokinetikai viselkedését, hogy hosszabb ideig maradnak meg az állat vérkeringésében, mint egyébként. Ezek leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyeken: Blume et. al., [Biochim. Biophys. Acta., 1149:180 (1993)]; Gabizon et. al., [Pharm. Res., 10(5):703 (1993)]; Parkét, al., [Biochim. Biophys Acta., 257: 1108 (1992)]; Woodle et al., valamint az 5,013,556, a 4,837,028 és 4,920,016 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban.

A fejcsoportban módosított lipidek rendszerint foszfatidil-etanol-aminok (PE-k), például dipalmitoil-foszfatidil-etanol-amin (DPPE), palmitoleoil-foszfatidil-etanol-amin (POPE) vagy dioleoil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE). Ezeknek a lipideknek a fejcsoportja általában egy polietilénglikollal vagy egy szerves dikarbonsawal, például borostyánkősawal, glutársawal (GA) vagy ezek anhidridjeivel van módosítva. A lipid hordozóanyaghoz hozzáadott, fejcsoportban módosított lipidek mennyisége sokféle olyan tényezőtől függ, amelyeket az átlagosan művelt szakember jól ismer, illetve felesleges kísérletezés nélkül meg tud határozni. Ezek például - de nem kizárólag a lipid és a fejcsoport-módosítás típusa, a hordozóanyag típusa és szemcsemérete valamint a készítmény terápiás alkalmazása. Ha a lipid hordozóanyag fejcsoportban módosított lipidet tartalmaz, ez utóbbi általában 5 és 20 mól% közötti mennyiségben van jelen.

A komplexképző ágensek általában - de nem mindig - a biológiai hatóanyaggal ellenkező töltésűek, mint például a spermin, spermidin, kobalt-hexamin, kalci

73.280/SM

J...*·

- 25 umionok, magnéziumionok, polilizinek, polihisztidinek, protaminok, polianionok, például heparin- és dextrán-szulfát, citrátionok és szulfátionok. A szakember más olyan komplexképző ágenseket is ismer, amelyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók.

A liposzómákba kapszulázott kondenzált nukleinsav lehet DNS - például genom DNS, plazmid DNS és cDNS - vagy RNS; a kapszulázott nukleinsav előnyösen DNS, még előnyösebben zárt (cirkuláris) plazmid DNS. A kondenzált nukleinsavak a liposzomális lipid 1 mikromoljára számítva legalább körülbelül 0,5 μg -os, vagy legalább körülbelül 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75 vagy 2 μg/mikromolos koncentrációban vannak a liposzómákba kapszulázva. Még előnyösebben a liposzómák körülbelül 2 20 μg/mikromol nukleinsavat tartalmaznak. A „kondenzált nukleinsav” kifejezés a leírásban olyan nukleinsavat jelent, amely egy vagy több polikationnal úgy van kombinálva, hogy a nukleinsav-szálak pakolása tömörebb, mint a polikationok jelenléte nélkül. Ez a pakolás lehetővé teszi a nukleinsavak kapszulázását liposzómákba, ugyanakkor a nukleinsavak transzfektálható, transzkripcióra (átírásra) kész állapotban szabadulnak fel.

Tehát a találmány előnyös megvalósításaiban az eljárással olyan liposzómákat kapunk, amelyek egy kondenzált DNS-t és körülbelül 70 mól% N-C12 DOPE-ból és körülbelül 30 mól% DPOC-ből álló lipidet tartalmaznak. A ilyen liposzómák a lipid 1 mikromoljára számítva legalább körülbelül 0,5 μg kondenzált DNS-t tartalmaznak.

A találmány szerinti eljárással előállított liposzómák a komplexált biológiai hatóanyag mellett további egy vagy több biológiai hatóanyagot is tartalmazhatnak. A biológiai hatóanyagok a liposzómákban kombinálhatok vírusellenes szerekkel, mint például acyclovir, zidovudin és az interferonok; baktériumellenes szerekkel, mint például amino-glikozidok, cephalosporinok és tetraciklinek; gombaölő szerekkel, mint

73.280/SM ”’·J. -

- 26 például polién antibiotikumok, imidazolok és triazolok; antimetabolikus ágensekkel, mint például folsav, továbbá purin- és pirimidin-analógok; daganatellenes szerekkel, mint például az antraciklin antibiotikumok és növényi alkaloidák; szterinekkel, például koleszterinnel; szénhidrátokkal, mint például cukrok és keményítők; aminosavakkal, peptidekkel, proteinekkel, mint például sejtreceptor-proteinek, immunglobulinok, enzimek, hormonok, neurotranszmitterek és glikoproteinek; színezékekkel; radioaktív jelölő anyagokkal, mint például a sugárzó izotópok és ilyen izotópokkal megjelölt vegyületek; radioopak vegyületekkel; fluoreszcens vegyületekkel; pupillatágító vegyületekkel; hörgőtágítókkal; helyi érzéstelenítőszerekkel és hasonlókkal.

A liposzómás bioaktív készítmények megnövelhetik a biológiai hatóanyag terápiás indexét, például a hatóanyag toxicitásának pufferolása révén. A liposzómák csökkenthetik továbbá a sebességet, amellyel a biológiai hatóanyag kiürül az állatok vérkeringéséből. Tehát a biológiai hatóanyagok liposzómás készítményeinek alkalmazásával a kívánt hatás eléréséhez adott esetben kevesebb hatóanyagot kell beadni.

A találmány szerinti liposzómákat lehet dehidratálni, tárolni, majd belső tartalmuk nagy részének megőrzése mellett visszaalakítani. A liposzóma dehidratálásához rendszerint egy hidrofil szárítási védőanyagot, például egy diszacharid cukrot kell alkalmazni a liposzóma kettősrétegének mind a belső, mind pedig a külső oldalán (lásd a 4,880,635 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírást). Általában úgy tartják, hogy ez a hidrofil vegyület meggátolja a lipidek átrendeződését a liposzómákban, így azok mérete és tartalma megmarad a szárítás és későbbi rehidratálás folyamán. Ilyen szárítási védőanyagként azok az anyagok alkalmasak, amelyek erős hidrogénkötő akceptorok, és sztereokémiái jellemzőik folytán megtartják a távolságot a liposzóma kettösréteg komponensei között. A szárítási védőanyag

73.280/SM «·· * *··* ·ί· ·*

- 27 el is hagyható, ha dehidratálás előtt a liposzómát nem fagyasztjuk, és a dehidratálás után elegendő víz marad benne.

A találmány további tárgya egy gyógyszerkészítmény, amely egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és egy találmány szerinti liposzómát tartalmaz. Ez a készítmény alkalmas például nukleinsavak bevitelére állati sejtekbe. A „gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag” a leírásban olyan közeget jelent, amely általában alkalmas lipidek és liposzómák, például biológiai hatóanyagot tartalmazó liposzómás készítmények állatoknak vagy embernek történő beadására. A gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok formulálása sok olyan tényező szerint történik, amelyeket az átlagosan művelt szakember könnyen meghatároz és figyelembe vesz, ilyenek például - az oltalmi kör korlátozása nélkül - az alkalmazott biológiai hatóanyag, annak koncentrációja, stabilitása és biológiai hasznosíthatósága; a liposzómás készítménnyel kezelendő betegség, rendellenesség vagy állapot; a kezelendő egyed, annak életkora, mérete és általános állapota; a tervezett beadási mód, például nazális, orális, oftalmikus (szembe), helyi, transzdermális, vaginális, szubkután, intramammáris (mellbe), intraperitoneális, intravénás vagy intramuszkuláris [lásd például Nairn (1985)]. Biológiai hatóanyag parenterális beadáshoz tipikusan használt gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag például a DSW, egy vizes sóoldat, amely 5 tömeg% dextrózt és fiziológiai nátrium-klorid-oldatot tartalmaz. A gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok további, például a hatóanyag stabilitását növelő adalékanyagokat, például tartósítószereket vagy antioxidánsokat is tartalmazhatnak.

A találmány további tárgya eljárás egy nukleinsav, például DNS liposzómába történő kapszulázására, amely az alábbi lépésekből áll: a) egy nukleinsav, például DNS vizes szuszpenzióját egy lipidet, például egy foszfolipid-származékot és egy járulékos lipidet tartalmazó szerves oldattal összekeverünk, így a nukleinsavat és a

73.280/SM

- 28 lipidet tartalmazó fordított (inverz) micellás szuszpenziót képezünk; b) a micellás oldathoz egy polikationt adunk, hogy a nukleinsav a reverz micellákban kondenzálódjék, és c) a b) lépésben kapott szuszpenzióból a szerves oldószert eltávolítjuk, így a reverz micellákból a nukleinsavat és a lipidet tartalmazó liposzómákat képzünk.

A találmány megvalósításában alkalmazható lipidek, mint mondottuk, olyan lipidek, amelyek liposzómákba vihetők, akár önmagukban, akár más lipidekkel együtt; ilyenek például a foszfolipidek, glikolipidek, szterinek és származékaik. Szerves oldószerként bármely olyan oldószert használhatunk, amely alkalmas a lipidek feloldására a liposzómák előállítása során, például - az oltalmi kör korlátozása nélkül - metanol, etanol, dimetil-szulfoxid, kloroform és ezek keverékei. Szerves oldószerként előnyösen kloroformot alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárásban a nukleinsavak kondenzálására polikationként bármely olyan vegyületet alkalmazhatunk, amely három vagy több, nukleinsavak vagy más biológiai hatóanyagok vagy drogok kondenzálására alkalmas ionizálható csoportot tartalmaz; ilyen például a polilizin, poliaminok (például spermin vagy spermidin), kobalt(lll)-hexamin, polihisztidin, poli(etilén-imin) és hasonlók. Polikationként előnyösen spermint alkalmazunk. A találmány megvalósításában nukleinsavként alkalmazható DNS - például genom DNS, plazmid DNS és cDNS, lineáris vagy zárt DNS - valamint RNS. A nukleinsavakat a makromolekulák szuszpendálására ismert és könnyen kivitelezhető módon, például Vortex keveréssel vizes közegben szuszpendáljuk. Vizes közegként alkalmazható a különböző adalékanyagok, például pufferek vizes oldata, amely bizonyos anyagokat, például sókat és nukleáz enzimeket gyakorlatilag nem tartalmaz; ilyen közeg lehet például a kis sótartalmú puffer (LBS, lásd a 3. példát).

A foszfolipidekkel stabilizált „víz az olajban” típusú emulziók reverz micellákat tartalmaznak. A Bru és munkatársai [Biochem J, 310: 721-739 (1995)] által leírt

73.280/SM

.. · * *·♦* Λ· ^—

- 29 reverz micellák amfipatikus, lipid-alapú szerkezetek, amelyekben a lipidek hidrofil részei a micellákba vannak bezárva, míg a hidrofób részek a külső felületen helyezkednek el.

A reverz micellás emulziók - amint azt fent és a 2. ábránál az alábbiakban leírjuk - a bennük lévő biológiai hatóanyagokat, például nukleinsavakat elzárják az intermolekuláris érintkezéstől, amely a komplexképző ágens jelenlétében aggregációhoz vezetne, és így alkalmatlanná válnának a liposzómákba való bevitelre. Ezt a folyamatot úgy irányítjuk, hogy maximális arányban kapjuk a kívánt komplexeket tartalmazó liposzómákat.

Többek között Bru és munkatársai [FESS, 282: 170-174 (1991)] valamint Fletcher és munkatársai [J Chem Soc Faraday Trans I, 83: 9851006 (1987)] leírják, hogy az emulzióban a komplexek úgy alakulnak ki, hogy a hozzáadott komplexképző ágensek, például polikationok vagy a biológiai hatóanyagok az emulzióban a reverz micellák vizes részei között kicserélődnek. DNS-komplexek kapszulázásához bármely, nukleinsavak kondenzálására alkalmas polikation használható. Például Chattoraj és munkatársai [J Mól Bioi, 121: 327-337 (1978)] valamint Gosule és munkatársai [Nature, 259: 333-335 (1976)] egyedi plazmidok kondenzálására spermint és spemnidint alkalmaztak in vitro, de alacsony DNS-koncentrációknál a kondenzált plazmidok aggregációjának elkerülésére. Ezek a koncentrációk elég kicsinyek voltak ahhoz, hogy a kísérleti cél, vagyis a nukleinsavak liposzómákba történő kapszulázának elérésekor jelentős számú üres, tehát DNS-t nem tartalmazó liposzóma maradjon. Nukleinsavak kondenzálására polilizin és kobalt(lll)-hexamin is alkalmazható.

Wilson és munkatársai [Biochem, 18: 2192-2196 (1979)] szerint a polikationokat a nukleinsavak kondenzálásra olyan koncentrációban kell alkalmazni, amely a nukleinsavak negatív töltései nagy részének, például DNS esetén körülbelül

73.280/SM

- 30 90 %-ának semlegesítését eredményezi. Az átlagosan művelt szakember adott kondenzálandó nukleinsavhoz az alkalmazott polikation nukleinsav-koncentráció és polikation vegyérték alapján könnyen meg tudja határozni a szükséges vagy optimális polikation-koncentrációt.

A biológiai hatóanyagok, például nukleinsavak kondenzálásához szükséges poliation-koncentrációkat további tényezők is befolyásolhatják, amelyek meghatározása és figyelembevétele ugyancsak az átlagosan művelt szakember ismereteinek körébe tartozik. Például a NAPE-k, mint az N-C12 DOPE, a kiegészítő acilláncok következtében nettó negatív töltést hordoznak, ezért az ilyen lipidek kölcsönhatásba léphetnek pozitív töltésű molekulákkal, ezáltal csökkentve a nukleinsavkondenzációhoz rendelkezésre álló polikationok mennyiségét.

Tehát ilyen esetekben előfordulhat, hogy a polikationból nagyobb mennyiséget kell alkalmaznunk, mint amekkora a nukleinsav-kondenzációhoz egyébként szükséges lenne. Sokféle módon meghatározható, hogy a polikationokból mekkora felesleg szükséges, például a 4. példában leírt megosztásos kísérleti berendezéssel. Az ilyen kísérletekből kapott eredmények (lásd a 3. ábrán) megadják, hogy a nukleinsav kondenzálásához mennyivel kell megnöveli a polikation-koncentrációt. így például a 3. példában alkalmazott nukleinsav- és lipidkoncentrációk esetén 0,6 mM spermin kellett a plazmid DNS kondenzálásához, de ez a mennyiség NAPE N-C12 DOPE jelenlétében a fenti koncentrációk mellett 0,85 mM-ra emelkedett. De ezeknél, vagyis a minimálisan szükségesnél nagyobb polikation-koncentrációkat is alkalmazhatunk, például - ismét a 3. példa szerinti körülményeket véve alapul - az emulzióban 8-20 mM spermin végkoncentrációt találtunk optimálisnak a nukleinsav és lipid töltésének semlegesítéséhez.

Az átlagosan művelt szakember könnyen meg tudja határozni a találmány megvalósításában alkalmazandó lipid- és nukleinsav-koncentrációkat. Például kon

73.280/SM

- 31 denzált plazmid DNS 200 nm-es, gömb alakú liposzómákba történő kapszulázásához (lásd az alábbi 3. példát) 200 pg pZeoLacZ plazmid DNS-t 125 ml LSB-ben 30 μηηοΙ 70:30 mólarányú N-C12 DOPE / DOPC kombinációval kevertünk össze.

Tehát a találmány egy másik előnyös megvalósításához kondenzált nukleinsavként plazmid DNS-t, egy foszfolipid-származékot, például N-C12 DOPE-t tartalmazó lipidet, kloroformot és spermint alkalmazunk körülbelül 1 mM vagy nagyobb koncentrációban.

A találmány még további tárgya eljárás egy állat sejtjeinek egy biológiai hatóanyaggal végzett transzfektálására, amelynek során a sejteket érintkezésbe hozzuk egy találmány szerinti, komplexált nukleinsavat tartalmazó liposzómával. Az érintkezés történhet in vitro - ez esetben a liposzómát tartalmazó keveréket hozzáadjuk a sejteket körülvevő tenyésztő közeghez - vagy in vivo, amikor a liposzómákat egy gyógyszerkészítményben adjuk be, amely egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot is tartalmaz, és bármely módszerrel beadható, amelyet gyógyszerkészítmények állatoknak történő beadására alkalmazni szoktak.

Az in vivo érintkezést — különösen akkor, ha specifikusság vagy célzás szükséges - elősegíti egy olyan eszköz beépítése a liposzómákba, amely a liposzómát a vagy speciális helyre irányítja, például egy antitest kapcsolása a liposzómákhoz streptavidinnel, aminek hatására a liposzómák tartalma előnyösen egy bizonyos helyen szabadul fel, például úgy, hogy NAPE-ket vagy peptid-lipid konjugátumokat viszünk be a liposzómákba; vagy amelynek hatására a liposzómák bizonyos helyeken, például tumorokban gyülemlenek fel, és oda egy fejcsoportban módosított lipidet visznek be.

A transzfekció hatásosságát, vagyis egy liposzómába kapszulázott nukleinsavmolekula sejtbe történő bejuttatásának hatékonyságát akár in vivo, akár in vitro növelhetjük úgy, hogy a liposzómákba egy olyan eszközt építünk be, amelynek hatásá73.280/SM

- 32 3.2’· 2^: ra a liposzóma kettősrétege összeolvad a sejtmembránokkal. Ilyen eszközök például a NAPE-k, peptid-lipid konjugátumok és ionizálható lipidek, amint az a WO 87/07530 és a WO 95/27478 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben olvasható.

Az in vivo vagy in vitro transzfekció célja nukleinsavak bevitele a sejtekbe úgy, hogy azok ott átíródjanak (transzkripció) vagy transzlatálódjanak. Az ilyen, külső nukleinsavak bevitelével létrehozott fehérje-expresszió felhasználható a sejt sokféle olyan defektusának kezelésére, amelyet egy gén expressziójának hiánya vagy túlzott expressziója okoz, vagy pedig a sejtfehérjék és expressziójuk egyéb módosítására. A sejtek transzfektálása a találmány szerinti liposzómákba kapszulázott nukleinsavakkal olyan betegségekben vagy rendellenességekben szenvedő állatok kezelésére alkalmazható, amelyeket egy fehérje abnormális - tehát nem létező, abnormálisán alacsony, abnormálisán magas vagy nem megfelelő - expressziója jellemez. Ilyen betegségek és rendellenességek például - az oltalmi kör korlátozása nélkül - a különböző rákok és géndefektusos betegségek. A terápiásán értékelhető transzfekció olyan fehérje expresszióját is eredményezheti, amelyet a célsejtek előzőleg nem expresszáltak.

A transzfekció sikeressége és a transzfektált nukleinsavak expressziója a sejtben sokféleképpen meghatározható, ezek a módszerek vagy a nukleinsav fizikai jelenlétének kimutatásán alapulnak - például úgy, hogy a nukleinsavba egy sugárzó nukleotidot építenek be -, vagy pedig a nukleinsav által kódolt fehérje expressziójának kimutatásán. Ez többféle módon megoldható, például - az oltalmi kör korlátozása nélkül - ha a fehérje kimutatható például fluoreszcens markerrel, vagy ha a fehérje elválasztható, például citotoxikus ágens rezisztencia markerrel.

így például a pEGFP-1 plazmid tartalmaz egy, a megnövelt zöld fluoreszcencia proteint kódoló DNS-szekvenciát, amelynek jelenléte fluoreszcencia-mikroszkóppal

73.280/SM

mutatható ki. Tehát az ilyen plazmiddal végzett transzfekció (lásd például a 10-12. példában) sikere könnyen kimutatható a sejtek fluoreszcenciájának mérésével. Ezen kísérletek eredményeit (lásd 8-12. ábra) az OVCAR-3 sejtek sikeres transzfekciója pEGFP-1 plazmiddal, valamint a transzfektált sejtek jelentős aránya jellemzi.

Ilyen sikeres expressziót csak ott észleltünk, ahol a transzfektált DNS polikationkondenzált volt; azok a minták, amelyeket nem sperminnel dolgoztunk fel, semmi vagy majdnem semmi fluoreszcenciát nem mutattak (8. ábra). A fluoreszcens protein mennyiségi meghatározása (9. ábra) azt mutatja, hogy a polikationnal kondenzált DNS transzfekciója a spermin nélkül feldolgozott mintákban nem eredményez mérhető fluoreszcenciát. Továbbá a szabad, vagyis kapszulázatlan DNS-sel végzett transzfekció sem ad észlelhető vagy mérhető fluoreszcenciát (lásd a 8c és 9c ábrát).

Az alábbi példák a találmány részletesebb ismertetésére szolgálnak, annak az igénypontokban meghatározott oltalmi körét nem korlátozzák.

Példák

1. példa - Anyagok

A (tojásból átészterezett) N-(lissamin-rodamin-B-szulfonil)-foszfatidil-etanolamint, a DOPC-t, EPC-t és N-C12-DOPE-t az Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) cégtől, az OVCAR3 petefészek-karcinómasejteket az NCI-Frederick Cancer Research Laboratory-tól (Frederick, MD) a pEGFP-C1 plazmidot és az E. coli DHSa kompetens sejteket a Clontech Laboratories-tól (Palo Alto, CA), a pZeoSVLacZ plasmid kompetens sejteket és a Hanahan's S.O.C.-t az Invitrogen-től (San Diego, CA), a Hank-féle kiegyenlített sóoldatot (HBSS), az RPMI 1640-et, a hővel inaktivált marhaszérumot és a Lipofectint a Gibco/BRL-től (Grand Island, NY), a DNáz-mentes

73.280/SM

- 34 RNázt és az RNáz-mentes DNázt a Boehringer Mannheim-től (GmbH, Germany), az agarózt az FMC Bioproducts cégtől, (Rockland, ME), a Bacto agart, Bacto tryptone-t és az élesztőkivonatot a DIFCO Laboratories-tól (Detroit, Ml), a kalceinkék-acetoximetil-észtert (CBAM), a PicoGreen és a SybrGreen I festéket a Molecular Probes cégtől (Eugene, OR) szereztük be.

2. példa - A plazmid tisztítása

Ebben a vizsgálatban kétféle plazmidot használtunk: a pZeoSVLacZ plazmidot, amely 6,5 kb (kilobázispár) hosszúságú, és emlősök sejtjeiben az SV40 korai enhancer-promoterből lacZ gént expresszál a β-galaktozidázhoz, ami lehetővé teszi az emlős-sejtek megkülönböztetését az E. co//-tól zeocin antibiotikum alkalmazásával; és a pEGFP-C1 plazmidot, amely 4,7 kb (kilobázispár) hosszúságú, és erősített zöld fluoreszcens fehérjét (EGFP) expresszál egy humán citomegalovírus közvetlen korai promoterből, ami lehetővé teszi az elválasztást E. co//-ban kanamycin, az emlős-sejtekben pedig G418 alkalmazásával. A plazmidokat E. coli-bó\ a Baumann és Bloomfield [Biotechniques, 19: 884-890 (1995)] által leírt módon tisztítottuk; a 260 nm-nél és 280nm-nél mért optikai sűrűség végső aránya minden készítménynél 1,9 volt, az agarózgél-elektroforézis azt mutatta, hogy a DNS a várt mérettartományba esik.

3. példa - Liposzómás DNS-készítmény előállítása

A minták előállításához 200 μg DNS-t 125 μΙ LSB-vel hígítottunk, majd az így kapott szuszpenziót egy 13 x 100 Pyrex kémcsőben, vortex-keverés közben összeöntöttük 1 ml kloroformmal, amely 30 pmol 70:30 mólarányú N-C12 DOPE/DOPC-t tartalmazott. A mintákat rögtön ezután 12 másodpercig ultrahangos fürdőben (Laboratory Supplies Co. Hicksville, NY) maximális energiájú ultrahanggal kezeltük,

73.280/SM

- 35 így a plazmid DNS-sel először emulziót képeztünk. Ehhez az emulzióhoz azután vortex-keverés és ultrahangos kezelés közben 125 μΙ-es, azonos térfogatú, különböző spermin-koncentrációjú (16-40 millimolos) LBS-adagokat adtunk. Ugyanígy készítettük a spermin nélküli mintákat, azzal a különbséggel, hogy a második 125 μΙ-es adagból a spermint kihagytuk. Az EPC-t tartalmazó mintákat is ugyanígy készítettük, azzal a különbséggel, hogy itt 7 mM spermint alkalmaztunk.

Az így kapott emulziókat néhány percen bélül egy Rotovap készüléken (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Switzerland) elhelyezett lombikba töltöttük. A szerves oldószereket eltávolítottuk, miközben a lombikot maximális sebességgel forgattuk, és a vákuumot egy tűszeleppel szabályoztuk. Kezdetben 600-650 mm-es vákuumot állítottunk be, ezt azután azzal a lehető legnagyobb sebességgel növeltük, amellyel még elkerülhető volt az erős buborékképződés, a maximális (körülbelül 730 mm-es) vákuum eléréséig; ezután a lombikot további 25 percig vákuum alatt tartottuk. A lombikban visszamaradt filmet 1 ml 300 mM LSB-s szacharóz-oldatban szuszpendáltuk, majd a mintát 0,4 pm-es polikarbonát membránszűrőkön (Poretics, Livemore, CA) ötször átextrudáltuk. Ezután a mintát kalcium- és magnéziumionoktól mentes Hankféle kiegyenlített sóoldattal (HBSS) szemben egy éjszakán át 4°C-on dializáltuk.

Más lipidkészítményeket is alkalmaztunk a kondenzált DNS találmány szerinti kapszulázására. Plazmidokat kondenzáltunk és kapszuláztunk az ezen példa fenti részében a leírt módon, és ezeket a 12. példa szerinti módon ülepítettük. A liposzóma lipid-összetétele a következő volt: koleszterin-hemiszukcinát: koleszterin : 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-foszfoetanol-amin : 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-glicero3-foszfoetanol-amin : dioieoil-dimetil-ammónium-propán : oleoil-acetát 12,5:2,5: 50:12:10,5: 10,5 arányban. Ülepítés és mosás után a liposzómák DNS/lipid arányát a 10. példában leírt módon határoztuk meg. A tipikus DNS/lipid arány 1,4-2,1 pg DNS / μmol lipid.

73.280/SM

4. példa - A spermin megoszlása

A nettó negatív töltést hordozó N-C12 DOPE adott esetben kölcsönhatásba léphet a pozitív töltésű sperminnel, és befolyásolhatja a kondenzációs folyamatot. Ezért egy alacsony sótartalmú pufferben végzett dialízissel vizsgálni kell a spermin megoszlását a DNS és a készítmény liposzómái között. A kísérleteket, amelyek célja a spermin megoszlásának mérése volt a negatív töltésű foszfolipidek és DNS között, egy háromkamrás dializáló berendezéssel (Sialomed, MD) végeztük, mindegyik kamra

250 μΙ folyadékot tartalmazott. A kívánt mennyiségű spermint LSB-vel hígítottuk, és betöltöttük a középső kamrába, amely kétoldalt egy-egy 100000 molekulatömeg áteresztőképességű dializáló membránnal volt határolva. A spermines kamra egyik oldalán elhelyezkedő kamra 250 μΙ össztérfogatú LBS-ben 400 μg pZeoLacZ plazmid DNS-t tartalmazott. A másik oldalon lévő kamra vagy csak 250 μΙ LBS-t, vagy a 3. példa szerinti módon előállított üres 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákat tartalmazott 30 mM koncentrációban, 250 μΙ LSB-ben - ebben az elrendezésben csak a spermin tudott bejutni mind a három kamrába. Ismert, hogy a plazmid DNS semlegesítése sperminnel aggregációt eredményez (1. ábra), ezért a DNS-t tartalmazó kamrában lévő oldat zavarosságát a spermin megoszlásának jelzésére használtuk. Ha a liposzómák teljesen elzárták a spermint a DNS-től, akkor a DNS nem aggregálódott. Ezekben a kísérletekben a rendelkezésre álló negatív töltésű lipid mennyisége körülbelül kétszerese volt a DNS negatív töltéseinek. Mindegyik dializáló berendezést egy éjszakán át (körülbelül 20 óra hosszat) forgattuk egy 30,5 cm-es (12 hüvelykes) keréken. Ezután a DNS-t tartalmazó kamrát kivettük, a mintát keverés céljából többször átpipettáztuk, majd egy 250 μΙ-es küvettába töltöttük. A zavarosság jellemzésére a 400 nm-nél mért fényelnyelést alkalmaztuk a pufferrel szemben.

73.280/SM

- 37 A DNS zavarosságmérési görbéket felvettük liposzómák jelenlétében és ezek nélkül végzett dialízisekre (3. ábra). A liposzómák jelenléte által okozott görbe-eltolódás közelítő értékét használtuk a lipidek és a DNS közötti relatív kötési állandók kiszámítására, azzal a feltételezéssel, hogy minden sperminmolekula négy nukleotid foszfátcsoporthoz vagy négy foszfolipidhez kötődik, egyszerű, Kdns illetve K|_jpid aszszociációs állandókkal meghatározott egyensúlyi állapotban. Wilson és munkatársai [Biochem, 18: 2192-2196 (1979)] valamint Gosule és munkatársai [J Mól Bioi, 121: 327-337 (1978)] szerint alacsony sókoncentráció esetén a spermin és DNS disszociációs állandója a mikromólok tartományába esik. Ezért ezekben a vizsgálatokban a szabad spermin koncentrációját elhanyagolhatónak tekintettük a DNS aggregációjához szükséges millimólos sperminkoncentrációk mellett.

A DNS foszfátcsportjainak a DNS aggregációjához szükséges, sperminnel végzett részleges semlegesítését, vagyis γι-et a liposzómák távollétében kapott eredmények alapján 0,9-nek vettük. Ez ugyanaz az érték, mint ami Wilson és munkatársai [Biochem, 18: 2192-2196 (1979)] szerint a DNS kondenzálásához szükséges, Gosule és munkatársai azon korábbi megfigyelésével [J Mól Bioi, 121: 327-337 (1978)] összhangban, hogy nagy DNS-koncentrációknál a kondenzálást aggregáció kíséri. Feltéve, hogy az aggregációs ponton [DNS-spm] = y[DNS]össz, és [lipid-spm] = a görbe eltolódása, használható a

K_DNs/Kii_Pid = [γ/(1 -γ)] x [(Lipid_ÖSSz - eltolódás)/(eltolódás)] egyenlet. Ha úgy vesszük, hogy Lipid_ÖSSz értéke a liposzómák felületén jelenlévő negatív töltésű lipid összes koncentrációjának egynegyede, akkor a látszólagos egyensúlyi állandó 178 lesz, vagyis a spermin sokkal hajlamosabb a DNS-hez kötődni, mint a lipidekhez. A kötési állandók aránya és a jobb oldali első tényező állandó. Ezért a jobb oldali utolsó tényező bármilyen lipidkoncntráció, így az emulziókban al

73.280/SM

- 38 kalmazott legnagyobb tényleges koncentrációk mellett is használható a DNS kondenzációjára vonatkozó sperminmeghatározási görbe eltolódásának kiszámítására.

A 3. ábra adatai azt mutatják, hogy a liposzómák jelenléte csak kis mértékben tolja el a DNS-aggregációs görbét. Például a 250 μΙ kiindulási emulzióban körülbelül 0,6 mM spermin kellett a plazmid DNS kondenzálásához, míg az itt alkalmazott mennyiségű N-C12 DOPE jelenlétében ehhez 0,85 mM lett volna elegendő. Tehát feltételezhető, hogy ezen készítményekben a plazmid DNS-t valóban könnyen, a liposzómákat destabilizáló negatív töltésű lipidek semlegesítésének komplikációja nélkül lehet kondenzálni.

5. példa - Liposzómaminták fénvmikroszkópos vizsgálata

Vizsgáltuk a DNS liposzómákba történő kapszulázása előtti kondenzációt. Az oldat turbiditásának nagy mértékű változása alapján masszív aggregáció ment végbe. Ez nem volt váratlan, mert ilyen problémákról beszámoltak a szakirodalomban. A plazmid-aggregátumok fénymikroszkópos vizsgálatához (1. ábra) 200 pg pZeoLacZ plazmidot 125 μΙ LSB-ben óvatosan összekevertünk 7 mM spermint tartalmazó 125 pl LSB-vel, és 15 percig inkubáltuk.

A mikroszkópos vizsgálat (1 A. ábra) azt mutatja, hogy az aggregátumok általában sokkal nagyobbak 1 pm-nél, sok esetben még 5-10 pm-nél is nagyobbak. Az aggregátumok nagy méretét a krio-elektronmikroszkópos vizsgálatok (1B. ábra) is megerősítették. Ebben a nagyításban különös figyelmet érdemel a szálak szabályos elrendezése, amit talán az okoz, hogy a spermin által előidézett kondenzáció egy részlegesen rendezett szerkezetet hoz létre. Néhány hajlított pálca is előfordult, ezek toroid szerkezetek kezdetére utalnak, de nem teljes toroidok. Az ily módon előállított aggregátumok túl nagyok voltak egy szállító rendszerben történő alkalmazáshoz.

73.280/SM

- 39 A DNS-t tartalmazó, 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómák méretének meghatározásához (5. ábra) 269 ± 7 nm átlagos átmérőjű polisztirol gyöngyöket (Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA) mikroszkópos vizsgálatra alkalmas koncentrációra hígítottunk vízzel, és a DNS-t tartalmazó 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákat extrudálás és dialízis után további hígítás nélkül alkalmaztuk (körülbelül 20 mM lipid). A mintákat Olympus BH-2 fluoreszcencia-microszkóp (Olympus, Lake Success, NY) alatt 1000-szeres nagyításban vizsgáltuk.

Az eredmények az 5. ábrán láthatók. A DNS-t tartalmazó liposzóma-részecskék ilyen nagyításban viszonylag egyenletes méretűnek és alakúnak látszottak, és a minta részecskéinek közelítő mérete igen hasonlónak tűnt ahhoz, amit dinamikus fényszórási vizsgálatokkal mértünk. Ennek a DNS-t tartalmazó liposzóma-mintának a részecskéit a sperminnel aggregált DNS-ével (1A. ábra) összehasonlítva láthatjuk annak az eljárásnak az előnyeit, hogy a DNS-t a liposzómák kialakítása előtt a találmány szerinti módon reverz micellákba kondenzáljuk. Itt nem jelentek meg azok a nagy aggregátumok, amelyeket akkor észleltünk, mikor a spermin a vizes oldatban közvetlen kölcsönhatásba lépett a DNS-sel, ami azt mutatja, hogy az emulziós kondenzálási eljárás valószínűleg nagy mértékben gátolja az ilyen aggregációt.

6. példa - Részecskeelemzés fényszórással

Az N-C12 DOPE/DOPC készítményeket kvázi-elasztikus fényszórással jellemeztük. A részecsekeméret-elemzést Nicomp 370 részecsekeméret-elemző készülékkel (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) végeztük. A mintákat az elemzéshez körülbelül tízszeresre hígítottuk. Buborékos mérési módban Gauss-elemzést végeztünk, és megadtuk a szám szerinti átlagértékeket. A 3. példa szerinti módon előállított, sperminnel kondenzált pZeoLacZ plazmid DNS adataihoz olyan Gauss

73.280/SM

- 40 féle méreteloszlási görbe illeszthető, amelynél a részecsekeméret szám szerinti átlaga 222,6 nm.

7. példa - Faqyasztva-töréses TEM (transzmissziós elektronmikroszkópia)

A kapszulázott DNS-t tartalmazó fuzogén N-C12 DOPE/DOPC készítményeket a továbbiakban fagyasztva-töréses TEM-mel vizsgáltuk, körülbelül 2 μΙ mintát két Blazer vörösréz replikáié (felületi lenyomatot készítő) tartó közé helyezve folyékony propánban lefagyasztottunk. A mintát -100°C-on, 10 -10' nyomáson feltörtük, és egy Balzers BAF 400 fagyasztva törő berendezésben platina- (<45°C) és széngőzöléssel árnyékoltuk. A replikátumokat 5 % fehérítővel egy éjszakán át marattuk, majd desztillált vízzel lemostuk, és egy 0,05 mm lyukbőségű (300 mesh) rácsra szereltük. A felvételekhez Philips 300 TEM készüléket alkalmaztunk.

Az eredmények a 6. ábrán láthatók. A részecskék többsége a NICOMP eredményekkel összhangban kis méretű (400 nm-nél kisebb). Ezzel a módszerrel a meghatározó törési sík miatt a lipid kettősrétegek ellenére ritkán figyelhető meg a belső tartalom. Úgy tűnik azonban, hogy néhány részecske olyan kapszulázott szerkezeteket mutat, amelyek megfelelhetnek a kondenzált DNS-nek.

8. példa - Faqyasztásos transzmissziós elektronmikroszkópia

A fagyasztásos (krio-) elektronmikroszkópiát a készítmények liposzómás természetének bizonyítására és arra alkalmaztuk, hogy esetleg láthatóvá tegyünk valamit a kapszulázott anyagból. Az EPC mintához és a sperminnel aggregált DNS-hez egy porózus szén hordozóanyaggal bevont rézhálókat alkalmaztunk további kezelés nélkül. A DNS-tartalmú, 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzóma-mintákhoz a porózus szénfilmmel bevont elektronmikroszkóp-hálókat egy csepp 0,1 mM polilizinoldat rácseppentésével pozitívvá tettük, és egy percig állni hagytuk. Ezután a

73.280/SM

- 41 polilizint letöröltük, a hálót néhány csepp desztillált vízzel, majd néhány csepp mintapufferrel leöblítettük. A minta egy 5 μΙ-es aliquot részét a hálóra helyeztük, vékony filmmé szétkentük, majd azonnal bementettük folyékony etánba. A hálókat a felhasználásig folyékony nitrogénben tároltuk. A mintákat egy 120 kV gyorsítófeszültségen működő Philips CM12 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Mahwah, NJ) vizsgáltuk. A mintákat a képalkotás során egy 626 (Warrendale, PA) típusú fagyasztó mintatartóval -177°C és

-175°C közötti hőmérsékleten tartottuk. A lyukak fölötti területekről kis elektrondózissal elektronmikroszkópos felvételeket készítettünk. 35000-szeres vagy 60 000-szeres nagyítást alkalmaztunk, az aláfókuszálás körülbelül 1,8-2,5 μm volt.

Az eredmények a 7. árán láthatók. Mikor a spermint kihagytuk az N-C12 DOPE/DOPC liposzómák előállításából, főleg unilamellás, viszonylag kicsi, de szerkezetileg heterogén liposzómák voltak észlelhetők (7a. ábra), a Nicomp elemzéssel összhangban. Sok liposzóma csőszerű volt, valószínűleg az előállítási eljárás folyamán fellépő ozmotikus gradiens következtében. Néhány liposzóma szálas belső szerkezeteket mutatott, ezek valószínűleg a kondenzálatlan DNS-t képviselik (bal oldali nyíl). Kapszulázatlan szabad szálak is láthatók (jobb oldali nyíl).

Asperminnel készített, DNS-t tartalmazó N-C12 DOPE/DOPC liposzómaminták (7b. és c. ábra) méretüket, alakjukat és lamellaritásukat tekintve szintén heterogének voltak. Néhány részecske normál liposzómának látszott, kapszulázott anyag nem volt látható bennük. Más liposzómák viszont elektronikusan sűrű, jól definiált toroid szerkezeteket tartalmaztak (nyilakkal jelölve a 7b. ábrán), ilyenek a spermin nélkül készített mintákban nem voltak láthatók. Ezek a szerkezetek nem voltak öszszefüggésben azzal, hogy milyen lipidet alkalmaztunk, mert a tojás PC-t tartalmazó készítményekben, amelyek a krioelektronmikroszkópos mintakészítési körülmények között stabilabbak voltak, szintén találtunk toroid (7c. ábra, jobb oldali nyíl) és hajlított

73.280/SM

- 42 pálca (7c. ábra, bal oldali nyíl) szerkezeteket. A pálcákon és toroidokon belül a vékony vonalak közötti távolság egyenletes és lényegesen kisebb volt, mint két membrán közötti távolság a multilamellás liposzómákban (*-gal jelölve). Ezek a toroid szerkezetek nagyon hasonlók azokhoz, amelyeket a Chattoraj és munkatársai észleltek [J Mól Bioi, 121: 327-337 (1978)] a szabad DNS-t sperminnel kondenzálva, vagy amelyeket Arscott és munkatársai [Biopolymers, 30: 619-630 (1990) valamint Gosule és Schellman [J Mól Bioi, 121: 327-337 (1978)] állítottak elő híg oldatokban más kondenzálószerek alkalmazásával. A pálcák és toroidok belsejében látható párhuzamos és koncentrikus vékony vonalak a plazmid aggregátumokban látottakhoz (1b. ábra) is hasonlók.

Egyes toroid szerkezetek körül tisztán láthatók a membránok (például a 7b. ábrán). Valószínű, hogy minden megfigyelt toroid egy ionzáró gáttal van körülvéve, mert a kondenzált DNS-t tartalmazó toroidok nem tudnának megmaradni a nagy sótartalmú pufferben, amelyben végül a liposzómákat szuszpendáltuk. Tehát úgy látszik, hogy ezen készítmények nagy része liposzómákba kapszulázott plazmid DNSből áll.

9. példa - Agarózgéles elemzés

Sperminnel és kontrollmintaként spermin nélkül készített, liposzómákba kapszulázott plazmid DNS agarózgél-elektroforézisével vizsgáltuk a plazmid DNS védelmét a DNáz-emésztéstöl. A kívánt készítmény egy 50 μΙ-es aliquot részét 145 μΙ, kalcium- és magnéziumionoktól mentes HBSS-sel hígítottuk, és keverés közben hozzáadtunk 1 μΙ 0,2M magnézium-klorid-oldatot és 2 μΙ (20 egység) DNázt. A reakcióelegyet 6 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a reakciót 2 μΙ 0,5M etilén-diamin-tetraecetsav-oldat hozzáadásával leállítottuk. Emésztetlen összehasonlítok előállítására minden mintából egy 50 μΙ-es aliquot mennyiséget 150 μΙ, kalcium

73.280/SM

- 43 és magnéziumionoktól mentes HBSS-sel kevertünk össze. Ezután a mintákat a Sambrook és munkatársai [Molecular cloning: A laboratory manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, pp B4-B5 (1989)] által leírt módon fenol, kloroform és izoamil-alkohol elegyével extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A csapadékot 20 μΙ pH = 8-as TE pufferben oldottuk, és az oldatból 5 μΙ-t 0,8 %os agarózgélre vittünk fel. A géleket SYBR Green I nukleinsav-gélszínezék törzsoldat (Molecular Probes) 1:10000 arányú hígításával 30 percig festettük, majd egy FotoSpectrum® ultraibolya átvilágító berendezéssel („lightbox”) tettük láthatóvá. A lightboxról Polaroid MP 4+ kamerával felvételeket készítettünk. Ezeket a felvételeket ScanJet IIC készülékkel beszkenneltük, (Hewlett Packard, Palo Alto, CA), és Aldus Photostyler -rel (U-Lead Systems, Torrance, CA) digitalizáltuk.

A 4. ábra azt mutatja, hogy mindkét készítmény jelentős védelmet adott, illetve jól látható kapszulázódást eredményezett.

10. példa - Mennyiségi elemzés

A DNS védelmének mennyiségi meghatározására mindegyik minta aliquot mennyiségéből extraháltuk és egy fluoreszcens vizsgálattal mértük a DNS-t. A 9. példa szerinti fenol/kloroformos eljárással extrahált DNS mennyiségi meghatározására a Haugland [Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 6^th ed. Molecular Probes, Inc., pp161-162 (1996)] által leírt PicoGreen fluoreszcenciás módszert alkalmaztuk. 20 ml pH = 7,5-es TE pufferhez 100 μΙ PicoGreen törzsoldatot (Molecular Probes) adva egy munkaoldatot készítettünk. Az extrahált mintát először pH = 7,5-es TE pufferrel százszorosra hígítottuk, majd a hígított minta egy 14 μΙ-es aliquot részét 986 μΙ pH = 7,5-es TE pufferrel és 1 ml PicoGreen munkaoldattal kevertük. A keveréket sötét szobában, szobahőmérsékleten 4 percig inkubáltuk. A PicoGreen fluoreszcenciát szobahőmérsékleten egy PTI Alphascan fluorométerrel

73.280/SM

- 44 (South Brunswick, NJ), 480 nm gerjesztési és 520 nm emissziós hullámhosszon, egy >500 nm-es felüláteresztő szűrő (Schott Glass Technologies, Duryea, PA) alkalmazásával mértük. Vakpróbaként egy 1 ml 7,5-es TE pufferből és 1 ml PicoGreen munkaoldatból álló keverék fluoreszcenciáját alkalmaztuk. A DNáz I emésztéstől védett DNS százalékos értékének kisámításához a mért értékből kivontuk a vakpróbát, és az emésztetlen minta értékét vettük 100 %-nak. Az általunk alkalmazott kísérleti körülmények között az emésztett DNS-ből származó fluoreszcenciás jel elhanyagolható volt.

A sperminnel készített minta 10,1 ± 5,6 %-os plazmidvédelmet mutatott, míg a spermin nélküli mintában 19,0 ± 4,5 % volt védett.

11. példa - Transzfekciós elemzés

Ezután a pEGFP C1 plazmid DNS kapszulázásával előállított liposzómakészítményektranszfekciós aktivitásátvizsgáltuk. OVCAR3 sejteket 1 x 10⁵ sejt/ml sűrűséggel 24-lyukú mikrotiter lemezekre vagy 2 x 10⁵ sejt/ml sűrűséggel 96-lyukú mikrotiter lemezekre oltottunk, lyukanként 1 ml illetve 0,1 ml, 10 % hővel inaktivált magzati borjúszérum-albumint tartalmazó RPMI 1640-ben. A sejteket a transzfektálás előtt két napig (40-48 órán át) szaporítottuk; ebben az időpontban a sejtek már összefüggő felületet alkottak. A transzfekciós oldatokat a megfelelő liposzóma- vagy DNS-minták szérummentes közeggel végzett hígításával állítottuk elő. A lemezekről a közeget leszívattuk, azután Dulbecco foszfátpufferes sóoldattal egyszer átmostuk.

A transzfekciós oldatokat (a 24-lyukú lemezekhez lyukanként 0,5 ml, a 96lyukúakhoz lyukanként 0,1 ml) a pEGFP C1 plazmidot tartalmazó minták szérummentes közegben végzett tízszeres dialízisével állítottuk elő (körülbelül 2 mM összes lipid, hacsak másképp nem adjuk meg), majd betöltöttük a lyukakba, és 37°C-on 3

73.280/SM _ 45 - ·“ **· — ^r órán át inkubáltuk. Ezután a lyukakat leszívattuk, és minden lyukhoz 10 % hővel inaktivált magzati borjúszérum-albumint tartalmazó közeget adtunk. Minthogy Tang és munkatársai [Human Gene Therapy, 8: 2117-2124 (1997); Dion és munkatársai [Virology, 231: 201-209 (1997)] már korábban kimutatták, hogy a transzgének a CMV promoter hatása alatt „elnémulnak, az expresszió fokozására mindegyik lyukhoz 5 μΜ trichostatin A hiszton-dezacetiláz inhibitort adtunk. A két utolsó ábrán bemutatott kísérletekben ehelyett egy másik hiszton-dezacetiláz inhibitort, 5 mM nátrium-butirátot alkalmaztunk.

Egy sejttenyészet-inkubátorban 37°C-on 18-22 órán át végzett inkubálás után a közeget leszívattuk, és a lemezeket Dulbecco PBS 0,5 ml-es aliquot mennyiségeivel átmostuk. A mintákról még a tenyésztő lemezeken fényképfelvételeket készítettünk egy Olympus IMT-2 inverz mikroszkóppal, 10x objektív alkalmazásával. A PBS-t leszívattuk, és minden lyukhoz hozzáadtunk 0,5 ml (a 96-lyukú lemezeknél 0,1 ml) 5 μΜ kalceinkék-acetoxi-metil-észtert (CBAM) PBS-ben, és a lemezeket szobahőmérsékleten 40 percig inkubáltuk. A sejteket ismét átmostuk PBS-sel, leszívattuk, és minden lyukhoz hozzáadtunk 0,5 ml (a 96-lyukú lemezeknél 0,1 ml) 1 %-os C12 E8at pH = 8,0-as TE pufferben.) PBS-ben. Ezután a mintákat detergensben oldottuk, és mértük a korrigált összes EGFP fluoreszcenciát, amit az élő sejtek teljes számában kifejezve adtunk meg. A lemezek fluoreszcenciáját fluoreszkáló lemezek leolvasására szolgáló Cytofluor II készülékkel (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) mértük. Az élő sejtekbe bevitt kalceinkéket 360 nm gerjesztési és 460 nm-es emiszsziós hullámhosszon mértük 80 %-os erősítéssel. A leolvasott értékek az összefüggő sejtfelület kialakulásának szintjéig lineáris összefüggést mutattak a lemezre eredetileg ráoltott sejtek számával. A 10. ábrán látható eredményeket egy, a külső DNS-töl a 12. példa szerinti módon elválasztott liposzóma-üledékkel kaptuk. Minthogy a kalcium- és magnéziumionok szintje az RPMI 1640-ben sokkal alacsonybb, mint a szé

73.280/SM . 46 - - *’· rumban, a 11. és 12. ábrán látható eredményeket úgy kaptuk, hogy a szérummentes közeget a transzfekció során kalcium- és magnéziumionok hozzáadásával 1,2 illetve 0,8 mM koncentrációra egészítettük ki.

Az egységnyi sejtfehérjére eső EGFP fluoreszcencia közelítő értékének kiszámításához OVCAR-3 sejtek 24- illetve 96-lyukú mikrotiter lemezeken 48 órán át szaporított és 1 % Triton-100 detergenssel extrahált tenyészetében mérjük az átlagos fehérjekoncentrációt. Összehasonlítóként egy bicinchoninsavas (Pierce Chemical, Rockford, IL) vizsgálatot alkalmaztunk borjúszérum-albuminnal. A 9. ábra „a” oszlopában az összes fluoreszcencia háttér-korrigált átlagértéke lyukanként 670 egység. Egy másik lemezen az összes sejtfehérje átlagértéke a transzfekció időpontjában (48 óra) lyukanként körülbelül 88,4 pg, ami azt jelenti, hogy a 24-lyukú lemezeken végzett kísérletekben 1 μg sejtfehérje 0,5 ml-es térfogatban 7,6 egységnyi fluoreszcenciát adott. A 10. ábra „a” oszlopában (96-lyukú lemezen végzett kísérlet) a fluoreszcencia háttér-korrigált átlagértéke lyukanként 420 egység, az összes sejtfehérje átlagértéke körülbelül 27 pg, tehát 1 pg sejtfehérje 0,1 ml-es térfogatban 15,5 egységnyi fluoreszcenciát adott. A 11. ábra „a” oszlopában (96-lyukú lemezen) a mért érték 103 fluoreszcencia-egység/pg sejtfehérje.

Az intraperitoneális (hashártyába történő) bevitel modellezésére (11. és 12. ábra) a transzfekciót úgy hajtottuk végre, hogy a fenti módon tenyésztett OVCAR-3 sejteket tartalmazó 96-lyukú mikrotiter lemez minden kiszívatott lyukához először hozzáadtunk tumoros SCID (súlyos kombinált immunhiányos) egerek tömény, sejtmentes hashártyaűri mosófolyadékából (13. példa) 50 pl-t. Ezután minden lyukhoz 50 pl-t adtunk a 3. példa szerinti módon előállított N-C12-DOPE/DOPC liposzómaDNS készítményből, így a lipid végkoncentrációja körülbelül 10 mM, a kapszulázott DNS-é pedig körülbelül 7-14 pg/ml lett (összes DNS: 67 pg/ml). Az inkubálást a fenti módon hajtottuk végre. Ebben az esetben a hashártyaűri mosófolyadék Ca²⁺- és

73.280/SM

- 47 Mg²⁺-ionkoncentrációját egy tömény törzsoldat hozzáadásával 1,2 illetve 0,8 mM-ra állítottuk be. A liposzómás DNS-oldat Ca²⁺- és Mg²⁺-ionkoncentrációját a tömény törzsoldattal ugyanezen értékekre állítottuk be közvetlenül azelőtt, hogy a liposzómákat a sejtekhez adtuk.

A 7. és 8. ábrán látható adatok azt mutatják, hogy a sperminnel kondenzált plazmid DNS-t kapszulázva tartalmazó 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzóma- készítmény aktívnak bizonyult az OVCAR-3 sejtek transzfektálásában. Az eredmények azt mutatják, hogy az aktivitás függ a spermin kondenzálószer jelenlététől és a plazmid DNS-nek a liposzómákba történő kapszulázásától. A 10. ábrán látható adatok is azt mutatják, hogy a transzfekciós aktivitás a liposzómákba kapszulázott DNS-től, nem pedig a szabad, külső DNS-től függ. A 11. és 12 ábra adatai azt mutatják, hogy a transzfekció az OVCAR-3 tumorok intraperitoneális helyein található, esetlegesen zavaró hatású anyagok (például szérumfehérjék) jelenlétében is végbemehet.

12. példa - Plazmid DNS- és lipid részecskék szedimentációia

A kapszulázott plazmid DNS transzfekciós aktivitásának kimutatására a szabad plazmid DNS-t el kellett választani a liposzómába kapszulázott DNS-től. Erre az alábbi eljárást alkalmaztuk. Az eltávolított külső DNS-re végzett kiülepítésével kapott liposzómákat használtuk a vizsgálatokhoz, amelyek eredményei a 10. ábrán láthatók. A szedimentációs kísérletekhez a 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómamintákat a 3. példa szerinti módon sperminnel készítettük, azzal az eltéréssel, hogy a 200 mM szacharózt az LSB-ben alkalmaztuk. Hozzáadtunk továbbá fejcsoportban megjelölt lisszamin-rodamin B - foszfatidil-etanol-amint (Rh-PE) is 10 gg/ml lipid szonda alakjában. A készítményből egy 500 ml-es aliquot mennyiséget 16000 g-vel 3 órán át centrifugáltunk. A felülúszó eltávolítása után az üledéket kalci

73.280/SM

- 48 um- és magnéziumionoktól mentes HBSS-ben szuszpendáltuk. A szuszpenziót 16000 g-vel 3 órán át centrifugáltuk, majd az üledéket kalcium- és magnéziumionoktól mentes HBSS-ben szuszpendáltuk. Mindegyik frakcióból 50 μΙ-es aliquot részeket vettünk DNáz l-es emésztéshez (9. példa). Fenol/kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után minden aliquot részben PicoGreen vizsgálattal, a 10. példa szerinti módon mértük a plazmid DNS-t, és ezt használtuk fel az egyes frakciók védett plazmid százalékának és összes plazmid DNS százalékának kiszámítására.

A lipideloszlás meghatározására minden frakcióból egy 40 μΙ-es aliquot részt 0,2 %-os Ci₂E₈-ban, 2 ml össztérfogatban oldottunk, és a fluoreszcenciát 560 nm gerjesztési hullámhosszon egy 550 ± 20 nm-es sávszűrő (Melles Griot, Irvine, GA) alkalmazásával 590 nm emissziós hullámhosszon mértük. Összehasonlítóként üres 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákat is készítettünk a fenti módon. Dialízis után 500 μΙ mintához 100 μg EGFP plazmidot adtunk. Ezután a mintát centrifugáltuk, és meghatároztuk benne a lipid és plazmid DNS mennyiségét.

Ilyen körülmények között a lipidnek körülbelül 80 %-a, míg az összes DNS-nek csak körülbelül 14 %-a ülepedett ki. A kiülepített anyag transzfekciós aktivitása a 10. ábrán látható. A transzfekciós aktivitás nyilvánvaló összefüggésben áll a lipid üledékkel, vagyis a liposzómákba kapszulázott DNS-sel.

13. példa - Mosófolvadék

Annak vizsgálatára, hogy az intraperitoneális fehérjék hogyan hatnak a találmány szerinti készítmények transzfekciós aktivitására, mosófolyadékot állítottunk elő az alábbiak szerint. Egy SCID egérből OVCAR-3 sejtek beinjektálása után 3 héttel 6 ml sejtmentes HBSS mosófolyadékot vettünk, és 10000 mw-os zárt forgó bepárlóban 1 ml-re bepároltuk. A fehérje-kinyerés körülbelül 60 %. Ezt a folyadékot, amely HBSS-ben körülbelül 10 mg/ml fehérjét tartalmazott, Ca2+ és Mg2+ hozzáadásával a

73.280/SM

- 49 normális szérumszintre egészítettük ki, OVCAR-3 sejttenyészethez adtuk, és gyengéden összekevertük annyi azonos Ca/Mg-szintű HBSS-es liposzóma-oldattal, hogy a lipid végső koncentrációja 10 mM legyen.

Ezen transzfekciós kísérletek eredményei a 11. és 12. ábrán láthatók. Annak ellenére, hogy a szérumfehérjék ismert módon gátolják a transzfekció hatékonyságát, a találmány szerinti módon előállított készítmények alkalmazásával még ilyen körülmények között is jelentős mértékű maradt az aktivitás.

13. példa - A liposzómák töltésének hatékonysága

Összehasonlítottuk egy előkondenzált DNS-t alkalmazó módszer és a találmány szerinti módszer liposzómatöltési hatékonyságát. Liposzómákat állítottunk elő az Ibanez és munkatársai [Biochem Cell Bioi, 74: 633-643 (1996)] által leírt módon. pEGFP plazmid DNS-t 66 pg/ml koncentrációban TS pufferben (10 mM Tris, 1 mM nátrium-klorid, pH=7,0) oldottunk. Ebből az oldatból 2 ml-t a DNS elökondenzálására 2 ml 23 mM TS pufferes spermin-oldattal kevertünk, így egy erősen zavaros oldatot kaptunk. Ezt egy éjszakán át 4°C-on tároltuk. Másnap összesen 9 μmol lipidet 1 ml dietil-éterben oldottunk. Ezt vortex-keverés nélkül hozzáadtuk 330 μΙ spermidines DNS-oldathoz. Rögtön ezután a keveréket háromszor 5 másodpercig ultrahanggal kezeltük (Laboratory Supply sonicator#G112SOI), majd a liposzómák kialakítására a dietil-étert rotációs bepárlóban 37°C-on eltávolítottuk. Mindegyik lipidkészítményhez négy ilyen mintát készítettünk. A liposzómákat 200,000 g-vel 30 percig ülepítettük. A felülúszót eltávolítottuk, majd további 500 μΙ TS puffer hozzáadásával a centrifugálást megismételtük. Három teljes ciklus után a liposzómákat 0,45 pm pórusméretű MF membránokon át extrudáltuk. Ezen a ponton a liposzómákat felhasználtuk a kapszulázás mértékének meghatározására, illetve egy részüket kalcium- és magnéziumionoktól mentes Hank-féle kiegyenlített sóoldattal szemben dializáltuk. Össze

73.280/SM

- 50 hasonlítóként a 3. példa szerinti módon is állítottunk elő liposzómákat. A DNS kapszulázását a 9. és 10. példában leírt módon mértük. Minden emésztést 6 órán át végeztünk. A lipidkoncentrációt nagynyomású folyadékkromatográfiával mértük. A koleszterin kivételével minden komponens meghatározásához Waters Sherisorb 3 pmes szilícium-dioxiddal töltött oszlopot, mozgó fázisként acetonitril, metanol és kénsav 100:3:0,05, elegyét, a detektáláshoz pedig UV-elnyelést alkalmaztunk. A koleszterint Phenomenex Luna C18 oszlopon (5 pm) mértük, ehhez mozgó fázisként 96:4 arányú methanohvíz-elegyet, a detektáláshoz pedig egy elasztikus fényszórás-detektort alkalmaztunk. A vizsgált lipidkészítmények az alábbi táblázaton láthatók.

73.280/SM

1. Táblázat

DNS/lipid arány (μ9 DNS / μ mól összes lipid)*

Készítmény	Emésztés előtt	Emésztés után

Irodalmi adatok**
EPC:CHOL (1:1)	1,00
EPC:agyi PS:CHOL (4:1:5)	2,87
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	2,64
EPC:kardiolipin:CHOL (5:1:4)	2,53

Kis sótartalmú (10 mM) Tris:
EPC:CHOL (1:1)	0,52	0,07
EPC:agyi PS:CHOL (4:1:5)	0,70	0,01
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	0,48	0,04
EPC:kardiolipin:CHOL (5:1:4)	0,78	0,09

Izotóniás só elkészítés után:
EPC:CHOL (1:1)	0,42	0,10
EPC:agyi PS:CHOL (4:1:5)	0,78	0,08
EPC:EPA:CHOL (4:1:5)	1,63	0,16
EPC:kardiolipin:CHOL (5:1:4)	0,65	0,20
TLC 70:30 készítmény	6,53	0,59

* Lipid-visszanyerés mérése HPLC-vel. DNS mennyiségi meghatározása extrakcióval és PicoGreen vizsgálattal.

** Ibanez, M., Gariglio, P., Chavez, P., Santiago, C.W. and Baeza, I. (1996) „Spermidine-condensed DNA and cone shaped lipids improve delivery and expression of exogenous DNA transfer by liposomes (A spermidinnel kondenzált DNS és kúp alakú lipidek javítják az exogén DNS liposzómás szállítását és expresszióját) [Biochem Cell Bioi. 74: 633-643 (1996)].

73.280/SM

- 52 A találmány szerinti módon, a DNS emulzión belüli kondenzálásával készített liposzómákban a DNS:lipid arány sokkal nagyobb volt, mint az előkondenzált DNSsel készített liposzómákban.

15. példa - Liposzómák lamellaszámának meghatározása

70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC-ből álló és a belsejükben plazmid DNS-t tartalmazó liposzómákat állítottunk elő a 3. példában leírt módon, majd ezeket a 12. példa szerinti módon ülepítettük és mostuk. A liposzómák egy, az összes lipidtartalom 0,5 mól%-át kitevő NBD szondát is tartalmaztak. A liposzómákat egy fluorméter küvettájában, keverés közben, foszfáttal pufferolt sóoldattal 80 pmol öszszes lipidkoncentrációra hígítottuk. Az NBD fluoreszcenciát 450 nm gerjesztési hullámhosszon és 530 nm emissziós hullámhosszon mértük. A liposzómákat tartalmazó küvettába a megvilágított NBD szonda redukálására annyi nátrium-ditionitot injektáltunk, hogy végkoncentrációja 20 mM legyen. A 13. ábrán látható, hogy az NBD-jel körülbelül 50-55 %-ban eltűnt, ami azt mutatja, hogy a készítményben a liposzómák nagyrészt unilamellásak, vagyis a lipidszondáknak körülbelül a fele volt kitéve a membránon áthatolni nem képes redukálószer, a nátrium-ditionit redukáló hatásának.

16. példa - Szubkután humán tumor transzfektálása SCID egérben intrtumorális injekcióval

SCID egérbe 2x10⁶ humán OVCAR-3 sejtet injektáltunk szubkután, és néhány hétig, körülbelül 4-7 mm átlagos átmérő eléréséig növekedni hagytuk.

Spermint, pEGFP-C1 plazmidot, 70 mol% N-C12 DOPE-t és 30 mol% DPOC-t tartalmazó liposzómákat állítottunk elő a 3 példában leírt módon. A liposzóma

73.280/SM

- 53 membránok 0,5 mol% Rodamin-PE-t is tartalmaztak fluoreszkáló liposzómamarkerként.

0,11 ml, körülbelül 40 mM összes lipidkoncentrációjú, kalcium- és magnéziumionoktól mentes Hank-féle kiegyenlített sóoldattal (HBSS) készített liposzóma-oldatot injektáltunk egyenesen a tumorok közepébe, miután a kalcium- és magnéziumionok szintjét 1,2 illetve 0,8 mM-ra állítottuk be. Egy nappal később ugyanezen helyekre 0,11 ml 20 mM HBSS-es nátrium-butirát-oldatot injektáltunk. 24 óra elteltével a tumorokat kimetszettük, és lefagyasztottuk. Később egy -20°C-os kriosztát berendezés alkalmazásával 14-30 μιτι vastagságú metszeteket készítettünk, ezeket fagyott állapotban üveg fedőlemezekre helyeztük, és egy másik fedőlemezzel rögzítettük. A fagyasztott tumorminták összeállítását O.C.T. ágyazóközegben végeztük.

A pEGFP-C1 plazmid transzgén expresszióját a fixált, fagyasztott szövet 20 μm-es fagyasztott metszeteinek konfokális (közös fókuszú) mikroszkópos vizsgálatával mértük. A fagyasztott metszeteket Argon/Krypton lézerrel felszerelt Olympus BX50/ Biorad MRC 1000 konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk [az EGFP-nél gerjesztési hullámhossz (Ex) = 488 nm, emissziós hullámhossz (EM) = 515 nm; a rodaminnál Ex = 568 nm, Em = 585 nm]. A szövetmetszetekről 20x-szoros nagyítással készítettünk felvételeket. Az ábrákon látható képeket nem nagyítottuk, csak a színeket állítottuk be. A 14. ábrán két fluoreszcencia-kép látható egy pEGFP-C1 plazmiddal kezelt tumor szövetmetszetéről. Az alsó képen a rodaminnal jelzett liposzómákból eredő vörös fluoreszcencia látható. A nagyon erős (sárga) lipidjel azt mutatja, hogy ez a metszet nagyon közel volt a liposzóma-injekció helyéhez. A felső képen a transzgén expresszióból eredő zöld fluoreszcencia látható. Az expresszált plazmidból származó jel, amely majdnem - de nem egészen — egybeesik a lipid jelével, a plazmid tényleges expresszióját jelzi a tumorban. A 15. ábra két másik, különböző tumormetszetekből származó fluoreszcencia-képet mutat expresszált EGFP73.280/SM

- 54 vei. A 16. ábrán látható két fluoreszcencia-képet az összehasonlítóként használt tumor fagyasztásos metszetéből kaptuk. A felső képen a szövetre jellemző gyenge, szórt zöld fluoreszcencia látható, de egyetlen kontroli-metszetben sem találtunk erősen fluoreszkáló területet. Vörös fluoreszcencia sem fordult elő a kontroll tumormetszetekben.

17. példa - Eqérizom in vivo transzfekciója pZeoSVLacZ Plazmidot kapszulázottan tartalmazó 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómák transzfekciós aktivitását vizsgáltuk egér lábszárizmában in vivo. A liposzómákat a 3. példa szerinti módon állítottuk elő. A kísérlethez szabványos körülmények között tartott nőstény DBA egereket használtunk. A pZeoSVLacZ plazmidot tartalmazó liposzómákból az első napon 50 μΙ-t injektáltunk közvetlenül az egyik hátsó láb izmába. Az injekciót a comb közelében adtuk be. A másik láb vagy 50 μΙ pEGFP-C1 plazmidot tartalmazó liposzómát vagy semmi kezelést nem kapott. A második napon a liposzómával kezelt lábakba 50 μΙ 120 mM HBSS-es nátriumbutirát-oldatot injektáltunk. Az egereket a 3. napon leöltük, és a lábizmot négyféle metszet alakjában kioperáltuk: első láb, hátsó láb, első comb és hátsó comb. Mindegyik metszet egyik felét folyékony propánban azonnal lefagyasztottuk, a másik felet pedig 4 %-os paraformaldehid oldattal kezeltük, majd 30 %-os szacharóz-oldattal védve propánnal gyorsfagyasztottuk.

A 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómákkal bevitt pZeoSVLacZ plazmid transzgén-expresszióját a Clontech lumineszcens β-gal kit alkalmazásával vizsgáltuk. A fixálatlan izmot kiolvasztottuk, metszetekre vágtuk, és az alábbi módon homogenizáltuk. 1 mg nedves szövethez 15 ml lízis-puffert (9,15 ml dikáluim-hidrogénfoszfát, 0,85 ml káluim-dihidrogén-foszfát, 20 μΙ Triton X100,10 μΙ DTT) adtunk, 5 percig homogenizáltuk, majd szobahőmérsékleten 20 percig inkubáltuk. A mintákat a

73.280/SM

a.

- 55 szövettörmelék kiülepítésére 2 percig 14000/perc fordulatszámmal centrifugáltuk. A felülúszók aliquot részeit β-galaktozidáz aktivitásra vizsgáltuk a Clontech utasításai alapján. A fényt 60 perc múlva egy Berthold-féle lemez-luminométerrel mértük. Az azonos típusú izommetszetekre leolvasott értékeket átlagoltuk. Az eredmények a 17. ábrán láthatók. Az elülső combnál a β-galaktozidáz aktivitás jelentős növekedését tapasztaltuk a kontrollmintához viszonyítva. A hátsó láb és a hátsó comb szöveteiben enyhe emelkedést észleltünk.

Ezek az eredmények a 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzóma vektor alkalmazásával az egér izmához szállított pZeoSVLacZ piazmidok in vivo transzfekcióját és transzgén-expresszióját bizonyítják.

18. példa - Liposzomális kondenzált DNS és kationos lipoplex összehasonlítása

Kationos lipoplex előállítása:

A kationos lipidek és helper lipidek plazmid DNS-sel képzett komplexeit kevéssel a felhasználás előtt állítottuk elő. A Lipofectint a Gibco BRL-től (Grand Island, N.Y.) szereztük be. A Lipofectinhez a lipidet a DNS-sel végzett komplexképzés előtt önmagában, szérummentes közegben körülbelül 45 percig inkubáltuk a gyártó cég (Invitrogen) által ajánlott módon. Azonos térfogatú 4 pg/ml koncentrációjú DNS-t és 40 pg/ml koncentrációjú lipidet vagy azonos térfogatú 20 pg/ml koncentrációjú DNS-t és 200 pg/ml koncentrációjú lipidet - mindezeket szérummentes RPM3 1640 közegben - összekevertünk, a keveréket körülbelül 10-15 percig hagytuk inkubálódni, majd szövettenyésztő lemezek lyukaiba töltöttük. A kalcium- és magnéziumionok végső koncentrációját egy tömény törzsoldat hozzáadásával 1,2 illetve 0,8 mM-ra állítottuk be, majd rögtön ezután hozzáadtuk a lipoplexeket a sejtekhez. A Lipofectinhez alkalmazott lipid/DNS arány különböző arányokkal végzett optimalizáláson alapult.

73.280/SM

...· 4. —*

- 56 A DC-koleszterin/DOPE (4/6) komplexeket lényegében a Muldoon és munkatársai [Biotechniques 22, 162-167 (1997)] által leírt, fent ismertetetett módon állítottuk elő, és 15 percen belül felhasználtuk. Minden kísérletben az optimalizált DNS/lipid arányokat alkalmaztuk, tehát 4 pg/ml DNS-t azonos térfogatú, 100 pg/ml koncentrációjú lipiddel kevertünk.

Minden más komplexet egyazon gyártótól (Invitrogen) származó kationos lipidekkel vagy lipid-keverékekkel állítottunk elő. Ezeket a gyártó cég által ajánlott módon, egyszeres koncentrációban és az ajánlott lipid/DNS arányokkal készítettük. A transzfekciós analízist a 11. példában leírt módon végeztük.

Összehasonlítás kationos lipoplexekkel:

A külső DNS-től mentes ülepített liposzómákat azonos DNS-koncentrációkban hasonlítottuk össze a kationos lipoplexekkel a transzfekció szempontjából. Ezeket az adatokat a 2. táblázatban a liposzómás kezelésre vonatkoztatva adjuk meg (minden adatot nátrium-butirátos inkubálás után -Tang és munkatársai [Human Gene Therapy, 8: 2117-2124 (1997)]; Wheeler és munkatársai [Biochim BiophysActa 1280 (1996)] valamint Gruner és munkatársai [Biochem 24:2833-2842 (1984)] ismertetik a transzgén-expressziónak ezt a nem toxikus aktivátorát - és fiziológiai Ca²⁺ és Mg²⁺szinteken mértünk; minden adatot teljes intracelluláris észteráz-aktivitásra átszámítva normalizáltunk). A 2. táblázaton a N-C12 DOPE/DOPC liposzómákra a sejtek életképességét és transzfekcióját 1,0-nak vettük, vagyis az 1,0-nél nagyobb számok jelentik azt a szorzótényezőt, amellyel ezen paraméterek valamelyike nagyobb, mint a vizsgált rendszerben. A 70:30 arányú N-C12 DOPE/DOPC liposzómák transzfekciós aktivitása ilyen körülmények között általában azonos nagyságrendű volt a kationos lipoplexekre mért értékekkel. Egyes lipoplexek lényegesen kisebb, mások lényegesen nagyobb aktivitást mutattak. Különösen aktívnak bizonyultak a 3p-[N-(dimetil-amino-etán)-karbamoil]-koleszterint és a dioieoyil-foszfatidil-etanol

73.280/SM • · · · · ·«· ·· ·* · ···

- 57 amint (DC-chol/DOPE) tartalmazó lipoplexek. De mint minden kationos lipoplex, a kísérletekben alkalmazott sejttípusokra nézve ezek - főleg nagy koncentrációkban sokkal toxikusabbak, mint a liposzómák. Ezt mutatja a kisebb kalceinkék fluoreszcencia a lipoplexekkel végzett kezelés után (2. táblázat), valamint a kezelés után mikroszkóppal észlelhető lekerekített és felhasadt sejtek (itt nem láthatók). Egyes esetekben a kationos lipoplexek transzfekciós aktivitása magasabb koncentrációkban ténylegesen csökkent a liposzómákéhoz képest, valószínűleg toxicitásuk következtében. A liposzómákba kapszulázott DNS-nél semmiféle toxicitást nem észleltünk. Érdekes módon a liposzómás kezelés általában 10-30 %-kal megnövelte a végső kalceinkék fluoreszcenciát, valószínűleg azért, mert védelmet nyújt a szérummentes közegben végzett inkubálás hatásaival szemben.

Szövettenyészetekben a liposzómás plazmid DNS szállító rendszer viszonylag kis toxicitásának jelentősége nem teljesen nyilvánvaló, mert a transzfekció hatékonysága már a fenti kísérletekben alkalmazott, viszonylag alacsony DNS-szinteknél eléri a telítettségi értéket. In vivo viszont várhatóan egészen más a helyzet. A nem specifikus in vivo kötőhelyek nagy feleslege miatt nagyobb koncentrációjú DNS és/vagy többszörös injekció válhat szükségessé ahhoz, hogy a célsejtekben hatásos expressziót érjünk el. Ebben a helyzetben a kationos lipidek felhasználását korlátozhatja a toxicitásuk.

Ovcar-3 sejteket mosott liposzóma-üledékekkel (10. ábra) vagy azonos menynyiségű pEGFP-C1 plazmid DNS-sel képzett lipid komplexekkel szérummentes közegben 3 órán át inkubáltunk. Minden transzfekciót a 11. példa szerinti módon végeztünk, közben a kalcium- és magnéziumionok szintjét 1,2 illetve 0,8 mM-ra állítottuk be.

73.280/SM

2. Táblázat

Lipid/ keverék⁸	a sejtek relatív túlélése 2 gg/ml DNS^b	szórás (standard deviáció)	relatív transzfekció 2 μς/ΓηΙ DNS^bc	szórás	a sejtek relatív túlélése 10 μα/ml DNS^b	szórás	relatív transzfekció 10 pg/ml DNS^bc	szórás
1	0.631	0.078	0.619	0.203	0.313	0.011	0.942	0.222
2	0.651	0.084	0.987	0.216	0.401	0.009	0.794	0.207
3	0.639	0.059	0.833	0.272	0.352	0.006	1.186	0.267
4	0.739	0.078	1.655	0.382	0.297	0.017	1.327	0.395
5	0.618	0.070	0.096	0.064	0.460	0.011	0.091	0.024
6	0.704	0.077	1.050	0.224	0.366	0.008	1.182	0.266
7	0.660	0.069	0.096	0.030	0.431	0.008	0.802	0.231
8 (iipofectin)	0.708	0.089	1.651	0.381	0.139	0.014	0.325	0.077
9 (DC-chol/ DOPE)	1.095	0.101	4.930	0.991	0.383	0.032	2.451	0.627

^a A kationos lipid komplexeket az alábbi lipidekből állítottuk elő:

1) trisz[(2-glutaroil-4-amino-N-dioktadeci!-amin)-4'-(2,5-diamino-pentanoil-(2,5-diamino-propiletil)]-amin-trifluor-acetát és 2-amino-(2^, ₁2'-dimetil)-etil-metil-foszfonsav-O-oktadecil-(T-heptadecil)észter-trifiuor-acetát 1:1 arányú keveréke (Pfx-1);

2) 2,5-diamino-pentanoil-glicil-gicil-N-oktadecil-(T-heptadecil)-amid-trifluor-acetát (Pfx-2);

3) 2,5-diamino-pentanoil-[2',3’-bisz(3-amino-propil)]-2-amino-acetil-2-amino-acetil-N-oktadecil(T-heptadecil)-amid-trifluor-acetátés DOPE 1:1 arányú keveréke (Pfx-3);

4) 2-amino-(2',2'-dimetil)-etil-metilfoszfonsav-0-oktadecil-(1 '-heptadecil)-észter- trifluor-acetát és 2₁5-diamino-pentanoil-2-amino-acetil-N-dioktadecil-amid-trifluoride 1:1 arányú keveréke (Pfx-4);

5) 2₁5-diamino-pentanoil-[2,5-bisz(3-amino-propil)]-glutaroil-N-oktadecil-(r-heptadecil)-amidtrifluor-acetá és 2,5-diamino-pentanoil-[2,2,5₁5-tetra-3-(amino-propil)]-glicil-N-dioktadecil-amin-trifluoracetát 1:1 arányú keveréke (Pfx-5);

6) 2_l5-diamino-pentanoil-(2_l5-bisz-(3-amino-propil)]-1,2-diamino-etil-0-oktadecil-(T-heptadecil)karbaminsav-trifluorid és DOPE 1:1 arányú keveréke (Pfx-7);

7) bisz(2,5-diamino-pentanoil-[2,5- bisz-(3-amino-propil)]-cisztil-N-dioktadecil-amin]-diszulfidtrifluor-acetát (Pfx-8);

73.280/SM

8) lipofectin;

9) DC-kolesterin/DOPE 4/6.

^b Az eredményeket az N-acil-PE-tartalmú liposzómákhoz viszonyítva fejeztük ki, azokat 1,0-nek véve, vagyis a számok az egyes lipoplexek toxicitásának vagy aktivitásának szorzőszámát jelentik. A több kísérletből álló sorozatokhoz a 2) számú lipidet alkalmaztuk ősszehasonlítóként.

c A transzfekció hatékonyságát EGFP fluoreszcenciával határoztuk meg, mint a 11. ábrán, és korrigáltuk az összes sejt-észteráz aktivitásra, amit az összes kalceinkék fluoreszcencia mutat (lásd a 11. példát).

A szakmában jártasak előtt nyilvánvaló, hogy a találmány jól alkalmazható a kitűzött célok és az itt felsorolt valamint a benne rejlő további előnyök eléréséhez. A leírásban megadott vegyületek, kompozíciók, módszerek és technikák csak az előnyös megvalósítások bemutatására, illetve példaként szolgálnak, a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. Az átlagosan művelt szakemberek ezekben és más alkalmazásokban végrehajthatnak olyan változtatásokat, amelyek a leírás és a csatolt igénypontok által meghatározott oltalmi körbe beletartoznak.

73.280/SM

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy biológiai hatóanyag-komplex liposzómába történő kapszulázására, amely az alábbi lépésekből áll:

a) legalább egy amfipatikus lipidet egy vagy több szerves oldószerben feloldunk;

b) egy első vizes szuszpenziót, amely egy biológiai hatóanyagot tartalmaz, az

a) lépésben kapott lipidtartalmú szerves oldattal kombinálunk, így egy emulziót kapunk, amely a biológiai hatóanyagot és a lipidet tartalmazza;

c) a b) lépésben kapott emulzióhoz egy második vizes szuszpenziót adunk, amely egy komplexképző ágenst tartalmaz;

d) a c) lépésben kapott emulziót inkubáljuk, hogy a komplexképző ágens a biológiai hatóanyaggal érintkezve a lipiddel stabilizált vízcseppek belsejében kialakítsa a biológiai hatóanyag és a komplexképző ágens komplexét, amelynek átmérője nem nagyobb a vízcseppek átmérőjénél; és

e) a d) lépésben kapott szuszpenzióból a szerves oldószert eltávolítjuk, így kialakulnak a komplexbe vitt biológiai hatóanyagot és a lipidet tartalmazó liposzómák.
2. Eljárás egy biológiai hatóanyag-komplex liposzómába történő kapszulázására, amely az alábbi lépésekből áll:

a) legalább egy amfipatikus lipidet egy vagy több szerves oldószerben feloldunk;

b) egy első vizes szuszpenziót, amely egy komplexképző ágenst tartalmaz, az a) lépésben kapott lipidtartalmú szerves oldattal kombinálva egy emulziót képeznek, amely a komplexképző ágenst és a lipidet tartalmazza;

73.280/SM

- 61 .««* **♦ «··

c) a b) lépésben kapott emulzióhoz egy biológiai hatóanyagot tartalmazó második vizes szuszpenziót adnak;

d) a c) lépésben kapott emulziót inkubálják, hogy a komplexképző ágens a biológiai hatóanyaggal érintkezve a lipiddel stabilizált vízcseppek belsejében azoknál kisebb átmérőjű komplexet képezzen; és

e) a d) lépésben kapott szuszpenzióból a szerves oldószert eltávolítva kialakulnak a komplexbe vitt biológiai hatóanyagot és a lipidet tartalmazó liposzómák.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai hatóanyagként egy nukleinsavat alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleinsavként DNS-t alkalmazunk.

A meghatalmazott —-----------«wáWWjrifelO-, ^{37 s R G} * Ügyvivői Iroda

H 4062 Budapest, Andrássy út 113. Tetóoa: 461-1000 Fax: 461-1099

6' ^v . _Λ / C -_v. a < A

2 < a ^k '

I X ΙΛΛ.-:

73.280/SM