HUP0201423A2 - A novel type of transposon-based genetic marker - Google Patents
A novel type of transposon-based genetic marker Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0201423A2 HUP0201423A2 HU0201423A HUP0201423A HUP0201423A2 HU P0201423 A2 HUP0201423 A2 HU P0201423A2 HU 0201423 A HU0201423 A HU 0201423A HU P0201423 A HUP0201423 A HU P0201423A HU P0201423 A2 HUP0201423 A2 HU P0201423A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- nucleic acid
- mite
- tem
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 36
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 94
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 41
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 24
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 24
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 23
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 108020003564 Retroelements Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 claims description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 2
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 221
- 101000740462 Escherichia coli Beta-lactamase TEM Proteins 0.000 description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 44
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 31
- KEICUBJHMOUMBG-UHFFFAOYSA-N 2-(2-decyl-2-oxo-1,3,6,2$l^{5}-dioxazaphosphocan-6-yl)ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCP1(=O)OCCN(CCO)CCO1 KEICUBJHMOUMBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 241001299819 Hordeum vulgare subsp. spontaneum Species 0.000 description 14
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 3
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 3
- 210000000077 angora Anatomy 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 241001533099 Callanthias legras Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YREQHYQNNWYQCJ-UHFFFAOYSA-N etofenprox Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C(C)(C)COCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 YREQHYQNNWYQCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 101100433746 Arabidopsis thaliana ABCG29 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 229920008347 Cellulose acetate propionate Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 1
- 241000295146 Gallionellaceae Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101000869690 Homo sapiens Protein S100-A8 Proteins 0.000 description 1
- 235000017335 Hordeum vulgare subsp spontaneum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101100054289 Oryza sativa subsp. japonica ABCG34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107601 Oryza sativa subsp. japonica ABCG45 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150088582 PDR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 241000256618 Trichogramma Species 0.000 description 1
- 101100400877 Trichophyton rubrum (strain ATCC MYA-4607 / CBS 118892) MDR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000009470 controlled atmosphere packaging Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008077 processed pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
pú'.' - π í ípú'.' - π í í
KÖZZÉTÉTELIPUBLICATION
PÉLDÁNYCOPY
Új típusú transzpozon-alapú genetikai markerA new type of transposon-based genetic marker
A találmány tárgyát eljárás képezi nukleinsavszekvencia láncindító-párral végzett amplifikáció alkalmazásával történő genotipizálására, melynek során első láncindítóként miniatűr, fordított ismétlődést tartalmazó, transzpozícióra képes elemmel (miniature inverted-repeat transposable element; MITE) homológ DNS-szekvenciát tartalmazó láncindítót, második láncindítóként pedig az elsővel azonos vagy attól eltérő láncindítót alkalmazunk. Tágabb értelemben a találmány tárgyát a MITE-Iáncindítók fingerprinting analízisben vagy kapcsoltsági vizsgálatokban történő alkalmazása képezi.The invention relates to a method for genotyping a nucleic acid sequence using primer pair amplification, wherein a primer containing a DNA sequence homologous to a miniature inverted-repeat transposable element (MITE) is used as the first primer, and a primer identical to or different from the first primer is used as the second primer. In a broader sense, the invention relates to the use of MITE primers in fingerprinting analysis or linkage studies.
Az Ac/Ds transzpozícióra képes elemrendszer felismerése után [McClintock: Carnegie Inst. Wash. Yearbook 45, 176 (1946); McClintock: Carnegie Inst. Wash. Yearbook 46, 146 (1947)] az új, transzpozícióra képes elem-rendszerek (családok) genetikai azonosítása a növények, illetve más organizmusok genetikai vizsgálatának népszerű területévé vált [Peterson: Plant Breeding Reviews £, 3 (1986)]. Ezt követte a transzpozícióra képes elemek molekuláris karakterizálása, illetve ezen elemek génazonosításra és -izolálásra történő alkalmazása [például, Drosophila-ban a whíte-lokusz copia-retrotranszpozonnal végzett klónozásátAfter the discovery of the Ac/Ds transposable element system [McClintock: Carnegie Inst. Wash. Yearbook 45, 176 (1946); McClintock: Carnegie Inst. Wash. Yearbook 46, 146 (1947)], the genetic identification of new transposable element systems (families) became a popular area of genetic study in plants and other organisms [Peterson: Plant Breeding Reviews £, 3 (1986)]. This was followed by the molecular characterization of transposable elements and their use for gene identification and isolation [e.g., cloning of the white locus in Drosophila with the copia retrotransposon
15518 KO követően; Id. Bingham és mtsai.: Cell 25, 693 (1981), és a kukorica Ac transzpozícióra képes elemének karakterizálása; Id. Pohlmann és mtsai.: Cell 37, 635 (1984), illetve a kukorica En/Spm transzpozícióra képes elemének karakterizálása; Id. Pereira és mtsai.: EMBO J. £, 17 (1985)]. Azóta a transzpozícióra képes elemekkel kapcsolatos kutatások a biológiatudományok egyik fő vonalát képezik.15518 KO; See Bingham et al.: Cell 25, 693 (1981), and the characterization of the maize Ac transposable element; See Pohlmann et al.: Cell 37, 635 (1984), and the characterization of the maize En/Spm transposable element; See Pereira et al.: EMBO J. £, 17 (1985)]. Since then, research on transposable elements has been a major focus of biological science.
A biológiai kutatások más területeihez hasonlóan, a számítógépes technikák a transzpozícióra képes elemek azonosításában is fellendülést eredményeztek. Bureau és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 8524 (1996)] ezen új technika adaptálásával a transzpozícióra képes elemek egy új családjának számos tagját azonosították. Az általuk azonosított transzpozícióra képes elemek a hagyományos DNSközvetítette, transzpozícióra képes elemekre emlékeztetnek [ellentétben az RNS-köztestermékeken keresztül áthelyeződő retroelemekkel; Id. Boeke és mtsai.: Cell 40, 491 (1985)], mégpedig abban, hogy terminális fordított (invertált) ismétlődéseket (TIR-eket) tartalmaznak. Mindazonáltal, ellentétben a klasszikus, genetikailag karakterizált transzpozonokkal, ezek az elemek kis méretűek, és kódoló kapacitást nem mutatnak. Ezeket az elemeket miniatűr fordított ismétlődéses transzpozonoknak (ΜΙΤΕ) nevezik [Bureau és mtsai., Id. fentebb].As in other areas of biological research, computational techniques have led to a boom in the identification of transposable elements. Bureau et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 8524 (1996)] have adapted this new technique to identify several members of a new family of transposable elements. The transposable elements they identified resemble traditional DNA-mediated transposable elements (as opposed to retroelements that transpose via RNA intermediates; see Boeke et al.: Cell 40, 491 (1985)) in that they contain terminal inverted repeats (TIRs). However, unlike classical, genetically characterized transposons, these elements are small in size and do not exhibit coding capacity. These elements are called miniature inverted repeat transposons (MΙΤΕ) [Bureau et al., supra].
A restrikciós fragmens-hosszúság polimorfizmus (RFLP) technika [Id. Bostein és mtsai.: Am. J. Hum. Genet. 32, 314 (1980)] molekuláris térképezési eszközként történő bevezetése óta a genomtérképezési és fingerprint ’’-analí zises technológiák jelentős fejlődésen estek át, amit olyan új technikák kifejlesztése is bizonyít, mint a random amplifikált DNS-polimorfizmus [RAPD; Welsh és McClelland: Nucleic Acids Res. 18, 7213 (1990); Williams és mtsai.: Nucleic Acids Res. 18, 6531 (1990); és az amplifikált fragmens hosszúság-polimorfizmus [AFLP; Vos és mtsai.: Nucleic Acids Res. 23, (1995)]. A retroelemek [Sinnet és mtsai.: Alumorphs-human DNA polymorphisms detected by polymerase chain reaction using Alu-specific primers”, Genomics Ί_, 331 (1990); és Nelson és mtsai.: Alupolymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific DNA sequences from complex DNA sources, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6686 (1989)], valamint az egyszerű szekvencia-ismétlődések [SSR-ek; Id. Litt és Luty: Am. J. Hum. Genet. 44, 397 (1989); Tautz: Nucleic Acids Res. 17, 6463 (1989); és Weber és May: Am. J. Hum. Genet. 44, 388 (1989)] alkalmazásával az utóbbi években adaptált technikák a genomtérképezési és fingerprinf'-analizálási eszközök új generációjának szolgálnak alapjául.Since the introduction of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique [Id. Bostein et al.: Am. J. Hum. Genet. 32, 314 (1980)] as a molecular mapping tool, genome mapping and fingerprinting technologies have undergone significant advances, as evidenced by the development of new techniques such as random amplified DNA polymorphism [RAPD; Welsh and McClelland: Nucleic Acids Res. 18, 7213 (1990); Williams et al.: Nucleic Acids Res. 18, 6531 (1990); and amplified fragment length polymorphism [AFLP; Vos et al.: Nucleic Acids Res. 23, (1995)]. Techniques adapted in recent years using retroelements [Sinnet et al.: Alumorphs-human DNA polymorphisms detected by polymerase chain reaction using Alu-specific primers”, Genomics Ί_, 331 (1990); and Nelson et al.: Alupolymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific DNA sequences from complex DNA sources, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6686 (1989)], as well as simple sequence repeats [SSRs; Id. Litt and Luty: Am. J. Hum. Genet. 44, 397 (1989); Tautz: Nucleic Acids Res. 17, 6463 (1989); and Weber and May: Am. J. Hum. Genet. 44, 388 (1989)] serve as the basis for a new generation of genome mapping and fingerprint analysis tools.
Izvak és mtsai. Angel elnevezésű ismétlődő elemeket tártak fel, amelyek hajtűhurok-szerű struktúrák kialakítására képesek. Ezen elemek kis mérete és másodlagos szerkezetet létrehozó képessége szolgál alapjául annak, hogy a szerzők ezeket az elemeket MITE-ként definiálták. Mindazonáltal, az Angel elem nem felel meg a ΜΙΤΕ általunk leírt definíciójának, mivel semmi jele sincs annak, hogy bármilyen célhely-kettőződés (target site duplication; TSD) szegélyezné. Mivel a TSD-k nemcsak a MITE-elemek, hanem gyakorlatilag valamennyi ismert transzpozícióra képes elem azonosító bélyege, nyilvánvaló, hogy az Angel sem MITEelemnek, sem transzpozonnak nem nevezhető.Izvak et al. have discovered repetitive elements called Angel, which are capable of forming hairpin-like structures. The small size of these elements and their ability to form secondary structures are the basis for the authors to define these elements as MITEs. However, the Angel element does not fit our definition of a ΜΙΤΕ, as there is no evidence that it is flanked by any target site duplication (TSD). Since TSDs are the hallmark not only of MITEs, but of virtually all known transposable elements, it is clear that Angel can be called neither a MITE nor a transposon.
Sinett és mtsai. az eddigiektől nagyon különböző, transzpozícióra képes elemet (Adu) alkalmazó technikát tártak fel. A transzpozonok általában két nagy csoportba sorolhatók. Az I. osztály elemei közé endogén retrovírusok, LTR-retrotranszpozonok, LINE-elemek (hosszú, közbeszúrt sejtmagi elemek), SINE-elemek (rövid, közbeszúrt sejtmagi elemek) és feldolgozott (processed) pszeudogének tartoznak. Az Alu-elem SINE-ként definiálható. A II. osztály elemei közé a MITE-k és az egyéb, terminális fordított ismétlődést hordozó elemek tartoznak. Az I. osztályba tartozó elemek RNS-intermedieren és reverz transzkriptáz működésén keresztül mozognak, míg a II. osztályba sorolt eleme mozgása közvetlenül DNS alakban, az elem által kódolt transzpozáz működése révén történik. A MITE-elemek számos eukarióta és prokarióta organizmusban megtalálhatók. Az Alu-elem csak főemlősökben van jelen. Az Alu és a MITEelemek egyértelműen ismétlődőek; gazda-genomjukon szétszórva helyezkednek el; és génekkel asszociálhatok. Az Alu-PCR technika - Alu-elem terminális szekvenciáján alapján tervezett - láncindítók (közelebbről, két láncindító) alkalmazását foglalja magában. Az 5'- és 3'-terminális szekvencia különböző, így a láncindítók szekvenciája is eltér egymástól. A MITE-MITE alapú PCR a MITE-elem terminális ismétlődésén alapuló láncindító alkalmazását foglalja magában, így csak egy láncindítóra van szükség.Sinett et al. have revealed a very different technique using a transposable element (Adu). Transposons are generally classified into two major groups. Class I elements include endogenous retroviruses, LTR retrotransposons, LINE elements (long interspersed nuclear elements), SINE elements (short interspersed nuclear elements), and processed pseudogenes. The Alu element can be defined as a SINE. Class II elements include MITEs and other terminal inverted repeat elements. Class I elements move via RNA intermediates and reverse transcriptase, while class II elements move directly in DNA form via the transposase encoded by the element. MITE elements are found in many eukaryotic and prokaryotic organisms. The Alu element is only present in primates. The Alu and MITE elements are clearly repetitive; they are scattered throughout their host genome; and they can be associated with genes. The Alu-PCR technique involves the use of primers (more specifically, two primers) designed based on the terminal sequence of the Alu element. The 5'- and 3'-terminal sequences are different, so the sequence of the primers also differs from each other. MITE-MITE-based PCR involves the use of a primer based on the terminal repeat of the MITE element, so only one primer is needed.
A restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmus (RFLP) marker-technika a következő lépésekből áll: genomi DNS emésztése restrikciós enzimmel; a DNS-fragmensek elválasztása elektroforézissel; az elválasztott DNS-fragmensek nylon-membránból készült szilárd hordozóra történő átmásolása (miáltal a gél másolatát - képét - olyan hordozón kapjuk, amely alkalmas az ismert DNS-szekvenciákkal végzett hibridizációs kísérletekhez). Ismert DNS-szekvenciaként klónozott genomi DNS-szekvencia, cDNS-szekvencia vagy specifikus PCR-termék alkalmazható. Ez a DNS-szekvencia (próba szekvencia) radioaktív, fluoreszcens vagy festett nukleotiddal van megjelölve. A hibridizáció eredménye a szilárd hordozó röntgen-sugárzásra érzékeny filmre történő exponálásával, vagy - megfestett nukleotiddal végzett jelölés esetén - közvetlenül a hordozón tehető láthatóvá. A próba szekvencia eredetétől függően általában egy vagy néhány DNS-csík figyelhető meg. A restrikciós fragmenshosszúság-polimorf izmusok a különböző genotípusok csíkozódási mintázata közötti különbségként vizualizálhatók, és egy adott restrikciós enzim hasítási helyei eloszlásának különbségeit tükrözik.The restriction fragment length polymorphism (RFLP) marker technique consists of the following steps: digestion of genomic DNA with a restriction enzyme; separation of DNA fragments by electrophoresis; transfer of the separated DNA fragments to a solid support made of nylon membrane (thereby obtaining a copy - an image - of the gel on a support suitable for hybridization experiments with known DNA sequences). A cloned genomic DNA sequence, a cDNA sequence or a specific PCR product can be used as a known DNA sequence. This DNA sequence (probe sequence) is labeled with a radioactive, fluorescent or dyed nucleotide. The result of the hybridization can be visualized by exposing the solid support to X-ray sensitive film or - in the case of labeling with a dyed nucleotide - directly on the support. Depending on the origin of the probe sequence, one or a few DNA bands are usually observed. Restriction fragment length polymorphisms can be visualized as differences in the banding pattern between different genotypes and reflect differences in the distribution of cleavage sites for a given restriction enzyme.
A random amplifikált polimorf DNS (RAPD) markertechnika végrehajtása során egy - templátként ossz genomi DNS alkalmazásával végzett - polimeráz-láncreakció (PCR) láncindítójaként rövid (tíz nukleotidos) DNS-szekvenciákat alkalmazunk. A láncindító-oligonukleotidok nukleotidösszetételét önkényesen - létező DNS-szekvenciával mindenféle kapcsolat nélkül - választjuk meg. A PCR-termékeket agaróz gélelektroforézis után közvetlenül tesszük láthatóvá. Eukarióta genom esetében amplifikációs termékként általában 1-15 amplifikált DNS-fragmens figyelhető meg. A polimorfizmusok közvetlenül az agarózgélen (megfelelő festés után), az amplifikációs mintázatok egyes genotípusok között megfigyelhető különbségeiként detektálhatok, és a láncindítóban egy-egy nukleotid-változást, illetve inszerciót/deléciót tükröznek.The random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker technique uses short (ten nucleotide) DNA sequences as primers for a polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA as a template. The nucleotide composition of the primer oligonucleotides is chosen arbitrarily, without any relation to an existing DNA sequence. The PCR products are visualized directly after agarose gel electrophoresis. In the case of eukaryotic genomes, 1-15 amplified DNA fragments are usually observed as amplification products. Polymorphisms can be detected directly on the agarose gel (after appropriate staining) as differences in amplification patterns between genotypes and reflect single nucleotide changes or insertions/deletions in the primer.
Az amplifikált fragmens hosszúság-polimorfizmus (AFLP) marker-technika a következő lépésekből áll: genomi DNS-t restrikciós enzimmel emésztünk; a létrejött genomi DNSfragmenseket adapter-szekvenciához (olyan rövid, kettős szálú DNS-szekvencia, amely egyik végén ugyanolyan bázissorrendű helyet tartalmaz, mint a genomi DNS emésztésére alkalmazott restrikciós enzim által létrehozott hely) ligáljuk; és polimeráz-láncreakciót végzünk, melynek során láncindítóként az adapter-szekvenciával homológ oligonukleotidot alkalmazunk. Az amplifikáció eredményét, megfelelő festés után, közvetlenül akrilamid-gélen, jó néhány (akár 60) DNS-fragmensként figyelhetjük meg. A polimorfizmusok a különböző genotípusokban a specifikus amplifikált DNS-fragmensek jelenléte/hiánya különbségeiként jelennek meg, és - hasonlóan az RFLP-technikához - egy adott restrikciós enzim hasítási helyei eloszlásának különbségeit tükrözik, de a genomi DNS egy részhalmazával.The amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker technique consists of the following steps: genomic DNA is digested with a restriction enzyme; the resulting genomic DNA fragments are ligated to an adapter sequence (a short, double-stranded DNA sequence that contains a site with the same base sequence at one end as the site created by the restriction enzyme used to digest the genomic DNA); and a polymerase chain reaction is performed, in which an oligonucleotide homologous to the adapter sequence is used as a primer. The result of the amplification can be observed directly on an acrylamide gel, after appropriate staining, as several (up to 60) DNA fragments. Polymorphisms appear as differences in the presence/absence of specific amplified DNA fragments in different genotypes and, similar to the RFLP technique, reflect differences in the distribution of cleavage sites for a given restriction enzyme, but with a subset of genomic DNA.
Az egyszerű szekvencia-ismétlődés (SSR) markertechnika abból áll, hogy próbaként egyszerű DNS-szekvencia ismétlődést [pl. (TA)n (CAGA)n, (GA)n, stb., ahol n érté7 ke általában 5-18] alkalmazunk abból a célból, hogy egy organizmus génkönyvtárából ilyen egyszerű szekvenciamotívumokat hordozó genomi kiónokat azonosítsunk. Az izolált kiónokat szekvenáljuk, és az SSR PCR-amplífikációjához SSR-t körülvevő láncindító-párt tervezünk. A polimorfizmusok egy vagy nagyon kevés amplifikált DNS-fragmensként figyelhetők meg, melyek a különböző genotípusokban egy vagy néhány nukleotidban térnek el egymástól, és az egyszerű szekvencia ismétlődéseinek számát (n) reprezentálják.The simple sequence repeat (SSR) marker technique consists of using a simple DNA sequence repeat [e.g. (TA) n (CAGA) n , (GA) n , etc., where n is usually 5-18] as a probe to identify genomic clones carrying such simple sequence motifs from a gene library of an organism. The isolated clones are sequenced and a primer pair surrounding the SSR is designed for PCR amplification of the SSR. Polymorphisms are observed as one or very few amplified DNA fragments that differ by one or a few nucleotides in different genotypes and represent the number (n) of simple sequence repeats.
A retroelemeken és egyéb, nagyméretű ismétlődő elemeken alapuló DNS-marker technika az elemet körülvevő láncindítók tervezését foglalja magában, és a polimorfizmusok akkor mutathatók ki, ha az elem a különböző genotípusokban jelen van vagy hiányzik.DNA marker technology based on retroelements and other large repetitive elements involves designing primers surrounding the element, and polymorphisms can be detected when the element is present or absent in different genotypes.
Léteznek más típusú DNS-markerek is, azonban ezek a fentebb leírt DNS-marker típusok kombinációi. Például, a CAP-k hasított amplifikált polimorf DNS-ek (cut amplified polymorphic DNA), amelyek esetében a PCR-termék PCRamplifikáció után restrikciós enzimekkel emésztve van. A láncindító-párok egy ismétlődő elemből és egy AFLPláncindítóból vagy különböző, ismétlődő elemekből tervezhetők .There are other types of DNA markers, but they are combinations of the types of DNA markers described above. For example, CAPs are cut amplified polymorphic DNA, in which the PCR product is digested with restriction enzymes after PCR amplification. Primer pairs can be designed from a repetitive element and an AFLP primer, or from different repetitive elements.
Igen előnyös lenne olyan új, általánosan elterjedt nukleinsav-szekvenciát feltárni, amely alkalmazható lenne a kapcsoltsági vizsgálatokban és a fingerprinting analízisekben.It would be very beneficial to discover a new, commonly occurring nucleic acid sequence that could be used in linkage studies and fingerprinting analyses.
Szintén szükség lenne olyan eljárást kifejleszteni, amely az új, általánosan elterjedt nukleinsav felhasználá sával alkalmazható lenne az eukariótákban előforduló polimorfizmusok detektálására.It would also be necessary to develop a method that could be used to detect polymorphisms in eukaryotes using the new, commonly used nucleic acid.
A fentieknek megfelelően, a találmány kidolgozása során egyik célunk volt egy olyan, általánosan elterjedt nukleinsav-szekvenciát feltárni, amely kapcsoltsági vizsgálatokban és fingerprinting analízisekben használható.Accordingly, one of our goals in developing the invention was to discover a commonly used nucleic acid sequence that could be used in linkage studies and fingerprinting analyses.
További célul tűztük ki egy eljárás kifejlesztését polimorfizmusok detektálására eukariótákban, a feltárt új, általánosan elterjedt nukleinsav-szekvencia alkalmazásával.A further goal was to develop a method for detecting polymorphisms in eukaryotes using the newly discovered, commonly distributed nucleic acid sequence.
A találmány szerinti megoldás értelmében eljárást tárunk fel egy adott nukleinsav-szekvencia polimorfizmusainak detektálására, mely eljárás a következő lépésekből áll:According to the solution according to the invention, we disclose a method for detecting polymorphisms of a given nucleic acid sequence, which method consists of the following steps:
a) a kérdéses nukleinsav-szekvenciát egy miniatűr, fordított ismétlődést tartalmazó, transzpozícióra képes elemmel (miniature inverted-repeat transposable element; MITE), annak fragmensével vagy származékával homológ első láncindító és egy második láncindító alkalmazásával amplifikáljuk, mely első láncindító akkor hibridizálódik a MITE-elemmel, ha az megtalálható a kérdéses nukleinsavszekvenciában, és a második láncindító az elsővel azonos vagy attól eltérő, és a MITE-szekvenciával homológ vagy sem;a) the nucleic acid sequence of interest is amplified using a first primer homologous to a miniature inverted-repeat transposable element (MITE), a fragment or derivative thereof, and a second primer, which first primer hybridizes to the MITE element if it is present in the nucleic acid sequence of interest, and the second primer is identical to or different from the first primer and is homologous to the MITE sequence or not;
b) a kérdéses nukleinsav-szekvencia (a) pontban amplifikált fragmenseit elválasztjuk egymástól; ésb) separating the fragments of the nucleic acid sequence of interest amplified in (a); and
c) a (b) lépésben kapott fragmenseket - egy nukleinsav-szekvenciának a legalább egy láncindítóval végzett amplifikálásával kapott - vonatkoztatási fragmensekkel öszszefüggésben analizáljuk, hogy meghatározzuk a nukleinsav szekvenciában a (b) lépésben kapott fragmensek és a vonatkoztatási fragmensek közötti eltérést, mely eltérés a kérdéses nukleinsavban polimorfizmus jelenlétére utal.c) analyzing the fragments obtained in step (b) in relation to reference fragments obtained by amplifying a nucleic acid sequence with at least one primer to determine the difference in the nucleic acid sequence between the fragments obtained in step (b) and the reference fragments, which difference indicates the presence of a polymorphism in the nucleic acid in question.
Ezen túlmenően, feltárunk egy eljárást eukarióta organizmus genotipizálására, mely eljárás a következő lépésekből áll:Furthermore, we disclose a method for genotyping a eukaryotic organism, which method comprises the following steps:
a) a szóban forgó eukarióta organizmus egy nukleinsavszekvenciáját egy MITE-elemmel, annak fragmensével vagy származékával homológ első láncindító és egy második láncindító alkalmazásával amplifikáljuk, mely első láncindító akkor hibridizálódik a MITE-elemmel, ha az megtalálható a szóban forgó eukarióta organizmus kérdéses nukleinsavszekvenciájában, és a második láncindító az elsővel azonos vagy attól eltérő, és a MITE-szekvenciával homológ vagy sem;a) amplifying a nucleic acid sequence of said eukaryotic organism using a first primer homologous to a MITE element, fragment or derivative thereof, and a second primer, which first primer hybridizes to the MITE element if it is found in the nucleic acid sequence of said eukaryotic organism in question, and the second primer is identical or different to the first and is homologous or not to the MITE sequence;
b) a nukleinsav-szekvencia (a) pontban amplifikált fragmenseit elválasztjuk egymástól; ésb) separating the fragments of the nucleic acid sequence amplified in (a); and
c) a (b) lépésben kapott fragmenseket összehasonlítjuk a szóban forgó eukarióta organizmus egy vonatkoztatási nukleinsavának fragmenseivel, és a (b) lépésben kapott fragmensek és a vonatkoztatási fragmensek azonossága arra utal, hogy a szóban forgó eukarióta tartalmazza a kérdéses nukleinsav-szekvenciát.c) comparing the fragments obtained in step (b) with fragments of a reference nucleic acid of the eukaryotic organism in question, and the identity of the fragments obtained in step (b) with the reference fragments indicates that the eukaryote in question contains the nucleic acid sequence in question.
Feltárunk továbbá egy eljárást eukarióta organizmus DNS-’’fingerprint”-jének elkészítésére, melynek soránWe further disclose a method for generating a DNA fingerprint of a eukaryotic organism, in which
a) egy eukarióta organizmus egy nukleinsavszekvenciáját egy MITE-elemmel, annak fragmensével vagy származékával homológ első láncindító és egy második lánc indító alkalmazásával amplifikáljuk, mely első láncindító specifikus egy MITE-szekvenciára, és a második láncindító az elsővel azonos vagy attól eltérő, és a MITEszekvenciával homológ vagy sem; ésa) amplifying a nucleic acid sequence of a eukaryotic organism using a first primer homologous to a MITE element, fragment or derivative thereof and a second primer, the first primer being specific for a MITE sequence and the second primer being the same or different from the first and homologous or not to the MITE sequence; and
b) a nukleinsav-szekvencia (a) lépésben végzett amplifikálásával kapott fragmenseit elválasztjuk egymástól, és az így elválasztot fragmensek az eukarióta organizmusra jellemzőek.b) the fragments obtained by amplifying the nucleic acid sequence in step (a) are separated from each other, and the fragments thus separated are characteristic of the eukaryotic organism.
Az amplifikálási lépést előnyösen polimerázláncreakcióval végezzük. Az első láncindító egy MITE-elem konszenzus-szekvenciájából származik. Még előnyösebben, az első láncindító a Tourist, Stowaway, Barfly vagy Mariner MITE-elem konszenzus-szekvenciájából származik.The amplification step is preferably carried out by polymerase chain reaction. The first primer is derived from a consensus sequence of a MITE element. More preferably, the first primer is derived from a consensus sequence of the Tourist, Stowaway, Barfly or Mariner MITE element.
Az amplifikálási lépés során alkalmazott első láncindító legelőnyösebben az 1-35. azonosítószámú nukleotidszekvenciák valamelyikét tartalmazza.The first primer used in the amplification step most preferably comprises one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-35.
Második láncindítóként, adott esetben, MITE-specifikus láncindítót, SSR-szekvencián alapuló láncindítót, retroelem szekvenciáján alapuló láncindítót, RFLP-t detektáló klónozott nukleinsav szekvenciáján alapuló láncindítót, véletlenszerű genomi szekvencián alapuló láncindítót, vektorszekvencián alapuló láncindítót vagy génszekvencián alapuló láncindítót alkalmazunk.As a second primer, optionally, a MITE-specific primer, a primer based on an SSR sequence, a primer based on a retroelement sequence, a primer based on a cloned nucleic acid sequence detecting RFLP, a primer based on a random genomic sequence, a primer based on a vector sequence, or a primer based on a gene sequence are used.
Ezen túlmenően, a találmány szerinti megoldás értelmében feltárjuk egy polimorfizmus alkalmazását, például a találmány szerinti eljárással, egy eukarióta organizmus utódainak kimutatására; egy eukarióta organizmus hibriditásának meghatározására; egy eukarióta organizmusban egy kapcsolt fenotipusos sajátság variációjának azonosítására; egy keresztezésből származó egyes utódok azonosítására (mely utódok szülői donorból és/vagy recipiens szülőből származó, kívánt genetikai részesedéssel bírnak); vagy genetikai térképek készítésének genetikai markereiként.Furthermore, the present invention discloses the use of a polymorphism, e.g., by the method of the invention, to detect progeny of a eukaryotic organism; to determine the hybridity of a eukaryotic organism; to identify variation in a linked phenotypic trait in a eukaryotic organism; to identify individual progeny from a cross (which progeny have the desired genetic contribution from the parental donor and/or recipient parent); or as genetic markers for the construction of genetic maps.
A találmány szerinti eljárás felhasználható egy gén kódolószekvenciáját vagy egy nem kódoló DNS-szekvenciát szegélyező genomi DNS-szekvencia izolálására. A gén kódolószekvenciáját szegélyező genomi DNS-szekvencia előnyösen egy promóter vagy más szabályozószekvencia.The method of the invention can be used to isolate a genomic DNA sequence flanking a coding sequence of a gene or a non-coding DNA sequence. The genomic DNA sequence flanking the coding sequence of a gene is preferably a promoter or other regulatory sequence.
A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk továbbá egy nukleinsav-fragmenst vagy annak származékát nukleinsav-szekvenciák próbájaként történő alkalmazásra, amely fragmens vagy származék egy eukarióta organizmus nukleinsav-szekvenciájának - legalább egy, MITE-elemmel homológ láncindító alkalmazásával végzett - amplifikálásával van előállítva.The present invention further provides a nucleic acid fragment or derivative thereof for use as a probe for nucleic acid sequences, which fragment or derivative is produced by amplifying a nucleic acid sequence of a eukaryotic organism using at least one primer homologous to a MITE element.
A nukleinsav-fragmens vagy annak származéka markersegítette szelekcióra (MAS), térkép-alapú klónozásra, hibrid-hitelesítésre, DNS-fingreprint készítésre, genotipizálásra, valamint allél-specifikus markerként alkalmazható .The nucleic acid fragment or derivative thereof can be used for marker-assisted selection (MAS), map-based cloning, hybrid validation, DNA fingerprinting, genotyping, and as an allele-specific marker.
Feltárunk továbbá egy eljárást genom térképezésére, melynek soránWe also disclose a method for genome mapping, in which
a) frakciónáljuk egy eukarióta organizmus genomját;a) fractionating the genome of a eukaryotic organism;
b) a frakcionált genomot vektorba klónozzuk;b) cloning the fractionated genome into a vector;
c) a klónozott vektorokat a vektorokban lévő DNS amplifikálásával teszteljük, melynek során egy miniatűr, fordított ismétlődést tartalmazó, transzpozícióra képes elemmel (ΜΙΤΕ) homológ első láncindítót és egy második láncindítót alkalmazunk, mely első láncindító képes hibridizálódni a DNS-ben lévő MITE-elemmel, és a második láncindító az elsővel azonos vagy attól eltérő, és a MITEszekvenciával homológ vagy sem;c) the cloned vectors are tested by amplifying the DNA contained in the vectors, using a first primer homologous to a miniature inverted repeat transposable element (MITE) and a second primer, which first primer is capable of hybridizing to the MITE element contained in the DNA, and the second primer is the same or different from the first and is homologous or not to the MITE sequence;
d) az amplifikációs lépés lánchosszabbítási termékeit méret szerint elválasztjuk;d) separating the chain extension products of the amplification step by size;
e) meghatározzuk a lánchosszabbítási termékek mintázatát; ése) determine the pattern of chain extension products; and
f) az átfedő mintázatokból rekonstruáljuk a genomot.f) reconstruct the genome from the overlapping patterns.
Feltárunk továbbá egy eljárást polimorf genetikai marker térképezésére, melynek soránWe further disclose a method for mapping polymorphic genetic markers, in which
a) eukarióta organizmusból származó biológiai mintából restrikciós enzimmel emésztett nukleinsav-szekvenciák elegyét hozzuk létre;a) generating a mixture of restriction enzyme digested nucleic acid sequences from a biological sample derived from a eukaryotic organism;
b) a restrikciós enzimmel emésztett nukleinsavszekvenciák elegyét amplifikáljuk, melynek során egy miniatűr, fordított ismétlődést tartalmazó, transzpozícióra képes elemmel (ΜΙΤΕ) homológ első láncindítót és egy második láncindítót alkalmazunk, mely első láncindító képes hibridizálódni a DNS-ben lévő MITE-elemmel, és a második láncindító az elsővel azonos vagy attól eltérő, és a MITEszekvenciával homológ vagy sem;b) amplifying the mixture of restriction enzyme digested nucleic acid sequences using a first primer homologous to a miniature inverted repeat transposable element (MITE) and a second primer, which first primer is capable of hybridizing to the MITE element in the DNA, and the second primer is the same or different from the first primer and is homologous or not to the MITE sequence;
c) az elegyben azonosítjuk az eltérően amplifikálódott nukleinsav-szekvenciák sorozatát; ésc) identifying the sequence of differentially amplified nucleic acid sequences in the mixture; and
d) az eltérően amplifikálódott nukleinsav-szekvenciák legalább egyikét egyedi genetikai polimorfizmushoz térké pezzük, létrehozva ezáltal a polimorfizmus markerét.d) mapping at least one of the differentially amplified nucleic acid sequences to a unique genetic polymorphism, thereby creating a marker for the polymorphism.
A találmány szerinti, MITE-alapú marker-rendszer eltérő a korábbi marker-rendszerektől, mivel sokkal egyszerűbb, sokkal több információt nyújt és ismételhető.The MITE-based marker system of the invention differs from previous marker systems in that it is much simpler, provides much more information, and is repeatable.
Az alábbiakban a találmány szerinti megoldás céljaira a következő kifejezéseket definiáljuk.The following terms are defined below for the purposes of the present invention.
A ΜΙΤΕ kifejezésen minitatűr, fordított ismétlődést tartalmazó, transzpozícióra képes elemet értünk. A MITEelemek valójában a transzpozícióra képes elemek főcsaládját alkotják. Ezek az elemek 3 kilobázisosnál kisebbek; teljes vagy degenerált terminális fordított ismétlődéseket tartalmaznak; 10 bázispáros vagy kisebb célhely-kettőződéssel vannak szegélyezve; és a genomban mérsékelten vagy igen gyakoriak.The term ΜΙΤΕ refers to a miniature inverted repeat transposable element. MITE elements are actually a major family of transposable elements. These elements are smaller than 3 kilobases; contain complete or degenerate terminal inverted repeats; are flanked by target site duplications of 10 base pairs or less; and are moderately to highly abundant in the genome.
A MITE-elemek hosszúsága előnyösen egy kilobázisnál nagyobb; teljes vagy degenerált terminális fordított ismétlődéseket tartalmaznak; TA vagy TAA célhely-duplikációval vannak szegélyezve; és a genomban mérsékelten vagy igen gyakoriak.MITE elements are preferably greater than one kilobase in length; contain complete or degenerate terminal inverted repeats; are flanked by TA or TAA target site duplications; and are moderately to highly abundant in the genome.
A MITE-alapú láncindító kifejezésen MITE-elemet vagy annak fragmensét tartalmazó láncindítót; MITE-elemből származó láncindítót; illetve MITE-elemet felismerő vagy azzal hibridizáló láncindítót értünk.The term MITE-based primer refers to a primer containing a MITE element or a fragment thereof; a primer derived from a MITE element; or a primer that recognizes or hybridizes with a MITE element.
A MITE-alapú genetikai marker (MGM) kifejezésen MITE-elemhez hibridizáló markert vagy egy nukleinsavszekvencia - legalább egy MITE-láncindítóval és, adott esetben, egy másik MITE-láncindítóval vagy egy (SSRszekvencián, retroelem-szekvencián, RFLP-szekvencián vagy génszekvencián alapuló) másik láncinditóval végzett amplifikációjával előállított markert értünk.The term MITE-based genetic marker (MGM) refers to a marker hybridizing to a MITE element or a marker produced by amplification of a nucleic acid sequence with at least one MITE primer and, optionally, another MITE primer or another primer (based on an SSR sequence, a retroelement sequence, an RFLP sequence or a gene sequence).
A MITE-elemek közötti polimorfizmus (IMP) kifejezésen egy MGM részhalmazát értjük, azaz egy olyan markert, amely egy nukleinsav-szekvencia - egy MITE-láncindító és két eltérő MITE-láncindító alkalmazásával végzett amplifikációjával van létrehozva.The term inter-MITE polymorphism (IMP) is understood to refer to a subset of an MGM, i.e., a marker generated by the amplification of a nucleic acid sequence using one MITE primer and two different MITE primers.
Az eukarióta vagy eukarióta organizmus kifejezésen növényeket, állatokat és gombákat értünk.The term eukaryote or eukaryotic organism refers to plants, animals, and fungi.
A homológ kifejezésen - nukleinsav-szekvenciák vonatkozásában - olyan nukleinsav-szekvenciát értünk, amely sztringens körülmények között hibridizálódni képes azon nukleinsav komplementerével, amellyel a szóban forgó nukleinsav-szekvencia homológ.The term homologous, in relation to nucleic acid sequences, refers to a nucleic acid sequence that is capable of hybridizing under stringent conditions to the complement of the nucleic acid to which the nucleic acid sequence in question is homologous.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.A brief description of the figures follows.
Az 1. ábrán a TEM-4/TEM-10 láncindító-kombinációval (illetve a TEM-10 láncindítóval önmagában) kapott PCRtermékek agarózgélen végzett elválasztásának eredménye látható.Figure 1 shows the results of agarose gel separation of PCR products obtained with the TEM-4/TEM-10 primer combination (or with the TEM-10 primer alone).
A 2. ábrán IRD700™ fluoreszcens színezékkel jelölt TEM-1 láncindítóval kapott PCR-termékek láthatók, melyeket - a találmány előnyös megvalósítási módjának megfelelően automatizált LI-COR 4200 rendszerben 6 %-os akrilamid gélen tettünk láthatóvá. Pl = szülői H. vulgare Lina változat; P2 = szülői H. spontaneum Canada Park változat. A szegregálódó egyedek a Lina és Canada Park kettős haploid (DH) populáció keresztezéséből származnak.Figure 2 shows PCR products obtained with the TEM-1 primer labeled with the IRD700™ fluorescent dye, which were visualized on a 6% acrylamide gel in an automated LI-COR 4200 system according to the preferred embodiment of the invention. Pl = parental H. vulgare Lina strain; P2 = parental H. spontaneum Canada Park strain. The segregating individuals are derived from crosses between the Lina and Canada Park double haploid (DH) populations.
A 3. ábrán a TEM-3/TEM-10 láncindító-kombinációval nagyobb (1 perc 15 másodperces) lánchosszabbítási idővel, agarózgélen kapott PCR-eredményeket mutatjuk be.Figure 3 shows PCR results obtained on agarose gel with a longer chain extension time (1 minute 15 seconds) using the TEM-3/TEM-10 primer combination.
A 4/A és 4/B ábrán a TEM-l/TEM-4 láncindítókombinációval (60 másodperces, illetve 75 másodperces lánchosszabbítási lépés alkalmazásával) agarózgélen kapott PCReredmények láthatók.Figures 4/A and 4/B show the PCR results obtained on agarose gel with the TEM-1/TEM-4 primer combination (using a 60 second and 75 second extension step, respectively).
Az 5. ábrán a H. vulgare cv. Lina x H. spontaneum cv. Canada Park keresztezésből származó populáció kapcsoltsági térképe látható, a TEM-1 és TEM-10 láncindítókkal detektált IMP-lokuszok megoszlásának feltüntetésével.Figure 5 shows the linkage map of the population derived from the cross H. vulgare cv. Lina x H. spontaneum cv. Canada Park, showing the distribution of IMP loci detected with primers TEM-1 and TEM-10.
A 6. ábrán a 27 Hordeum vonal agarózgélen készített DNS-ujjlenyomata látható.Figure 6 shows the DNA fingerprint of 27 Hordeum lines prepared on an agarose gel.
A 7. ábrán a 27 Hordeum vonal IRD700™ fluoreszcens színezékkel jelzett TEM-1 láncindítóval kapott DNSujjlenyomatának képe látható.Figure 7 shows an image of the DNA fingerprint of 27 Hordeum lines obtained with the TEM-1 primer labeled with the IRD700™ fluorescent dye.
A 8. ábrán a 27 Hordeum változat genetikai hasonlósági mátrixának UPGMA-csopoftosításával (a TEM-1 és TEM-10 csíkozottsági mintázat alapján) kapott dendrogram látható.Figure 8 shows the dendrogram obtained by UPGMA clustering of the genetic similarity matrix of the 27 Hordeum varieties (based on the TEM-1 and TEM-10 striation patterns).
A 9/A-9/D ábrákon a MITE-alapú markerek különböző eukariótákban való univerzális alkalmazhatóságát illusztráljuk. Ezeken az ábrákon 11 különböző DNS-forrás TEM-12 alap (master) láncindító alkalmazásával (9/A ábra); TEM-1 alap-láncindító alkalmazásával (9/B ábra); TEM-10 alap-láncindító alkalmazásával (9/C ábra); illetve TEM-11 alapláncindító alkalmazásával (9/D ábra) kapott PCR-amplifikált mintázatai láthatók.Figures 9/A-9/D illustrate the universal applicability of MITE-based markers in various eukaryotes. These figures show PCR-amplified patterns obtained from 11 different DNA sources using the TEM-12 master primer (Figure 9/A); TEM-1 master primer (Figure 9/B); TEM-10 master primer (Figure 9/C); and TEM-11 master primer (Figure 9/D).
A 10/A-10/E ábrákon a TEM-1 alap-láncindítóval és az annak megfelelő, kihorgonyzott láncindítóval· kapott eredmé nyék jellemző példáit mutatjuk be.Figures 10/A-10/E show typical examples of results obtained with the TEM-1 base primer and its corresponding anchored primer.
A következőkben a találmány szerinti megoldás részletes leírását ismertetjük.The following is a detailed description of the solution according to the invention.
A találmány tárgyát új genetikai marker képezi, amelyet MITE-alapú genetikai markernek (MGM) nevezünk. A találmány szerinti, polimeráz-láncreakció alkalmazásával végrehajtott új eljárás során a gyakori, transzpozícióra képes elemek, az ún. MITE-elemek alapján tervezett láncindítókkal polimorfizmusokat mutatunk ki. A transzpozícióra képes elemeken alapuló láncindítók hasznosságát kettős haploid térképező árpa-populáció szegregációs mintázatainak vizsgálata, valamint a Hordeum vulgare 26 kultúrnövény-változatának és egy Hordeum spontaneum vonal genotipizálása során állapítottuk meg. A találmány szerinti megoldás értelmében új típusú DNS-markereket tárunk fel, melyeket MITE-alapú genetikai markereknek nevezünk. Feltárjuk továbbá e markerek kromoszomális lokalizációját, univerzális alkalmazhatóságukat és sokoldalúságukat, valamint a DNS-fingerprint analizálás! eredményeket. Végül, feltárjuk a találmány szerinti MGM- és IMP-analízis alkalmazhatóságát és kiterjesztését is.The invention relates to a novel genetic marker, which is called a MITE-based genetic marker (MGM). In the novel method according to the invention, which is carried out using polymerase chain reaction, polymorphisms are detected with primers designed on the basis of frequent transposable elements, so-called MITE elements. The utility of primers based on transposable elements was established during the investigation of segregation patterns of a double haploid mapping barley population and during the genotyping of 26 Hordeum vulgare cultivars and a Hordeum spontaneum line. According to the solution according to the invention, we reveal new types of DNA markers, which are called MITE-based genetic markers. We also reveal the chromosomal localization of these markers, their universal applicability and versatility, and the results of DNA fingerprint analysis. Finally, we also reveal the applicability and extension of the MGM and IMP analysis according to the invention.
Ahogy fentebb említettük, a MITE-elemek gyakran génekkel kapcsolatban fordulnak elő, és így nem korlátozódnak ismétlődő régiókra. A MITE-elemek ilyenfajta általános előfordulása rendkívül értékes; ez azt jelzi, hogy a legtöbb eukarióta organizmusban a genom gyakorlatilag valamennyi régiója hajlamos az IMP-amplifikációra.As mentioned above, MITE elements often occur in association with genes and are thus not restricted to repetitive regions. This general occurrence of MITE elements is of great value; it indicates that in most eukaryotic organisms, virtually all regions of the genome are susceptible to IMP amplification.
Minden egyes láncindítóval összesen 50-100 értékelhető csíkot amplifikáltunk, ami azt mutatja, hogy a MITE-elemek a genomban nagy példányszámban vannak jelen. Az átvizsgálás (szkrínelés) során több láncindítóval - és láncindítónként 50-100 lokusszal - a teljes genom könnyen lefedhető.A total of 50-100 appreciable bands were amplified with each primer, indicating that MITE elements are present in high abundance in the genome. With multiple primers - and 50-100 loci per primer - the entire genome can be easily covered during screening.
A MITE-láncindító egyéb típusú láncindítókkal kombinálható, például, SSR-ekre, retroelemekre, szekvenált RFLPkre, véletlenszerű genomi szekvenciákra, vektorszekvenciákra és génekre specifikus láncindítókkal. Ez minden valószínűség szerint növeli a találmány szerinti MGM eljárás hatékonyságát .The MITE primer can be combined with other types of primers, such as primers specific for SSRs, retroelements, sequenced RFLPs, random genomic sequences, vector sequences, and genes. This is likely to increase the efficiency of the MGM method of the invention.
A találmány szerinti eljárás - a nagy felbontású, automatizált LI-COR fluoreszcens genotipizálási rendszerrel kombinálva - rendkívüli teljesítményt biztosít a DNStérképezési és DNS-fingerprint készítési technikákban. A RAPD és RFLP-technikával összehasonlítva a találmány szerinti eljárás teljesítménye és felbontása egyértelműen jobb, mivel egy reakcióval sokkal több lokusz mutatható ki. Az MGM- és IMP-analízis egyszerű, gyors és költségtakarékos. E vizsgálatokhoz - a RAPD-analízishez képest - sokkal kevesebb láncindító alkalmazására van szükség. Eltérően az AFLP- és RFLP-technikáktól, az MGM- és IMP-analízishez nincs szükség restrikciós enzimes emésztésre vagy adapterligálásra.The method of the invention, combined with the high-resolution, automated LI-COR fluorescent genotyping system, provides extraordinary performance in DNA mapping and DNA fingerprinting techniques. Compared to RAPD and RFLP techniques, the performance and resolution of the method of the invention are clearly superior, since many more loci can be detected with one reaction. MGM and IMP analysis are simple, rapid and cost-effective. These assays require the use of far fewer primers than RAPD analysis. Unlike AFLP and RFLP techniques, MGM and IMP analysis do not require restriction enzyme digestion or adapter ligation.
i) Növényi anyagok(i) Plant materials
Az alkalmazott térképezési populáció 88 kettős haploid egyedből áll, amelyek a Hordeum vulgare Lina változat és aThe mapping population used consists of 88 double haploid individuals, which are the Hordeum vulgare Lina variety and the
H. spontaneum Canada Park változat keresztezéséből származnak. Ezt a populációt használtuk egy - főként RFLPmarkereken alapuló - kapcsoltsági térkép létrehozására.They are derived from a cross of H. spontaneum Canada Park variant. This population was used to create a linkage map, mainly based on RFLP markers.
A fingerprint-készítésí kísérletekben összesen 27 kultúrnövény-változatot (Id. 1. táblázat) alkalmaztunk, melyek közül 26 H. vulgare változat, egy pedig H. spontaneum változat (Canada Park), amelyet - a Lina változattal együtt - a térképezési populáció létrehozásának szülői vonalaként alkalmaztunk. A kollekció kétsoros és hatsoros típusokból állt. A kétsoros típusok között tavaszi és őszi változatok egyaránt előfordultak. Mind a 27 változatot korábban RFLPgenotipizálási vizsgálatban alkalmaztuk, így az e változa tok közötti RFLP-alapú genetikai rokonság ismert volt.A total of 27 cultivars (see Table 1) were used in the fingerprinting experiments, of which 26 were H. vulgare and one was H. spontaneum (Canada Park), which was used - together with the Lina variety - as the parental line for the mapping population. The collection consisted of two-row and six-row types. Both spring and autumn varieties were present among the two-row types. All 27 varieties had previously been used in RFLP genotyping studies, so the RFLP-based genetic relationship between these varieties was known.
1. táblázatTable 1
A fingerprint vizsgálathoz alkalmazott változatokVariants used for fingerprint analysis
ii) PCR detektálási rendszerekii) PCR detection systems
A polimorfizmus-azonosítások felbontásának és hatékonyságának összehasonlítására két detektálási rendszert alkalmaztunk. Az első a szokványos agarózgéles detektálási rendszer. E rendszerben a polimeráz-láncreakciókat szokványos (jelöletlen) láncindítók alkalmazásával végezzük. A PCR-termékekét 2 %-os agarózgéleken (Nusieve agarózzal vagy anélkül; 2/3 Nusieve:l/3 szokványos agaróz) tesszük láthatóvá. A második rendszer az automatizált LI-COR DNSszekvenáló/genotipizáló rendszer, amelyben a láncindítók IRDVOO™ fluoreszcens színezékkel (LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska) vannak jelölve. A PCR-termékeket 6 %-os denaturáló akrilamid-gélen (41 cm hosszúságú üveglemezen) tesszük láthatóvá. A gélelektroforézist LI-COR 4200 rendszer alkalmazásával végeztük.Two detection systems were used to compare the resolution and efficiency of polymorphism identifications. The first is a conventional agarose gel detection system. In this system, polymerase chain reactions are performed using conventional (unlabeled) primers. PCR products are visualized on 2% agarose gels (with or without Nusieve agarose; 2/3 Nusieve:1/3 conventional agarose). The second system is the automated LI-COR DNA sequencing/genotyping system, in which the primers are labeled with IRDVOO™ fluorescent dye (LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska). PCR products are visualized on a 6% denaturing acrylamide gel (41 cm long glass slide). Gel electrophoresis was performed using a LI-COR 4200 system.
iii) Polimeráz láncreakcióiii) Polymerase chain reaction
E vizsgálatban hét alap (master) láncindítót (Id. 2. táblázat) és ezek 3'-végen kihorgonyzott származékait (3. táblázat) terveztük meg és értékeltük. Az alap-láncindítók közül hat (TEM-1, TEM-2, TEM-3, TEM-10, TEM-11 és TEM-12) MITE-láncindító volt, míg a TEM-4 a több Tyl/copia-szerű retrotranszpozon [Hirochika és Hirochika: Jpn. J. Genet. 68, 35 (1993)] reverz transzkriptáz (RT) doménje konzervált szekvenciáinak egy szakasza. Az alap-láncindítók degeneráltak voltak, mivel bizonyos pozíciókban egynél több nukleotid elhelyezkedése is valószínű volt. A kihorgonyzott láncindítók olyan alap-láncindítók voltak, amelyek az alapláncindító 3'-végén egy további nukleotidot tartalmaztak (Id. 3. táblázat). A MITE-Iáncindítókat az egyes kategóriákból származó MITE-elemek terminális fordított ismétlődésű (TIR) régióinak konszenzus-szekvenciái alapján terveztük meg. A láncindítók tervezéséhez mindkét TIR-régiót felhasználtuk. A TEM-4 láncindítót csak más láncindítókkal kombi nálva alkalmaztuk. A láncindítókat az agarózgéles detektálási rendszerben és az automatizált LI-COR detektálási rendszerben felhasználtuk, azzal a különbséggel, hogy az utóbbi esetében a láncindítókat fluoreszcens színezékkel jelöltük.In this study, seven master primers (Table 2) and their 3'-anchored derivatives (Table 3) were designed and evaluated. Six of the master primers (TEM-1, TEM-2, TEM-3, TEM-10, TEM-11, and TEM-12) were MITE primers, while TEM-4 is a region of conserved sequences in the reverse transcriptase (RT) domain of several Tyl/copia-like retrotransposons [Hirochika and Hirochika: Jpn. J. Genet. 68, 35 (1993)]. The master primers were degenerate, since it was possible for more than one nucleotide to be located at certain positions. The anchored primers were master primers that contained an additional nucleotide at the 3'-end of the master primer (Table 3). MITE primers were designed based on the consensus sequences of the terminal inverted repeat (TIR) regions of MITE elements from each category. Both TIR regions were used for primer design. Primer TEM-4 was used only in combination with other primers. Primers were used in the agarose gel detection system and the automated LI-COR detection system, except that in the latter case the primers were labeled with a fluorescent dye.
2. táblázatTable 2
Az alap (master) láncindítók forrásai és szekvenciájukSources of master primers and their sequences
* Hirochika és Hirochika (1993)* Hirochika and Hirochika (1993)
3. táblázatTable 3
Alap-láncindítők és a megfelelő kihorgonyzott láncinditókBasic primers and corresponding anchored primers
Az agarózgéles detektálási rendszer esetében a polimeráz-láncreakciós amplifikációt 25 μΐ térfogatú - 2,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 1-1 μΜ láncindítók és 0,625 egység AmpliTaq™ DNS-polimeráz (Perkin-Elmer) összetételű - reakcióelegyben végeztük. A következő amplifikációs rendszert alkalmaztuk (hacsak másképp nem jelezzük): 94 °C-on 1,5 perces kezdeti denaturációs lépés, majd 35 cikluson keresztül, ciklusonként 94 °C-on 30 másodperces, 58 °C-on 45 másodperces és 72 °C-on egy perces inkubálás, végül 72 °C-on 5 perces lánchosszabbítás. A TEM-1 láncindító alkalmazása esetén a hibridizáltatási lépést 60 °C-on végeztük.For the agarose gel detection system, polymerase chain reaction amplification was performed in a 25 μΐ reaction mixture containing 2.5 mM MgCl 2 , 0.4 mM dNTP, 1-1 μΜ primers, and 0.625 units of AmpliTaq™ DNA polymerase (Perkin-Elmer). The following amplification regime was used (unless otherwise indicated): an initial denaturation step at 94 °C for 1.5 min, followed by 35 cycles of 30 s at 94 °C, 45 s at 58 °C, and 1 min at 72 °C, and finally a 5 min extension at 72 °C. When using the TEM-1 primer, the hybridization step was performed at 60 °C.
A LI-COR detektálási rendszerhez a PCR-amplifikációt a szokványos agarózos rendszerhez hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy a reakcióelegy végtérfogata 20 μΐ volt, és 0,5 egység AmpliTaq™ DNS-polimerázt (Perkin-Elmer) alkalmaztunk. Az inkubálási rendszer azonos az előzőhöz, aFor the LI-COR detection system, PCR amplification was performed similarly to the conventional agarose system, except that the final reaction volume was 20 μΐ and 0.5 units of AmpliTaq™ DNA polymerase (Perkin-Elmer) were used. The incubation system was the same as the previous one, with
TEM-1 esetében azonban a hibridizációs hőmérsékletet nem módosítottuk. A PCR-amplifikációt két lépésben hajtottuk végre. Az első lépés egy - jelöletlen láncindítókkal végzett - előzetes amplifikáció (35 inkubálási ciklussal). A második lépésben az előamplifikációs elegy 3 μΐ-es alikvotját használtuk fel. Ennek során 0,1 μΜ koncentrácójú jelzett láncindítót alkalmaztunk (szemben az első lépésben alkalmazott jelöletlen láncindító 1 μΜ koncentrációjával).However, in the case of TEM-1, the hybridization temperature was not modified. The PCR amplification was performed in two steps. The first step was a pre-amplification with unlabeled primers (with 35 incubation cycles). In the second step, a 3 μΐ aliquot of the pre-amplification mixture was used. In this, a labeled primer concentration of 0.1 μΜ was used (compared to the 1 μΜ concentration of the unlabeled primer used in the first step).
iv) Adatgyűjtés és statisztikai analízisiv) Data collection and statistical analysis
a) Fingerprint-analízis és genetikai hasonlóság analízisa) Fingerprint analysis and genetic similarity analysis
A géleken megjelenített polimorf, illetve közös csíkokat - minden egyedre - jelenlétként (1), hiányként (0) vagy hiányzó adatként (9) értékeltük. A kapott nyers adatmátrixokat relatív genetikai hasonlósági (GS) mátrixok létrehozására használtuk, melynek során a Nei és Li összefüggést [Proc. Natl. Acad. Sói. 76, 5269 (1979)] alkalmaztuk, amely szerint 2nxy/(nx+ny), ahol nx és ny értéke: az x, illetve y sávban lévő csíkok száma, és nxy értéke: az x és y sávban egyaránt meglévő csíkok száma. A GS-érték kiszámítására mind a polimorf, mind a közös csíkokat felhasználtuk.Polymorphic and common bands displayed on the gels were scored as present (1), absent (0) or missing data (9) for each individual. The resulting raw data matrices were used to generate relative genetic similarity (GS) matrices, using the Nei and Li relationship [Proc. Natl. Acad. Soci. 76, 5269 (1979)], which is 2n xy /(n x +n y ), where n x and n y are the numbers of bands in the x and y bands, respectively, and n xy is the number of bands in both the x and y bands. Both polymorphic and common bands were used to calculate the GS value.
A GS-mátrixok alapján - a súlyozatlan pár-csoport aritmetikai átlag eljárás (UPGMA) alkalmazásával dendrogramokat készítettünk. Két MITE-láncindító (TEM-1 és TEM-10) alkalmazásával végzett analízisek alapján kombinált dendrogramot készítettünk. A MITE-alapú genetikai markereken alapuló genetikai hasonlósági mátrix és az ugyanazon változat 313 polimorf RFLP-marker csíkon alapuló genetikai hasonlósági mátrixának összehasonlítására a normalizált Mantel-statisztikát [Mantel: Cancer Res. 27, 209 (1967)] alkalmaztuk. A szignifikancia tesztet úgy végeztük, hogy a megfigyelt Z-értéket összehasonlítottuk a mátrixok 1000 véletlenszerű permutációjának megoszlásával. Valamenynyi statisztikai analízist NTSYS-pc szoftver [Rohlf: ”NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system, 1.80 verzió, Exeter Software, N.Y. (1994)] alkalmazásával végeztük.Dendrograms were constructed using the unweighted pair-group arithmetic mean method (UPGMA) based on the GS matrices. A combined dendrogram was constructed based on analyses using two MITE primers (TEM-1 and TEM-10). The normalized Mantel statistic [Mantel: Cancer Res. 27, 209 (1967)] was used to compare the genetic similarity matrix based on MITE-based genetic markers with the genetic similarity matrix based on 313 polymorphic RFLP marker bands of the same variant. The significance test was performed by comparing the observed Z-score with the distribution of 1000 random permutations of the matrices. All statistical analyses were performed using NTSYS-pc software [Rohlf: ”NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 1.80, Exeter Software, N.Y. (1994)].
b) Genetikai térképezésb) Genetic mapping
A TEM-1 és TEM-10 láncindítóval létrehozott MITE-alapú genetikai markerek lokalizálását e makrereknek 71 - korábban a Hordeum vulgare Lina változat x H. spontaneum Canada Park populáció térképének létrehozására alkalmazott - RFLPmarker vázán belüli térképezésével hajtottuk végre. A térképezéshez e populáció 88 kettős haploid egyedéből álló részhalmazt alkalmaztunk. A szegregációs rátát khi-négyzet analízissel határoztuk meg. A térképezést MAPMAKER számítógépes program [Lander és mtsai.: Genomics jL, 174 (1987)] alkalmazásával végeztük. A MITE-alapú genetikai markereket - két pontos analízissel, 4-es LOD-küszöbnél (a 7H csoport kivételével, amely e küszöbnél két csoportot képezett) kapcsoltsági csoportokhoz rendeltük hozzá, és RFLP-markerek közzétett elhelyezkedése alapján kapcsoltuk. A markerek kapcsoltsági csoportokon belüli elhelyezésére 2-es LODküszöbbel végzett több pontos analízist végeztünk.The localization of MITE-based genetic markers generated with primers TEM-1 and TEM-10 was performed by mapping these markers within the framework of 71 RFLP markers previously used to map the Hordeum vulgare Lina x H. spontaneum Canada Park population. A subset of 88 double haploid individuals of this population was used for mapping. The segregation rate was determined by chi-square analysis. The mapping was performed using the MAPMAKER computer program [Lander et al.: Genomics jL, 174 (1987)]. The MITE-based genetic markers were assigned to linkage groups at a LOD threshold of 4 (except for group 7H, which formed two groups at this threshold) by two-point analysis and linked based on the published locations of RFLP markers. To place markers within linkage groups, we performed multi-point analysis with a LOD threshold of 2.
EredményekResults
A MITE-szekvenciák találmány szerinti PCR-alapú eljárással történő értékelése céljából a terminális fordított ismétlődésű (TIR) régiók alapján láncindító-oligonukleotidokat terveztünk (valamennyi láncindító a TIRrégiókon kívülre irányult). Ilyenformán, az e láncindítókkal amplifikált szekvenciák mindegyike várhatóan két szomszédos MITE-elem között (amplifikálható távolságon belül) helyezkedik el. Ezeket a láncindítókat önmagukban vagy kombinálva, a Hordeum vulgare Lina változat és a H. spontaneum Canada Park változat keresztezéséből származó 88 egyed alkotta kettős haploid populáció alkalmazásával végzett szegregációs analízisben használtuk.To evaluate MITE sequences using the PCR-based method of the invention, oligonucleotide primers were designed based on terminal inverted repeat (TIR) regions (all primers were directed outside the TIR regions). Thus, each sequence amplified with these primers was expected to be located between two adjacent MITE elements (within amplifiable distance). These primers were used alone or in combination in a segregation analysis using a double haploid population of 88 individuals derived from a cross between Hordeum vulgare Lina and H. spontaneum Canada Park.
a) Egy láncindítós amplifikációka) Single-primer amplifications
Agarózgéleken a MITE-láncindítók mindegyike kb. 10 értékelhető csíkot eredményezett, melyek közül 2-5 volt polimorf. Ezek a polimorfizmusok egyértelműen detektálhatok voltak a szülői H. vulgare Lina változat és a szülői H. spontaneum Canada Park változat között, és a kettős haploid populációban többnyire a várt 1:1 arányú mendeli szegregációt mutatták. Az 1. ábrán a szegregációs mintázat egy példáját mutatjuk be. Az 1. ábrán M a XPstI markert jelöli.On agarose gels, each of the MITE primers yielded approximately 10 evaluable bands, of which 2-5 were polymorphic. These polymorphisms were clearly detectable between the parental H. vulgare Lina strain and the parental H. spontaneum Canada Park strain, and mostly showed the expected 1:1 Mendelian segregation in the double haploid population. An example of the segregation pattern is shown in Figure 1. In Figure 1, M denotes the XPstI marker.
Az 1. sáv a H. vulgare Lina változat PCR-termékeit; a 2.Lane 1 shows PCR products of H. vulgare Lina variant; lane 2 shows PCR products of H. vulgare Lina variant.
változat a H. spontaneum Canada Park változat PCRtermékeit, míg a 3-28. sávok a térképezési populációt alkotó egyedek PCR-termékeit tartalmazzák.variant contains the PCR products of the H. spontaneum Canada Park variant, while lanes 3-28 contain the PCR products of the individuals constituting the mapping population.
A TEM-1 láncinditó nagy háttérszintet mutatott, néhány nagyon gyengétől csaknem láthatatlanig terjedő intenzitású csíkkal, feltehetően a sok igen hasonló szekvenciának köszönhetően (pl. a TIR-régiókban lévő variációkból származók) . Ebben az esetben a reakcióelegyekhez 2 % formamidot adtunk, mivel a formamidról leírták, hogy csökkenti a PCR háttérszintet és növeli a specifitást [Id. Nagaoka és Ogihara: Theor. Appl. Genet. 94, 597 (1997)].The TEM-1 primer showed high background, with some bands ranging from very weak to almost invisible, presumably due to the many highly similar sequences (e.g., those originating from variations in the TIR regions). In this case, 2% formamide was added to the reaction mixtures, as formamide has been reported to reduce PCR background and increase specificity [Id. Nagaoka and Ogihara: Theor. Appl. Genet. 94, 597 (1997)].
A LI-COR szekvenáló gélen a TEM-1 láncindító alkalmazásakor összesen kb. 100 értékelhető csíkot detektáltunk, míg a TEM-10 láncindítóval 60-70 csíkot, a TEM-3 láncindítóval pedig 30-40 csíkot detektáltunk. A 2. ábrán a TEM-1 láncindítóval végzett polimeráz-láncreakció termékeinek elektroforetikus akrilamid-gél képét mutatjuk be. Hasonlóan az agarózos detektálási rendszerhez, a polimorfizmusok egyértelműen detektálhatók voltak a szülői H. vulgare Lina változat és a szülői H. spontaneum Canada Park változat között, és a kettős haploid populációban többnyire a várt 1:1 arányú mendeli szegregációt mutatták.A total of approximately 100 evaluable bands were detected on the LI-COR sequencing gel when using the TEM-1 primer, while 60-70 bands were detected with the TEM-10 primer and 30-40 bands with the TEM-3 primer. Figure 2 shows the electrophoretic acrylamide gel image of the polymerase chain reaction products performed with the TEM-1 primer. Similar to the agarose detection system, the polymorphisms were clearly detectable between the parental H. vulgare Lina strain and the parental H. spontaneum Canada Park strain, and mostly showed the expected 1:1 Mendelian segregation in the double haploid population.
A 2. ábrán az 1. sávban a szülői H. vulgare Lina változatból származó PCR-termékek; a 2. sávban a szülői H. spontaneum Canada Park változatból származó PCR-termékek; a 3-45. sávban pedig a Lina és a Canada Park változat keresztezéséből létrejött populáció egyedeiből származó PCRtermékek láthatók.In Figure 2, lane 1 shows PCR products from the parental H. vulgare Lina strain; lane 2 shows PCR products from the parental H. spontaneum Canada Park strain; and lanes 3-45 show PCR products from individuals of the population resulting from the cross between Lina and Canada Park strains.
b) Láncindító-kombinációkb) Chain starter combinations
A láncindító-kombinációs tesztekhez csak az agarózos detektálási rendszert alkalmaztuk. A láncindítók különböző kombinációban történő alkalmazásakor több szituációval kerültünk szembe. Míg a TEM-4/TEM-10 kombináció azonos mintázatot eredményezett, mint az önmagában alkalmazott TEM-10 láncindító, a TEM-l/TEM-10 kombináció más eredményt adott, amelyben a csak TEM-10 alkalmazásával kapott csíkok többsége gátolt volt, és a csak TEM-l-gyel kapott csíkok szintén kevésbé voltak láthatók, továbbá kisebb méretű csíkok is megjelentek. A TEM-3/TEM-10 kombináció - hosszabb (1 perc 15 másodperces) lánchosszabbítási idővel - eltérő mintázatot eredményezett (három jól látható szegregálódó csík, melyek külön egyik láncindítóval sem voltak láthatók; Id. 3. ábra). Az 1-16. sávban a térképezési populáció egyedeiből származó eredmények láthatók (a szülők eredményeit nem mutatjuk be) .For the primer combination tests, only the agarose detection system was used. Several situations were encountered when using the primers in different combinations. While the TEM-4/TEM-10 combination resulted in the same pattern as the TEM-10 primer used alone, the TEM-l/TEM-10 combination gave different results, in which the majority of the bands obtained with TEM-10 alone were inhibited, and the bands obtained with TEM-l alone were also less visible, and smaller bands also appeared. The TEM-3/TEM-10 combination - with a longer (1 min 15 s) chain extension time - resulted in a different pattern (three clearly visible segregating bands that were not visible with either primer alone; Id. Fig. 3). Lanes 1-16 show the results from individuals of the mapping population (the results of the parents are not shown).
A TEM-1 láncindítóval hasonló szituációkat figyeltünk meg. Ha a TEM-l-et a TEM-4-gyel kombináltuk, a esikozottsági mintázat nem változott (Id. 4/A ábra), azonban a TEM-1 láncindító TEM-3-mal vagy TEM-10-zel kombinált alkalmazása megváltozott mintázatot eredményezett. Ezen túlmenően, megnövelt lánchosszabbítási idővel (1 perc 15 másodperc) a TEM-l/TEM-4 kombináció egy nagyobb, szegregálódó csíkot eredményezett, és néhány csík szuppresszált volt (Id. 4/B ábra) . Érdekes, hogy a nagyobb csík (melyet a láncindító-kombináció után Tl-4AA-nak ne vezünk) csaknem ugyanúgy szegregálódott, mint a T4-10A esik (Id. 1. ábra). A T1-4AA és a T4-10A csík nem azonos a közös TEM-4 láncindító termékével, mivel a TEM-10 önmagában szintén amplifikálta a T4-10A csíkot. Ezenfelül, a T1-4AA hozzávetőleg 300 bp-ral nagyobb, mint a T4-10A. Ez azt jelzi, hogy a két láncindító-kombináció szorosan kapcsolt DNSrégiókat amplifikált. Ez nem váratlan, mivel ezek a transzpozícióra képes elemek nagy kópiaszámban vannak jelen.Similar situations were observed with the TEM-1 primer. When TEM-1 was combined with TEM-4, the pattern of cleavage was not changed (Fig. 4/A), however, the use of TEM-1 primer in combination with TEM-3 or TEM-10 resulted in a changed pattern. In addition, with an increased chain extension time (1 min 15 sec) the TEM-1/TEM-4 combination resulted in a larger, segregating band, and some bands were suppressed (Fig. 4/B). Interestingly, the larger band (which we will refer to as Tl-4AA after the primer combination) segregated almost in the same way as T4-10A (Fig. 1). The T1-4AA and T4-10A bands are not identical to the product of the common TEM-4 primer, as TEM-10 alone also amplified the T4-10A band. In addition, T1-4AA is approximately 300 bp larger than T4-10A. This indicates that the two primer combinations amplified closely linked DNA regions. This is not unexpected, as these transposable elements are present in high copy number.
A 4/A és 4/B ábra jelmagyarázata megegyezik az 1. ábráéval. A 4/A és 4/B ábrán a sávok számozása egymásnak megfelelő.The legend of Figures 4/A and 4/B is the same as that of Figure 1. The numbering of the bars in Figures 4/A and 4/B corresponds to each other.
Bizonyos láncindító-kombinációkkal ellentmondó eredményeket kaptunk, melyek lehetséges magyarázatai a következők:We obtained conflicting results with certain primer combinations, the possible explanations for which are as follows:
az egyes láncindítók önmagukban tíznél több csíkot amplifikáltak, így e láncindítók kombinációi vagy túl sok csíkot adtak ahhoz, hogy egyértelműen láthatók legyenek, vagy olyan csíkozottsági mintázatot adtak, amely a mikrokörnyezeti változásoktól függően változékony;individual primers amplified more than ten bands on their own, so combinations of these primers either gave too many bands to be clearly visible or gave a banding pattern that was variable depending on microenvironmental changes;
a kapott mintázat meghatározásában lényeges tényező lehet az eltérő hibridizációs hőmérséklet (pl. a TEM-4 esetében, amelynél sokkal nagyobb hibridizációs hőmérsékletet kell alkalmazni);Different hybridization temperatures may be an important factor in determining the resulting pattern (e.g. in the case of TEM-4, for which a much higher hybridization temperature must be used);
a láncindítók eltérő affinitása bizonyos csíkok dominanciáját eredményezheti, mint pl. a TEM-1 és a TEM-10 esetében .Different affinities of the primers may result in the dominance of certain bands, such as TEM-1 and TEM-10.
Mindazonáltal, valószínű, hogy a fluoreszcens jelöléses detektálási rendszer alkalmazásával - az egy láncindí30 tós reakciók esetében tapasztaltakhoz hasonlóan - e problémák némelyike megoldható, és a láncinditó-kombinációk jelentős mértékben növelik a kimutatható lokuszok számát.However, it is likely that by using a fluorescently labeled detection system, similar to that experienced with single-primer reactions, some of these problems can be overcome, and primer combinations will significantly increase the number of detectable loci.
c) A MITE-alapú genetikai markerek kromoszomális lokalizálásac) Chromosomal localization of MITE-based genetic markers
Az agarózos detektálási rendszer alkalmazásával a három MITE-láncindító és a Tyl/copia retrotranszpozon láncindító a térképezési populációban összesen 15 detektálható polimorf markert eredményezett. Ezek - kettő kivételével a várt 1:1 arányban szegregálódtak. Ez a 13 marker elhelyezhető a térképen, míg a másik kettő kapcsoltság nélküli maradt; ezek a várt szegregációs aránytól jelentős eltérést mutató markerek, és valószínűleg két hasonló méretű csíkból állnak, melyek agarózgélen nem választhatók el.Using the agarose detection system, the three MITE primers and the Tyl/copia retrotransposon primer resulted in a total of 15 detectable polymorphic markers in the mapping population. All but two of these segregated in the expected 1:1 ratio. These 13 markers could be placed on the map, while the other two remained unlinked; these are markers that show a significant deviation from the expected segregation ratio and are likely to consist of two bands of similar size that cannot be separated on an agarose gel.
Az 5. ábrán a MITE-alapú genetikai markereket nagyobb betűmérettel és félkövér betűtípussal tüntetjük fel. Csak a fluoreszcens színezékkel jelzett TEM-1 és TEM-10 láncindítókkal akrilamid gélen detektált lokuszok láthatók. Azokat a lokuszokat tettük zárójelbe, amelyek 2-nél nagyobb vagy egyenlő LOD-értékkel nem helyezhetők el. A TEM-1 és TEM-10 láncindítóval LI-COR szekvenáló gélen hozzávetőleg 120, illetve 90 egyértelműen látható csíkot detektáltunk. A kimutatott csíkok mérettartománya 100 bp és 1 kb közötti. A 2. ábrán a TEM-1 láncindítóval kapott - poliakrilamid gélelektroforézissel láthatóvá tett - amplifikációs eredmény egy részét mutatjuk be.In Figure 5, MITE-based genetic markers are shown in larger font size and bold. Only loci detected on acrylamide gel with fluorescently labeled primers TEM-1 and TEM-10 are shown. Loci that could not be placed with a LOD value greater than or equal to 2 are in parentheses. Approximately 120 and 90 clearly visible bands were detected on LI-COR sequencing gel with primers TEM-1 and TEM-10, respectively. The size range of the detected bands is between 100 bp and 1 kb. Figure 2 shows a portion of the amplification result obtained with primer TEM-1, visualized by polyacrylamide gel electrophoresis.
A TEM-1 és TEM-10 láncindítóval 75, illetve 19 poli31 morf csíkot kaptunk. Néhány csík-pár ko-domináns viselkedést mutatott (Tl-0,2 lokusz az IH-csoporton; Tl-4 és Tl-16 lokuszok a 2H-csoporton; T10-6 lokusz a 3H-csoporton; Tl-8 lokusz a 4H-csoporton; és a Tl-36 lokusz a 7H-csoporton; Id. 5. ábra), de a többi csík jelenlét/hiány mintázatot mutatott, oly módon, hogy pontosan 41 lokusz a Lina szülőtől, és 41 a H. spontaneum szülőtől származott. A 70 térképezett TEM-1 lokusz közül 24 jelentősen eltért a várt 1:1 szegregációs aránytól. Egy kivételével (Tl-19 a 7H-csoporton) mind a 24 lokusz olyan területen volt lokalizálható, amelyen - e populációban - az RFLP-markerek is torzult szegregációs arányt mutatnak. A 18 TEM-10 lokusz közül kettő jelentős mértékben eltért a várt szegregációs aránytól, és ezeket szintén olyan területen lokalizáltuk, amelyeken az RFLP-lokuszok is eltértek az 1:1 szegregációs aránytól.TEM-1 and TEM-10 primers yielded 75 and 19 polymorphic bands, respectively. Some band pairs showed co-dominant behavior (locus Tl-0.2 on the IH group; loci Tl-4 and Tl-16 on the 2H group; locus Tl-6 on the 3H group; locus Tl-8 on the 4H group; and locus Tl-36 on the 7H group; Id. Fig. 5), but the remaining bands showed a presence/absence pattern, such that exactly 41 loci were from the Lina parent and 41 from the H. spontaneum parent. Of the 70 mapped TEM-1 loci, 24 significantly deviated from the expected 1:1 segregation ratio. All 24 loci, with one exception (Tl-19 on the 7H group), were localized in regions where the RFLP markers also show a skewed segregation ratio in this population. Two of the 18 TEM-10 loci deviated significantly from the expected segregation ratio and were also localized in regions where the RFLP loci also deviated from the 1:1 segregation ratio.
Összesen 88 lokuszt térképeztünk. Ezek a lokuszok lefedték mind a hét kapcsoltsági csoportot (5. ábra). A lokuszok eloszlása nem mutatott jelentős csoportosulást, eltekintve a centromer régiók körül várhatótól, ahol a rekombináció rendszerint csökkent mértékű (pl. 1H, 3H és 7H csoportok; Id. 5. ábra). Valójában a lokuszok eloszlása hasonló az RFLP-ket detektáló cDNS-ek esetében tapasztalhatóhoz (L. S. O'Donoughue, nem publikált forrás). Ez arra utal, hogy a MITE-elemek a genom kódolószekvenciákat tartalmazó területein helyezkednek el, és valószínű, hogy a teljes genom a MITE-alapú láncindítók egy korlátozott méretű csoportjával lefedhető.A total of 88 loci were mapped. These loci covered all seven linkage groups (Fig. 5). The distribution of loci did not show significant clustering, except as expected around centromeric regions where recombination is usually reduced (e.g. groups 1H, 3H and 7H; Id. Fig. 5). In fact, the distribution of loci is similar to that observed for cDNAs detecting RFLPs (L. S. O'Donoughue, unpublished data). This suggests that MITE elements are located in regions of the genome containing coding sequences and that it is likely that the entire genome can be covered by a limited set of MITE-based primers.
d) DNS-fingerprint analízisd) DNA fingerprint analysis
E MITE-láncindítók fingerprint analízisben való hasznosságának vizsgálatára összesen 27 termesztett árpaváltozatot alkalmaztunk, köztük a szülői H. vulgare Lina változatot, a szülői H. spontaneum Canada Park változatot és 25 H. vulgare változatot (1. táblázat). Agarózgéles detektálási rendszer alkalmazásával a szóban forgó változatok megkülönböztetésére a következő láncindítókat, ill. láncindító-kombinációkat találtuk alkalmasnak: TEM-3, TEM-10, TEM-l/TEM-3 és TEM-l/TEM-4. E láncindítók és kombinációk alkalmazásával 1-3 polimorf csíkot figyeltünk meg. Az agarózgélen végzett fingerprinting kísérletek egyik példáját a 6. ábrán mutatjuk be.To test the utility of these MITE primers in fingerprint analysis, a total of 27 cultivated barley varieties were used, including the parental H. vulgare Lina variety, the parental H. spontaneum Canada Park variety, and 25 H. vulgare varieties (Table 1). Using an agarose gel detection system, the following primers and primer combinations were found to be suitable for distinguishing the varieties in question: TEM-3, TEM-10, TEM-l/TEM-3, and TEM-l/TEM-4. Using these primers and combinations, 1-3 polymorphic bands were observed. An example of fingerprinting experiments performed on agarose gel is shown in Figure 6.
A 6. ábrán feltüntetett három szegregálódó csík azt jelzi, hogy a 27 kultúrnövény-változat hét csoportba sorolható. Az ábrán M jelentése: XPstI molekulatömeg-marker. A sávok felett feltüntetett számok a változatok 1. táblázatban felsorolt számozásának felelnek meg.The three segregating bands shown in Figure 6 indicate that the 27 crop variants can be classified into seven groups. In the figure, M stands for XPstI molecular weight marker. The numbers above the bands correspond to the numbering of the variants listed in Table 1.
A fluoreszcens jelölésű detektálással végzett fingerprint analízis során két MITE-láncindítót (TEM-1 és TEM-10) vizsgáltunk. A TEM-1 alkalmazásával összesen 62 csíkot értékeltünk, melyek közül 37 polimorf volt, a többi 22 pedig mint a 27 kultúrnövény-változat mindegyikében azonos volt. Az elektroforizáló gél egy lemezét a 7. ábrán mutatjuk be. A TEM-10 láncindítóval összesen 60 csíkot detektáltunk, melyek közül 34 volt polimorf, a többi 26 pedig mind a 27 változatban azonosnak bizonyult. A 7. ábrán fel33 tüntetett vonalak azonosító számait Id. az 1. táblázatban.Two MITE primers (TEM-1 and TEM-10) were used in the fingerprint analysis using fluorescent detection. A total of 62 bands were detected using TEM-1, of which 37 were polymorphic and the remaining 22 were identical in all 27 cultivars. A slice of the electrophoresis gel is shown in Figure 7. A total of 60 bands were detected using TEM-10, of which 34 were polymorphic and the remaining 26 were identical in all 27 cultivars. For the identification numbers of the bands shown in Figure 7, see Table 1.
Az 1-27. sávokban a Lina, Canada Park, Alexis, Angora, Ariel, Azhul, Ellice, Express, Fillipa, Goldie, Golf, High amylose Glacier, Igri, Ingrid, Kinnan, Maud, Meltan, Mentor, Mette, Mona, Roland, Saxo, Svani, Tellus, Tofta, Trebon, illetve Vixen változat eredményei láthatók. A gondolatjelek olyan markereket jelölnek, amelyek lehetővé teszik legalább egy változat többi változattól történő megkülönböztetését .Lanes 1-27 show the results of the Lina, Canada Park, Alexis, Angora, Ariel, Azhul, Ellice, Express, Fillipa, Goldie, Golf, High amylose Glacier, Igri, Ingrid, Kinnan, Maud, Meltan, Mentor, Mette, Mona, Roland, Saxo, Svani, Tellus, Tofta, Trebon and Vixen variants. Dashes indicate markers that allow at least one variant to be distinguished from the others.
A TEM-1 és TEM-10 láncindítóval, illetve e két láncindító kombinációjával kapott adatok alapján, a Nei és Li koefficiens [Id. Nei és Li: Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 5269 (1979)] alkalmazásával genetikai hasonlósági (GS) mátrixokat hoztunk létre. Ugyanezen adatsorokból dendrogramokat készítettünk. A TEM-1 és TEM-10 kombinált adatainak dendrogramját a 8. ábrán mutatjuk be. A dendrogram alapján a H. spontaneum vonal egyértelműen elkülöníthető a H. vulgare változatoktól. Az Azhul (hatsoros típusú) változat kivételével a tavaszi kétsoros típusok egy csoportot alkottak, és elkülönültek a négy őszi típustól (Angora, Express, Igri és Vixen). Az őszi kétsoros típusokkal csoportosuló High Amylose Glacier vonal hatsoros típusú. A GS-mátrixnak egy korábbi, RFLP-analízissel kapott mátrixszal végzett összehasonlítása jó egyezést mutatott (Mantel-féle statisztikai érték: Z = 0,69475). Ez a pozitív korreláció igen szignifikáns volt (annak valószínűsége, hogy ez a Z-érték önmagában véletlenszerűen forduljon elő: P = 0,0020).Based on the data obtained with the TEM-1 and TEM-10 primers and the combination of these two primers, genetic similarity (GS) matrices were generated using the Nei and Li coefficient [Id. Nei and Li: Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 5269 (1979)]. Dendrograms were constructed from the same data sets. The dendrogram of the combined TEM-1 and TEM-10 data is shown in Figure 8. Based on the dendrogram, the H. spontaneum line can be clearly distinguished from the H. vulgare varieties. With the exception of the Azhul (six-row type) variety, the spring two-row types formed a group and were separated from the four autumn types (Angora, Express, Igri and Vixen). The High Amylose Glacier line, which grouped with the autumn two-row types, is a six-row type. Comparison of the GS matrix with a previous matrix obtained by RFLP analysis showed good agreement (Mantel statistic: Z = 0.69475). This positive correlation was highly significant (probability of this Z value occurring by chance alone: P = 0.0020).
e) A láncinditó univerzális alkalmazhatóságae) Universal applicability of the chain starter
A láncindítók általános alkalmazhatóságának demonstrálása céljából az állati eredetű alap (master) MITEláncindítókat és a növényi eredetű alap MITE-láncindítókat növényi, rovareredetű és humán genomi DNS-ek amplifikálására alkalmaztuk.To demonstrate the general applicability of the primers, the animal-derived master MITE primers and the plant-derived master MITE primers were used to amplify plant, insect, and human genomic DNAs.
A 9/A-9/D ábrákon 11 különböző DNS-forrás PCRamplifikált mintázatát mutatjuk be. Az amplifikációt TEM-12 alap (master) láncindító alkalmazásával (9/A ábra); TEM-1 alap-láncindító alkalmazásával (9/B ábra); TEM-10 alapláncindító alkalmazásával (9/C ábra); illetve TEM-11 alapláncindító alkalmazásával (9/D ábra) hajtottuk végre (Id. 2. táblázat). A DNS-források a következők voltak (a sávok felett feltüntetett számok szerint):Figures 9/A-9/D show the PCR-amplified patterns of 11 different DNA sources. Amplification was performed using the master primer TEM-12 (Figure 9/A); the master primer TEM-1 (Figure 9/B); the master primer TEM-10 (Figure 9/C); and the master primer TEM-11 (Figure 9/D) (see Table 2). The DNA sources were as follows (according to the numbers above the lanes):
1) Normál humán DNS (férfi);1) Normal human DNA (male);
2) Normál humán DNS (nő);2) Normal human DNA (female);
3) Humán DNS (albino férfi);3) Human DNA (albino male);
4) Humán DNS (albino nő);4) Human DNA (albino woman);
5) Rovar ( Tri chogramma) ;5) Insect (Trichogramma);
6) Hüvelyes (szója);6) Legumes (soybeans);
7) Hüvelyes (lucerna);7) Legumes (alfalfa);
8) Keresztesvirágú (Canola);8) Cruciferous (Canola);
9) Gabona (búza);9) Grain (wheat);
10) Gabona (zab);10) Grain (oats);
11) Gabona (árpa).11) Grain (barley).
Ezek az eredmények egyértelműen azt bizonyítják, hogy a MITE-alapú markerek igen különböző fajokban egyaránt al35 kalmazhatók.These results clearly demonstrate that MITE-based markers can be used equally in very different species.
f) Az alap-láncindítókból származó szekvenciák sokoldalúságaf) Versatility of sequences derived from basic primers
A MITE-elemeken alapuló marker-rendszer sokoldalúságának bemutatása céljából az alap-láncindítók szekvenciáit úgy módosítottuk, hogy 3'-végükhöz egy további nukleotidot kapcsoltunk. Ennek hatása az amplifikált termék specifitásának fokozódásában nyilvánult meg, és különösen hasznosnak bizonyult abban az esetben, ha az alapláncinditóval kapott amplifikációs mintázat túl összetett volt ahhoz, hogy értelmezni lehessen (pl. a Stowaway változatból származó TEM-1 esetén).To demonstrate the versatility of the MITE-based marker system, we modified the sequences of the basic primers by adding an additional nucleotide to their 3'-end. This effect was manifested in the increased specificity of the amplified product and proved to be particularly useful in cases where the amplification pattern obtained with the basic primer was too complex to be interpreted (e.g., in the case of TEM-1 from the Stowaway variant).
A 10/A-10/E ábrákon a TEM-1 alap-láncinditóval végzett elő-amplifikálási lépéssel és a TEM-l-nek megfelelő, kihorgonyzott láncindítókkal (Id. 3. táblázat) végzett amplifikálással kapott eredmények jellemző példáit mutatjuk be. Az ábrákon az árpa-DNS PCR-amplifikációs mintázatai láthatók, összehasonlítva a TEM-1 alap-láncinditóval önmagában kapott mintázatot (10/A ábra); a 3'-végén egy további adenozint tartalmazó TEM-1A kihorgonyzott láncindítóval kapott mintázatot (10/B ábra); a 3'-végén egy további citozint tartalmazó TEM-1C kihorgonyzott láncindítóval kapott mintázatot (10/C ábra); a 3'-végén egy további guanint tartalmazó TEM-1G kihorgonyzott láncindítóval kapott mintázatot (10/D ábra); és a 3'-végén egy további timint tartalmazó TEM-1T kihorgonyzott láncindítóval kapott mintázatot (10/E ábra).Figures 10/A-10/E show typical examples of the results obtained by the pre-amplification step with the TEM-1 basic primer and the amplification with the anchored primers corresponding to TEM-1 (Id. Table 3). The figures show the PCR amplification patterns of barley DNA, comparing the pattern obtained with the TEM-1 basic primer alone (Figure 10/A); the pattern obtained with the TEM-1A anchored primer containing an additional adenosine at the 3'-end (Figure 10/B); the pattern obtained with the TEM-1C anchored primer containing an additional cytosine at the 3'-end (Figure 10/C); the pattern obtained with the TEM-1G anchored primer containing an additional guanine at the 3'-end (Figure 10/D); and a pattern obtained with the anchored primer TEM-1T containing an additional thymine at the 3'-end (Figure 10/E).
··»· *.··' ·*.··»· *.··' ·*.
- 36 Ezen eredmények alapján egyértelműen látható, hogy sokkal egyszerűbb amplifikációs mintázatot kapunk, ha a TEM-1 3'-végéhez adenozint, citozint, timint vagy guanint kapcsolunk. Nyilvánvaló továbbá, hogy a 3'-végen különböző toldalékot tartalmazó láncindítókkal különböző és komplementer amplifikációs mintázatot kapunk.- 36 Based on these results, it is clear that a much simpler amplification pattern is obtained when adenosine, cytosine, thymine or guanine is added to the 3'-end of TEM-1. It is also clear that different and complementary amplification patterns are obtained with primers containing different extensions at the 3'-end.
Általános és kereskedelmi célú alkalmazásokGeneral and commercial applications
Különféle vizsgálatokkal kimutatták, hogy a transzpozícióra képes elemek gyakorlatilag valamennyi, napjainkig tanulmányozott fajban jelen vannak. A retrotranszpozonok a növények genomjában nagy példányszámban találhatók meg. Az Alu-családba tartozó elemek haploid humán genomra vonatkoztatva 5 x 105 példányban találhatók meg, ami minden 5 kilobázisnyi DNS-ben egy Alu-elemet jelent. Ez az elem önmagában a főemlősök genomjának 5 %-át teszi ki [Berg és Howe: Mobile DNA, Washington, American Society of Microbiology (1989)]. A Tyl/copia csoportba tartozó elemek Vicia fajok genomjában akár 106 példányszámban is jelen lehetnek, ami azt jelenti, hogy e fajok genomjának több, mint 2 %-át ilyen elemek teszik ki, bár az egyes fajok között nagy variációk lehetnek [Id. Pearce és mtsai.: Mól. Gén. Genet. 250, 305 (1996)]. A BARE-1 retrotranszpozon kópiaszáma az árpa genomjában 3 x 104, és a genom 6,7 %-át teszi ki [Suoniemi és mtsai.: Plant Molecular Biology 30, 1321 (1996)]. A SanMiguel és mtsai. [Science 274, 765 (1996)] a kukorica Adhl-F gén - mesterséges élesztőkromoszóma (YAC) kiónon izolált - összefüggő, 280 kb-os régiójának szekvenálásával az egymásba illesztett (nested) retrotranszpozon-ismétlődések 37 osztályát azonosították, melyek a klón több, mint 60 %-át tették ki.Various studies have shown that transposable elements are present in practically all species studied to date. Retrotransposons are found in large numbers in the genome of plants. Elements belonging to the Alu family are found in 5 x 10 5 copies in the haploid human genome, which means one Alu element in every 5 kilobases of DNA. This element alone constitutes 5% of the genome of primates [Berg and Howe: Mobile DNA, Washington, American Society of Microbiology (1989)]. Elements belonging to the Tyl/copia group can be present in the genome of Vicia species in up to 10 6 copies, which means that more than 2% of the genome of these species is made up of such elements, although there can be large variations between individual species [Id. Pearce et al.: Mol. Genet. Genet. 250, 305 (1996)]. The BARE-1 retrotransposon has a copy number of 3 x 10 4 in the barley genome, accounting for 6.7% of the genome [Suoniemi et al.: Plant Molecular Biology 30, 1321 (1996)]. By sequencing a contiguous 280 kb region of the maize Adhl-F gene isolated on a yeast artificial chromosome (YAC) clone, SanMiguel et al. [Science 274, 765 (1996)] identified 37 classes of nested retrotransposon repeats, accounting for more than 60% of the clone.
A Tourist és Stowaway elemek [Bureau és Wessler: Plant Cell _4, 1283 (1992); Bureau és Wessler: Plant Cell 6, 907 (1994)] a transzpozícióra képes elemek TIR-osztályának tagjai, bár jelentős mértékben különböznek a szokványos transzpozícióra képes TIR elemcsaládoktól, mint pl. az Ac és En/Spm. A Barfly, amely - hasonlóan a Tourist-hoz és a Stowaway-hez - a transzpozícióra képes TIR elemek újonnan felismert tagja, az árpa xilóz izomeráz génnel van asszociálva. Ezek az elemek - melyeket e típus néhány egyéb elemével együtt MITE-elemeknek nevezünk [Bureau és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 8524 (1996)] - az eddig tanulmányozott növényfajokban nagy mennyiségben találhatók. A MITE-elemek várhatóan az eukarióta-genomokban is nagy kópiaszámban vannak jelen.Tourist and Stowaway elements [Bureau and Wessler: Plant Cell _4, 1283 (1992); Bureau and Wessler: Plant Cell 6, 907 (1994)] are members of the TIR class of transposable elements, although they differ significantly from the conventional transposable TIR element families such as Ac and En/Spm. Barfly, which, like Tourist and Stowaway, is a newly identified member of the transposable TIR element family, is associated with the barley xylose isomerase gene. These elements, which together with some other elements of this type are called MITE elements [Bureau et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 8524 (1996)], are found in high abundance in plant species studied to date. MITE elements are also expected to be present in high copy numbers in eukaryotic genomes.
A transzpozícióra képes elemek univerzalitása és genomban való eloszlásuk arra utal, hogy PCR-alapú géntérképezési eszközként alkalmazhatók. Sinnet és mtsai. [Genomics ]_, 331 (1990)] Alu-specifikus láncindítókat alkalmaztak polimorfizmusok különböző humán DNS-mintákban történő keresésére. Az említett kutatók egyértelműen bebizonyították e polimorfizmusok (melyeket alumorfoknak neveztek el) genomvizsgálati eszközként történő alkalmazhatóságát [Sinnet és mtsai., Id. fentebb], és ezeket az alumorfokat sikeresen alkalmazták az egyik alumorf humán betegséggel való kapcsolatának detektálására [Zietkiewicz és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 8448 (1992)]. Egy copia-szerű retrotranszpozont, a PDRl-et, szintén sikeresen alkalmazták polimorfizmusok vizsgálatára, és - más specifikus láncinditókkal kombinálva - különböző PÍ3um vonalak diagnosztizálására [Lee és mtsai.: Plant Molecular Biology 15, 707 (1990)].The universality of transposable elements and their distribution in the genome suggest that they can be used as a PCR-based gene mapping tool. Sinnet et al. [Genomics ]_, 331 (1990)] Alu-specific primers were used to search for polymorphisms in various human DNA samples. The aforementioned investigators clearly demonstrated the utility of these polymorphisms (which they named alumorphs) as genomic screening tools [Sinnet et al., Id. supra], and these alumorphs were successfully used to detect the association of one of the alumorphs with human disease [Zietkiewicz et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 8448 (1992)]. A copia-like retrotransposon, PDR1, has also been successfully used to screen for polymorphisms and, in combination with other specific primers, to diagnose different P. spp. lines [Lee et al., Plant Molecular Biology 15, 707 (1990)].
A találmány szerinti megoldás értelmében a transzpozícióra képes TIR-elemeket, az ún. MITE-elemeket, árpa-DNS térképezési és fingerprint-készítési eszközeként alkalmazzuk. Ezek az elemek a polimorfizmusok detektálására a szokványos agarózos rendszerben és az automatizált LI-COR DNS-analízis rendszerben egyaránt hasznosnak bizonyultak, továbbá sikeresen alkalmazhatók ezen MGM-markerek (MITEalapú genetikai markerek) létező genetikai kapcsoltsági térképen történő lokalizálására és a H. vulgare fajba tartozó kultúrnövény-változatok DNS-fingerprint analízisére.According to the solution of the invention, transposable TIR elements, so-called MITE elements, are used as a tool for mapping and fingerprinting barley DNA. These elements have proven useful for detecting polymorphisms in both the conventional agarose system and the automated LI-COR DNA analysis system, and can also be successfully used for the localization of these MGM markers (MITE-based genetic markers) on existing genetic linkage maps and for DNA fingerprinting analysis of crop plant variants belonging to the species H. vulgare.
A szokványos agarózgéles detektálási rendszer alkalmazásával kimutattuk, hogy három MITE-láncindítóval és egy retrotranszpozon-láncindítóval 15 tisztán értékelhető polimorfizmus detektáltunk, melyek közül 13 az árpa négy kapcsoltsági csoportján volt lokalizálható. Mindegyik MITEláncindítóval vagy láncindító-kombinációval 10-nél több értékelhető csíkot kaptunk, melyek közül 2-5 bizonyult polimorfnak. Az automatizált LI-COR genotipizáló rendszerben mindkét vizsgált MITE-láncindító közel 100 értékelhető csíkot adott, melyek közül akár 75 is polimorfnak bizonyult. E két láncindító alkalmazásával olyan markereket kaptunk, amelyek az árpa mind a hét kapcsoltsági csoportján lokalizálhatok voltak. Ez a MITE-alapú markerek genomokban megfigyelhető véletlenszerű eloszlását bizonyítja.Using the standard agarose gel detection system, we demonstrated that 15 clearly evaluable polymorphisms were detected with three MITE primers and one retrotransposon primer, of which 13 were localized to the four linkage groups of barley. Each MITE primer or primer combination yielded more than 10 evaluable bands, of which 2-5 were polymorphic. In the automated LI-COR genotyping system, both tested MITE primers yielded nearly 100 evaluable bands, of which up to 75 were polymorphic. Using these two primers, we obtained markers that were localized to all seven linkage groups of barley. This demonstrates the random distribution of MITE-based markers observed in genomes.
A számítógépes szekvencia-hasonlósági keresések eredményeként folyamatosan új MITE-elemek válnak ismertté. A MITE-elemek számának növekedésével, kizárólag MGM-markerek alapján gyakorlatilag bármely - MITE-elemeket nagy példányszámban hordozó - faj részletes kapcsoltsági térképe létrehozható. A fontos gének MGM-markerekkel végzett kapcsoltsági vizsgálatai szintén egyszerűen végrehajthatók. Az ugyanazon fajba tartozó kultúrnövény-változatok közötti - ilyen MITE-alapú láncindítókkal detektált - nagy változékonyság e láncindítók gyakorlati értékét bizonyítja.As a result of computer-based sequence similarity searches, new MITE elements are continuously being identified. As the number of MITE elements increases, detailed linkage maps of virtually any species carrying high MITE element abundance can be generated using MGM markers alone. Linkage studies of important genes using MGM markers can also be easily performed. The high variability among crop varieties of the same species detected with such MITE-based primers demonstrates the practical value of these primers.
Néhány transzpozícióra képes elemről, mint pl. az Aluelemről [Berg és Howe, Id. fentebb; Makalowski és mtsai.: Trends Genet. 10, 188 (1994)] és az egéreredetű B2-elemről [Clemens: Cell 4 9, 157 (1987)] megállapították, hogy gyakran génekkel vannak asszociálva. A MITE-elemeket szintén gyakran azonosítják növényi és egyéb eukarióta génekben. A Stowaway MITE-elemet először a kukorica wx-lokuszában mutációs eseményként ismerték fel [Bureau és Wessler, Id. fentebb] . Több, mint száz génről állapították meg, hogy kódoló vagy nemkódoló régióikban MITE-elemeket tartalmaznak [Bureau és mtsai., Id. fentebb]. A retroelemek állati és növényi génekkel való szoros kapcsolata, illetve a MITEelemek mezőgazdasági terménynövények vagy egyéb növények génjeivel való szoros kapcsolata a gének és génszekvenciák karakterizálásának új módját teszi lehetővé. A transzpozí cióra képes eleinek egyéb típusaival vizsgálatokat végeztek a génszekvenciák izolálása [Nelson és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6686 (1989); Souer és mtsai.: Plant Journal 7, 677 (1995)], a genom-anali zis [Hirochika: Plant Molecular Biology 35, 231 (1997); Lee és mtsai.: Plant Molecular Biology 15, 707 (1990)] és a génstruktúra és génexpresszió terén [White és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 11792 (1994)] .Some transposable elements, such as the Alu element [Berg and Howe, supra; Makalowski et al. Trends Genet. 10, 188 (1994)] and the mouse B2 element [Clemens Cell 4 9, 157 (1987)], have been found to be frequently associated with genes. MITE elements are also frequently identified in plant and other eukaryotic genes. The Stowaway MITE element was first identified as a mutational event in the maize wx locus [Bureau and Wessler, supra]. More than a hundred genes have been identified as containing MITE elements in their coding or noncoding regions [Bureau et al., supra]. The close association of retroelements with animal and plant genes, and the close association of MITE elements with genes of agricultural crops or other plants, provides a new way to characterize genes and gene sequences. Other types of transposable elements have been studied for gene sequence isolation [Nelson et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6686 (1989); Souer et al.: Plant Journal 7, 677 (1995)], genome analysis [Hirochika: Plant Molecular Biology 35, 231 (1997); Lee et al.: Plant Molecular Biology 15, 707 (1990)], and gene structure and expression [White et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 11792 (1994)] .
A találmány szerinti eljárás többféle területen alkalmazható .The method according to the invention can be used in several fields.
1) Kapcsoltsági vizsgálatok1) Connectivity tests
a) Ahogy a találmány leírásában ismertetjük, MITEmarkerek alkalmazásával kapcsoltsági térképek készíthetők. Ehhez szegregálódó populációra és a szülőkre van szükség. A kapcsoltsági térképeket a szegregáció alapján hozzuk létre.a) As described in the description of the invention, linkage maps can be generated using MITE markers. This requires a segregating population and parents. The linkage maps are generated based on the segregation.
b) A fenotípusos sajátsághoz vagy génhez való kapcsoltság szintén analizálható. Ez - a vizsgálat felgyorsítása érdekében - nagy mennyiségű szegregáns analízisével összekapcsolva hajtható végre. Ebben az esetben a MITEláncindítókkal végzett PCR-amplifikációra két szülőt és a fenotípus szintjén (fizikai sajátságban) vagy genetikailag (génben) eltérő utódokat használjuk, hogy azonosíthassuk a polimorf markereket, s ezáltal a feltételezhető kapcsoltságokat .b) Linkage to a phenotypic trait or gene can also be analyzed. This can be done in conjunction with large-scale segregant analysis to speed up the analysis. In this case, two parents and offspring that differ at the phenotypic (physical trait) or genetic (gene) level are used for PCR amplification with MITE primers to identify polymorphic markers and thus putative linkages.
c) Hasonló elvi alappal, az MGM vagy IMP - komplex genetikai kontroll alatt fizikai sajátságokat szabályozó Kvantitatív Sajátság Lokuszokkal (Quantitative Traitc) With a similar principle, MGM or IMP - Quantitative Trait Loci regulating physical traits under complex genetic control
Loci; QTL) való asszociáltsága különböző statisztikai analízisek (pl. egy pontos ANOVA-tesztek, Intervallum Térképezés és Összetett Intervallum Térképezés) alkalmazásával detektálható .Loci; QTL) can be detected using various statistical analyses (e.g. one-way ANOVA tests, Interval Mapping and Composite Interval Mapping).
d) A markerek mezőgazdasági jelentőségű sajátságokkal való kapcsoltságának felismerése után ezek a markerek marker-segítette szelektálásra alkalmazhatók, melyek elősegíthetik a növénynemesítési programok sikerét.d) Once markers are identified as being associated with traits of agricultural importance, these markers can be used for marker-assisted selection, which can facilitate the success of plant breeding programs.
2) DNS-fingerprint'* vizsgálatok2) DNA fingerprinting* tests
Az MGM- és IMP-analízis felhasználható nagy inszert könyvtárak, pl. YAC-k (élesztő mesterséges kromoszómák) és BAC-k (bakteriális mesterséges kromoszómák) létrehozására; a kultúrnövény-változatok azonosításának elősegítésére; génizolálás elősegítésére; valamint marker-konverzióra.MGM and IMP analysis can be used to generate large insert libraries, such as YACs (yeast artificial chromosomes) and BACs (bacterial artificial chromosomes); to aid in the identification of crop plant variants; to aid in gene isolation; and for marker conversion.
a) A létrehozott MGM- és IMP-markerek folytonos szekvenciák egymás alá rendezésének és az ún. kromoszómasétáltatás iránypontjaiként szolgálhatnak.a) The created MGM and IMP markers can serve as landmarks for the alignment of continuous sequences and the so-called chromosome walking.
b) Az MGM- és IMP-módszer egyszerűen alkalmazható a kultúrnövény-változatok és nemesítési vonalak fingerprint-analízisében a pedigrék és genetikai rokonságok megállapítására; a szülő genetikai állományának az utódvonalak genetikai állományához való hozzájárulási arányának meghatározására; továbbá új vonalak és változatok azonosítására.b) The MGM and IMP methods can be easily applied in the fingerprint analysis of crop plant varieties and breeding lines to establish pedigrees and genetic relationships; to determine the contribution ratio of the parental genetic stock to the genetic stock of the progeny lines; and to identify new lines and varieties.
Az MGM-módszer génizolálás elősegítésére és genomi szekvenciák szubklónozására is alkalmazható.The MGM method can also be used to aid gene isolation and subcloning of genomic sequences.
a) Ha egy génhez transzpozícióra képes elemet kapcso t ....a) If a transposable element is linked to a gene ....
- 42 lünk, az MGM - a genomban való általános elterjedtsége révén - jól kihasználható. A génhez kapcsolt transzpozon alapján tervezett láncindítóval· együtt MITE-Iáncindítót alkalmazhatunk, ezáltal a szegélyező szekvencia amplifikálható, mely azután felhasználható a vad típusú gén izolálására. Ezzel a módszerrel - a transzpozonnal jelölt gén szokványos klónozásával összehasonlítva - megtakaríthatunk egy DNS-könyvtár átvizsgálási lépést.- 42 we, the MGM - due to its general distribution in the genome - can be well exploited. A MITE primer can be used together with a primer designed based on the transposon linked to the gene, thereby amplifying the flanking sequence, which can then be used to isolate the wild-type gene. This method - compared to the conventional cloning of the transposon-tagged gene - saves one DNA library screening step.
b) Az MGM - a génizoláláshoz hasonló forgatókönyv szerint - ismert génszekvenciákat szegélyező genomi szekvenciák izolálására alkalmazható. E szegélyező szekvenciák PCRamplifikációjára a MITE-láncindítót az ismert gén szekvenciája alapján tervezett láncindítóval együtt alkalmazzuk.b) MGM can be used to isolate genomic sequences flanking known gene sequences, in a scenario similar to gene isolation. For PCR amplification of these flanking sequences, the MITE primer is used together with a primer designed based on the sequence of the known gene.
c) Egy RFLP-t detektáló DNS-klónból származó láncindítóval és egy MITE-láncindítóval végzett amplifikáció az RFLP-marker PCR-alapú markerré történő átalakítására alkalmazható .c) Amplification with a primer from a DNA clone detecting an RFLP and a MITE primer can be used to convert the RFLP marker into a PCR-based marker.
Bár a találmányt speciális megvalósítási módjain keresztül mutattuk be, a leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.Although the invention has been described in terms of specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art from the description that many changes can be made to the specific embodiments disclosed by us that will still achieve the same or similar results. It is evident that such solutions do not depart from the essence of the inventive idea and remain within the claimed scope of protection.
SzekvencialistaSequentialist
Szekvenciák száma: 35 <210> 1. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 20 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 1. azonosítószámú szekvencia:Number of sequences: 35 <210> Sequence ID No. 1 <211> Number of nucleotides: 20 <212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 1:
rtatttwgga acggagggag 20 <210> 2. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 2. azonosítószámú szekvencia:rtatttwgga acggagggag 20 <210> Sequence ID No. 2 <211> Number of nucleotides: 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 2:
ttkcccaaaa gaactggccc 20 <210> 3. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 18 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 3. azonosítószámú szekvencia:ttkcccaaaa gaactggccc 20 <210> Sequence ID No. 3 <211> Number of nucleotides: 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 3:
tccccaytrt gaccabcc <210> 4. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 17 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 4. azonosítószámú szekvencia:tccccaytrt gaccabcc <210> Sequence ID No. 4 <211> Number of nucleotides: 17 <212> DNA <213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 4:
gtyttnacrt ccatytg 17 < 210> 5. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 20 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 5. azonosítószámú szekvencia:gtyttnacrt ccatytg 17 < 210> Sequence ID No. 5 < 211> Number of nucleotides: 20 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 5:
tcyccattgy grccagccta 18 < 210> 6. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 20 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító <400> 6. azonosítószámú szekvencia:tcyccattgy grccagccta 18 < 210> Sequence ID No. 6 < 211> Number of nucleotides: 20 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 6:
ccttytaamn gaacaasccc 20 <210> 7. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 7. azonosítószámú szekvencia:ccttytaamn gaacaasccc 20 <210> Sequence ID No. 7 <211> Number of nucleotides: 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 7:
aattmytttt gcaccaacct 20 <210> 8. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 8. azonosítószámú szekvencia:aattmytttt gcaccaacct 20 <210> Sequence ID No. 8 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 8:
rtatttwgga acggagggag a 21 < 210> 9. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 21 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 9. azonosítószámú szekvencia:rtatttwgga acggagggag a 21 < 210> Sequence ID No. 9 < 211> Number of nucleotides: 21 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 9:
rtatttwgga acggagggag c 21 < 210> 10. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 10. azonosítószámú szekvencia:rtatttwgga acggagggag c 21 < 210> Sequence ID No. 10 < 211> Number of nucleotides: 21 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 10:
rtatttwgga acggagggag g 21 <210> 11. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 11. azonosítószámú szekvencia:rtatttwgga acggagggag g 21 <210> Sequence ID No. 11 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 11:
rtatttwgga acggagggag t 21 <210> 12. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 12. azonosítószámú szekvencia:rtatttwgga acggagggag t 21 <210> Sequence ID No. 12 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 12:
ccttytaamn gaacaasccc a 21 <210> 13. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 13. azonosítószámú szekvencia:ccttytaamn gaacaasccc a 21 <210> Sequence ID No. 13 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 13:
ccttytaamn gaacaasccc c 21 <210> 14. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 14. azonosítószámú szekvencia:ccttytaamn gaacaasccc c 21 <210> Sequence ID No. 14 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 14:
ccttytaamn gaacaasccc g 21 <210> 15. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 15. azonosítószámú szekvencia:ccttytaamn gaacaasccc g 21 <210> Sequence ID No. 15 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 15:
ccttytaamn gaacaasccc t 21 <210> 16. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 16. azonosítószámú szekvencia:ccttytaamn gaacaasccc t 21 <210> Sequence ID No. 16 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 16:
ttkcccaaaa gaactggccc a 21 < 210> 17. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 21 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 17. azonosítószámú szekvencia:ttkcccaaaa gaactggccc a 21 < 210> Sequence ID No. 17 < 211> Number of nucleotides: 21 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 17:
ttkcccaaaa gaactggccc c 21 <210> 18. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 18. azonosítószámú szekvencia:ttkcccaaaa gaactggccc c 21 <210> Sequence ID No. 18 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 18:
ttkcccaaaa gaactggccc g 21 < 210> 19. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 21 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító <400> 19. azonosítószámú szekvencia:ttkcccaaaa gaactggccc g 21 < 210> Sequence ID No. 19 < 211> Number of nucleotides: 21 < 212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 19:
ttkcccaaaa gaactggccc t 21 <210> 20. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 18 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 20. azonosítószámú szekvencia:ttkcccaaaa gaactggccc t 21 <210> Sequence ID No. 20 <211> Number of nucleotides: 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 20:
gtyttnacrt ccatytga <210> 21. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 18 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncinditó <400> 21. azonosítószámú szekvencia:gtyttnacrt ccatytga <210> Sequence ID No. 21 <211> Number of nucleotides: 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 21:
gtyttnacrt ccatytgc 18 <210> 22. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 18 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 22. azonosítószámú szekvencia:gtyttnacrt ccatytgc 18 <210> Sequence ID No. 22 <211> Number of nucleotides: 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 22:
gtyttnacrt ccatytgg 18 <210> 23. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 18 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 23. azonosítószámú szekvencia:gtyttnacrt ccatytgg 18 <210> Sequence ID No. 23 <211> Number of nucleotides: 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 23:
gtyttnacrt ccatytgt 18 <210> 24. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 19 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 24. azonosítószámú szekvencia:gtyttnacrt ccatytgt 18 <210> Sequence ID No. 24 <211> Number of nucleotides: 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 24:
tccccaytrt gaccabcca 19 <210> 25. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 19 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 25. azonosítószámú szekvencia:tccccaytrt gaccabcca 19 <210> SEQ ID NO: 25 <211> Number of nucleotides: 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> SEQ ID NO: 25:
tccccaytrt gaccabccc 19 <210> 26. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 19 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 26. azonosítószámú szekvencia:tccccaytrt gaccabccc 19 <210> SEQ ID NO: 26 <211> Number of nucleotides: 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> SEQ ID NO: 26:
tccccaytrt gaccabccg 19 <210> 27. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 19 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncinditó <400> 27. azonosítószámú szekvencia:tccccaytrt gaccabccg 19 <210> SEQ ID NO: 27 <211> Number of nucleotides: 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> SEQ ID NO: 27:
tccccaytrt gaccabcct 19 <210> 28. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncinditó <400> 28. azonosítószámú szekvencia:tccccaytrt gaccabcct 19 <210> Sequence ID No. 28 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 28:
tcyccattgy grccagccta a 21 <210> 29. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 29. azonosítószámú szekvencia:tcyccattgy grccagccta a 21 <210> Sequence ID No. 29 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 29:
tcyccattgy grccagccta c 21 <210> 30. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 30. azonosítószámú szekvencia:tcyccattgy grccagccta c 21 <210> Sequence ID No. 30 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 30:
tcyccattgy grccagccta g 21 <210> 31. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 31. azonosítószámú szekvencia:tcyccattgy grccagccta g 21 <210> Sequence ID No. 31 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 31:
tcyccattgy grccagccta t 21 <210> 32. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncindító <400> 32. azonosítószámú szekvencia:tcyccattgy grccagccta t 21 <210> Sequence ID No. 32 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 32:
aattmytttt gcaccaacct a 21 <210> 33. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Mesterséges láncinditó <400> 33. azonosítószámú szekvencia:aattmytttt gcaccaacct a 21 <210> Sequence ID No. 33 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Artificial primer <400> Sequence ID No. 33:
aattmytttt gcaccaacct c 21 <210> 34. azonosítószámú szekvencia <211> nukleotidok száma: 21 <212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> Mesterséges láncindító < 400> 34. azonosítószámú szekvencia:aattmytttt gcaccaacct c 21 <210> Sequence ID No. 34 <211> Number of nucleotides: 21 <212> DNA < 213> Artificial sequence < 223> Artificial primer < 400> Sequence ID No. 34:
aattmytttt gcaccaacct g 21 < 210> 35. azonosítószámú szekvencia < 211> nukleotidok száma: 21 < 212> DNS <213> Mesterséges szekvenciaaattmytttt gcaccaacct g 21 < 210> Sequence ID No. 35 < 211> Number of nucleotides: 21 < 212> DNA <213> Artificial sequence
- 53 <223> Mesterséges láncinditó <400> 35. azonosítószámú szekvencia: aattmytttt gcaccaacct t- 53 <223> Artificial primer <400> Sequence ID 35: aattmytttt gcaccaacct t
Claims (20)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12746099P | 1999-04-01 | 1999-04-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0201423A2 true HUP0201423A2 (en) | 2002-08-28 |
| HUP0201423A3 HUP0201423A3 (en) | 2004-12-28 |
Family
ID=22430239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0201423A HUP0201423A3 (en) | 1999-04-01 | 2000-03-30 | A novel type of transposon-based genetic marker |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1163370A2 (en) |
| JP (1) | JP2002540799A (en) |
| CN (1) | CN1351671A (en) |
| AU (1) | AU3547800A (en) |
| CA (1) | CA2371128A1 (en) |
| CZ (1) | CZ20013532A3 (en) |
| HK (1) | HK1047139A1 (en) |
| HU (1) | HUP0201423A3 (en) |
| PL (1) | PL351816A1 (en) |
| RU (1) | RU2279482C2 (en) |
| WO (1) | WO2000060113A2 (en) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2417704A1 (en) * | 2000-08-02 | 2003-01-31 | Japan Tobacco Inc. | Markers for detecting genomic polymorphisms in plant based on transposable elements and a method for producing thereof |
| FI112093B (en) * | 2002-01-30 | 2003-10-31 | Boreal Plant Breeding Ltd | Procedure and test kit for determining genetic identity |
| CN105567809A (en) * | 2004-12-17 | 2016-05-11 | 国立大学法人东京大学 | Method of identifying gene with variable expression |
| CA2598737C (en) * | 2005-03-03 | 2015-05-12 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Reverse progeny mapping |
| JP5563206B2 (en) * | 2007-07-24 | 2014-07-30 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Rice variety identification method |
| CN101280338B (en) * | 2007-12-13 | 2011-08-17 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | Nucleic acid amplification method for detecting polymorphism of nucleic acid |
| RU2392330C2 (en) * | 2008-04-16 | 2010-06-20 | Геннадий Тихонович Сухих | Method of genetical variability detection in animal cell culture of different passage rate |
| RU2386698C1 (en) * | 2008-11-24 | 2010-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН | Method of identifying transgenic dna sequences in plant material and products based on plant material |
| TWI414607B (en) * | 2009-06-03 | 2013-11-11 | Kaohsiung Distr Agricultural Res And Extension Station Council Of Agriculture | Method to establish a molecular marker for detecting polymorphism in plant genome and the molecular marker establised thereby |
| DK3110975T3 (en) * | 2014-02-27 | 2021-10-11 | Jumpcode Genomics Inc | METHODS FOR ANALYSIS OF SOMATIC MOBILE ELEMENTS AND USES THEREOF |
| JP6860936B2 (en) * | 2015-12-02 | 2021-04-21 | ウニヴェルズィテート バーゼル | Mobilization of transposable factors to enhance genetic and epigenetic variability in the population |
| CN106868119B (en) * | 2017-02-14 | 2021-04-30 | 山东农业大学 | SSR marker primer group for identifying genetic relationship of robinia pseudoacacia germplasm resources and application thereof |
| WO2018211477A1 (en) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | Pharmacogenetics Limited | Genome-wide capture of inter-transposable element segments for genomic sequence analysis of human dna samples with microbial contamination |
| KR101998526B1 (en) * | 2018-10-23 | 2019-07-09 | 경희대학교 산학협력단 | A primer set for detecting active transposon PTE-1 in Chinese cabbage transformants |
| CN111455087B (en) * | 2020-05-12 | 2023-01-06 | 江苏省农业科学院 | Novel molecular marker, primer pair, molecular marker design method and application developed based on kidney bean CACTA transposon |
| CN113817838B (en) * | 2021-08-31 | 2025-03-25 | 皖南医学院 | A dust mite microsatellite marker, primers and applications thereof, and a method for obtaining the primers |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2245501A1 (en) * | 1996-02-02 | 1997-08-07 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Use of primers for universal fingerprint analysis |
-
2000
- 2000-03-30 AU AU35478/00A patent/AU3547800A/en not_active Abandoned
- 2000-03-30 JP JP2000609602A patent/JP2002540799A/en active Pending
- 2000-03-30 CA CA002371128A patent/CA2371128A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-30 EP EP00913997A patent/EP1163370A2/en not_active Withdrawn
- 2000-03-30 CZ CZ20013532A patent/CZ20013532A3/en unknown
- 2000-03-30 WO PCT/CA2000/000351 patent/WO2000060113A2/en not_active Ceased
- 2000-03-30 HK HK02108603.0A patent/HK1047139A1/en unknown
- 2000-03-30 PL PL00351816A patent/PL351816A1/en unknown
- 2000-03-30 RU RU2001129366/13A patent/RU2279482C2/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 HU HU0201423A patent/HUP0201423A3/en unknown
- 2000-03-30 CN CN00807651A patent/CN1351671A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL351816A1 (en) | 2003-06-16 |
| CA2371128A1 (en) | 2000-10-12 |
| HK1047139A1 (en) | 2003-02-07 |
| WO2000060113A2 (en) | 2000-10-12 |
| WO2000060113A3 (en) | 2001-04-05 |
| CN1351671A (en) | 2002-05-29 |
| CZ20013532A3 (en) | 2002-03-13 |
| JP2002540799A (en) | 2002-12-03 |
| AU3547800A (en) | 2000-10-23 |
| EP1163370A2 (en) | 2001-12-19 |
| HUP0201423A3 (en) | 2004-12-28 |
| RU2279482C2 (en) | 2006-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cheng et al. | Microsatellite markers for genetic mapping in the chicken | |
| Jiang et al. | Genome wide sampling sequencing for SNP genotyping: methods, challenges and future development | |
| Poczai et al. | Advances in plant gene-targeted and functional markers: a review | |
| Jenkins | New dinucleotide and trinucleotide microsatellite marker resources for cotton genome research | |
| Davila et al. | Comparison of RAMP and SSR markers for the study of wild barley genetic diversity | |
| US20100223293A1 (en) | Polymorphic Markers and Methods of Genotyping Corn | |
| US20110008793A1 (en) | Maize Polymorphisms and Methods of Genotyping | |
| US20090208964A1 (en) | Soybean Polymorphisms and Methods of Genotyping | |
| US20100240061A1 (en) | Soybean Polymorphisms and Methods of Genotyping | |
| JPH05505528A (en) | How to differentiate nucleic acids based on nucleotide differences | |
| HUP0201423A2 (en) | A novel type of transposon-based genetic marker | |
| FI112093B (en) | Procedure and test kit for determining genetic identity | |
| US20120174254A1 (en) | Maize genomic marker set | |
| US20070192909A1 (en) | Methods for screening for gene specific hybridization polymorphisms (GSHPs) and their use in genetic mapping ane marker development | |
| Caetano-Anolles et al. | Nucleic acid markers in agricultural biotechnology. | |
| US20070048768A1 (en) | Methods for screening for gene specific hybridization polymorphisms (GSHPs) and their use in genetic mapping and marker development | |
| Silflow et al. | Molecular mapping of genes for flagellar proteins in Chlamydomonas | |
| Xu | Molecular breeding tools: markers and maps. | |
| Rollins | The characterization and inheritance of chromosomal variation in Glomerella graminicola | |
| Alsohim et al. | Molecular markers and transposon mutagenesis for genes identification | |
| US20250207208A1 (en) | Markers for Iron Deficiency Chlorosis | |
| Casa | Heartbreaker (Hbr)-based markers for genetic and evolutionary analyses in maize (Zea mays L.) | |
| Kresovich | Multiple methods for the identification of polymorphic simple sequence r'epeatslSSRs) in sorghum [Sorghum bicolortL.) MOenchl | |
| ALMAS | 1.3. Molecular markers and their potential roles in genetic management | |
| Monteiro-Vitorello et al. | ESTABLISHMENT OF A GENETIC PLATFORM TO STUDY SPORISORIUM SCITAMINEUM IN BRAZIL |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD9A | Lapse of provisional protection due to non-payment of fees |