HUT72848A - Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin - Google Patents
Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin Download PDFInfo
- Publication number
- HUT72848A HUT72848A HU9502318A HU9502318A HUT72848A HU T72848 A HUT72848 A HU T72848A HU 9502318 A HU9502318 A HU 9502318A HU 9502318 A HU9502318 A HU 9502318A HU T72848 A HUT72848 A HU T72848A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- dna sequence
- transformed
- dna
- cells
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 91
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical class OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 7
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 9
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 32
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 9
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 description 9
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002933 immunoreactive insulin Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 2
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 tPA Proteins 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 240000001546 Byrsonima crassifolia Species 0.000 description 1
- 235000003197 Byrsonima crassifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000020054 awamori Nutrition 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát B-Pg-A képletű inzulin prekurzorokat kódoló DNS-szekvenciák képezik, ahol B és A sorrendben az inzulin B- és A-láncát jelenti, Pg pedig módosított C-peptidet jelöl, vagy akárhány aminosavat, melyek legalább egy N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi egy eljárás is inzulin és más gyógyászatilag jelentős peptidek és fehéijék előállítására, alkalmas gazdasejtek, előnyösen gombasejtek tenyésztése útján, melyek olyan vektorral vannak transzformálva, amely az említett képlet szerinti inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik olyan DNSszekvenciák is, melyek gyógyászatilag jelentős peptideket és fehérjéket kódolnak, melyekben valamely távtartó-régióban egy nem esszenciális helyre N-glikozilálási konszenzus szekvencia van bejuttatva, a peptid vagy protein nagyobb mértékű expressziója vagy szekréciója elérésének céljából. Aktaszámunk: 82284-5076/PÁThe present invention relates to DNA sequences encoding insulin precursors of the formula B-Pg-A, wherein B and A are the B and A chains of insulin, and Pg represents a modified C-peptide or any number of amino acids having at least one N-glycosylation. consensus sequence. The present invention also provides a method of producing insulin and other pharmaceutically important peptides and proteins by culturing suitable host cells, preferably fungal cells, which are transformed with a vector comprising the DNA sequence encoding the insulin precursor of said formula. The invention also relates to DNA sequences encoding pharmaceutically important peptides and proteins in which a N-glycosylation consensus sequence is introduced in a spacer region to achieve a higher expression or secretion of the peptide or protein. Our number: 82284-5076 / PÁ
Description
Bioszintetikus inzulinprekurzorokat kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó transzformált sejtek és eljárások inzulin, valamint egyéb gyógyászatilag jelentős peptidek és fehérjék előállításáraDNA sequences encoding biosynthetic insulin precursors, transformed cells and methods containing these sequences for the production of insulin and other pharmaceutically significant peptides and proteins
A találmány tárgyát bioszintetikus inzulinprekurzorokat kódoló DNSszekvenciák képezik, valamint eljárások inzulin és egyéb gyógyászatilag jelentős peptidek és fehérjék előállítására, az említett DNS-szekvenciákat hordozó transzformált sejtek alkalmazásával.The present invention relates to DNA sequences encoding biosynthetic insulin precursors, and methods for producing insulin and other pharmaceutically significant peptides and proteins using transformed cells carrying said DNA sequences.
Az inzulin egy hormon, melynek elsődleges szerepe a glükóz transzport szabályozása, a véráramból azokba a sejtekbe, ahol a glükóz metabolizálódik.Insulin is a hormone whose primary function is to regulate glucose transport from the bloodstream to the cells where glucose is metabolized.
Az inzulin két aminosavláncból áll: a 21 aminosavból álló A-láncból, valamint a 30 aminosavból álló B-láncból, és a láncokat két diszulfid-híd köti össze. Egy harmadik diszulfid-híd pedig az A-láncon belül található.Insulin consists of two amino acid chains: the 21-amino acid A chain and the 30-amino acid B chain, and the chains are linked by two disulfide bridges. A third disulfide bridge is located inside the A-chain.
Az inzulinmolekula elsődleges formája egyetlen polipeptid-lánc formájában szintetizálódik, melyet preproinzulinnek neveznek, amely egy szignál-pepiidből és a proinzulinból áll. A szignál-peptid irányítja az újonnan keletkezett polipeptid-lánc endoplazmatikus endoplazmatikus retikulumba történő bejutását. Az endoplazmatikus retikulum belső terében a preproinzulinból proinzulin keletkezik, mihelyt a polipeptid-lánc átjut azThe primary form of the insulin molecule is synthesized in the form of a single polypeptide chain, called preproinsulin, which consists of a signal peptide and proinsulin. The signal peptide directs the entry of the newly formed polypeptide chain into the endoplasmic endoplasmic reticulum. Inside the endoplasmic reticulum, preproinsulin produces proinsulin as soon as the polypeptide chain passes through
Aktaszámunk: 82284-5076/PÁOur file number is 82284-5076 / PA
-2endoplazmatikus retikulum membránján. A proinzulin tartalmaz egy 35 aminosavból álló láncot is, amely az inzulinban nincs jelen. Ez a kapcsolópeptid vagy C-peptid a későbbi inzulinmolekula B-láncának C-terminális végét kapcsolja a későbbi inzulinmolekula A-láncának N-terminális végéhez. Az endoplazmatikus retikulum belső teréből a proinzulin a Golgi-készülékbe szállítódik, ahol megkezdődik a kapcsolópeptid proteolizise. A kapcsolóvagy C-peptidet egy olyan enzimrendszer hasítja ki, amely hasonló a tripszin/karboxipeptidáz-B-rendszerhez. A hasító enzimrendszer a két egymást követő bázisos aminosavat tartalmazó szekvenciarészletnél hat, és inzulin keletkezik [Steiner és mtsai.: J. Cell. Bioi. 24,121 (1984)].-2endoplasmic reticulum membrane. Proinsulin also contains a 35 amino acid chain that is not present in insulin. This linker peptide or C-peptide binds the C-terminus of the B-chain of the subsequent insulin molecule to the N-terminal end of the A-chain of the subsequent insulin molecule. From the interior of the endoplasmic reticulum, proinsulin is transported to the Golgi apparatus, where proteolysis of the coupling peptide begins. The linker or C peptide is cleaved by an enzyme system similar to the trypsin / carboxypeptidase B system. The cleaving enzyme system acts on the sequence containing two consecutive basic amino acids and produces insulin [Steiner et al., J. Cell. Biol. 24, 121 (1984)].
A C-peptid jelentősége abban áll, hogy összekapcsolja a B- és Aláncokat, és ily módon lehetővé teszi, hogy a diszulfíd-hidak az inzulinmolekulán belül megfelelő módon alakuljanak ki [Bell és mtsai.: Natúré 284, 26 (1980)], valamint abban, hogy elősegíti, hogy a tripszinszerü konvertáló enzim a proinzulint a kétbázisos aminosavat tartalmazó helyen hasítsa el [Thim és mtsai.: PNAS, 83, 6766 (1986)].The importance of C-peptide is to link B and Al chains, thereby allowing disulfide bridges to form properly within the insulin molecule (Bell et al., Natur. 284, 26 (1980)), and in promoting that the trypsin-like converting enzyme cleaves proinsulin at the site containing the two-base amino acid (Thim et al., PNAS, 83, 6766 (1986)).
Bioszintetikus humán inzulin előállítását elsősorban Escherichia coli baktériumban és Saccharomyces cerevisiae élesztőben írták le. Minden leírt rendszer vonatkozásában elmondható, hogy az expresszált DNS-szekvencia vagy a teljes proinzulin kódolja, vagy a proinzulin egy módosított részletét, vagy az A- és B-láncokat külön-külön.The production of biosynthetic human insulin has been described primarily in Escherichia coli and in yeast Saccharomyces cerevisiae. For each of the systems described, the expressed DNA sequence is either encoded by the whole proinsulin, or by a modified portion of the proinsulin, or by the A and B chains separately.
Az E. coli baktériumban az inzulint egyrészt termeltették különálló Aés B-láncok formájában [Chance és mtsai.: Diabetes Care 4, 147 (1982)], másrészt pedig proinzulin formájában (EP 55945).Insulin in E. coli has been produced in the form of separate A and B chains (Chance et al., Diabetes Care 4: 147 (1982)) and proinsulin (EP 55945).
• · · · ·• · · · ·
-3Az S. cerevisiae élesztőben az inzulint proinzulinon keresztül termeltették, bár meglehetősen alacsony kitermeléssel (EPA 121884). A C-peptid bizonyos módosításai élesztőben fokozzák az inzulinkitermelést és segítik az inzulinmolekula helyes térszerkezetének kialakulását.-3In S. cerevisiae yeast, insulin was produced via proinsulin, albeit in a relatively low yield (EPA 121884). Certain modifications of the C-peptide in yeast increase insulin production and aid in the proper formation of the insulin molecule.
A DK-A-5284/87 számú szabadalmi bejelentéshez mellékelt leírásban B-X-A képlettel jellemezhető inzulin prekurzorokat tárnak fel, amely képletben B és A az inzulin B- és A-láncait jelenti, X pedig egy 2-35 aminosavat tartalmazó peptidet.DK-A-5284/87 discloses an insulin precursor having the formula B-X-A, wherein B and A represent the B and A chains of insulin and X is a peptide comprising 2 to 35 amino acids.
Az EP-A-195.691 számú szabadalmi bejelentéshez csatolt találmányi leírás B-X-Y-A képlettel jellemezhető inzulin prekurzorokat tár fel, mely képletben B és A az inzulin B- és A-láncát jelzi, X és Y pedig vagy lizint vagy arginint jelöl.EP-A-195,691 discloses an insulin precursor having the formula B-X-Y-A, wherein B and A represent the B and A chains of insulin and X and Y represent either lysine or arginine.
Az EP-A-163.529 számú szabadalmi bejelentéshez mellékelt leírás olyan inzulinprekurzorokat tár fel, melyek a B(l-29)-A(l-21)-láncokat tartalmazzák, melyeket egy rövid, 2-8 aminosavból álló peptid köt össze. Az EP-A-347.845 számú szabadalmi bejelentéshez mellékelt leírás a deszB(30)-inzulin prekurzor olyan módosításait tálja fel, melyek a következő képlettel jellemezhetők: B( 1 -29)-Xi-X2- Y2- Yi-A( 1-21).EP-A-163 529 discloses insulin precursors comprising B (1-29) -A (1-21) chains linked by a short peptide of 2-8 amino acids. The specification appended to EP-A-347,845 discloses modifications of the deszB (30) insulin precursor having the formula: B (1 -29) -X 1 -X 2 -Y 2 -Y 1 -A (1-) 21).
Az EP 249.350 számú szabadalmi leírás fehérjék gombasejtekben történő termelésére és szekretálására alkalmas glükoamiláz-promótert és szignálszekvenciát tár fel. A leírásban példaként egy háromszorosan ismétlődő proinzulin szekvenciát is bejuttattak egy ilyen expressziós vektorba, és expresszálták.EP 249,350 discloses a glucoamylase promoter and signal sequence useful for the production and secretion of proteins in fungal cells. By way of example, a triple-repetitive proinsulin sequence has also been introduced and expressed into such an expression vector.
-4Sok terápiás és diagnosztikai célra alkalmas polipeptid - például az eritropoietin, a tPA és a VlII.faktor - N-glikozilálva van [Parekh és mtsai.: TIBTECH7, 117(1989)].Many therapeutic and diagnostic polypeptides, such as erythropoietin, tPA, and factor VIII, are N-glycosylated (Parekh et al., 1989, TIBTECH7, 117).
Azt is kimutatták, hogy a marha kimozin (glikokimozin) termelődésének szintje a A. niger var. awamori gombában háromszorosára emelkedett, amennyiben a kódoló szekvenciába beépítettek egy N-glikozilálási konszenzus szekvencia részletet. Még magasabb kitermelést lehetett elérni abban az esetben, hogyha a prokimozingént a glükoamilázgénnel fúzionáltatták, de amennyiben a glikokimozingént fúzionáltatták a glükoamilázgénnel, további növekedés nem volt tapasztalható a kitermelésben [Berka és mtsai.: Biochem. Soc. Trans. 19, 681 (1991)].It has also been shown that bovine chymosin (glycochymosin) production levels of A. niger var. in awamori fungi, if an N-glycosylation consensus sequence fragment was incorporated into the coding sequence. Even higher yields could be achieved when the prochymosin gene was fused to the glucoamylase gene, but when the glycochymosin gene was fused to the glucoamylase gene, no further increase in yield was observed [Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19: 681 (1991)].
Az aszparaginsav protenáz (renin) esetében, amely egy mikrobiális eredetű enzim és a kimozint helyettesíti, kimutatták, hogy a hiperglikolizáció csökkentheti az enzim aktivitását, amennyiben a molekula egy kritikus helyén történik [Berka és mtsai.: Biochem. Soc. Trans. 19, 681 (1991); Aikawa és mtsai.: J. Bioi. Chem. 265,13955 (1990)].In the case of aspartic protenase (renin), which is an enzyme of microbial origin and replaces chymosin, it has been shown that hyperglycolization can reduce the activity of the enzyme if it occurs at a critical site of the molecule [Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19: 681 (1991); Aikawa et al., J. Bioi. Chem., 1990, 265, 13969.
Amennyiben a renin kódoló régiójában egy glikolizált aszparagint elmutáltatnak, élesztő sejtekben az enzim szekréciójában jelentős csökkenést tapasztaltak [Aikawa és mtsai.: J. Bioi. Chem. 265,13955 (1990)].When a glycolized asparagine is mutated in the coding region of renin, a significant decrease in enzyme secretion has been observed in yeast cells (Aikawa et al., J. Bioi. Chem., 1990, 265, 13969.
A találmány tárgyát új bioszintetikus inzulin prekurzorokat kódoló DNS-szekvenciák képezik, valamint eukarióta sejtek, különösen gombasejtek alkalmazása inzulin előállítására.The present invention relates to DNA sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and to the use of eukaryotic cells, in particular fungal cells, for the production of insulin.
A találmányt tárgyát közelebbről olyan DNS-szekvenciák képezik, melyek a B-Pg-A képlettel jellemezhető inzulin prekurzorokat kódolnak, ahol B és A az inzulin B- és A-láncait jelenti, Pg pedig egy módosított C• · · · ♦ « * ilMore particularly, the present invention relates to DNA sequences encoding insulin precursors of the formula B-Pg-A, wherein B and A represent the B and A chains of insulin and Pg is a modified C?
-5peptidet jelöl, amely akárhány aminosavat tartalmazhat, de tartalmaz legalább egy N-glikozilálási konszenzus szekvenciarészletet. A Pg-szekvencia a B- és az A-láncokat preteolitikus hasítóhelyeken vagy specifikus kémiai hasítóhelyeken keresztül köti össze.Denotes a peptide of -5 which may contain any amino acid but contains at least one N-glycosylation consensus sequence fragment. The Pg sequence binds the B and A chains through preteolytic cleavage sites or specific chemical cleavage sites.
A proinzulingén módosítását előnyösen az AsnXSer képletű Nglikozilálási szekvencia kiépítésével hajtjuk végre. Ezt elérhetjük például úgy, hogy a C-peptid szekvenciájában megváltoztatjuk az Ala-C-20 amimosavat kódoló GCC-kódont Asn aminosavat kódoló AAC-kódonra.Modification of the proinsulin gene is preferably accomplished by constructing the Ng glycosylation sequence of AsnXSer. This can be achieved, for example, by changing the GCC coding for the Ala-C-20 amino acid in the C-peptide sequence to the AAC coding for the Asn amino acid.
Hasonló módon alakíthatjuk át a desz-B(30) proinzulint is.Similarly, des-B (30) proinsulin can be converted.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a RIA-eljárással meghatározható immunreaktív inzulin termelődésének mértéke lényegesen nagyobb olyan transzformánsokban, amelyek egy védőfehérjéhez fuzionáltatott B-Pg-A képletű proinzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mint azokban a transzformánsokban, melyek védőfehérjéhez fuzionáltatott módosítatlan szekvenciájú proinzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. Azok a sejtek, melyek nem fuzionált proinzulint vagy nem fuzionált módosított N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó proinzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaztak, rendkívül kis mértékben termeltek RIAeljárással kimutatható immunreaktív inzulint, vagy egyáltalán nem termeltek ilyet.The present invention is based on the discovery that the production of immunoreactive insulin, as determined by the RIA, is significantly higher in transformants containing a DNA sequence encoding proinsulin B-Pg-A fused to a protective protein than in those transformed with a fusion protein that is fused to a protective protein. encoding DNA sequence. Cells containing the DNA sequence encoding a non-fused proinsulin or a pro-insulin encoding a non-fused modified N-glycosylation consensus sequence produced very little or no RIA detectable immunoreactive insulin.
Megállapíthatjuk tehát, hogy amennyiben a távtartó-régióba Nglikozilálási konszenzus szekvenciát juttatunk, amely szekvencia az érett inzulin molekulának nem része, az említett fuzionált inzulin prekurzorokat kódoló DNS-szekvenciával transzformált gombasejtekben az expresszió mértéke jelentősen fokozódik. A fuzionált protein vagy magában a gazdaszerveil • · · · · * · · · · • · · «· · · • · · · · · *Thus, it can be stated that when a Nglycosylation consensus sequence is inserted into the spacer region, which sequence is not part of the mature insulin molecule, the degree of expression in the fungal cells transformed with the DNA sequence encoding said fused insulin precursors is significantly increased. The fused protein, or the host organism itself, is a fusion protein.
-6zetben átalakul érett inzulin molekulává, vagy átalakítható későbbi enzimatikus vagy kémiai lépések alkalmazásával is.It can either be converted into a mature insulin molecule, or it can also be converted by subsequent enzymatic or chemical steps.
A találmány szerinti módosított inzulin prekurzorokat kódoló DNSszekvenciát előállíthatjuk a teljes DNS-szekvencia kémiai szintézise útján, de alkalmazhatunk PCR-eljárást vagy in vitro mutagenézist is. Az említett kódoló szekvenciákat kódonhasználat szempontjából optimizálhatjuk, annak érdekében, hogy az alkalmazott gazdaszervezetben, előnyösen egy gombatörzsben a fehérjetermék expressziója fokozódjék.The DNA sequence encoding the modified insulin precursors of the present invention may be prepared by chemical synthesis of the entire DNA sequence, but may also be performed by PCR or in vitro mutagenesis. Said coding sequences may be optimized for codon usage in order to increase expression of the protein product in the host used, preferably in a fungal strain.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás inzulin előállítására, mely eljárás szerint alkalmas sejteket, előnyösen gombasejteket, melyek a B-Pg-A képletü inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvenciával vannak transzformálva, alkalmas táptalajban tenyésztünk.The present invention also provides a method of producing insulin, which comprises culturing suitable cells, preferably fungal cells, transformed with the DNA sequence encoding the insulin precursor B-Pg-A in a suitable medium.
A fenti képletü peptid expresszióját és szekrécióját olyan vektor alkalmazásával valósíthatjuk meg, melyben a kódoló szekvencia a kiválasztott gazdaszervezetben működőképes promóter, szignálszekvencia és terminátor szabályozása alatt áll. Ilyen szabályozó szekvenciaként alkalmazhatjuk például az aszpergilusz fajban történő expressziót lehetővé tévő PgiaAszekvenciát, valamint a glaA-gén szignál szekvenciáját, vagy annak egy részletét [Cullen és mtsai.: Biotechnology, 5, 369 (1987)]. A találmány szerinti pepiidet expresszióját és szekrécióját megvalósíthatjuk olyan expressziós vektor alkalmazásával is, melyben a fenti képletü inzulin prekurzort kódoló DNS-szekvencia egy védőfehérjét kódoló génnel van fuzionáltatva, valamilyen enzimatikusan vagy kémiai úton hasítható szekvenciarészleten keresztül [Ward és mtsai.: Biotechnology 8, 435 (1990); Broekhuijsen és mtsai.: J. Biotech. 135, (1993)].Expression and secretion of the peptide of the above formula may be accomplished using a vector in which the coding sequence is under the control of a promoter, signal sequence and terminator operable in the selected host. Such a regulatory sequence may be, for example, the PgiaA sequence which permits expression in the aspergillus species and the signal sequence of the glaA gene, or a portion thereof (Cullen et al., Biotechnology, 1987, 5, 369). Expression and secretion of the peptide of the invention may also be accomplished using an expression vector in which the DNA sequence encoding the insulin precursor of the above formula is fused to a gene encoding a protective protein via an enzymatically or chemically cleavable sequence fragment [Ward et al. 1990); Broekhuijsen et al., J. Biotech. 135 (1993)].
-7 A találmány tárgyát képezik továbbá gyógyászatilag alkalmazható peptideket vagy fehérjéket kódoló DNS-szekvenciák, mely szekvenciákban a kódolt tennék egy nem esszenciális részén vagy valamely távtartórégiójában, amely az érett fehérjében jelen nem lévő részletet kódol, egy Nglikozilálási konszenzus szekvencia van kialakítva, a fehérjetermék nagyobb mértékű expressziója vagy szekréciója céljából.The present invention further provides DNA sequences encoding a pharmaceutically acceptable peptide or protein, wherein the Nglycosylation consensus sequence is formed in a non-essential portion or spacer region of the encoded gene encoding a portion not present in the mature protein. degree of expression or secretion.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The accompanying drawings are briefly described below.
Az 1. ábrán a tennészetes és az optimizált kódonhasználatú proinzulingén nukleotid szekvenciáját láthatjuk, valamint a nukleotid szekvenciáknak megfelelő aminosav sorrendet. Az ábrán mind a nukleotidok, mind pedig az aminosavak vonatkozásában a hagyományos rövidítéseket alkalmaztuk.Figure 1 shows the nucleotide sequence of the native and optimized codon proinsulin gene and the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequences. Conventional abbreviations are used in the figure for both nucleotides and amino acids.
A 2. ábrán kétféle humán proinzulingén kifejezésére alkalmas expressziós egységet láthatunk, valamint a humán proinzulingén és az Nglikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gén vázlatos ábrázolását.Figure 2 is a schematic representation of two expression units suitable for expression of the human proinsulin gene and the mutant gene containing the human proinsulin gene and the Nglycosylation consensus sequence.
A 3. ábrán a humán proinzulingén és az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gén kifejezésére alkalmas két expressziós egység kialakításának stratégiáját láthatjuk. Az expressziós egységeket külön-külön szintetizált átfedő oligonukleotidok és PCR-eljárás alkalmazásával állítottuk elő.Figure 3 depicts a strategy for constructing two expression units capable of expressing the human proinsulin gene and the mutant gene containing the N-glycosylation consensus sequence. Expression units were generated using individually synthesized overlapping oligonucleotides and PCR.
A 4. ábrán 14 oligonukleotid szekvenciáját láthatjuk, melyeket a humán proinzulingén és az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gén előállítása céljából terveztünk.Figure 4 shows the sequence of 14 oligonucleotides designed to generate the human proinsulin gene and the mutant gene containing the N-glycosylation consensus sequence.
• · « · · • · · · · • · · · · · ♦ ·♦····♦ /1• «· • 1 1 ♦ ♦ / / / / 1
-8Αζ 5. ábra az I. fragmens szintézisének példáján szemlélteti azt az új megközelítési módot, melyet a humán proinzulingén szintézisénél alkalmaztunk, átfedő komplementer oligonukleotidok és PCR-eljárás felhasználásával.Figure 5 illustrates a novel approach for the synthesis of fragment I using human overlapping complementary oligonucleotides and PCR.
A 6. ábrán a IV. fragmens szintézisének vázlatát láthatjuk (az oligonukleotidokat csak nyilakkal jelöltük).FIG. (see oligonucleotides indicated by arrows only).
A 7. ábrán a II., III. és V. fragmens szintézisének vázlatát láthatjuk (az oligonukleotidokat csak nyilakkal jelöltük).Figure 7 is a view showing the second, third, third, third, and second positions. and V (see oligonucleotides indicated by arrows only).
A 8. ábrán a pPZG301-, pPZG302-, pPZG303-, pPZG304- és pPZG305-jelű plazmidok előállításának vázlatát láthatjuk.Figure 8 is a schematic representation of the construction of plasmids pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 and pPZG305.
A 9. ábrán a pPZG311- és pPZG312-jelű plazmidok előállításának vázlatát láthatjuk.Figure 9 is a schematic diagram of the construction of plasmids pPZG311 and pPZG312.
A 10. ábrán a I. típusú expressziós egység bejuttatására alkalmas fonalas gombákban működőképes expressziós vektor előállításának vázlatát láthatjuk.Figure 10 is a schematic diagram of the construction of a functional expression vector in filamentous fungi for delivery of the Type I expression unit.
All. ábrán a Π. típusú expressziós egység bejuttatására alkalmas fonalas gombákban működőképes expressziós vektor előállításának vázlatát láthatjuk.All. FIG. A schematic representation of the construction of a functional expression vector in filamentous fungi suitable for delivery of a type I expression unit is shown.
A 12. ábrán a glaA-gén GlaG2 kapcsolódási régiójának szekvenciáját láthatjuk.Figure 12 shows the sequence of the GlaG2 binding region of the glaA gene.
• · · · · ♦ « · · · • · · · · · · • «··♦ · ·• · · · · ♦ «· · · · · · · · · · · · · · ·
1. példaExample 1
A humán proinzulingén és az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gén szintézise átfedő oligonukleotidok és polímerázláncreakció (PCR) alkalmazásávalSynthesis of the human proinsulin gene and the mutant gene containing the N-glycosylation consensus sequence using overlapping oligonucleotides and polymerase chain reaction (PCR)
a) Módszerek(a) Methods
A DNS-manipulációs kísérleteket szokásos molekuláris biológiai eljárások alkalmazásával végeztük, melyeknek leírása megtalálható Maniatis, T., és mtsai. Molecular Cloning, A Laboratory Manual című kézikönyvében [Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A., (1982)].DNA manipulation experiments were performed using standard molecular biological techniques as described in Maniatis, T., et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A., 1982).
Az alkalmazott vegyszerek, enzimek és plazmidok, hacsak másként nem jelezzük, különböző kereskedelmi forrásokból beszerezhetők. A restrikciós endonukleázos emésztések esetén a gyártó által ajánlott puífereket és reakciókörülményeket alkalmaztuk, hacsak másként nem jeleztük.The chemicals, enzymes and plasmids used are, unless otherwise indicated, commercially available. For restriction endonuclease digestions, the buffers and reaction conditions recommended by the manufacturer were used unless otherwise noted.
Az alkalmazott oligonukleotidok szintézisét az ISOGEN Bioscience, Amszterdam, Hollandia, végezte, megrendelésünk alapján. A gyártó cég a DNS-mintákat liofílizált formában, nátriumsóként szolgáltatta, az oligonukleotidok 5'- és 3'-végükön szabad hidroxilcsoportokat tartalmaztak. A DNS-mintákat steril MQ-vízben oldottuk fel. Az egyláncú DNSoligonukleotidok koncentrációját abszorbancia-méréssel (A2óo) határoztuk meg. A feloldott DNS-oligonukleotidokat -20 °C-on tároltuk.The oligonucleotides used were synthesized by ISOGEN Bioscience, Amsterdam, The Netherlands, on request. The manufacturer provided the DNA samples in lyophilized form as the sodium salt, the oligonucleotides having free hydroxyl groups at their 5 'and 3' ends. The DNA samples were dissolved in sterile MQ water. The concentration of single-stranded DNA oligonucleotides was determined by absorbance measurement (A 2 h). The dissolved DNA oligonucleotides were stored at -20 ° C.
A polimeráz-láncreakciós (továbbiakban PCR) kísérleteket Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) készülékben, GeneAmp™ DNS amplifíkációs reagenskészlet és ampliTaq™ rekombináns taq-DNS-polimeráz alkalmazásával hajtottuk végre. A törzsoldatokat és a reakcióelegyeket a Perkin Elmer Cetus Protocol fór DNA • ··· · ♦ ··· ·· • · • · • · « · · · · • · · · · · ·Polymerase chain reaction (hereinafter PCR) experiments were performed on a Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) using the GeneAmp ™ DNA Amplification Reagent Kit and ampliTaq ™ recombinant taq DNA polymerase. The stock solutions and reaction mixtures were prepared using Perkin Elmer Cetus Protocol for DNA (·) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
- 10Amplifícation kiadványban leírtak szerint, a gyártó ajánlása szerint állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegyekben templát-DNS nem volt, csak oligonukleotidok, egyenként 100 pmól/1 koncentrációban (reakciótérfogat: 100 pl). A PCR-reakciókban a következő hőmérsékletciklusokat alkalmaztuk: szálak szétválasztása: 94 °C, 1 perc, hibridizáció: 40 °C, 1 perc (az 1. és 4. fragmens esetén) vagy 50 °C, 1 perc (a 2., a 3. és10 Amplification was prepared according to the manufacturer's recommendation, except that the reaction mixtures did not contain template DNA, only oligonucleotides at a concentration of 100 µM each (reaction volume: 100 µl). The temperature cycles used in the PCR reactions were: fiber separation: 94 ° C, 1 minute, hybridization: 40 ° C, 1 minute (for fragments 1 and 4) or 50 ° C, 1 minute (2, 3. and
5. fragmens esetén), polimerizáció: 72 °C, 1 perc. 25 ciklust hajtottunk végre. Az utolsó ciklus befejeztével a polimerizáció idejét 7 perccel megnyújtottuk, valamennyi lánc polimerizációjának teljessé tétele céljából. A reakcióelegyet ezután 4 °C-ra hütöttük. A PCR-termékeket a reakcióelegyből két lépésben végrehajtott kloroformos extrakcióval izoláltuk, a DNS-t ezután izopropanollal kicsaptuk, a csapadékot vákumban megszárítottuk, majd 50 pl TE-pufferben feloldottuk.Fragment 5), polymerization: 72 ° C, 1 minute. 25 cycles were performed. At the end of the last cycle, the polymerization time was extended by 7 minutes to complete the polymerization of all chains. The reaction mixture was then cooled to 4 ° C. The PCR products were isolated from the reaction mixture by chloroform extraction in two steps, the DNA was then precipitated with isopropanol, the precipitate was dried in vacuo and dissolved in 50 µl of TE buffer.
A transzformációs és plazmidamplifikációs kísérletekben az E. coli K12 baktérium JM109-jelü törzsét alkalmaztuk [Yanisch-Perron és mtsai.: Gene 33, 103 (1985)]. Az Escherichia coli sejtek transzformálását és elektroporációját a szakirodalomban megtalálható eljárások szerint végeztük [Hanahan, D.J.: Mól. Bioi. 166, 557 (1983); Biorad Genepulser berendezés alkalmazásával].Transformation and plasmid amplification experiments utilized the JM109 strain of E. coli K12 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103 (1985)). Transformation and electroporation of Escherichia coli cells were performed according to the procedures described in the literature (Hanahan, D. J., Mol. Biol. 166, 557 (1983); Using Biorad Genepulser equipment].
Az oligonukleotidok tervezéseDesign of oligonucleotides
A szintetikus humán proinzulingén szekvenciáját a humán inzulingén közzétett szekvenciája alapján terveztük [Bell és mtsai.: Natúré 284, 26 (1980)]. Rá kell mutatnunk, hogy a gén szintézise során bizonyos módosításokat végre lehet hajtani: lehetséges eltérő kódonokat használni, a legtöbb esetben előnyös kódonokat, be lehet építeni további funkcionális DNS• ΛThe sequence of the synthetic human proinsulin gene was designed based on the published sequence of the human insulin gene (Bell et al., Natura 284, 26 (1980)). It should be pointed out that certain modifications can be made in the synthesis of the gene: it is possible to use different codons, in most cases advantageous codons, to add additional functional DNA.
- 11 szekvenciákat, valamint az expressziós vektorokba történő ligálást elősegítő restrikciós helyeket, meg lehet változtatni a kódoló régió egy vagy több kódonját, olyan módosított polipeptid előállítása céljából, mely lényegében azonos aktivitással és hasznosíthatósággal bír.11 sequences, as well as restriction sites that facilitate ligation into expression vectors, one or more codons of the coding region may be altered to produce a modified polypeptide having substantially the same activity and utility.
A találmány szerinti megoldásban a szintetikus humán proinzulingént gombákban történő expresszió céljára módosítottuk. A szintézis során az A. niger fonalas gombafaj glükoamiláz-Gl -génjében leggyakrabban használt kódonokat alkalmaztuk. Az említett gén terméke az említett gombában nagy mennyiségben termelődik [Boel és mtsai.: EMBO J., 3, 1097 (1984); Nunberg és mtsai.: Mól. Cell. Bioi., 4, 2306 (1984)]. Az alkalmazott kódonokat a legtöbb esetben megegyeztek a humán kódonokkal, kivéve azokat a régiókat, ahol az előnyös kódonok alkalmazása C és G nukleotidokban túlzottan gazdag oligonukleotidokat eredményezett volna, ami a szekvenálás és talán még a PCR-reakciók végrehajtása során is problémákat okozhatott volna. Ezért bizonyos kódonokat megváltoztattunk, főképp a gli-kódonokat cseréltük GGC-ről GGT-re, ami az A. niger fonalas gombafajt glüamilázgénjében a második legkedveltebb Gly-kódon (1. ábra).In the present invention, the synthetic human proinsulin gene has been modified for expression in fungi. The codons most commonly used in the glucoamylase-G1 gene of the filamentous fungal species of A. niger were used in the synthesis. The product of said gene is produced in large quantities in said fungus (Boel et al., 1984, EMBO J. 3: 1097; Nunberg et al., Mol. Cell. Biol., 4, 2306 (1984)]. In most cases, the codons used were the same as the human codons, except for the regions where the use of the preferred codons would have resulted in oligonucleotides excessively rich in C and G, which could have caused problems in sequencing and even in carrying out the PCR reactions. Therefore, certain codons were changed, mainly the gli codons from GGC to GGT, which is the second most popular Gly code in the glyamylase gene of the filamentous fungus of A. niger (Figure 1).
A szintetikus proinzulingén 5'-végére egy további DNS-szekvenciát építettünk be, amely a glükoamilázgén (glaA) szignálpeptidének 18 aminosavát, vagy a glaA-propeptid génjének 6 aminosavát kódolta, és Lys-Argproteolítikus hasítóhelyet tartalmazott, abból a célból, hogy lehetővé tegyük két különböző típusú expressziós egység előállítását. Az első esetben (I) a szintetikus humán proinzulingén a glükoamiláz promóter (pgiaA) és szignálszekvencia (ss^ha) szabályozása alatt állt, a második esetben (II) pedig a proinzulingént az A. niger fonalas gombafaj teljes glaA-génjével fúzió·· · « « · »·· · «An additional DNA sequence was inserted at the 5 'end of the synthetic proinsulin gene, which encoded 18 amino acids of the signal peptide of the glucoamylase gene (glaA) or 6 amino acids of the glaA-propeptide gene and provided two Lys-Argproteolytic cleavage sites. production of different types of expression units. In the first case (I), the synthetic human proinsulin gene was under the control of the glucoamylase promoter (pgiaA) and the signal sequence (ss ^ ha), and in the second case (II), the proinsulin gene was fused to the entire glaA gene of the filamentous fungal species A. niger. «« · »·· ·«
-12náltattuk, egy távtartó pepiiden keresztül, amely tartalmazott egy KEX-2szerű fehérjefeldolgozása szignált, és a konstrukció a PgiaA-promóter szabályozása alatt állt (2. ábra).-12, through a spacer peptide that contained a KEX-2-like protein processing signal and was under the control of the PgiaA promoter (Figure 2).
Előállítottunk egy mutáns szintetikus humán proinzulingént is, amely N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazott, az N-glikozilálási szekvencia expresszió és szekréció mértékére gyakorolt hatásának tanulmányozása céljából. Mivel a C-peptid az inzulin működése szempontjából nem esszenciális, minthogy a szekréciós folyamat során a fehérjéből kihasad, egy mutációt hoztunk létre a humán proinzulingén (BCA) C-peptidet kódoló régiójában. Ily módon előállítottunk egy mutánst (B-Pg-A), amely hordozta az AsnXSer N-glikozilálási konszenzus szekvenciát, az Ala-C20-aminosavat kódoló GCC-kódon Asn-aminosavat kódoló AAC-kódonra történő változtatása útján (2. ábra).A mutant synthetic human proinsulin gene containing a consensus N-glycosylation sequence was also prepared to study its effect on the degree of expression and secretion of the N-glycosylation sequence. Because C-peptide is non-essential for insulin function, since it is cleaved from the protein during the secretion process, a mutation in the C-peptide region of the human proinsulin gene (BCA) was created. In this way, a mutant (B-Pg-A) carrying the N-glycosylation consensus sequence of AsnXSer was generated by converting the Glauca coding for Ala-C20 to the AAC coding for Asn (Figure 2).
A humán proinzulingén szintézisét egy új eljárás szerint végeztük, átfedő komplementer oligonukleotidok és PCR-eljárás alkalmazásával. Az eljárás alapelve az volt, hogy a PCR-eljárásban két középső átfedő komplementer oligonukleotidot alkalmaztunk, melyek egyidejűleg templátként és láncindítóként is funkcionáltak, ily módon lehetővé téve a Taq DNS polimeráz számára, hogy megnagyobbítsa őket, azaz az első ciklus során az oligonukleotidok meghosszabbodtak. A második ciklus során a megnagyobbított oligonukleotidok átfedtek a szomszédos 3'- vagy 5'-végi oligonukleotidokkal, és így lehetővé vált, hogy a Taq DNS polimeráz tovább nagyítsa a már megnagyobbított középső oligonukleotidokat. Az eljárás során tehát a Taq DNS polimeráz valójában betölti a kémiailag szintetizált átfedő oligonukleotidok végei közötti réseket, és ily módon egy két<1 • · · * V • * · ··«· « · · v * · ·The synthesis of the human proinsulin gene was performed according to a novel method using overlapping complementary oligonucleotides and PCR. The principle of the method was to use two middle overlapping complementary oligonucleotides in the PCR procedure, which simultaneously functioned as templates and primers, thereby allowing the Taq DNA polymerase to enlarge them, i.e. the oligonucleotides were extended during the first cycle. During the second cycle, the enlarged oligonucleotides overlapped with the adjacent 3 'or 5' end oligonucleotides, thus allowing Taq DNA polymerase to further magnify the already enlarged middle oligonucleotides. Thus, in the process, Taq DNA polymerase actually fills in the gaps between the ends of chemically synthesized overlapping oligonucleotides, thereby providing a two <1 · · · * V • * · · · · · · · v · · ·
-13tősszálú DNS keletkezik. A humán proinzulingén és N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutánsa szintézisét PCR-eljárással hajtottuk végre, külön-külön megszintetizált fragmensek alkalmazásával. A gének fragmensekre vágását a C-peptid kódoló régiójában jelenlévő két Pstlhasítóhely jelenléte tette lehetővé (3. ábra). 14 különböző szekvenciájú oligonukleotidot terveztünk: 10 oligonukleotid (B3, B4, B5, B6, Cl, C2, C3, Al, A2 és A3) szekvenciáját a humán proinzulin DNS kódoló szekvenciájából származtattuk, az A. niger fonalas gombában történő expresszió szempontjából előnyös kódonok alkalmazásával, két oligonukleotidot (B1 és B2) úgy terveztünk, hogy beépítésükkel bejuttathassuk a glaA-gén szignálszekvenciáját valamint olyan restrikciós hasítóhelyeket, melyek lehetővé teszik a génkonstrukció I. típusú expressziós vektorba történő ligálását, egy oligonukleotidot (B7) a glaA- (G2) génszekvencia távtartó-régiójának és további restrikciós hasítóhelyek bejuttatása céljára terveztünk, mely hasítóhelyek lehetővé teszik a II. típusú expressziós vektorba történő ligálást, és terveztünk egy oligonukleotidot (C4) az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát hordozó mutáció bejuttatásának céljára (4. ábra).-13 stranded DNA is formed. Synthesis of the human proinsulin gene and its N-glycosylation consensus mutant was performed by PCR using fragments synthesized separately. Gene fragmentation was facilitated by the presence of two Pst I sites present in the coding region of the C-peptide (Figure 3). We designed 14 oligonucleotides of different sequences: The sequences of 10 oligonucleotides (B3, B4, B5, B6, Cl, C2, C3, Al, A2 and A3) were derived from the coding sequence of human proinsulin DNA using codons that are preferred for expression in A. niger filamentous fungi. , two oligonucleotides (B1 and B2) were designed to insert the signal sequence of the glaA gene and restriction sites that allow ligation of the gene construct into a Type I expression vector, one oligonucleotide (B7) being inserted into the glaA- (G2) spacer. and other restriction sites, which allow the cleavage of the II. type I expression vector and designed an oligonucleotide (C4) to introduce a mutation carrying the N-glycosylation consensus sequence (Figure 4).
b) Az I-V, fragmenseek PCR-színtéziseb) PCR synthesis of fragments I-V
I. és IV. fragmensekI and IV. fragments
Az I. és IV. fragmenst lépésről lépésre szintetizáltuk meg. Az első PCR-lépésben a reakciót a B3 és B4 oligonukleotidok alkalmazásával hajtottuk végre, és így a B3/B4 termék keletkezett. A következő lépésben 1 μΐ B3/B4 terméket a következő oligonukleotidokat tartalmazó PCRreakcióelegybe kevertünk: a) az I. fragmens létrehozásához szükséges B2 és B5 oligonukleotidok, és b) a IV. fragmens létrehozásához szükséges B7 ésI and IV. fragment was synthesized step by step. In the first PCR step, the reaction was performed using B3 and B4 oligonucleotides to give B3 / B4 product. In the next step, 1 μΐ of B3 / B4 product was mixed with the PCR reaction mixture containing the following oligonucleotides: (a) B2 and B5 oligonucleotides required to generate fragment I; B7 and B7 required to create a fragment
- 14• · · · · • · « « · • · · ···» • ···« · ·- 14 • · · · · · «« · · · · · · · · · · · ·
Β5 oligonukleotidok. így állítottuk elő a B2/B3/B4/B5 és B7/B3/B4/B5 termékeket. A harmadik lépésben az I. fragmens előállítása céljából a B2/B3/B4/B5 termék valamint a B1 és B6 oligonukleotidok alkalmazásával hajtottunk végre PCR-reakciót, a IV. fragmens előállítása céljából pedig a B7/B3/B4/B5 termékből 1 μΐ-t kevertünk egy B7 és B6 oligonukleotidokat tartalmazó PCR-reakcióelegybe. így állítottuk elő a B1/B2/B3/B4/B5/B6 és a B7/B3/B4/B5/B6 termékeket. A kapott termékek mérete megfelelt a várakozásnak, és a PCR-termékeket a megfelelő restrikciós enzimekkel megemésztve megkaptuk az I. és IV. fragmenst (5. és 6. ábra).Β5 oligonucleotides. Thus B2 / B3 / B4 / B5 and B7 / B3 / B4 / B5 were prepared. In the third step, PCR was performed using the B2 / B3 / B4 / B5 product and the B1 and B6 oligonucleotides to generate fragment I, and the IV. and 1 μΐ of the B7 / B3 / B4 / B5 product was mixed with a PCR reaction mixture containing B7 and B6 oligonucleotides. Thus, products B1 / B2 / B3 / B4 / B5 / B6 and B7 / B3 / B4 / B5 / B6 were prepared. The size of the resulting products was as expected, and the PCR products were digested with the appropriate restriction enzymes to give I and IV. fragment (Figures 5 and 6).
AII., III. és V. fragmensek előállításaAII., III. and V. fragments
AII., III. és V. fragmenst egy lépésben szintetizáltuk meg. A PCRreakciókat a következő oligonukleotidok alkalmazásával hajtottuk végre: a) Cl, C2, C3; b) Al, A2, A3; és c) Cl, C4, C3. A kapott PCR-termékek C1/C2/C3, A1/A2/A3 és C1/C4/C3 - mérete megfelelt a várakozásnak, majd a termékeket megfelelő restrikciós enzimekkel megemésztve kaptuk meg aAII., III. and fragment V were synthesized in one step. PCR reactions were performed using the following oligonucleotides: a) Cl, C2, C3; b) A1, A2, A3; and c) Cl, C4, C3. The PCR products obtained had C1 / C2 / C3, A1 / A2 / A3 and C1 / C4 / C3 sizes as expected and were digested with the appropriate restriction enzymes.
II., ΙΠ. és V. fragmenst (7. ábra).II., ΙΠ. and fragment V (Figure 7).
A PCR-szintetizált fragmensek pUC19-vektorba történő klónozása és DNSszekvencia analíziseCloning of PCR-synthesized fragments into pUC19 vector and analysis of DNA sequence
A pUC19-plazmidot a következő restrikciós enzimekkel emésztettük: a) PstI, b) Pstl/EcoRI, és c) Pstl/Sall, majd az emésztett plazmidokat a megfelelő fragmenssel (I-V) összeligáltuk, mely eljárás eredményeképp a következő plazmidokat kaptuk: pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 és pPZG305 (8. ábra). A kialakított plazmidokkal E. coli JM109-sejteket transzformáltunk. A kapott transzformánsokból plazmid DNS-t izoláltunk, mini-prep eljárás alkalmazásával, és az izolált plazmid DNS-eket restrik• · · 9 · • · · ««·· *··· · · ilPlasmid pUC19 was digested with the following restriction enzymes: (a) PstI, (b) PstI / EcoRI, and (c) PstI / SalI, and the digested plasmids were ligated with the appropriate fragment (IV), resulting in the following plasmids: pPZG301, pPZG302 , pPZG303, pPZG304 and pPZG305 (Figure 8). The resulting plasmids were used to transform E. coli JM109 cells. Plasmid DNA was isolated from the resulting transformants using a mini-prep procedure, and the plasmid DNA isolated was restrained.
- 15ciós enzimes emésztéssel analizáltuk. A megfelelő plazmidokat tartalmazó E. coli transzfonnánsokat tenyésztettük, plazmid DNS-üket QLAGEN typ 20 oszlop alkalmazásával izoláltuk, és SEQUENASE® Version 2.0 reagenskészlet alkalmazásával szekvenáltuk. A további konstrukciók kialakításához a megfelelően szintetizált és inszertált szekvenciákat tartalmazó vektorokat használtuk.- analyzed by 15 enzyme digestion. E. coli transformants containing the appropriate plasmids were cultured, their plasmid DNAs were isolated using a QLAGEN typ 20 column, and sequenced using the SEQUENASE® Version 2.0 kit. Vectors containing properly synthesized and inserted sequences were used to construct further constructs.
A pPZG311- és pPZG312-plazmidok előállításaConstruction of plasmids pPZG311 and pPZG312
A teljes humán proinzulingént, valamint az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gént a glaA-gén szignálszekvenciájával együtt tartalmazó vektorokat a következők szerint állítottuk elő: a pPZG311-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pPZG301-plazmidból izolált 173 bázispáros EcoRI/Pstl-fragmenst, a pPZG302-plazmidból izolált 75 bázispáros Pstl-fragmenst, valamint a pPZG303-plazmidból izolált Pstl-Sallfragmenst az EcoRI/Sall-emésztett pUC19-vektorba ligáltuk. A pPZG312plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pPZG301-plazmidból izolált 173 bázispáros EcoRI/Pstl-fragmenst, a pPZG305-plazmidból izolált 75 bázispáros Pstl/Pstl-fragmenst, valamint a pPGZ303-plazmidból izolált 74 bázispáros Pstl/Sall-fragmenst az EcoRI/Sall-emésztett pUC19-vektorba ligáltuk (9. ábra).Vectors containing the complete human proinsulin gene and the mutant gene containing the N-glycosylation consensus sequence, together with the signal sequence of the glaA gene, were constructed as follows: plasmid pPZG311 was constructed by isolating 173 bp Eco RI from the plasmid pPZG301. , the 75 bp PstI fragment isolated from plasmid pPZG302 and the PstI SalI fragment isolated from plasmid pPZG303 were ligated into EcoRI / SalI digested pUC19. Plasmid pPZG312 was constructed by constructing a 173 bp Eco RI / Pst I fragment isolated from pPZG301, a 75 bp Pst I / Pst I fragment isolated from pPZG305, and a 74 bp Eco R I / P I S p R I isolated from pPGZ303. digested with pUC19 (Figure 9).
···« 4t « • * · * · « · * ··»« • ··«· · · li··· «4t« • * · * · «· * ··» «• ··« · · · li
2. példaExample 2
Fonalas gombákban alkalmazható expressziós vektorok előállításaConstruction of expression vectors for use in filamentous fungi
I. Az I, típusú expressziós egység előállításaI. Preparation of the Type I Expression Unit
A pAN52-7NotBCA- és pAN52-7NotBPgA-plazmidok előállításaConstruction of plasmids pAN52-7NotBCA and pAN52-7NotBPgA
A pAN52-7NotuidA-plazmidot [Verdoes és mtsai., Gene (1994) nyomtatás alatt] részlegesen megemésztettük Ncol és Sáli enzimekkel. Izoláltuk a glaA-promótert és a trpC-gén terminációs régióját hordozó 7,55 kbos Sall/NcoI-fragmenst, és egyrészt összeligáltuk a pPZG311-plazmidból izolált 317 bázispáros Nco/Sall-fragmenssel, ily módon kialakítva a pAN527NotBCA-plazmidot, másrészt pedig összeligáltuk a pPZG312-plazmidból izolált 317 bázispáros NcoI/Sall-fragmenssel, és így kialakítottuk a pAN527NotBPgA-plazmidot (10. ábra).Plasmid pAN52-7NotuidA (Verdoes et al., Gene (1994) in print) was partially digested with Ncol and SalI. The 7.55 kb SalI / NcoI fragment carrying the glaA promoter and the trpC gene termination region was isolated and ligated with the 317 bp Nco / SalI fragment isolated from pPZG311 to form the plasmid pAN527NotBr with the 317 bp NcoI / SalI fragment isolated from plasmid pPZG312 to generate plasmid pAN527NotBPgA (Figure 10).
A pAN52-7BCAamdS- és a pAN52-7BPgAamdS-plazmidok előállításaConstruction of plasmids pAN52-7BCAamdS and pAN52-7BPgAamdS
Az A. nidulans acetamidáz génjét (amdS) hordozó 5.0 kb-os Notlfragmenst beligáltuk egyrészt a pAN52-7NotBCA-plazmid másrészt pedig a pAN52-7BPgA-plazmid Notl-helyére, és így megkaptuk a pAN527BCAamdS- valamint a pAN52-7BPgAamdS-plazmidokat (10. ábra).The 5.0 kb NotI fragment carrying the A. nidulans acetamidase gene (amdS) was ligated to the NotI site of plasmid pAN52-7NotBCA on the one hand and plasmids pAN527BCAamdS and pAN52-7BPgA (pAN52-7BPgA), respectively. . figure).
II. AII. típusú expressziós egység előállításaII. AII. Type I expression units
A pAN56-7BCAamdS- és a pAN56-7BPgAamds-plazmidok előállításaConstruction of plasmids pAN56-7BCAamdS and pAN56-7BPgAamds
A fuzionált glükoamiláz-proinzulin-fehérjét és az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns glükoamilált-proinzulin-fehérjét kódoló szekvenciákat hordozó vektorokat a következők szerint állítottuk elő: a pPZG304-p!azmidot megemésztettük EcoRV és AlwNI restrikciós enzimekkel. A 25 bázispáros EcoR5/AlwNI-fragmenst, amely a 6 aminosav hosszúságú távtartó-régiót kódoló szekvenciát hordozta, összeligáltuk aVectors containing sequences encoding the fused glucoamylase proinsulin protein and the mutant glucoamylated proinsulin protein sequence of the N-glycosylation consensus sequence were constructed as follows: pPZG304-p1 plasmid was digested with EcoRV and AlwNI. The 25 base pair EcoR5 / AlwNI fragment carrying the 6 amino acid spacer coding sequence was ligated to the
-17pAN56-7-plazmidból származó 3.07 kb-os Sall/EcoRV-fragmenssel, amely a gla(G2)-gént hordozta, és így előállítottuk a Sall/AlwNI-fragmenst. A pAN56-7-plazmidot a pAN56-4-plazmidból állítottuk elő [Broekhuijsen és mtsai.: J. Biotech., 31, 135 (1993)], oly módon, hogy a gpdA promótert kicseréltük a pAN52-7-plazmid 4.2 kb-os Notl/NcoI-fragmensével, amely a glaA-promótert hordozta, és az interleukingént eltávolítottuk, és így a plazmidban a GlaG2-géntöl 5'-irányban egy EcoRV hasítási hely keletkezett. Az AlwNI/SalI-fragmenst ezután összeligáltuk a pABl-6S-plazmidból [Den Herder és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 233, 404 (1992)] származó 10.6 kb-os HindlII/Sall-fragmenssel, amely tartalmazta a GlaA promótert és az amdSgént, valamint az említett fragmensekhez ligáltuk még a pAN52-7BCAplazmid a) 1.06 kb-os AlwNI/HindlII-fragmensét, így kialakítva a pAN567BCA amdS-plazmidot és b) a pAN52-7BPgA-plazmid 1.06 kb-os AlwNI/HmdIII-fragmensét, ily módon kialakítva a pAN52-7BPgAamdSplazmidot (11. ábra). A távtartó-régióban található egy kétszeresen bázisos Lys-Arg-hasítóhely. A glükoamilázgén humán proinzulingénnel (BCA) és proinzulin mutáns génnel (BPgA) kialakított fúziós fehérjéinek fuzióhelye körüli szekvenciáját a távtartó-régió szekvenciájával együtt a 12. ábrán láthatjuk.A 3.07 kb Sall / EcoRV fragment from plasmid -17pAN56-7 carrying the gla (G2) gene, thus generating the Sall / AlwNI fragment. Plasmid pAN56-7 was constructed from plasmid pAN56-4 (Broekhuijsen et al., 1993, J. Biotech. 31, 135) by replacing the gpdA promoter with the 4.2 kb plasmid pAN52-7. os Notl / NcoI fragment carrying the glaA promoter and the interleukin gene removed, resulting in an EcoRV site 5 'downstream of the GlaG2 gene. The AlwNI / SalI fragment was then ligated from pAB1-6S (Den Herder et al., Mol. Gene. Genet. 233, 404 (1992)] with the 10.6 kb HindIII / SalI fragment containing the GlaA promoter and the amdSgene, and a 1.06 kb AlwNI / HindIII fragment of plasmid pAN52-7BCA (a) was ligated to these fragments. and (b) a 1.06 kb AlwNI / HmdIII fragment of plasmid pAN52-7BPgA, thereby constructing pAN52-7BPgAamdSplasmid (Figure 11). There is a doubly basic Lys-Arg cleavage site in the spacer region. The sequence of the fusion proteins of the glucoamylase gene with the human proinsulin gene (BCA) and the proinsulin mutant gene (BPgA), together with the spacer region sequence, is shown in Figure 12.
3. példaExample 3
Az Aspergilus niger fonalas gomba transzformációjaTransformation of Aspergilus niger filamentous fungus
Az Aspergilus niger fonalas gombafaj transzformációját a szakirodalomban megtalálható eljárások szerint hajtottuk végre [Goosen és mtsai.:Transformation of the Aspergilus niger filamentous fungal species was performed according to procedures described in the literature [Goosen et al.
-18Curr. Génét. Π, 499 (1987); Kelly és Hynes, Embo J. 4, 475 (1985); Van Hartingsveldt és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 206. 71 (1987)].-18Curr. Genet. Π, 499 (1987); Kelly and Hynes, Embo J. 4, 475 (1985); Van Hartingsveldt et al., Mol. Gene. Genet. 206, 71 (1987).
Az A mger N402 fonalas gombafajt [Bős, C.J. és mtsai.: Curr. Génét. 14, 437 (1988)] a pAN52-7BCAamdS, a pAN52-7BPgAamdS, a pAN567BCAamdS és a pAN56-7BPgAamdS expressziós vektorokkal transzformáltuk. A transzformáns kolóniákat olyan táptalajon szelektáltuk, amely egyedüli nitrogénforrásként acetamidot vagy akrilamidot tartalmazott. A transzformánsokat tovább analizáltuk, minden esetben egyetlen spórából kiindulva.The filamentous fungal species A mger N402 [Bős, C.J. et al., Curr. Genet. 14, 437 (1988)] with the expression vectors pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN567BCAamdS and pAN56-7BPgAamdS. Transformant colonies were selected on media containing acetamide or acrylamide as the sole nitrogen source. The transformants were further analyzed, starting from a single spore in each case.
4. példaExample 4
Humán inzulin szekréciója a táptalajbanSecretion of human insulin in culture medium
1. Humán proinzulingént és N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó mutáns gént hordozó A. nizer transzformánsok tenyésztése1. Culturing A. nizer transformants carrying the mutant gene containing the human proinsulin gene and the N-glycosylation consensus sequence
500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba, melyek 100 ml folyékony táptalajt tartalmaztak, a kiválasztott transzformánsokból kb. 108-108 spórát oltottunk le. A táptalaj összetétele a következő volt: 70 mmól/1 NaNC>3,7 mmól/1 KC1, 11 mmól/1 KH2PO4, 2 mmól MgSO4, 4 % dextrin, nyomelemek (1:1000; 76 mmól/1 ZnSO4, 178 mmól/1 H3BO3, 25 mmól/1 MnCl2, 18 mmól/1 FeSO4, 7.1 mmól/1 CoCl2, 6,4 mmól/1 CuSO4, 6,2 mmól/1 Νη2ΜοΟ4, 176 mmól/1 EDTA) és vitaminok (1:1000; 100 mg/1 tiamin, 100 mg/1 riboflavin, 100 mg/1 nikotinamid, 50 mg/1 piridoxin, 10 mg/1 pantotinsav, 0,2 mg/1 biotin). A transzformánsokat 32 °C-on tenyésztettük 36 órán át. A táptalajból mintákat vettünk és megvizsgáltuk azokat inzulin jelenlétére vonatkozóan.In 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml liquid medium, approximately 500 ml of the selected transformants were used. 10 8 -10 8 spores were inoculated. The medium was as follows: 70 mmol / 1 Nance> 3.7 mmol / 1 KC1, 11 mmol / 1 KH2PO4, 2 mM MgSO 4, 4% dextrin, trace elements (1: 1000; 76 mM / 1 ZnSO4, 178 mmol / 1 H3BO3, 25 mmol / 1 MnCl2, 18 mmol / 1 FeSO 4, 7.1 mmol / 1 CoCl 2, 6.4 mmol / 1 CuSO4, 6.2 mmol / 1 Νη 2 ΜοΟ 4, 176 mmol / 1 EDTA) and vitamins (1: 1000; 100 mg / L thiamine, 100 mg / L riboflavin, 100 mg / L nicotinamide, 50 mg / L pyridoxine, 10 mg / L pantothenic acid, 0.2 mg / L biotin). The transformants were cultured at 32 ° C for 36 hours. Samples were taken from the culture medium and examined for the presence of insulin.
• · · *• · · *
2, Inzulin expresszálása2, Expression of insulin
Az immunreaktív humán inzulin termelődését a Pharmacia INSULIN RIA 100 reagenskészlet alkalmazásával mutattuk ki (Kabi Pharmacia Diagnostics). A transzformánsok tenyészetét tartalmazó fermentléből mintákat vettünk, a mintákat leszűrtük, a szürleteket semlegesítettük, szükség esetén meghígítottuk, majd RIA- (radioimmunoesszé) meghatározásnak vetettük őket alá [Livessy és mtsai.: Clin. Biochem. 13, 151 (1980)]. Az A. niger transzformánsok immunreaktív humán inzulinexpressziós szintjeit (mE/1) az 1. táblázatban foglaltuk össze.Production of immunoreactive human insulin was detected using the Pharmacia INSULIN RIA 100 kit (Kabi Pharmacia Diagnostics). Samples of the fermentation broth containing the transformants were collected, the samples were filtered, the filtrates were neutralized, diluted if necessary and subjected to RIA (radioimmunoassay) determination [Livessy et al., Clin. Biochem. 13, 151 (1980)]. The immunoreactive human insulin expression levels (mE / l) of A. niger transformants are summarized in Table 1.
1, táblázatTable 1
Az immunreaktív humán inzulin expressziós szintje különböző A. niger transzformánsokbanExpression levels of immunoreactive human insulin in various A. niger transformants
Az A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger 7649 és A. niger 7638 transzformánsokat letétbe helyeztük az Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (H-1052, Budapest, PF 53, Magyarország) 1994. július 8-án, ahol a törzsek a következő nyilvántartási számot kapták: NCAIM (P) F 001215, NCAIM (P) F001216, NCAIM (P) F 001214 • « · · ilTransformants A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger 7649 and A. niger 7638 were deposited with the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (H-1052, Budapest, PF 53, Hungary) on July 8, 1994, where strains have been given the following registration number: NCAIM (P) F 001215, NCAIM (P) F001216, NCAIM (P) F 001214 • «· · il
-20és NCAIM (P) F 001213. A letétbe helyezést a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően (6.1 cikk értelmében) hajtottuk végre.-20and NCAIM (P) F 001213. The deposit was made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty (Article 6.1).
A táblázatból látható, hogy a különböző vektorokat hordozó transzformánsok expressziós szintjeiben lényeges különbségek mutatkoznak. Messze a legmagasabb expressziós szintet az a transzformáns adta, amelyik az N-glikozilálási konszenzus szekvenciát tartalmazó humán proinzulingént a glukoamiláz-fehérjével fuzionáltatva tartalmazó vektorral volt transzformálva.The table shows that there are significant differences in the expression levels of transformants carrying different vectors. By far the highest expression level was obtained by a transformant transformed with a vector containing the human proinsulin gene containing the N-glycosylation consensus sequence fused to the glucoamylase protein.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HR944302 | 1994-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502318D0 HU9502318D0 (en) | 1995-09-28 |
| HUT72848A true HUT72848A (en) | 1996-05-28 |
Family
ID=10946199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502318A HUT72848A (en) | 1994-08-05 | 1995-08-04 | Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HUT72848A (en) |
-
1995
- 1995-08-04 HU HU9502318A patent/HUT72848A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9502318D0 (en) | 1995-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU593274B2 (en) | Insulin analogues and process for their preparation | |
| US6777207B2 (en) | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast | |
| JP5503968B2 (en) | Method for producing mature insulin polypeptide | |
| JP4681784B2 (en) | C-peptides that improve the production of insulin and insulin analogues | |
| JP4773023B2 (en) | Method for producing insulin precursor and insulin precursor analogue | |
| EP1377608B1 (en) | Insulin precursors and a process for their preparation | |
| JP2733602B2 (en) | Expression cassette, plasmid and transformed yeast encoding hirudin | |
| HU211600A9 (en) | Yeast expressing system | |
| CA2208095C (en) | Generation of human insulin | |
| JP2013208119A (en) | Method for producing mature insulin polypeptide | |
| EP1246933B1 (en) | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast | |
| US6861237B2 (en) | Production of heterologous polypeptides in yeast | |
| EP0704527B1 (en) | DNA sequences encoding biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin | |
| CA2021406A1 (en) | Expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in bacillus subtilis and means and methods for its achievement | |
| WO2015015518A2 (en) | Process for production of insulin and insulin analogues | |
| US8129146B2 (en) | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast | |
| US20010041787A1 (en) | Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast | |
| JPH04258294A (en) | Secretory vector, bacterium transformed with the same vector and preparation of product from the same bacterium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |