IT201600098005A1 - Analoghi e derivati di amminoacidi dicarbossilici come antibatterici - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo: “ Analoghi e derivati di amminoacidi dicarbossilici come antibatterici”

Campo tecnico

La presente invenzione è relativa ad analoghi e derivati di amino acidi dicarbossilici impiegabili come antibatterici. I composti delFinvenzione sono impiegabili in particolare come antibiotici in monoterapia o in combinazione nel trattamento di infezioni batteriche sostenute sia da batteri Gram-negativi che Grampositivi (o miste), soprattutto per contrastare l'antibioticoresistenza, ma anche come disinfettanti e antisettici.

Arte nota

Gli antibiotici sono ampiamente impiegati in campo medico per eradicare infezioni batteriche di diversa gravità e localizzazione nel corpo umano. Tuttavia i batteri, grazie alla loro plasticità genomica, riescono ad adattarsi velocemente e spesso a sviluppare una resistenza all’azione (batteriostatica o battericida) di queste molecole, rimanendo dunque immuni al trattamento.

L’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha emanato un’allerta riguardo all’uso spesso improprio degli antibiotici e al conseguente recente sviluppo nelle popolazioni batteriche di pericolose resistenze o multi-resistenze alle molecole attualmente utilizzate in terapia (http://www.agenziafarmaco.gov.it/it/content/nuovo-rapportodell%E2%80%99oms-evidenzia-che-la-resistenza-agli-antibiotici-%C3%A8-ancora-una-minaccia-l) in particolare per batteri Gramnegativi come Escherichia coli multiresistenti. E’ quindi sempre più fortemente riconosciuta la necessità di sviluppare e portare sul mercato nuove molecole che abbiano un meccanismo d’azione differente dalla maggior parte degli antibiotici correntemente in uso e che risultino efficaci anche su batteri che abbiano ormai sviluppato multi-resistenza.

Gli acidi α-amminofosfinici posseggono importanti proprietà farmaceutiche. Per esempio sono agenti antimicrobici in vitro a basse concentrazioni (0.8-50 pg/ml) andando ad inibire la crescita in terreno minimo (che consiste di sali e una fonte di carbonio) di batteri patogeni per gli umani quali Escherichia coli, ed altri enterobatteri, Pseudomonas aerugìnosa e, tra i lieviti, Candida albicane and Candida tropicalis [US Patent 4,147,780].

Inoltre peptidi contenenti acidi a-amminofosfinici all’estremità C-terminale mostrano pure proprietà antimicrobiche. Per esempio sono efficaci a basse concentrazioni (0.001 - 50 pg/ml, a seconda della specie batterica) nell’inibire la crescita in terreno minimo in vitro di batteri patogeni, sia Gram-negativi che Gram-positivi, come per esempio E. coli, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Salmonella typhimurium e altri enterobatteri, Pseudomonas aeruginosa e di lieviti patogeni, come C. albicans and C. tropicalis.

[US Patent 4,213,969].

Il composto L-Glu-y-Pii è un composto chimicamente noto e la sua sintesi chimica è stata descritta [Khomutov et al., 2016 e bibliografìe citate]. In aggiunta a ciò L-Glu-γ-ΡΗpuò essere isolato da Streptomyces viridochromogenes e Streptomyces hygroscopicus cresciuti in particolari condizioni o mutati, che portano al suo accumulo [Seto H et al., (1983) J Antibiot (Tokyo) 36: 96-98; Imai S. et al. (1985) J Antibiot (Tokyo) 38: 687-690].

Un tripeptide L-Glu-y-PH-L-Ala-L-Ala (che consiste in L-Glu-γ-ΡΗe due residui di L-alanina) è un composto chimicamente noto ed è stato isolato da fonti microbiche [US patent 4,466,913].

Tuttavia né per L-Glu-γ-Ριι né per il tripeptide L-Glu-y-PH-A-Ala-L-Ala, di cui sopra, l’attività antibiotica è mai stata descritta nella letteratura scientifica o nei brevetti.

Sommario dell'invenzione

La presente invenzione è relativa a composti sia noti che non noti di Formula 1 da impiegare come disinfettanti e antisettici, nel trattamento di infezioni batteriche. I composti di Formula 1 sono particolarmente indicati come agenti antimicrobici per l’impiego contro batteri patogeni Gram-positivi e Gram-negativi, in particolare verso patogeni resistenti ai comuni antibiotici, come evidenziato in E. coli (Tabella 1).

I composti in Formula 1 hanno dimostrato di possedere proprietà antibiotiche e vengono proposti come ingredienti attivi in formulazioni contro agenti patogeni e per la cura di patologie a cui si associano infezioni batteriche. Essi sono impiegabili da soli o in combinazione con altri composti farmacologicamente attivi e possono essere eventualmente formulati in kit per la somministrazione combinata, sequenziale o ritardata, da soli o in combinazione con altri principi attivi.

Costituiscono pertanto oggetto della presente invenzione i composti in Formula 1 da impiegare in campo medico come antibiotici, antisettici e come disinfettanti, in particolare:

Antibiotici per il trattamento di infezioni causate da batteri Gram-positivi e Gram-negativi, compresi quelli resistenti agli antibiotici attualmente in uso clinico

Antibatterici per la disattivazione o l’inibizione della crescita batterica sulle superfìci e oggetti inerti (disinfettanti) o sulla cute e tessuti (antisettici)

Ulteriori oggetti risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue.

Descrizione dettagliata deirinvenzione

La presente invenzione è relativa ad analoghi e derivati di amminoacidi dicarbossilici impiegabili come antibatterici, sia nel trattamento di infezioni batteriche che per contrastare l'antibiotico-resistenza.

Gli amminoacidi sono molecole organiche che nella loro struttura recano sia il gruppo funzionale amminico (-NH2) sia quello carbossilico (-COOH). In biochimica il termine “amminoacido” si riferisce più spesso agli α-amminoacidi, di formula generica NH2CHRCOOH, cioè quelli il cui gruppo amminico e il gruppo carbossilico sono legati allo stesso atomo di carbonio (chiamato appunto carbonio a). Gli amminoacidi naturali che rientrano nella presente invenzione sono in generale quelli presenti in natura, noti all’esperto del ramo, che vengono sintetizzati attraverso le specifiche vie biosintetiche dagli organismi viventi (siano essi batteri, archebatteri, piante, animali), mentre più specificatamente gli amminoacidi proteinogenici, sempre nell’ambito della presente invenzione e noti all’esperto del ramo, sono 23 e sono quelli che vengono incorporati all’interno di proteine e per i quali quindi c’è un codone specifico che ne detta l’incorporazione nella catene polipeptidiche durante la sintesi proteica. Questi ultimi sono tutti in configurazione L tra gli α-amminoacidi naturali. Quindi a parte i 23 L a-amminoacidi proteinogenici, tra gli amminoacidi naturali non proteinogenici, rientrano nelfambito della presente invenzione e noti all’esperto del ramo i D α-amminoacidi oltre che altri composti quali il GABA (un neurotrasmettitore), la 6-alanina, l’omitina, canavanina, penicillammine e cefalosporine.

Con il termine “derivati” si intende includere anche i prodotti di transaminazione (a-chetoglutarato-γ-Ρκ) e di decarbossilazione (GABA-PH).

I composti dell’invenzione hanno la seguente Formula 1 e l’invenzione è anche relativa alla sintesi di nuovi derivati che sono risultati avere attività antibatterica e assenza di tossicità in vivo. I composti in Formula 1 sono caratterizzati dalla presenza di due farmacofori, dagli inventori considerati responsabili della loro attività biologica, cioè l’unità α-amminocarbossilica (intendendo l'unità amminica e/o l'unità carbossilica) e il gruppo fosfinico.

La presente invenzione descrive nel suo senso più vasto l’impiego dei composti di Formula 1 contro microorganismi patogeni.

che include isomeri e diasteroisomeri in forma zwitterionica, e corrispondenti sali con acidi e basi sia organici che inorganici, in cui:

n è un numero intero positivo compreso fra 1 e 4

R= idrogeno o deuterio

Ri idrogeno, o deuterio, o Ri ed R2insieme formano un doppio legame di tipo carbonilico C=0;

R2è idrogeno, 0 deuterio, 0 un gruppo amminico, non

sostituito 0 sostituito con C(0)-CH(NH2)-R4,

dove R4è la catena laterale di un amminoacido naturale, preferibilmente proteinogenico, in particolare ma non esclusivamente L- Leu, 0 L-Ala, o un residuo di-, tri-, ieim-peptidico

derivato da amminoacidi proteinogenici;

R3è idrogeno, o deuterio, 0 un gruppo carbossilico, 0 C(0)-Rs

dove R5è la catena laterale di un amminoacido naturale, preferibilmente proteinogenico, in particolare ma non esclusivamente L- Leu, o L-Ala, preferibilmte un residuo di-, tri-,

tetra-peptidico derivato da amminoacidi proteinogenici.

La Formula 1 include i seguenti composi ;i noti

Composto R Ri Ri e sono:

2-Amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric acid;

R=Rt= H; R2= NH2; /?.,= COOH

G1U-Y-PH

L-2-Amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric acid;

L-Glu-y-PHn=2; R=Rt=K; NH2; K,= COOH

CAS: 126204-83-9 httDs://asischem.com/asis-0069.htmI

CAS: 85178-62-7 (per ramminoacido libero)

n=2; R=R

N- [L-2- Amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyry 1] -{= H; R2= NH2; R3= C(0)-R5

R -, ieira-peptidici formati da L- Alany 1-L-Alanine ;s= residui di-, tri

amminoacidi naturali, in particolare proteinogenici, L-Glu-Y-PH-L-Ala-L-Ala

preferibilmente L-Ala-L-Ala

4-(Hydroxyphosphinyl)-2-oxobutyric acid;

n=2; R= H; RI+R2= >0; R3= COOH

a-ketoglutarate-Y-PH;a-KG-Y-PH

3-Aminopropylphosphinic acid;

n=2; R=RI=R2= H; R3= NH2

GABA-PHhttD://www.chemicalbook.com/ProdSuDDlierGW EN.asD CAS: 103680-47-3 x?CBNumber=CB71339083&ProvID=1001

2-Amino-3-(hydroxyphosphinyl)propionic acid;

η=1; Λ=Λ,= Η; Λ2= ΝΗ

Asp-3-Ρπ2; «,= COOH

3-(hydroxyphosphinyl)propionic acid;

n=2; R=Rr=R2= H; R3= COOH

Succinate-PH

I composti noti sono stati preparati come descritto in:

Glu-y-PH: Maier L, Rist G. (1983) Phosph. Sulfur., 17, 21-28; Baylis et al. (1984)

J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., 2845-2853; Khomutov et al. (2016) Rus. J.

Bioorg. Chem., 42(6) {In Press).

L-Glu-γ-Ρκ: Selvam et al. (2007) J. Med. Chem., 50, 4656-4664.

L-Glu-y-Pn-l-Ala-L-Ala: Seto et al. (1983) J. Antibiot., 36, 96-98.

a-KG-Y-PH: Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1983), JP 58219192; Jpn. Kokai Tokkyo Koho

(1989), JP 01268695.

GABA-PH: Dingwall et al. (1989) Tetrahedron., 45(12), 3787-3808; Queffelec et al.

(2008) J. Org. Chem., 73, 8987-8991; Khomutov et al. (2016) Rus. J.

Bioorg. Chem., 42(6) {In Press).

Α8ρ-β-ΡΗ: Dingwall et al. (1989) Tetrahedron., 45(12), 3787-3808; Khomutov et al.

(1996) Rus. Chem. Bull., 45(8), 1961-1964.

Succinate-PH: Prishchenko et al. (1994) Zh. Obshch. Khim., 64(8), 1311-1312;Boyd

et al. (1990) Tetrahedron Lett., 31(20), 2933-2936.

La Formula 1 include i seguenti composti NON noti:

Composto R Ri Rz e R\ sono

D-2-Amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric acid;

n=2; /?=/?,= H; /?2= NH2; RI= COOH

Z)-G1U-Y-P„ (esempio 2)

P-Deutero- [2-amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric] acid; n=2; /?= D; Rt= H; fl2=NH2; R2= C OOH GIu-γ-Ρη (esempio 3)

P-Deutero-L- [2-amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric] acid; n=2; R= D; «,= H; R2= NH2; R2= COOH .L-G1U-Y-PD(esempio 3)

P-Deutero- D- [2-amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric] acid; n=2; /?= D; Λ,= Η; R2= NH2; R2= COOH Z)-G1U-Y-PD(esempio 3)

7V-(L-Leucyl)-2-amino-4- n=2; /?=/?,= H; R2= NH-C(0)-CH(NH2)-«4; R<= (hydroxyphosphinyl)butyric acid; COOH; /?4= catena laterale di un amminoacido L-Leu-Glu-y-PH(esempio 4) proteinogenico, preferibilmente L-Leu, L-Ala iV-L-Leucyl-[2-Amino-4- n=2; /?=/?]= H; R2= NH-C(0)-CH(NH2)-/Ì4; R2= (hydroxyphosphinyl)butyryl]-L-Alanyl-L- C(0)-Rs; /?4= catena laterale di un amminoacido Alanine; proteinogenico, preferibilmente L- Leu; Rs= residui di-, tri-, teira-peptidico formato da amminoacidi L-Leu-L-Glu-y-PM-L-Ala-L-Ala (esempio 5)

proteinogenici, preferibilmente L-Ala-L-Ala P-£)eMiero-(3-aminopropylphosphinic) acid;

n=2; R= D; R2=R2= H; R2= NH2

GABA-PD(esempio 3)

n=2; R=Ri=R2= H; /?,= NH-C(0)-CH(NH2)-«4; A-(L-Leucyl)-3-aminopropylphosphinic acid; /f4= catena laterale di un amminoacido naturale, in L-Leu-GABA-PH(esempio 6) particolare proteinogenico, preferibilmente L-Leu, o L-Ala

P-Deutero- 2-Amino-3 - n=l; R= D; Λ,= Η; /?2= NH2; 3⁄4= COOH (hydroxyphosphinyl)propionic acid;

Asp-β-Ρ,, (esempio 3)

TV-(L-Leucyl)-2-amino-3- n=l; /?=/?,= H; R2= NH-C(0)-CH(NH2)-/?4; «3=

COOH; Rx= catena laterale di un amminoacido (hydroxyphosphinyl)propionic acid;

naturale, in particolare proteinogenico,

L-Leu-Asp-β-Ρπ (esempio 7) preferibilmente L- Leu, o L-Ala

2-Amino-5-(hydroxyphosphinyl)valeric acid;

n=3; R=R\= H; /?2= NH2; 3⁄4= COOH AACÌ-S-PH(esempio 8)

L-2-Amino-5-(hydroxyphosphinyl)valeric acid;

n=3; R=Ri= H; fl2= NH2; Λ.,= COOH

L-AACÌ-5-PH(esempio 9)

iV-[L-2-amino-3-(hydroxyphosphinyl)propionyl] n=l; R=R{= H; ff2= NH2; R3= C(0)-/?5; Rs= residuo di-, tri-, tetra- peptidico costituito da L-Alanyl-L-Alanine;

amminoacidi naturali, in particolare

Asp-P-PH-I<-Ala-.L-Ala (esempio 10)

proteinogenici, preferibilmente L-Ala-L-Ala

Composti particolarmente preferiti sono:

o

HJ? HJI H^H

COOH ; ,P-\/\XOOH

HO'* HO Η0'<Ρ'ν/'>Ύ COOH

NH2NH2NH2

2-Amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric acid (Glu-y-PH)

L-GIu-y-PHA^-GIu-γ-ΡHD-GIu-γ-Ρκ

COOH

<H>>

HO o NH2

2-Amino-3-(hydroxyphosphinyl)propionic acid (Asp-β-Ρπ)

O COOH

.H

OH

NH, O

yV-(L-Leucyl)-2-amino-4-(hydroxyphosphinyl)butyric acid (L-Leu-rac-Glu-y-PH)

Gli inventori hanno anche messo a punto la sintesi dei composti

nuovi (cioè NON noti):

Derivati peptidici di Formula 1

Le sintesi dei derivati peptidici della Formula generale 1 sono

state eseguite a partire dagli amminofosfinati non-protetti; o Glu-γ

PHessendo già incorporato nei di-, tri-, o tetrapeptidi aventi gruppi carbossilici e amminici liberi. L’allungamento o la costruzione della catena peptidica sono stati ottenuti usando un derivato attivato dei amminoacido N-protetto in grado di reagire in miscele organico-acqua. Le attivazioni utilizzate sono quelle di uso comune nella chimica dei peptidi, preferibilmente gli esteri attivati, per esempio gli esteri della N-idrossisuccinimmide. [Anderson et al. (1964) J. Am. Chem. Soc. 86, 1839-1842, and Houben-Weyl Volume 15/2, page 149 et seq.]. I gruppi N-protettori utilizzati sono quelli di uso comune nella chimica dei peptidi, per esempio il gruppo benzilossicarbonile (Cbz) e il gruppo iert-butossicarbonile (Boc). Le reazioni sono state effettuate in una miscela solvente organicoacquosa, quale etanolo/acqua, 1,4-diossano/acqua, tetraidrofurano/acqua o 1,2-dimetossietano/acqua, a temperature comprese tra 0°C e 50°C, preferibilmente a temperatura ambiente. Basi ausiliarie idonee in sistemi organici acquosi sono i carbonati e bicarbonati di metalli alcalini, o quantità equivalenti di idrossidi di metalli alcalini, quali idrossido di sodio, preferibilmente sodio e potassio carbonato/bicarbonato; o animine terziarie come trietilammina. I gruppi protettori che rimangono nella molecola dopo che la catena peptidica è stata costruita possono essere scissi mediante metodi noti in letteratura, ad esempio il gruppo Cbz per idrogenolisi, il gruppo Boc per acidolisi ed i gruppi estere per idrolisi acida o alcalina. A seconda della natura e della sequenza della rimozione dei gruppi protettori, i peptidi di Formula 1 secondo l'invenzione sono ottenuti in forma libera o come sali. I sali possono essere convertiti nei peptidi liberi con metodi noti in letteratura (per esempio facendo reagire i cloridrati/bromidrati con ossido di propilene) o con resine a scambio ionico, preferibilmente Dowex 50 in forma H<+>. I sali sono ottenuti dai peptidi liberi mediante titolazione con un equivalente di acido o di base ed evaporando la soluzione acquosa.

Acido D-2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico (D-Glu-γ-ΡΗ) Il composto ZJ-Glu-γ-ΡΗè stato preparato enzimaticamente e isolato a partire dalla corrispondente miscela racemica (rac-Glu-γ-Ρκ) che è stata inizialmente sottoposta a reazione di decarbossilazione con l’enzima glutammato decarbossilasi (GadB) di Escherichia coli fino a completo esaurimento dell’isomero L, substrato della GadB, lasciando intatto l’isomero D, che è stato quindi isolato per cromatografia a scambio ionico dal prodotto di decarbossilazione dell’L-Glu-γ-ΡΗ (GAB A- Pausando una resina a scambio ionico Dowex 50Wx8.

Acido L-2-ammino-5-(idrossifosfinil)valerico e racemo- (L-AAd-δ-Ρκ e AAd-δ-Ριι )

AAd-δ-ΡΗ e L-AAC1-5-PH sono stato preparati partendo rispettivamente dai corrispondenti della miscela racemica e dell’isomero L del composto allilglicina protetti con metodi noti della chimica dei peptidi; per esempio, gruppi alchilici inferiori e gruppi benzilici sono adatti a proteggere i gruppi acidi, mentre i gruppi N-protettori utilizzati erano quelli di uso comune nella chimica dei peptidi, per esempio il gruppo benzilossicarbonile (Cbz). Così, preferibilmente la metil- N-(benzilossicarbonil)allilgbcina, seguita dall'addizione radicalica (anti-Markonikov) di acido ipofosforoso in miscele acqua-alcol, preferibilmente metanolo/acqua a temperature comprese tra 40°C e 100°C, preferibilmente tra 50°C e 80°C, e successiva deprotezione e isolamento del composto target per cromatografia a scambio ionico.

P-Deutero - derivati del composto di Formula 1

Il composto di Formula 1 contenente il legame fosforo-idrogeno è stato disciolto in soluzione di acidi forti deuterati volatili in ossido di deuterio (D2O), preferibilmente cloruro di deuterio (DC1) in D2O, e incubato a temperatura compresa tra 10°C e 80°C, preferibilmente tra 20°C e 50°C, fino a che non è stato rilevato alcun segnale di protoni >P-H negli spettri Ή-NMR. Successivamente é neutralizzato con basi organiche libere da protoni, 0 con ossido di propilene e quindi cristallizzato per ottenere i corrispondenti derivati >P-D voluti con rese elevate.

Altri derivati deuterati

Quando Ri o R2nel composto di Formula 1 sono deuterio, questo può essere introdotto inoltre per deuterazione di un composto di Formula 1 dove Ri o R2è idrogeno, 0 per deuterazione di opportuni precursori del composto di Formula 1, mediante procedimenti noti agli esperti l'arte.

Acido 4-(idrossifosfinil)-2-ossobutirrico (a-chetoglutarato-γ-PH; a-KG-γ-Ριι)

a-KG-γ-ΡΗ è un composto noto e la sua sintesi è descritta in due brevetti [Kokai Tokkyo Koho (1989), JP 01268695 e Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1983), JP 58219192]. Il primo suggerisce di far reagire H0PH(0)CH2CH2C02R (R = Ci-β alchile) con di(2-etilesil) ossalato in toluene in presenza di etilato di sodio a temp. ambiente per 24 h. la successive idrolisi (20% HC1, a riflusso, 8 hr) permette di ottenere H0PH(0)CH2CH2C0C02H (CL-KG-Y-PH) in alte rese. Questo protocollo è molto simile a quello usato per preparare l’acido α-chetoglutarico stesso [Organic Syntheses, Coll. Voi. 5, p.687 (1973); Voi 44, p.67 (1964). D01:10.15227/orgsyn.044.0067]. Tuttavia, secondo le nostre conoscenze, a-KG-γ-ΡΗè instabile a riflusso in 20% HC1 (dati non pubblicati). Il secondo brevetto usava una transaminaziono nonenzimatica (G1U-Y-PH e acido gliossalico in presenza di ioni Ni<2+>in soluzione di acqua-piridina) e isolamento di Q-KG-Y-PH usando successiva cromatografia su Amberlite IR120B (H<+>), DEAE-Sephadex A-25 (Cl·) and Sephadex G-10. Questo permetteva di ottenere il composto target a-KG-γ-ΡΗ con una resa del 39.6%. Nella presente invenzione (Esempio 10) noi abbiamo usato piridossale per la transaminazione non-enzimatica di Glu-γ-PHin presenza di ioni Al<3+>. Questo ha permesso di semplificare l’isolamento di a-KG-γ-ΡΗusando una sola cromatografia su resina Dowex 50Wx8 (forma H<+>) che ha portato ad ottene il composto target a-KG-γ-ΡΗcon una resa complessiva del 45%.

Al fine di investigarne le potenzialità antibatteriche e le possibilità di utilizzo nel trattamento di infezioni dovute a batteri, sia Gramnegativi che Gram-positivi anche in presenza di multiresistenze sviluppate verso altri antibiotici, i composti più rappresentativi tra quelli elencati qui e di cui sopra sono indicate le formule di struttura sono stati analizzati per la loro capacità di influenzare la crescita di E. coli K12 ceppo MG1655. Per testare l’efficacia di queste molecole anche su batteri resistenti agli antibiotici di uso comune sono stati condotti esperimenti su E. coli K12 MG 1655 trasformato in modo da portare i geni per la resistenza agli antibiotici Ampicillina (Amp) e Kanamicina (Kan).

La minima concentrazione inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC) sono state analizzate in terreno minimo (minimo E contenente glucosio) [Vogel and Bonner, 1955, J. Biol. Chem. 218, 97-106].

Tabella 1. MIC90 dei composti in Tabella (pg/ml) in E. coli Composto MIC90(ug/ml) Aminoacidi

AL-Glu-y-Pn 7 AL-Glu-y-Ps* 1800 (MIC20) L-Glu-γ-Ρπ 6-7 L-Glu-y-Pn 6-7 nel ceppo Kan Amp resistente

D-Glu-y-PH128 (MIC10) D.L-Asp-P-Pn 1800 (MIC50) Dipeptidi

L-Leu-Z), L-Glu-y-Pn 0.1-1 Antibiotici

Kanamicina** 16 Ampicillina** 8

* il composto fosfonico (D.L-Glu-y-Ps) è esclusivamente riportato per comparazione

**da: Chiang et al (2011) J. Exp. Microbiol. Immunol., 15, 59-63.

Gli Esperimenti i cui risultati sono riportati in Tabella 1 sono dettagliati negli esempi e sono stati condotti sia su batteri del ceppo di E. coli MG1655 e sia su batteri dello stesso ceppo modificato con tecniche note all’esperto del ramo, in modo da presentare una doppia resistenza alla Kanamicina e all’Ampicillina (Kan Amp).

Il composto L-Glu-γ-ΡΗrisulta l'isomero attivo nella miscela racemica e esercita un effetto batteriostatico nel basso range micromolare. La presenza del gruppo fosfinico è fondamentale per l’entrata della molecola nella cellula e per un’efficace attività intracellulare, come testimoniato dalla notevole differenza nel valore MIC90tra l’L-Glu-γ-ΡΗ e il suo derivato fosfonico (-PO3H2, P5) L-Glu-γ-Ρδ (riportato in Tabella 1 solo per comparazione). Inoltre Γ L-Glu-γ-Ριι si rivela molto più attivo del suo analogo mancante di un carbonio, ASP-6-PH.

Una MIC inalterata dell’L-Glu-γ-ΡΗ su un ceppo resistente a due noti antibiotici battericidi, FAmpicillina (un antibiotico 6-lattamico) e la Kanamicina (un antibiotico aminoglicosidico), lascia concludere che l’L-Glu-γ-ΡΗagisca interferendo con processi totalmente differenti da quelli bersaglio dei due antibiotici e che la sua penetrazione ed efficacia nella cellula non è alterata dalla presenza di questi antibiotici.

Quando il composto L-Glu-γ-ΡΗè funzionalizzato con altri amminoacidi, come nel caso riportato in Tabella 1 per il dipeptide L-Leu-AÌ'-Glu-y-PH si registra una MIC almeno 10 volte inferiore al composto L-Glu-γ-ΡΗcome tale, suggerendo che la molecola esplica meglio la sua attività batteriostatica come dipeptide, probabilmente perché entra più facilmente nella cellula bersaglio per mezzo dei trasportatori dei dipeptidi, risultando promettente per ulteriori studi.

Studi preliminari di metabolomica (dati non mostrati) su cellule di E. coli MG1655 trattate con G1U-Y-PH indicano che GABA-PH, Succinate-PH e CL-KG-PH sono presenti. Ad indicare che composti che ricadono anch’essi nella formula 1 sono suoi metaboliti e quindi l’L-Glu-γ-ΡΗ è a tutti gli effetti una molecola prodrug, cioè un precursore del principio attivo.

Gli inventori hanno infine verificato gli effetti citotossici e antiproliferativi dei composti secondo l’invenzione su linee cellulari HeLa (ATCC® CCL-2™) e Caco2 (ATCC® HTB-37™) coltivate in micropiastra e trattate con MTT, un colorante che viene convertito solo nelle cellule vive. In entrambi i casi anche usando Glu-γ-Ριι ad una concentrazione 1 mM non si osservano differenze significative (dati non mostrati) tra le cellule trattate e quelle non trattate, a significare che il composto Glu-γ-ΡΗ non è né tossico né ha effetti antiproliferativi .

Questo è confermato anche dalla limitata tossicità in modelli animali (LD50 in topi maschi e femmine erano rispettivamente: 2.7 and 2.9 g/kg, per os; 1.1 and 1.3 g/kg dopo iniezione i.p.; in ratti > 5.0 g/kg; Yonaga T. et al. (1982) Yakuri to Chiryo 10(11), 43-51 (in Japanese)).

I composti dell’invenzione possono essere somministrati, da soli o in combinazione con altri agenti antimicrobici. Un aspetto vantaggioso dei composti è che il loro uso in combinazione con antibiotici attualmente in commercio quali ad esempio non limitativo: peniciline, cefalosporine, fluorochinoloni, aminoglicosidi, monobactami, carbapenemi, macrolidi e relative miscele, 0 ancora in fase di trial clinico (come ad esempio β-lattami, anche in combinazione con i loro inibitori, carbapenemi, aminoglicosidi, chinoioni, macrolidi, glicopeptidi, sulfamidi, tetracicline, ossozolidinoni, acidi fusidici, pleurimutiline, cefalosporine, agenti che agiscono a livello delle membrane, come i peptidi antimicrobici, inibitori della peptide deformilasi, inibitori della sintesi degli acidi grassi, antitubercolari, nitroimidazoli, e ogni loro combinazione, lantibiotici e ogni loro combinazione) è più efficace, rispetto a ciascuno dei composti utilizzati da soli. I composti deirinvenzione hanno una bassa tossicità per i mammiferi (LD50in topi maschi e femmine rispettivamente: 2.7 and 2.9 g/kg, per os; 1.1 and 1.3 g/kg dopo iniezione i.p.; in ratti > 5.0 g/kg) e possono essere utilizzati per il trattamento delle malattie in animali, specialmente mammiferi, e nell’uomo, e possono essere usati come agenti antisettici per la protezione, oltre che dei viventi, anche dei materiali da contaminazioni microbiche .

Di conseguenza, l'invenzione fornisce composizioni terapeutiche comprendenti una quantità farmaceuticamente efficace di un composto di formula 1 e almeno un veicolo 0 un eccipiente farmaceuticamente accettabile fra quelli noti all’esperto del ramo, come ad esempio un supporto solido o un diluente liquido.

Le composizioni farmaceutiche secondo l'invenzione contengono almeno un composto di formula generale 1 come sostanza attiva insieme con un veicolo farmaceutico convenzionale. Il tipo di carrier utilizzabile dipende in larga misura dall'uso specifico, cioè, per esempio per disinfettare la pelle sana, disinfettare le ferite, nel trattamento di dermatiti e affezioni delle mucose causate da batteri e nelle malattie dell’apparato uro-genitale, le formulazioni come unguenti, polveri, spray, tinture, e bende sono utilizzate in particolare.

Formulazioni per gargarismi o concentrati per la loro preparazione, e compresse per lenta dissoluzione nella bocca, sono adatte per la disinfezione del cavo orale e della gola.

Unità di dosaggio solide, in particolare compresse, confetti (confetti) e capsule, sono convenienti per l'utilizzo nella disinfezione intestinale.

In tutte le forme di somministrazione i composti della formula generale 1 possono essere presenti come principi attivi singoli o possono anche essere combinati con altri ingredienti o possono essere anche combinati con altri composti noti farmaceuticamente attivi, e soprattutto antibatterici e/o antimicotici e/ antiinfiammatori o altre sostanze attive antimicrobiche, ad esempio per ampliare la gamma di applicazioni.

L'invenzione fornisce anche un metodo per proteggere un materiale organico/inorganico, ad esempio un manufatto, comprese le superfìci, recipienti, strumenti, apparecchiature e altre attrezzature mediche, suscettibili all'attacco batterico. Il metodo comprende lo stadio del trattamento del materiale con ima formulazione comprendente il composto di Formula 1. Il materiale organico può essere un materiale naturale o polimerico di sintesi, una superficie proteica o a base di carboidrati, o una fibra o materiale tessile naturale o di sintesi.

I composti della presente invenzione possono essere somministrati ad un paziente, (umano o animale) in composizioni farmaceutiche in cui sono mescolati con adatti carrier solidi o liquidi farmaceuticamente accettabili o eccipienti adatti a dosi tali da migliorare o trattare una serie di affezioni. Tali composizioni possono anche contenere, oltre ai composti dell’invenzione e al carrier, diluenti, filler, sali, tamponi, stabilizzanti, solubilizzanti ed altri componenti ben noti nell’arte. Col termine “farmaceuticamente accettabili” si intendono materiali non tossici e che non interferiscono con l’efficacia dell’attività biologica degli ingredienti attivi.

Le tecniche per la formulazione e la somministrazione dei composti dell’invenzione possono essere facilmente reperite [Gennaro, A. R. (ed) (2000) Remington: thè Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition. Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, MA; Gennaro, A. R. (ed) (2000) Remington’s Pharmaceutical Sciences , 20<th>edition. Mack Publishing Co., Easton, PA]. Inoltre, una dose efficace dal punto di vista terapeutico si riferisce a quella quantità di composto sufficiente al miglioramento dei sintomi, per esempio, trattamento, cura, prevenzione o miglioramento dello stato medico relativo.

Le vie di somministrazione adatte possono, per esempio, includere l’ingestione orale, rettale, vaginale, transmucosale, o intestinale; parenterale, comprese iniezioni intramuscolari, sottocutanee, intramidollari, intratecali, intraventricolari, endovenose, intraperitoneali, intranasali, o intraoculari. La somministrazione dei composti della presente invenzione impiegabili nelle composizioni farmaceutiche o nei metodi di trattamento secondo protocolli standard, può essere effettuata in ima molteplicità di vie convenzionali, quali ingestione orale, inalazione, applicazione topica o cutanea, sottocutanea, intraperitoneale, parenterale o endovenosa.

Le vie inalatoria e topica sono vie di somministrazione preferite per gli scopi dell'invenzione perchè di facile uso. Per l’utilizzo per via inalatoria i composti sono diluiti in opportuno solvente, in genere acquoso, e spruzzati sottoforma di aerosol sulle superfìci mucose delle cavità corporee acessibili dall'esterno. Per l’utilizzo topico i composti sono miscelati con opportuni veicoli, ottenendo creme, gel, oli, emulsioni spalmatali sulla superficie cutanea. Un’altra possibile applicazione topica è quella che utilizza sistemi terapeutici transdermici (cerotti e simili) da applicare sull'epidermide in modo che il principio attivo venga liberato e assorbito dalla cute in maniera continua e pressoché costante nel tempo.

Altra tipologia di formulazione è quella liquida come composizione disinfettante con il principio attivo combinato con le usuali formulazioni liquide, alla portata del tecnico del ramo.

I composti di formula 1 sono in grado di inibire la crescita batterica in maniera dose-dipendente con MIC90in terreno minimo <10, ad esempio compresa tra 10 e 0.1.

I composti di formula 1 sono in grado di inibire la crescita batterica anche in presenza di multi-resistenze e risultano attivi anche i composti deuterati.

I composti di formula 1 sono efficaci nei confronti di batteri patogeni come ad esempio: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Salmonella typhimurium e altri enterobatteri come Clostridium difficile, oltre che contro Pseudomonas aeruginosa e lieviti come Candida albicans e Candida tropicalis, compresi anche i patogeni che presentano mutiresistenza ai comuni antibiotici come Staphylococcus aureus meticillinaresistente.

Gli esempi seguenti sono dati per illustrare l'invenzi one e non sono da considerare limitativi della relativa portata.

ESEMPI

Esempio 1

Cromatografia su strato sottile è stata condotta su piastre di Cellulosa F254 (Merck) nel sistema: i-PrOH-25% NH4OH-H2O, 7:1:2 (A). Gli aminofosfinati sono stati rivelati sulle piaster con reagente molibdato d’ammonio o con colorazione alla ninidrina. I prodotti sono stati purificati su resina Dowex 50Wx8 (BioRad) (100-200 mesh) in forma H<+>(dimensioni della colonna ed eluenti sono indicati nel testo); mentre gli intermedi sono stati purificati su Kieselgel (Merck) 0.040-0.063 mm (dimensioni della colonna ed eluenti sono indicati nel testo).

Gli spettri NMR sono stati registrati in D2O su uno spettrometro Bruker Avance AMX III 400 (Germany) con frequenza di lavoro di 400.1 MHz per Ή NMR (sodio 3-trimetil-l-propansolfonato come standard interno) 100.1 MHz per<13>C (con disaccoppiamento carbonio-protone, sodio 3-trimetil-l-propansolfonato come standard interno) e 162 MHz per<31>P (con disaccoppiamento fosforo-protone, se non specificato, 85% H3PO4come standard interno); i Chemical shifts sono dati in ppm.

Gli spettri di massa ad alta risoluzione (HRMS) sono stati registrati su uno strumento Bruker Daltonics micrOTOF-Q II usando la ionizzazione per elettrospray (ESI). Le misure sono state acquisite in modalità ioni positivi con i seguenti parametri: tensione all’interfaccia capillare 4500 V; range di massa da m/z 50 a 3000; calibrazione esterna (elettrospray Calibrant Solution, Fluka); pressione di nebulizzazione 0,4 bar; portata 3 ml/min; l'azoto è stato applicato come gas secco (4 L/min); la temperatura di interfaccia è stata fissata a 200°C.

I punti di fusione sono stati determinati in tubi capillari aperti su strumento Electrothermals Mel-Temp 1202D e sono non corretti.

Esempio 2

Acido Z>-2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico; (D-GIU-Y-PH) Il composto D-Glu-γ-ΡΗè stato preparato enzimaticamente e isolato a partire dalla corrispondente miscela racemica (rac-Glu-γ-Ρκ) che è stata inizialmente sottoposta a reazione di decarbossilazione con l’enzima glutammato decarbossilasi (GadB) di Escherichia coli fino a completo esaurimento dell’isomero L, substrato della GadB, lasciando intatto l’isomero D, che è stato quindi isolato per cromatografia a scambio ionico Dowex 50. In breve, 167 mg della miscela racemica D,L-G1U-Y*PH (pari ad 1 mmole di composto) sono stati pesati e disciolti in un volume finale di 1,25 mi di tampone 0.2 M Piridina-HCl, pH 4.6, contenente 1 mM PLP e 0.1 mM DTT. Questa soluzione è stata mescolata con un uguale volume (1,25 mi) di GadB di E. coli (concentrata 2 mg/ml) disciolta nello stesso tampone in modo da avere una concentrazione finale di D,L- Glu-γ-PHdi 0,4 M e di GadB di 1 mg/ml.

La reazione è stata monitorata periodicamente per valutare il pH e, quando necessario, correggerlo con aggiunte di HC1 IN in modo da mantenerlo costante a valori compresi tra pH 4.6 e pH 5.5, assicurandosi cosi che l’enzima fosse sempre attivo (> 50% dell’attività massima). Ad intervali di tempi si è provveduto a prelevare 15 pl/2500 pi e a trasferirli in tubo eppendorf contenente 10 pi di NaOH 250 mM in modo da bloccare istantaneamente le reazione. I 25 pi risultanti sono stati trasferiti in tubi portacampione per NMR previa diluizione in 600 pi di D2O (diluizione 1:25) e analizzati su uno strumento Bruker 500 UltraShieldTM. Per semplicità e per la quantizzazione relativa delle sostanze presenti nella miscela di reazione, la cinetica è stata seguita come 31P NMR, ma gli stessi campioni sono stati analizzati anche in IH NMR. Il segnale relativo al 31P nel D,L-G1U-Y-PH (28.98 ppm) va gradualmente riducendosi fino ad attestarsi a circa il 50% del valore di partenza. A questo punto la reazione è stata interrotta in quanto tutto l’isomero L risultava convertito nel suo prodotto di decarbossilazione.

Quindi 7,8 mi di acqua MilliQ sono stati aggiunti a 2,2 mi di filtrato proveniente dalla reazione di bioconversione in modo tale da avere un volume totale di 10 mi, che è stato applicato su una colonna Dowex 50 (20 mi; 1.7 x 9 cm) consentendo così al campione di entrare in colonna ad una velocità di 1 ml/min.

La cromatografia è stata avviata con 400 mi di acqua MilliQ. L’isomero D-Glu-γ-ΡΗ che non ha reagito nella reazione di bioconversione, è stato quindi eluito applicando inizialmente 40 mi raccolti in una beuta, mentre i successivi sono stati raccolti in 22 frazioni (n° 1→20) di 5 mi ciascuna e poi altre 30 frazioni (dal n°21 al n°50) dalO mi ciascuna. Al termine di questa eluizione si è effettuata una TLC per controllare l’eluizione del D-Glu-γ-ΡΗ. Quindi si è provveduto a riunire le frazioni dalla n° 6 alla n° 31 e ad evaporare il loro contenuto totale in evaporatore rotante fino ad ottenere per completo essiccamento la polvere di Z<)>-G1U-Y-PH, che è stata ricristallizzata da una miscela etanolo/acqua per dare 62 mg (resa del 37 %, calcolata a partire dal TOC-GIU-Y-PH) , mp 222-223°C, dee., [a]D<20>-20.4° (1% in water), Rf 0.24 (A). Ή-NMR (D20) δ: 6.98 (dt, IH, VHP523 Hz,<3>JHH1.5 Hz, P-H), 4.09 (t, IH,<3>JHH6.1 Hz, CH), 2.22-2.07 (m, 2H, CH2P), 1.83-1.61 (m, 2H, CIfcCH). «C-NMR (D20) δ: 174.91 s, 56.15 d (<3>JCp16.2 Hz), 29.18 d (VCP88.8 Hz), 25.08 s. s<i>p-NMR (D20) δ: 29.10 s.

Esempio 3

Acidi amminofosfinici P-Deuterati (Glu-γ-Ρϋ, D-GIU-Y-PD, L-Glu-y-PD, GABA-PD, Asp-β-Ρϋ). Procedura generale di sintesi.

Una soluzione di 167 mg (1 mmol) di Glu-γ-ΡΗin 37% DC1 (5 mL) è stata incubata a 20°C per 4 ore, evaporata a secchezza in vacuo, coevaporata in vacuo con D20 (2 x 5 mL) e poi incubata in 37% DC1 (5 mL) per ulteriori 4 ore che secondo NMR [<31>P-NMR (35% DC1, protoni disaccoppiati) δ: 35.87 (t, VDP88,4 Hz),<31>P-NMR (35% DC1 , protoni accoppiati) δ: 35.87 (t, VDP88,4 Hz),<31>P-NMR (35% DC1, deuteri-disaccoppiati) δ: 35,87 (s)] hanno mostrato la formazione del composto con legame fosforo-deuterio e l’assenza del composto di fosforo-idrogeno. La miscela di reazione è stata co-evaporata in vacuo con D20 (2 x 5 mL) ed il residuo è stato disciolto nel volume minimo di metanolo-^. La soluzione così ottenuta è stata neutralizzata con ossido di propilene, diluita con un volume uguale di isopropanolo e mantenuta a -20°C fino alla fine della precipitazione che ha consentito di ottenere dopo essiccazione in vacuo su P2O5 HO mg (66%) di Glu-γ-Ρϋ. Ή-ΝΜβ (D2O) δ: 4.06 (t, IH,<3>JHH6.0 Hz, CH), 2.18-2.01 (m, 2H, CH2P), 1.78-1.57 (m, 2H, CH2CH).

Utilizzando lo stesso protocollo si possono ottenere L-Glu-γ-Ρο, GABA-PD e Asp-β-Ρϋ con una resa elevata.

Esempio 4

Acido iV-(L-Leucil)-2-ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico (L-Leu-Glu-γ-ΡΗ).

Alla soluzione di 500 mg (3 mmoli) di rac-Glu-γ-ΡΗin una miscela di acqua (1 mL) ed NaOH 1 M (6 mL) sono stati aggiunti 127 mg (1,5 mmol) di NaHCOe, 158 mg (1,5 mmol) di NaHC03e glima (1 mL) seguiti da una soluzione di 1,08 g (3 mmol) dell’estere di N-benzilossicarbonil-L-Leucina iV-idrossisuccinimmide in glima (5 mL) appena ricristallizzato (da isopropanolo). La soluzione praticamente limpida così ottenuta è stata lasciata per 16 ore a 20°C. Il glima è stato rimosso in vacuo, è stata aggiunta acqua (10 mL), e la soluzione risultante è stata estratta con acetato di etile (2 x 5 mL), acidificata a pH 1 con acido cloridrico al 37% ed estratta con acetato di etile (3 x 7 mL). Gli ultimo estratti in acetato di etile sono stati lavati con acqua (3 mL), salamoia (5 mL) ed essiccati su solfato di magnesio. La soluzione di acetato di etile è stata concentrata in vacuo e al residuo sono stati aggiunti acido acetico (3 mL), anisolo (0,2 mL), e il 35% di HBr/AcOH (2.2 mL). Dopo 1,5 ore a 20°C la miscela di reazione è stata riunita in etere etilico (50 mi) e lasciata per 5 ore a -20°C. Dall’olio separato (dopo averlo lavato con etere etilico) il target L-Leu-Glu-γ-ΡΗ è stato isolato mediante cromatografia su colonna di resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 12 mL, eluizione con acqua). Le frazioni contenenti L-Leu-Glu-γ-ΡΗsono state evaporate a secchezza in vacuo e poi essiccate in vacuo su P2O5/KOH to ottenere 0.64 g (76% per due stadi) di L-Leu-Glu-γ-ΡΗcome solido incolore. Rf 0.46 (A). Ή NMR (D2O): δ: 6.89 (dt, IH, VHP 514.3 Hz,<3>JHH 1.8 Hz, H-P), 4.43-4.35 (m, IH, CH-COOH), 4.00 (dd, IH, 3⁄4/HHa7.5 & 7.4 Hz,<3>JHHb7.4 & 6.7 Hz, CH-NH2), 2.11-1.99 (m, IH, CHa-P), 1.95-1.82 (m, IH, CHb-P), 1.77-1.50 (m, 5H, CH2-CH2-P, CH2-CH-NH2, CH-(CH3)2), 0.93-0.89 (m, 6H, CH-(CH3)2).<13>C NMR (D20): δ: 177.79 & 177.30 (2xs, COOH), 173.30 & 173.18 (2xs, CONH), 56.51 & 56.25 (2xd,<3>JCP16.6 & 16.3 Hz, CH-COOH), 54.78 & 54.61 (2xs, CH-NH2), 42.58 (s, CH2-CH-NH2), 30.26 & 30.04 (2xd, VCP 89.3 Hz, CH2-P), 26.61 (d, VCP 20.8 Hz, CH2-CH2-P), 25.82 & 25.78 (2xs, CH-(CH3)2), 24.39 & 24.35 & 23.94 & 23.91 (4xs, CH3).<3i>p NMR (D20): δ: 29.34 & 29.17 (2xs). I segni e “x” indicano differenze per gli stessi segnali e costanti di due diastereomeri (L,L- e LJ)- ). HRMS (ESI-MS): calculato per C10H21N2O5P [M+H]<+>281.1261, trovato 281.1271.

Esempio 5

iV-L-Leucil-{L-[2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirril]}-L-Alanil-L-Alanina (L-Leu-L-Glu-y-Pii-L-Ala-L-Ala) Preparata come descritto nell’Esempio 4 partendo da 78 mg (0.25 mmol) di AML-[2-ammino-4-(idrossifosfìnil)butirril]}-L-Alanil-L-Alanina (L-Glu-y-PH-£-Ala-L-Ala) e 100 mg (0.28 mmol) dell’estere di dell’estere di Af-benzilossicarbonil-L-Leucina N-idrossisuccinimmide ricristallizzato di fresco (da isopropanolo ) che dopo rimozione del gruppo benzilossicarbonilico con 35% HBr/AcOH e isolamento di L-Leu-L-Glu-y-PH-^-Ala-L-Ala mediante colonna cromatografica con resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 2 mL, eluizione con acqua) forniva 68 mg (68% per due stadi) di L-Leu-L-Glu-y-PH-L-Ala-L-Ala come solido incolore. Ή-NMR (D2O) δ: 6.95 (d, IH, VHP520 Hz, H-P), 4.22-4.05 (m, 2H, 2x CH-CH3), 3.95 (t, IH,<3>JHH7.4 Hz, CH-NH2), 1.92-1.82 (m, 2H, CH2-P), 1.80-1.55 (m, 5H, CH2-CH2-P, CH2-CH-NH2, CH-(CH3)2), 1.18 (d, 3H,<3>JHH7.2 Hz, CH3), 1.12 (d,<3>JHH7.2 Hz, 3H, CH3), 0.92-0.88 (m, 6H, CH-(CH3)2).<31>P-NMR (D2O) δ: 29.14 (s). HRMS (ESI-MS): calcolato per CÌ6H3IN407P [M+H]<+>423.2003, trovato 423.2008.

Esempio 6

Acido iV-(L-Leucil)-3-amminopropilfosfinico (L-Leu-GABA-PH)

Preparato come descritto nell’Esempio 4 partendo da 123 mg (1 mmol) di acido 3-amminopropilfosfinico (GABA-PH) e 397 mg (1.1 mmol) dell’estere di A-benzilossicarbonil-L-Leucina N-idrossisuccinimmide (ricristallizzato di fresco da isopropanolo) che dopo rimozione del gruppo benzilossicarbonilico con 35% HBr/AcOH e isolamento di L-Leu-GABA-PH mediante colonna cromatografica con resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 5 mL, eluizione prima con acqua e poi con HC1 1 mM) forniva L-Leu-GABA-PH cloridrato, che era convertito in forma zwitterionica usando ossido di propilene (analogamente a quanto descritto nell’Esempio 3) che dopo essiccamento in vacuo su P2O5/KOH forniva 137 mg (87% per due stadi) di L-Leu-GABA-PHcome solido incolore. Rf 0.71 (A). Ή-NMR (D2O) δ: 6.88 (dt, IH, VHP 509.5 Hz,<3>JHH 1.6 Hz, H-P), 3.89 (t, IH,<3>J 7.3 Hz, CH-NH2), 3.31-3.19 (m, IH, CH2-NH), 1.66-1.46 (m, 7H, CH(CH3)2, CH2-CH(CH3)2, CH2-P, CH2-CH2-P), 0.91 (d, 3H,<3>JHH 6.1 Hz, CH3), 0.90 (d, 3H,<3>JHH 6.1 Hz, CH3).<13>C-NMR (DaO) 8: 172.97 (s, C(O)NH), 54.90 (s, CH-C(O)NH), 42.85 (d, *JCp17.4 Hz, CH2-NH), 42.63 (s, CH2-CH-NH2), 31.06 (d, VCP 89.7 Hz, CH2-P), 26.71 (s, CH-(CH3)2), 24.16 (d,<2>JCP 32.1 Hz, CH2-CH2-P), 23.44 & 23.42 (2xs, CH3).<3i>p.

NMR (D2O) δ: 30.62 s. HRMS (ESI-MS): calcolato per C9H21N2O3P [M+H]+ 237.1363, trovato 237.1364.

Esempio 7

Acido iV-(L-Leucil)-2-ammino-3-(idrossifosfinil)propionico (L-Leu-Asp-β-ΡΗ)

Preparato come descritto nell’Esempio 4 partendo da 306 mg (2 mmol) di rac-Asp-β-Ριι e 795 mg (2.2 mmol) dell’estere di N-benzilossicarbonil-L-Leucina iV-idrossisuccinimmide (ricristallizzato di fresco da isopropanolo) che dopo rimozione del gruppo benzilossicarbonilico con 35% HBr/AcOH e isolamento di L-Leu-Asp-8-PH mediante colonna cromatografica con resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 10 mL, eluizione con acqua) ed essiccamento in vacuo su P2O5/KOH forniva 383 mg (resa complessiva 72% per due stadi) di L-Leu-Asp-B-PHcome solido incolore.<!>H-NMR (D2O) δ: 7.05 (d, IH, VHP516 Hz, H-P), 4.48-4.39 (m, IH, CH-COOH), 4.02-3.98 (m, IH, CH-NH2), 2.23-2.10 (m, IH, CHa-P), 2.01-1.89 (m, IH, CHb-P), 1.78-1.57 (m, 3H, CH2-CH-NH2, CH-(CH3)2), 0.94-0.89 (m, 6H, CH-(CH3)2).<31>P-NMR (D20) 6: 21.9. HRMS (ESI-MS): calcolato per C9H19N2O5P [M+H]<+>267.1104, trovato 267.1107.

Esempio 8

Acido 2-Ammino-5-(idrossifosfmil)valerico (AAd-δ-ΡΗ) Una soluzione di 790 mg (3 mmol) di metil iV-benzilossicarbonilallilglicina (da rac-allilglicina), 2.2 g 50% di acid aq. ipofosforoso (26 mmol) e 41 mg (0.25 mmol) di α,α,'-azoisobutirronitrile in metanola (20 mL) era posta a riflusso sotto atmosfera di Argon per 5 hr e per aggiunta di acqua (15 mL) il metanolo era rimosso in vacuo. Il residuo era estratto con acetate di etile (2 x 10 mL), gli estratti organic erano lavati con acqua (3 mL), salamoia (5 mL) ed essiccati su solfato di magnesio. La soluzione di acetate di etile era concentrata in vacuo e dal residuo veniva isolato il metil N-benzilossicarbonil-AAd- □ -PH SUcolonna Kieselgel (3.5 x 12 cm), usando per l’eluizione diossano-25%NH4OH, 85/15. Le frazioni contenenti il metil ZV-benzilossicarbonil-AAd-δ-ΡΗ erano evaporate a secchezza in vacuo, al residuo era aggiunto 20% HC1 (35 mL) e posto a riflusso in atmosfera di Argon per 3 hr. la miscela di reazione era evaporate a secchezza in vacuo AAd-Π-Ρΐίveniva isolato su resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 30 mL, eluizione con acqua). Le frazioni contenenti AAd-δ-ΡΗ erano evaporate a secchezza in vacuo e poi essiccate in vacuo su P2O5/KOH per fornire 109 mg (20% come calcolato per la allilglicina, i.e. per 4 stadi) di AAd-δ-ΡΗcome solido incolore; Rf 0.26 (Al^H-NMR (D20) 6: 7.01 (d, IH, VHP513 Hz, P-H), 3.98 (t, IH, 3⁄47HH5.9 Hz, CH), 2.12-1.98 (m, IH, CHa-P), 1.96 1.80 (m, IH, CHb-P), 1.73-1.45 (m, 4H, CH-CH2-CH2).<31>P-NMR (D20) δ: 32.3. HRMS (ESI-MS): calcolato per C5H12NO4P [M+H]<+>182.0577, trovato 182.0580.

Esempio 9

Acido L-2-Ammino-5-(idrossifosfinil)valerico (L-AAd-δ-ΡΗ) Preparato come descritto nell’Esempio 8 a partire da 920 mg (3.5 mmol) di metil iV-benzilossicarbonil-L-allilglicina (da L-allilglicina), che forniva 115 mg (18% come calcolato per L-allilglicina, i.e. per 4 stadi) di L-AAd-δ-ΡΗcome solido incolore. Il valore di Rfe gli spettri<1>H- e<31>P-NMR sono identici a quelli del composto descritto nell’esempio 8. HRMS (ESI-MS): calcolato per C5H12NO4P [M+H]<+>182.0577, trovato 182.0579.

Esempio 10

Acido 4-(idrossifosfmil)-2-ossobutirrico (a-chetoglutarato-γ-PH; O-KG-Y-PH)

Una soluzione di 240 mg (1.44 mmol) di rac-Glu-γ-ΡΗ, 422 mg (2.07 mmol) di cloridrato di piridossale e 50 mg (0.21 mmol) di cloruro di alluminio esaidrato in acqua (120 mL) erano portati a pH 6.8 con idrossido di ammonio diluito, poi posti a riflusso per 1.5 hr ed evaporati in vacuo a 15 mL. Da questa soluzione veniva isolato achetoglutarato-γ-ΡΗ mediante colonna cromatografica su resina Dowex 50Wx8 (100-200 mesh) in forma H<+>(volume della colonna 40 mL, eluizione con acqua), raccogliendo frazioni di “2,4-dinitrofenil idrazina positive”, che erano combinate, evaporate a secchezza in vacuo, dissolte in acqua e poi liofilizzate per dare 108 mg (45%) di CL-KG-Y-PH come solido semi-ceroso. a-KG-γ-ΡΗesiste in soluzione come equilibrio delle forme Cheto- e Diolo. Cheto-forma:

Ή-NMR (D20, pH 1.8): δ: 7.05 (dt, IH,<I>JHP 546.9 Hz, 3⁄4/HH 2.0 Hz, H-P), 3.10 (ddd, 2H,<3></ΗΗ37.7 Hz, 3⁄4/ΗΙ3⁄4 7.8 Hz, 3⁄4/HP 13.9 Hz, CH2-C(O)), 2.12-1.89 (m, 2H, CH2-P).<13>C-NMR (D20, pH 1.8): δ: 196.30 (d, 3⁄4/CP 12.4 Hz, C=0), 163.05 (s, COOH), 30.77 (s, CH2-C(0)), 22.80 (d, VCP 92.8 Hz, CH2-P).<3i>p-NMR (D20, pH 1.8): 8: 33.42 (s).

Piolo-forma: Ή-NMR (D20, pH 1.8): 8: 7.00 (dt, IH, VHP 544.7 Hz,<3>JHH 1.8 Hz, H-P), 2.12-1.68 (m, 4H, CH2-P & CH2-C(OH)2).<13>C-NMR (D20, pH 1.8): 8: 174.04 (s, COOH), 94.2 (d,<3>JCP 17.9 Hz, C(OH)2), 29.92 (s, CH2-C(OH)2), 23.58 (d, VCP 91.7 Hz, CH2-P).<3i>p. NMR (D20, pH 1.8): 8: 34.43 (s).

Composizione terreni di crescita

Minimo EG p H 7:

terreno Minimo E alla concentrazione IX pH 7 [Vogel and Bonner, 1955, J. Biol. Chem. 218, 97-106].

D-glucosio 0.4%

Crescita e trattamento dei batteri in terreno Minimo EG pH 7 Il ceppo batterico E. coli K12 MG1655 viene prelevato da stock in glicerolo (-80°C), si striscia il ceppo su piastra LB-Agar e si incuba a 37°C ovemight (ON). Il giorno seguente si effettua un secondo passaggio su piastra LB-Agar con successiva incubazione a 37°C ON. Il giorno successivo si effettua un pre-inoculo (prelevando con ansa sterile circa 1 cm da piastra) in 2 mL di LB e incubo a 37°C ON. Quindi la coltura ON viene centrifugata a 3500 rpm per 15 minuti e il pellet viene risospeso in 2 mL di soluzione fisiologica (0.9% NaCl). La densità ottica (O.D.) a 600 nm viene corretta con soluzione fisiologica fino ad ottenere un O.D. 600 nm = 1.

Si procede effettuando un inoculo 1:25 in 3 mL di terreno Minimo EG pH 7 e si incuba la coltura a 37°C sotto moderata agitazione. Non appena la coltura raggiunge (in giornata) Ο.Ό.βοο tra 0.35-0.4 (circa 7-8 ore dall’inoculo), si effettua una nuova diluizione 1:25 in 3 mL di terreno Minimo EG pH 7 e si procede inoculando 1:10 su micropiastra da 96 pozzetti precedentemente allestita con diluizioni opportune del composto in studio in terreno Minimo EG pH 7. Si registra quindi 1OD al tempo 0 mediante apposito lettore per micropiastra e infine si incuba a 37°C.

Dalla 13esima ora, per ogni ora, si registra l'O.D. dell'inoculo su micropiastra al fine di ottenere una curva di crescita nel tempo.

Il controllo negativo (bianco) è rappresentato dallo stesso terreno in cui però non sono stati inoculati i batteri, mentre il controllo positivo è rappresentato dal ceppo batterico {E. coli K12 MG1655) coltivato su micropiastra nello stesso terreno ma in assenza di molecole in tabella 1.

Per gli esperimenti con il ceppo E. coli MG1655 Amp Kan resistente il ceppo viene strisciato su piastra LB-Agar, coltivato in LB e poi coltivato esattamente come sopra solo che in tutti i casi sono sempre presenti AmplOO pg/ml e Kan 25 pg/ml.

Conta delle cellule vive e calcolo MIC e MBC

Al fine di ricavare le unità formanti colonie di partenza (CFU/mL), 100 ul della diluzione 1:25 in 3 mL di terreno Minimo EG pH 7 vengono diluiti 1:10 in 1 mi di soluzione fisiologica in modo sequenziale (metodo delle diluizioni seriali) fino ad ottenere una diluizione finale 1:1000. 10 ul di questa diluizione sono piastrati su LB-Agar (in triplicato) e le piastre incubate a 37°C ON.

Il giorno successivo si procede con la conta delle cellule vive da cui viene quindi ricavato il valore CFU/mL.

La MIC è calcolata a partire dai valori delle densità ottiche (O.D.

595 nm) ricavate dalla lettura della micropiastra alla 20esima ora di incubazione applicando la seguente formula:

% di inibizione = [l-(O.D. pozzetto/O. D. controllo negativo)] *100 Il controllo negativo è la medesima coltura in assenza del composto.

La MBC viene ricavata piastrando su LB-Agar 10 e 100 ul provenienti dal pozzetto contenente una concentrazione del composto in studio 4 volte superiore la MIC. Le piastre sono infine incubate 37°C ON.

Test di tossicità cellulare

Gli esperimenti su cellule HeLa sono stati condotti in terreno standard per la crescita di queste cellule, che è DMEM ad alta concentrazione di glucosio (Life Technologies) e contenente 10% Siero Fetale Bovino (FBS; Sigma) su micropiastra da 96 pozzetti, con 1.2 x IO<4>cellule per pozzetto- mantenute in incubatore a 37°C, umidità 95%, 5% CO2.

Gli esperimenti su cellule Caco2 sono stati condotti in terreno standard per la crescita di queste cellule e che è DMEM ad bassa concentrazione di glucosio (Life Technologies) e contenente 20% Siero Fetale Bovino (FBS; Sigma)su micropiastra da 96 pozzetti, con 1.5 x IO<4>cellule per pozzetto- mantenute in incubatore a 37°C, umidità 95%, 5% CO2.

Le cellule sono state quindi trattate con MTT, un colorante che viene convertito solo nelle cellule vive [Mosmann, 1983. Journal of Immunological Methods. 65: 55-63]. In entrambi i casi è stato usato D,L-Glu-y-PH fino ad ima concentrazione di 1 mM per valutare i possibili effetti tossici o antiproliferativi.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti per uso farmaceutico come agenti antimicrobici contro batteri patogeni Gram-positivi e Gram-negativi, in particolare verso patogeni resistenti ai cornimi antibiotici, detti composti aventi la seguente Formula 1: O R P-(CH2)n-C-R3 HO Ri Formula 1 che include isomeri e diasteroisomeri in forma zwitterionica, e corrispondenti sali con acidi e basi sia organici che inorganici, in cui: n è un numero intero positivo compreso fra 1 e 4 R= idrogeno o deuterio Ri è idrogeno, o deuterio, o Ri ed R2insieme formano un doppio legame di tipo carbonilico C=0; R2è idrogeno, 0 deuterio, 0 un gruppo amminico, non sostituito 0 sostituito con C(0)-CH(NH2)-R4, dove R4è la catena laterale di un amminoacido naturale preferibilmente proteinogenico, in particolare ma non esclusivamente L- Leu, o L-Ala, preferibilmente un residuo di-, tri-, ieira-peptidico derivato da amminoacidi proteinogenici; R3 è idrogeno, 0 deuterio, 0 un gruppo carbossilico, 0 C(0)-R5 dove Rs è la catena laterale di un amminoacido naturale, preferibilmente proteinogenico, in particolare ma non esclusivamente L- Leu, 0 L-Ala, preferibilmte un residuo di-, tri-, ieira-peptidico derivato da amminoacidi proteinogenici, 2. Composti secondo da rivendicazione 1 che sono prodrugs. 3. Composti secondo le rivendicazioni 1-2 in cui almeno uno fra R, Ri, R2and R3è deuterio. 4. Composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 per uso come antibiotici e come ingredienti attivi in formulazioni contro agenti patogeni e per uso nel trattamento di patologie a cui si associano infezioni batteriche. 5. Composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per l’uso da soli 0 in combinazione con altri composti farmacologicamente attivi, preferibilmente formulati in kit per la somministrazione combinata, sequenziale 0 ritardata. 6. Composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 per l’uso in campo medico come antibiotici, antisettici e come disinfettanti, in particolare: come antibiotici per il trattamento di infezioni causate da batteri Gram-positivi e Gram-negativi, compresi quelli resistenti agli antibiotici attualmente in uso clinico; come antibatterici per la disattivazione o l’inibizione della crescita batterica sulle superfìci e oggetti inerti (disinfettanti) o sulla cute e tessuti (antisettici). 7. Composto secondo la Formula 1 della rivendicazione 1 per uso medico scelto fra: acido 2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico; Glu-γ-ΡΗ, acido L-2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico; L-Glu-γ-ΡΗ iV-[L-2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirril]-L-Alanil-L-Alanina; L-Glu-^PH-L-Ala-L-Ala acido 4-(idrossifosfinil)-2-ossobutirrico; a-chetoglutarato-γ-ΡΗ; a-KG-γ-ΡΗ acido 3-Amminopropilfosfìnico; GABA-PH acido 2-Ammino-3-(idrossifosfinil)propionico; Asp-β-ΡΗ acido 3-(idrossifosfinil)propionico; Succinate-PH 8. Composto secondo la Formula 1 della rivendicazione 1 scelto fra: acido D-2-Ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico; D-Glu-γ-ΡΗ acido P -Deutero- [2-ammino-4-(idrossifosfìnil)butirrico] ; Glu-γ-Ρϋacido P- Deutero-L-[2-ammino-4-(idrossifosfinil)butirrico]; L-Glu-γ-PD acido P-Deutero-Ό- [2-ammino-4-(idrossifosfmil)butirrico] ; D-Glu-γ-PD acido !V-(L-Leucil)-2-amimno-4-(idrossifosfinil)butirrico; L-Leu-Glu-γ-ΡΗ lV-L-Leucil-[2-Ammino-4-(idrossifosfìnil)butirril]-L-Alanil-L-Alanina; L-Leu-L-Glu-y-PH-L-Ala-L-Ala acido P- Deutero-(3-amminopropilfosfinico); GABA-PD acido lV-(L-Leucil)-3-amminopropilfosfìnico; L-Leu-GABA-PH acido P-Z<)>euiero-2-Amxnino-3-(idrossifosfinil)propionico; Asp-β-Ρο acido iV-(L-Leucil)-2-ammino-3-(idrossifosfìnil)propionico; L- Leu-Asp-β-ΡΗ acido 2-Ammino-5-(idrossifosfinil)valerico; AAd-δ-ΡΗ acido L-2-Ammino-5-(idrossifosfinil)valerico; L-AAd-δ-ΡΗ iV-[L-2-ammino-3-(idiOssifosfmil)propionil]L-Alanil-L-Alanina; Asp^-PH-L-Ala-L-Ala acido iV-(L-Leucil)-2-aniinino-4-(idrossifosfinil)butirrico; L-Leurac-Glu-γ-ΡΗ e fra i composti in cui almeno uno fra R, Ri, R2and R3è deuterio 9. Composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 da usare in combinazione con β-lattami, in particolare peniciline, cefalosporine, monobactami, carbapenemi, anche in combinazione con inibitori delle β-lattamasi, nonché fluorochinoloni, aminoglicosidi, macrolidi e relative miscele 10. Composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9 da usare per il trattamento delle malattie nell’uomo e negli animali, specialmente mammiferi. 11. Composizioni farmaceutiche comprendenti un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10 e almeno un veicolo o un eccipiente farmaceuticamente accettabile, come ad esempio un supporto solido o un diluente liquido. 12. Composizioni secondo la rivendicazione 11 per uso come disinfettanti, in particolare per disinfettare la pelle sana o per disinfettare le ferite e nel trattamento di dermatiti e affezioni delle mucose causate da batteri, per la disinfezione del cavo orale, della gola e come disinfettanti intestinali e dell’apparato uro-genitale. 13. Composizioni secondo una qualsisi delle rivendicazioni 11-12 formulate come creme, gel, oli, unguenti, polveri, spray, tinture, e bende, liquidi o concentrati per gargarismi, compresse, ad esempio compresse per lenta dissoluzione nella bocca, unità di dosaggio solide, in particolare compresse, confetti e capsule. 14. Composizioni secondo una qualsisi delle rivendicazioni 11-13 da impiegare come disinfettanti e antibatterici da applicare su materiali organici/inorganici, ad esempio manufatti, comprese le superimi, recipienti, strumenti, apparecchiature e attrezzature mediche, il materiale organico potendo essere un materiale naturale o polimerico di sintesi, una superficie proteica o a base di carboidrati, o una fibra o materiale tessile naturale o di sintesi. 15. Composizioni secondo una qualsisi delle rivendicazioni 11-14 formulate per la somministrazione orale, rettale, vaginale, transmucosale, o intestinale; parenterale, comprese iniezioni intramuscolari, sottocutanee, intramidollari, intratecali, intraventricolari, endovenose, intraperitoneali, intranasali, o intraoculari, inalazione, applicazione topica o cutanea, sottocutanea, intraperitoneale, parenterale o endovenosa. 16. Composizioni secondo la rivendicazione 15 formulate per le vie inalatoria e topica con il principio attivo diluito in un liquido adatto ad essere spruzzato sottoforma di aerosol sulle superfici mucose delle cavità corporee acessibili dall'esterno; oppure con il principio attivo mescolato con adatti veicoli per ottenere emulsioni spalmabili sulla superficie cutanea. 17. Composizioni secondo la rivendicazione 15 formulate per sistemi terapeutici transdermici come i cerotti da applicare sull'epidermide in modo che il principio attivo venga liberato e assorbito dalla cute in maniera continua e pressoché costante nel tempo. 18. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-10 come antibiotici, da soli o in combinazione con composti antibatterici contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi, in particolare contro ceppi di Escherichia coli, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Salmonella typhimurium e altri enterobatteri come Clostridium difficile, oltre che contro Pseudomonas aeruginosa e lieviti come, Candida albicans e Candida tropicalis, e per contrastare Γ antibiotico-resistenza nelle patologie causate da ceppi batterici resistenti ai comuni antibiotici, come per esempio quelle causate da Staphylococcus aureus meticillina-resistente.