IT201900005700A1 - Nuovo marcatore di patologia e suoi usi - Google Patents

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Gissey Lidia Castagneto
Geltrude Mingrone
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Metadeq Ltd
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Description

“NUOVO MARCATORE DI PATOLOGIA E SUOI USI”
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda l’identificazione di un nuovo marcatore patologico, nuovi metodi per la diagnosi o per il monitoraggio dell’andamento della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) mediante la rivelazione e la quantificazione di tale marcatore, e dispositivi che permettono l’attuazione di tali metodi.
STATO DELLA TECNICA
La steatosi epatica non alcolica, indicata anche con l’acronimo NAFLD (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease) è rappresentata da uno spettro di alterazioni istologiche epatiche caratterizzate da un iperaccumulo di grasso intraepatocitario (steatosi, consistente in un accumulo cellulare di trigliceridi >5%) in assenza di consumo alcolico significativo e cause secondarie di epatopatia.
La NAFLD costituisce attualmente la principale causa di alterazione degli indici di citolisi epatica nel mondo occidentale tra gli adulti e, in modo preoccupante, anche in bambini e adolescenti.
Dati aggiornati riportati in Bugianesi e Marietti 2016 (Recenti Prog Med 2016; 107: 360-368) indicano come nella popolazione adulta vi sia una prevalenza globale di NAFLD del 25%, e come tra gli individui con NAFLD, la prevalenza globale di NASH (steatoepatite non alcolica), diagnosticata mediante biopsia epatica, sia compresa tra il 20 e 50%. Le percentuali qui riportate salgono in maniera drammatica nei pazienti a rischio come ad esempio ne pazienti obesi e/o affetti da diabete di tipo 2.
I dati epidemiologici più drammatici riguardano la popolazione pediatrica, in cui obesità e sindrome metabolica sono in progressivo globale incremento, ormai marcato anche in Europa con stime simili a quelle registrate negli Stati Uniti d’America da cui risulta, da dati registrati tra il 2007 e il 2010, una prevalenza di NAFLD pari a circa il 7%, che è un valore tre volte maggiore rispetto ai valori registrati meno di 20 anni prima.
Anche se la steatosi semplice possiede un rischio trascurabile di progressione in cirrosi, una percentuale importante di soggetti con NAFLD (10-15%) presenta comunque aspetti istologici di necroinfiammazione e degenerazione balloniforme caratterizzanti la forma più severa di epatopatia, la non-alcoholic steatohepatitis (NASH), che può evolvere in fibrosi, cirrosi e relative complicanze, incluso l’epatocarcinoma (HCC).
Trattandosi di una patologia complessa e multifattoriale, la gravità e l’insorgenza della steatosi epatica non alcolica è condizionata sia da fattori genetici che ambientali. Essa si manifesta spesso in associazione a patologie come sindrome metabolica e diabete di tipo 2, ma risulta avere anche un ruolo nell’insorgenza della sindrome dello sviluppo e delle complicanze ad essa correlate. Dato l’aumento della prevalenza della NAFLD legato ai cambiamenti alimentari e sociali dei paesi agiati, dato che questa patologia ha potenziali implicazioni cliniche importanti, dato che, ad esempio, in un numero non trascurabile di casi la patologia può anche evolvere in steatoepatite non alcolica, -causa di cirrosi epatica e anche di HCC- è chiaramente importante poter identificare in modo precoce e corretto i soggetti ad alto rischio, al fine di poter sorvegliare e predire l’insorgenza di complicanze che possono influenzare la prognosi a livello epatico ed extra-epatico (cardiovascolare).
Oltre ai danni epatici, infatti, la principale causa di morbilità e mortalità negli individui affetti da NAFLD è rappresentata da complicanze cardiovascolari che appaiono maggiori tra questi individui rispetto alla popolazione generale, indipendentemente dalla presenza di diabete di tipo 2 e altri fattori di rischio.
Come riportato anche in Bugianesi e Marietti nel 2016, poiché attualmente la diagnosi di NASH è condizionata all’esecuzione della biopsia epatica, gli sforzi della comunità scientifica sono orientati, in questi ultimi anni, alla ricerca di biomarcatori non invasivi di danno epatico applicabili su ampia scala e di polimorfismi genici associati, al fine di indirizzare in modo corretto i programmi di screening, follow-up e i tentativi terapeutici. L’identificazione di mezzi per una diagnosi non invasiva, permettono una diagnosi tempestiva, anche in soggetti che normalmente non sarebbero sottoposti a biopsia epatica, dato che, in genere, una biopsia su questo organo si fa solamente quando vi sono sintomi seri per cui essa si rende indispensabile. Inoltre, una diagnosi non invasiva può anche permettere di monitorare in maniera sequenziale l’efficacia del trattamento terapeutico effettuato sul paziente. Bisogna anche considerare, infatti, che la biopsia epatica sotto guida ecografica è un esame costoso che si deve effettuare in ospedale ed il cui costo varia da US$ 2000 a 7000 o più. La mortalità per emorragia fatale dopo biopsia epatica varia fra lo 0.13% e lo 0.33%, ma può essere molto più alta nei soggetti con alterazioni della coagulazione.
Pertanto, è attualmente molto sentita la necessità di individuare marcatori diagnostici della NAFLD che permettano una diagnosi accurata e rapida, senza necessità di interventi bioptici sul fegato e che permettano quindi di ampliare la diagnosi della malattia nella popolazione grazie alla non invasività del metodo diagnostico.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Gli autori della presente invenzione hanno scoperto che la proteina PLIN2 è un efficace marcatore della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) in cellule circolanti, riscontrando, sorprendentemente, che il grado di espressione di tale marcatore misurato negli epatociti correla fortemente e positivamente con quello misurato nei leucociti dello stesso individuo, in particolare cellule polimorfonucleate e monociti, del sangue periferico. In aggiunta, gli autori della presente invenzione hanno anche scoperto che il grado di espressione della proteina PLIN2 nelle cellule ematiche e negli epatociti è proporzionale alla gravità della steatosi epatica non alcolica, per cui tanto più alta è la concentrazione di PLIN2 in pazienti affetti da steatosi epatica non alcolica, tanto maggiore è la gravità della malattia.
Gli autori dell’invenzione hanno pertanto realizzato un metodo di diagnosi della steatosi epatica non alcolica effettuato su campioni ematici di un individuo o sui leucociti estratti da detti campioni in cui, se la concentrazione di PLIN2 in detti campioni è maggiore rispetto a quella misurata in uno o più campioni di controllo prelevati da individui sani, la diagnosi di steatosi epatica non alcolica si deve considerare accertata.
La misurazione del grado di espressione PLIN2 può ulteriormente essere utilizzata in modo vantaggioso per monitorare l’efficacia di una terapia, in virtù della correlazione tra detta espressione e la gravità della malattia, per cui, il confronto tra una misurazione della concentrazione ematica di PLIN2 di un individuo effettuata ad un istante di tempo t0 in cui inizia il monitoraggio dell’efficacia terapeutica, permette di valutare detta efficacia terapeutica, confrontando il valore ottenuto in detta misurazione con quello ottenuto in una o più misurazioni successive effettuate negli istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui tali istanti di tempo sono progressivamente successivi tra loro e tutti successivi a t0, in quanto una diminuzione della concentrazione di PLIN2 nel tempo è indicativa di efficacia terapeutica. Valori costanti nel tempo indicano un contenimento della malattia mentre un aumento nel tempo di tali valori indica una inefficacia terapeutica.
Inoltre, la misurazione in tempi successivi come descritta sopra, permette di monitorare l’andamento della malattia anche in assenza di una terapia farmacologica, ad esempio a seguito della modifica delle abitudini di alimentazione e di vita del paziente, a farmaci o a chirurgia bariatrica.
L’invenzione permette quindi vantaggiosamente di effettuare una diagnosi e/o un monitoraggio della NAFDL senza necessità di una biopsia epatica, con ovvi ed evidenti vantaggi medici ed economici. Inoltre, la semplicità della diagnosi e/o del monitoraggio secondo l’invenzione permette di allargare in maniera importante il numero di individui su cui può essere effettuata l’analisi, permette di effettuare agevolmente anche esami su bambini e permette, inoltre, di verificare lo stato di salute relativamente alla NAFDL anche su tutta una popolazione di pazienti che normalmente non sarebbero stati sottoposti a biopsia epatica. Ulteriormente, l’analisi secondo la presente invenzione permette anche di effettuare screening su popolazioni.
Inoltre, data la maggiore frequenza di danni cardiovascolari nei pazienti affetti da NAFLD, che risulta essere indipendente dalla presenza o meno di altri fattori di rischio, una diagnosi precoce della malattia permette un monitoraggio preventivo relativamente al sistema cardiovascolare nei pazienti affetti.
Il metodo dell’invenzione è anche realizzabile con un semplice dispositivo che permette la misurazione suddetta.
Sono quindi oggetto dell’invenzione:
Un metodo per la diagnosi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) comprendente i passaggi di:
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo
b. confrontare il valore ottenuto al punto a. con il valore di concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo sano,
in cui, quando il valore misurato in a. è maggiore del valore misurato in b. si ha una diagnosi di steatosi epatica non alcolica;
un metodo per il monitoraggio dell’efficacia di un trattamento terapeutico della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente comprendente i passaggi di
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0 a partire dal quale si effettua detto monitoraggio
b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui
una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di una efficacia di detto trattamento terapeutico.
Un metodo per il monitoraggio della progressione della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente comprendente i passaggi di
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0 a partire dal quale si effettua detto monitoraggio
b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui
una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di un miglioramento della NAFDL mentre un aumento della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativo del peggioramento della NAFDL;
La presente invenzione fornisce, inoltre, un dispositivo per la misurazione automatica del valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico comprendente, in generale:
− mezzi per l’isolamento di PBMC da un campione ematico;
− mezzi per la misurazione della concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di detti PBMC, e
− un’unità di controllo connessa a detti mezzi per l’isolamento e mezzi per la misurazione, programmata in maniera tale da:
comandare e sincronizzare la loro attuazione in accordo ad una modalità automatica, secondo parametri operativi predeterminati, e
confrontare automaticamente il dato di concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di detti PBMC con un dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
L’invenzione fornisce altresì un programma per elaboratore per la diagnosi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) in un individuo da analizzare, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto individuo da analizzare o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico e un secondo valore di concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo sano, implementano i seguenti passi:
confrontare detto primo valore con detto secondo valore e
diagnosticare steatosi epatica quando detto primo valore è maggiore di detto secondo valore.
Ancora, è oggetto della presente invenzione un programma per elaboratore per il monitoraggio dell’efficacia di un trattamento terapeutico della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico del paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo t0 e un secondo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo successivo a t0, implementano i seguenti passi:
confrontare detto primo valore con detto secondo valore e
rilevare una efficacia di detto trattamento terapeutico se detto secondo valore è minore di detto primo valore.
Ulteriormente, l’invenzione fornisce un programma per elaboratore per il monitoraggio della progressione della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico del paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo t0 e un secondo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo successivo a t0, implementano i seguenti passi:
confrontare detto primo valore con detto secondo valore e
rilevare un miglioramento della NAFDL se detto secondo valore è minore di detto primo valore,
rilevare un peggioramento della NAFDL se detto secondo valore è maggiore di detto primo valore,
rilevare una stasi della NAFDL se detto secondo valore è circa uguale a detto primo valore.
GLOSSARIO
Il termine leucociti ai fini della presente invenzione ha il significato comunemente noto in letteratura e comprende comprendono tipi cellulari diversi: i granulociti (o polimorfonucleati) che si suddividono in neutrofili, eosinofili o acidofili, basofili; i linfociti; i monociti.
Ai fini della presente invenzione, il termine PLIN2 indica la proteina umana Adipose differentiation-related protein anche nota come ADFP, ADRP o perilipin 2 codificata dal gene umano ADFP localizzato in 9p22.1.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura 1: Il Panello A: Goccioline lipidiche (puntini in grigio chiaro) nei monociti e negli epatociti: sono visibili, più grandi e colorati meno intensamente, i nuclei delle cellule. Il Panello B mostra un Western blot di PLIN2 nei monociti e nel fegato.
La beta actina mostra come la quantità di proteina rilevata nei monociti sia simile alla quantità di proteina rilevata negli epatociti.
La figura 2 riporta la colorazione ORO in una sezione epatica ed in monociti di uno stesso soggetto.
La figura 3 riporta un grafico di Bland Altman delle differenze (asse delle Y) e delle medie (asse delle X) delle misure di PLIN2 mediante Western blot nei monociti e nel fegato. Le due line punteggiate rappresentano i limiti di congruenza.
La differenza fra i valori ottenuti con le due misure è riportata sull’asse delle Y mentre la media è sull’asse delle X. Le linee punteggiate riportano il 95% dei limiti di congruenza fra le due misure. Il grafico dimostra che tutti i punti si trovano all’interno dei limiti di congruenza il che dimostra la correlazione diretta tra l’espressione di PLIN2 in fegato e nelle cellule di sangue periferico.
Figura 4: Schema a blocchi esemplificativo di una forma di realizzazione preferita del dispositivo in accordo alla presente invenzione.
Figura 5: schema esemplificativo di utilizzo di una ulteriore forma di realizzazione preferita del dispositivo secondo la presente invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente scoperto che la proteina PLIN2 è un marcatore della steatosi epatica non alcolica, che la concentrazione della proteina in cellule ematiche (leucociti) correla con l’espressione di detta proteina nelle cellule epatiche, e che la sua concentrazione, è proporzionale al grado di gravità della malattia. Gli autori dell’invenzione hanno quindi scoperto che è possibile utilizzare la misurazione della concentrazione della proteina PLIN2 per effettuare una diagnosi di NAFLD, oppure per monitorare l’efficacia di un trattamento terapeutico della NAFLD, o anche per monitorare l’andamento nel tempo della NADFL, mediante l’analisi di campioni ematici senza bisogno di ricorrere ad un prelievo bioptico epatico.
L’invenzione fornisce, pertanto, un metodo per la diagnosi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) comprendente i passaggi di
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo
b. confrontare il valore ottenuto al punto a. con il valore di concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo sano,
c. diagnosticare steatosi epatica quando il valore misurato in a. è maggiore del valore misurato in b.
In una forma di realizzazione, nel passaggio a. è utilizzato un campione ematico, che può essere trattato al fine di isolare i leucociti dallo stesso mediante tecniche note all’esperto del settore.
Il metodo può quindi comprendere un passaggio, precedente la misurazione della concentrazione della proteina PLIN2 nel campione, in cui il campione ematico è sottoposto ad un trattamento per isolare i leucociti in esso contenuti. In una forma di realizzazione, il metodo può comprendere un passaggio in cui sono isolati dal campione ematico da analizzare o dai leucociti da questo isolati, cellule polimorfonucleate e/o monociti.
Può essere utilizzato qualsiasi protocollo noto in letteratura di uso corrente per l’isolamento dei leucociti da campione ematico.
A titolo meramente esemplificativo, le cellule polimorfonucleate possono essere isolate da un campione ematico come segue: Il sangue viene raccolto in una provetta contenente EDTA (concentrazione finale 4 mM) per impedirne la coagulazione. Si allestiscono quindi uno o più gradienti discontinui di Percoll (che consiste di particelle di silica colloidale dal diametro 15–30 nm (23% peso/peso in acqua) che sono state rivestite con polivinilpirrolidone (PVP)), ponendo 15 ml di Percoll al 62% in una provetta e stratificando delicatamente al di sotto di questi 15 ml di Percoll al 75%, con l’ausilio di una siringa provvista di un sottile catetere, evitando il mescolamento delle due sospensioni.
Successivamente, 8-10 ml di sangue sono stratificati sul gradiente sopra descritto; le provette sono centrifugate a 20° C per complessivi 25 minuti, dei quali 10 minuti a 200 x g e, di seguito, 15 minuti a 400 x g. Si ottiene in questo modo la separazione degli elementi figurati del sangue in base a densità e dimensioni: gli eritrociti e la maggior parte dei granulociti eosinofili sedimentano sul fondo della provetta; i polimorfonucleati si dispongono all’interfaccia tra le due sospensioni di Percoll; i linfomonociti si localizzano tra Percoll 62 % e plasma.
Dopo aver eliminato plasma e linfomonociti, la banda contenente i polimorfonucleati si preleva con una pasteur di vetro, raccolta in una provetta e sottoposta a lavaggio in HEPES/BSA mediante centrifugazione a 250 x g, per 7 minuti, a 20° C. Per eliminare gli eritrociti eventualmente presenti, si sottopone il fondo così ottenuto ad un rapido trattamento di lisi risospendendolo in 3 parti di soluzione ipotonica. Dopo circa 15 secondi di agitazione, si ripristina l’isotonicità del mezzo aggiungendo 7 parti di soluzione ipertonica.
Dopo un ulteriore lavaggio a 250 x g per 7 minuti, a 20° C, si risospende il pellet di cellule e si mantiene in un volume noto di HEPES/BSA fino all’uso. La concentrazione di neutrofili si determina utilizzando un contatore elettronico di particelle o al microscopio ottico utilizzando un emocitometro.
A titolo meramente esemplificativo, vari tipi di monociti possono essere isolati da campione ematico mediante le seguenti tecniche: tramite l’uso di frammenti Fab ricombinanti CD-specifici, espressi microbiologicamente, di anticorpi monoclonali contro markers cellulari di superficie. A questo fine sono disponibili anche kit commerciali come ad esempio IBA GmbH™ CD14 Isolation Kit for FABian™.
La misurazione della concentrazione della proteina PLIN2 può essere effettuata secondo qualsiasi metodo disponibile al tecnico del settore, a titolo meramente esemplificativo, nei metodi qui descritti la misurazione può essere effettuata mediante Western blot, oppure Citofluorimetria, oppure ELISA, oppure immunofluorescenza oppure PCR quantitativa, dosaggio immunospot legato ad un enzima (Enzyme-Linked Immunospot Assay) o sistema risonanza plasmonica di superficie con fibra a punta (localized surface plasmon resonace fiber tip probe system)-, o utilizzando un dispositivo predisposto a tale misurazione descritto di seguito.
Tutte le metodiche sopra indicate, sono note al tecnico del settore che, sapendo su che campione devono essere effettuate e quale proteina deve essere quantificata, potrà scegliere il protocollo che ritiene più idoneo e utilizzare i reagenti in commercio più adatti. Tutti i reagenti necessari ad effettuare la rivelazione e la quantificazione di PLIN2 nel campione secondo la presente descrizione sono noti e disponibili in commercio e non richiedono quindi particolari accorgimenti da parte del tecnico del settore una volta noto il metodo dell’invenzione.
A titolo esemplificativo, sono riassunte le tecniche sopra elencate, e sono indicati i passaggi normalmente utilizzati dal tecnico del settore per ciascuna di esse.
Il Western Blotting permette di monitorare l’espressione proteica in una cellula e quindi di determinare la presenza, la quantità e il peso molecolare di uno specifico antigene attraverso tre processi:
1) Estrazione e dosaggio delle proteine;
2) Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE);
3) Western Blotting: trasferimento delle proteine separate dal gel su di una membrana di nitrocellulosa (blot); esposizione della membrana all’anticorpo diretto contro la proteina di interesse (anticorpo primario); esposizione della membrana ad un anticorpo diretto contro l’anticorpo della specie utilizza come anticorpo primario (anticorpo secondario), e sviluppo della membrana con il metodo della chemiluminescenza (ECL).
4) Analisi densitometrica delle immagini.
La citofluorimetria è una tecnologia di laboratorio che consente di rilevare, identificare e contare specifiche cellule o proteine in esse contenute.
Le tecniche citofluorimetriche prevedono diverse fasi:
Sospensione di un campione cellulare in un fluido
Prima del test e sulla base delle cellule da analizzare, il campione viene trattato con coloranti specifici in grado di discriminare i sottotipi cellulari. Questo colorante, fluorocromo, è legato ad anticorpi monoclonali diretti verso particolari distretti cellulari o antigeni marcatori.
Il campione contenente le cellule marcate viene introdotto nello strumento chiamato citofluorimetro.
Nello strumento, il fluido contenente le cellule viene incanalato nella camera di flusso e quindi attraverso un foro molto stretto, in modo tale da creare un flusso all'interno del quale le cellule risultano organizzate in fila, una dietro l'altra. Il flusso di cellule viene posto davanti ad un rilevatore, che così analizza ciascuna cellula presente all'interno del flusso ad una velocità altissima (da centinaia a migliaia di cellule per secondo). Il citofluorimetro contiene uno o più laser e più rilevatori in grado di identificare alcune caratteristiche, uniche per ciascuna cellula. Ciascun laser colpisce le cellule presenti nel flusso, generando per ciascuna di esse uno scatter caratteristico e dipendente dalle caratteristiche della stessa. Le caratteristiche possono essere fisiche (dimensione e complessità cellulare) o possono dipendere dal segnale generato dal colorante (il fluorocromo) intercettato dal laser. La combinazione di queste informazioni genera un profilo caratteristico per ciascuna cellula presente all'interno del campione. Il segnale rilevato dai rilevatori (o detector) viene amplificato (dai fotomoltiplicatori) e inviato al computer. Qui viene convertito in formato digitale e mostrato sul computer o stampato.
I dati sono forniti sotto forma di grafici.
L'ELISA (Enzyme-Lynked Immunosorbent Assay) è una tecnica molto utilizzata, basata sulla coniugazione chimica di enzimi con anticorpi o antigeni. L’attività di questi enzimi è facilmente monitorabile e consente di quantificare la concentrazione di complesso coniugato precisione. A seconda del particolare metodo utilizzato, l’ELISA può servire per il dosaggio di antigeni o anticorpi.
Antigene riconosciuto dall’anticorpo specifico (Immuno)
Analita (antigene o anticorpo) adsorbito sulla superficie del sistema (sorbent) Antigene/anticorpo riconosciuto da un (secondo) anticorpo marcato con un enzima (Enzyme linked), capace di dare una reazione il cui prodotto sia colorato.
La PCR quantitativa o real-time PCR è una tecnologia utilizzata per quantificare gli acidi nucleici, in questo caso mRNA codificante la proteina PLIN2, attraverso la misurazione della fluorescenza emessa da un fluoroforo. Questa tecnica associa amplificazione e quantificazione in un’unica reazione. In una reazione di real-time PCR, la fluorescenza aumenta in proporzione all’accumulo dei prodotti di PCR. Il tecnico del settore non avrà alcun problema a disegnare sonde adatte per realizzare la RT-PCR in quanto il gene e il DNA codificanti la proteina PLIN2 sono noti in letteratura. L'analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT) in un campione di PBMC si basa sull'incubazione delle cellule per un periodo di tempo definito, in piastra a 96 pozzetti precedentemente funzionalizzata (coating) mediante adsorbimento di un anticorpo monoclonale ad alta affinità per la citochina investigata che viene prodotta durante l'incubazione. La combinazione di un anticorpo biotinilato anti-proteina di riferimento e di un anticorpo secondario anti-biotina enzima-coniugato, in presenza di substrati cromogeni per l'enzima, permette la rivelazione della produzione della proteina in aree definite dovute alla precipitazione del prodotto di reazione mediante la formazione di spot (accumuli di colore). Tale tecnica può essere applicata al contenuto di PBMC dopo lisi cellulare.
I plasmoni di superficie sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità della superficie di diverse misurazioni spettroscopiche inclusa la fluorescenza, lo scattering di Raman e la generazione di seconda armonica. Tuttavia, nella loro forma più semplice, le misurazioni della riflettanza della SPR possono essere utilizzate per rilevare l’assorbimento molecolare nelle proteine, ecc.. Tecnicamente, si misura l'angolo della riflessione minima (massimo di assorbimento).
Qualsiasi tecnica analitica nota in letteratura idonea a quantificare la concentrazione di PLIN2 nel campione ematico o cellulare come sopra definito è utilizzabile in qualsiasi metodo dell’invenzione.
Ulteriormente, il dispositivo secondo la presente invenzione può essere disegnato per realizzare la quantificazione della proteina PLIN2 nel campione di interesse mediante una o più delle tecniche di rivelazione sopra descritte.
Ulteriormente, l’invenzione fornisce un metodo per il monitoraggio dell’efficacia di un trattamento terapeutico della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente, comprendente i passaggi di
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0, a partire dal quale si effettua detto monitoraggio
b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui
una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di una efficacia di detto trattamento terapeutico.
Nella realizzazione del metodo di monitoraggio sopra descritto, il tempo t0 è il tempo in cui si inizia il monitoraggio, che può corrispondere ad un istante di tempo precedente l’inizio della terapia, o può essere un istante di tempo da cui si effettua l’inizio del monitoraggio anche a terapia iniziata.
Gli istanti di tempo tn, sono istanti di tempo successivi tra loro al crescere del valore di n, e successivi all’istante t0.
Pertanto, l’istante di tempo t0 è l’istante in cui si inizia il monitoraggio, ed il valore di concentrazione di PLIN2 nel campione ematico è considerato il valore da cui si inizia a valutare l’efficacia della terapia. La misurazione della concentrazione è quindi ripetuta in tempi successivi a t0 e successivi tra loro in progressione da 1 in poi, detti tempi tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, per cui l’istante di tempo t1, precede l’istante di tempo t2 che precede l’istante di tempo t3 e così a seguire.
Una diminuzione rilevabile e significativa della concentrazione di PLIN2 nei campioni ematici del paziente analizzato nei tempi successivi a t0 rispetto al valore misurato in t0 è indicativa di una efficacia del trattamento terapeutico nel migliorare la NADFL. Il mantenimento di un valore costante nel tempo è indicativo di una efficacia del trattamento terapeutico nel contenere la NADFL, un aumento del valore nel tempo rispetto a quello misurato in t0 è indicativo di una inefficacia del trattamento terapeutico.
In alcuni casi, prima di effettuare una terapia farmacologica, è suggerito al paziente un cambiamento delle abitudini alimentari e dello stile di vita. In questi casi, può essere utile, monitorare nel tempo la progressione della malattia, per vedere, ad esempio se il cambiamento delle abitudini alimentari e dello stile di vita influiscono positivamente sulla malattia.
Monitorare comunque l’andamento della malattia, indipendentemente dal valutare o meno una possibile efficacia terapeutica, può essere di interesse per il medico curante. È pertanto oggetto dell’invenzione anche un metodo per il monitoraggio della progressione nel tempo della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) in un paziente comprendente i passaggi di
a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0 a partire dal quale si effettua detto monitoraggio
b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui
una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di un miglioramento della NAFDL mentre un aumento della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativo del peggioramento della NAFDL mentre un mantenimento costante del valore nel tempo è indicativo di una situazione di stasi della malattia.
Quanto descritto sugli istanti di tempo t0 e tn nella spiegazione del metodo di monitoraggio del trattamento terapeutico, si applica al metodo di monitoraggio in generale.
Tutte le forme di realizzazione descritte per il metodo diagnostico si applicano anche ai metodi di monitoraggio successivamente descritti.
In generale, nonostante possano essere prelevati campioni ematici anche da organi o altro, nella realizzazione dei metodi qui descritti, è preferito l’utilizzo di sangue periferico.
In particolare, nell’attuazione dei metodi qui descritti è preferibile effettuare la misurazione della concentrazione di PLIN2 sui leucociti isolati da detto sangue periferico e più in particolare su cellule polimorfonucleate e/o monociti.
La presente invenzione fornisce, inoltre, un dispositivo per la misurazione automatica del valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico prelevato da un individuo comprendente, in generale:
mezzi per l’isolamento di PBMC da un campione ematico;
mezzi per la misurazione della concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di detti PBMC, e
mezzi che correlano la misurazione ottenuta ad un valore comparativo che può essere un valore ottenuto da individui sani e/o uno o più valori della concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di PBMC da campioni ematici del medesimo individuo, precedentemente ottenuti.
Come detto sopra, il dispositivo secondo la presente invenzione può essere realizzato in modo tale da effettuare la misurazione della proteina PLIN2 in un campione ematico prelevato da un individuo mediante una o più delle tecniche di rivelazione sopra descritte.
A seconda della tecnica di isolamento e lisi dei PBMC prescelta, i mezzi suddetti saranno implementati in accordo a diverse varianti, di cui alcune saranno descritte a seguire. Ad esempio, nel caso in cui sia utilizzata una forma separazione mediante componenti che legano selettivamente i PBMC o i monociti, il dispositivo potrà comprendere:
− una camera di raccolta atta a ricevere il campione ematico;
− mezzi di miscelazione compresi in detta camera di raccolta, configurati per miscelare detto campione ematico con un componente atto a legarsi ai polimorfonucleati PBMC presenti in tale campione, e ove necessario, con una sostanza anticoagulante;
− mezzi di movimentazione configurati per applicare una sollecitazione meccanica di vibrazione e/o rotazione alla miscela ottenuta mediante detti mezzi di miscelazione e per convogliare detta miscela a mezzi filtranti;
− detti mezzi filtranti configurati per ritenere detto componente legato ai polimorfonucleati PBMC e lasciare eluire il resto di detta miscela;
− mezzi di isolamento di detti polimorfonucleati PBMC dal componente a cui erano legati, configurati per favorire la separazione tra detti polimorfonucleati PBMC e detto componente;
− mezzi per il trattamento dei polimorfonucleati PBMC isolati con detti mezzi di isolamento, configurati in modo tale permettere il legame della proteina PLIN2, quando presente, con un reagente specifico per tale proteina, in cui detto reagente è fluorescente ad una o più lunghezze d’onda predeterminate;
− almeno una sorgente di radiazione, configurata per emettere radiazioni ad una lunghezza d’onda predeterminata in maniera tale che detto reagente emetta fluorescenza ad esempio sotto forma di onde luminose;
− mezzi per l’acquisizione di immagini del campione irradiato;
− un’unità di controllo (7), connessa a tutti detti mezzi e a detta sorgente di radiazioni (12), programmata in maniera tale da comandare e sincronizzare la loro attuazione in accordo ad una modalità automatica, secondo parametri operativi predeterminati, in cui detta unità di controllo è ulteriormente configurata per elaborare dette immagini in modo tale da quantificare la concentrazione della proteina PLIN2 presente in detto campione.
Detta unità di controllo sarà ulteriormente configurata per confrontare detta concentrazione misurata con uno o più dati di riferimento di concentrazione della proteina PLIN2, ottenuti da misurazioni effettuate su campioni ematici di soggetti sani e/o su campioni ematici dello stesso individuo prelevati in istanti di tempo diversi.
In una forma di realizzazione, ad esempio, detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento è un dato associato ad un soggetto sano ed in cui detta unità di controllo (7) è ulteriormente programmata per rilevare una condizione di steatosi epatica non alcolica (NAFDL) se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è maggiore di detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione, detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento è un dato associato al medesimo paziente e rilevato in un istante temporale (t0) precedente ad un istante temporale (tn) in cui è stato rilevato detto campione ematico, ed in cui detta unità di controllo (7) è ulteriormente programmata per rilevare l’andamento della malattia nel tempo.
Ad esempio, se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è maggiore del dato di riferimento, è rilevato un miglioramento della NAFDL;
se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è minore del dato di riferimento, è rilevato un peggioramento della NAFDL mentre, se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è uguale al dato di riferimento, è rilevata una stasi della malattia.
Preferibilmente, il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è considerato essere uguale al dato di riferimento quando la differenza tra i due dati è compresa tra circa 0 e circa 5%.
Una prima e una seconda forma di realizzazione preferita del dispositivo sono illustrate a titolo esemplificativo in Figura 4 e 5.
Secondo una forma di realizzazione, un campione ematico, preferibilmente già miscelato ad un anticoagulante, è inserito in una camera di raccolta 3 interna al dispositivo. Alternativamente, il dispositivo 1 può comprendere dei mezzi di puntura 2 atti a forare la pelle del paziente, ad esempio in corrispondenza di un polpastrello. Tali mezzi di puntura comprendono in particolare un elemento protrudente che termina con un’estremità appuntita, ad esempio un ago. I mezzi di puntura 2 sono recati in corrispondenza di una superficie esterna del dispositivo 1, e possono essere configurati e articolati in maniera tale da poter assumere una configurazione di minimo ingombro in condizione di non utilizzo, in cui l’elemento appuntito risulta rivolto verso la superficie esterna del dispositivo 1, e una configurazione di utilizzo, in cui l’elemento appuntito risulta rivolto in direzione opposta alla superficie esterna del dispositivo 1.
Quando dispositivo secondo la presente descrizione comprende direttamente i mezzi di puntura per l’ottenimento del campione ematico, questo, una volta ottenuto, si raccoglie in corrispondenza dei suddetti mezzi 2 ed è quindi convogliato in una camera di raccolta 3 interna al dispositivo 1 mediante opportuni mezzi di connessione fluidica. Tale convogliamento può avvenire mediante aspirazione del campione ematico. In particolare, l’aspirazione è realizzata ad opera di mezzi aspiranti 4, che presentano una rispettiva bocca di aspirazione in corrispondenza dei mezzi di puntura 2. I mezzi aspiranti 4 preferibilmente comprendono una micropompa da vuoto, che può presentare dimensioni pari a 28 x 14 x 14mm, in maniera tale da mantenere contenuto l’ingombro del dispositivo 1 stesso.
I mezzi aspiranti 4 possono comprendere altresì un condotto o cannula di raccolta, ad esempio un catetere in gomma, in cui il campione può essere messo a contatto con un anticoagulante.
Alternativamente il campione, prelevato indipendentemente dal dispositivo qui descritto, può essere immesso direttamente nella camera di raccolta, preferibilmente dopo trattamento con un anticoagulante.
In una forma alternativa di realizzazione, il campione è introdotto o convogliato nella camera di raccolta 3, prima di essere messo a contatto con un anticoagulante.
Secondo l’invenzione, la camera di raccolta 3, comprende mezzi di miscelazione 14, configurati per miscelare detto campione ematico con un componente o un gruppo di componenti atti a isolare i PBMC (qui anche definito come “mezzi di isolamento di PBMC”). Ad esempio, detto gruppo di componenti può comprendere un componente atto a legarsi ai polimorfonucleati (PBMC) presenti in tale campione, e ove necessario (e cioè quando detto campione ematico non è ancora stato trattato con anticoagulante), con una sostanza anticoagulante.
Nella realizzazione del dispositivo qui descritto, detto componente può essere, ad esempio, rappresentato da apposite microbiglie su cui sono legati anticorpi contro CD3+T, antigeni specifici dei PBMC che quindi legano i PBMC (es. tecnologia tipo PluriBead® o Dynabeads®).
Il dispositivo 1 può comprendere altresì un primo s1 e/o un secondo serbatoio s2 in cui sono rispettivamente contenuti un anticoagulante e il componente in grado di legare le cellule polimorfonucleate, ciascun serbatoio s1, s2 essendo preferibilmente provvisto di rispettivi mezzi di erogazione 15.
Grazie alla miscelazione, i PBMC si legano al suddetto componente. La miscela ottenuta è soggetta ad una sollecitazione meccanica di vibrazione e/o rotazione, realizzata mediante l’azione di mezzi di movimentazione dedicati 5, preferibilmente compresi nella camera di raccolta 3. In particolare, i mezzi di movimentazione 5 possono essere implementati mediante almeno un nastro trasportatore rotante e/o vibrante su cui è convogliata la miscela così ottenuta.
La sollecitazione o agitazione della miscela ad opera dei mezzi 5 è operata per un tempo di durata predeterminata, che può essere un tempo compreso tra 5 e 20 minuti, tra 5 e 15 minuti, ad esempio pari a circa 10 minuti. La durata del tempo può essere misurata, ad esempio, mediante un timer T preferibilmente connesso ai medesimi mezzi di movimentazione 5. Successivamente, la miscela è convogliata in corrispondenza di mezzi filtranti 6, preferibilmente mediante i medesimi mezzi di movimentazione 5, ancor più preferibilmente quando questi ultimi sono implementati mediante un nastro trasportatore.
In accordo a varianti di realizzazione preferite, i mezzi di filtranti 6 possono essere integrati nei mezzi di movimentazione 5, ad esempio nella forma di un nastro trasportatore filtrante. In altre parole, la superficie operativa del nastro trasportatore, su cui è disposta la miscela da convogliare, può essere realizzata in materiale filtrante. I mezzi filtranti 6 sono configurati per ritenere il componente legato ai PBMC e lasciare eluire il resto della miscela, portando, di fatto, all’isolamento dei PBMC legati al componente suddetto. A tale scopo, i mezzi filtranti 6 (che fanno parte del gruppo di componenti atti ad isolare i PBMC) presentano luci di passaggio di sezione predeterminata, tali da impedire il passaggio al componente legato ai PBMC e consentirlo invece al resto della miscela.
La scelta del cutoff dei mezzi filtranti può essere facilmente effettuata dal tecnico del settore a seconda della dimensione del componente legato ai PBMC. Il cutoff del filtro dovrà comunque essere selezionato in modo tale da lasciare eluire le varie cellule e componenti del campione ematico non legate al componente suddetto e ritenere il complesso componente-PBMC. In una forma di realizzazione, quando sono utilizzate microbiglie coniugate con anticorpo anti-antigene PBMC specifico, i mezzi filtranti avranno un cutoff selezionato in base al diametro delle biglie. Ad esempio, per biglie con diametro di circa 30 µm, i mezzi filtranti avranno un cutoff tale da trattenere le biglie legate alle cellule e lasciare eluire tutto ciò che ha un diametro inferiore. Volendo utilizzare reagenti già disponibili in commercio, i mezzi filtranti 6 possono essere implementati mediante tecnologia tipo pluriStrainer®, come attualmente disponibile in commercio.
I complessi componente-PBMC, ritenuti sui mezzi filtranti 6, sono trattati con mezzi per isolare i soli PBMC o mezzi di separazione 19. L’isolamento o separazione dei PBMC dal componente che li lega può essere effettuato ad esempio impiegando un tampone specifico (detachment buffer), atto a favorire la rottura del legame tra i PBMC e il componente a cui sono legati, il dispositivo potrà quindi comprendere mezzi per l’erogazione di una opportuna soluzione per il distacco dei PBMC dal componente a cui sono legati.
I PBMC così isolati sono convogliati mediante mezzi di raccolta 9, comprendenti ad esempio un tubo o catetere, ad una camera di analisi 11. Tale camera di analisi 11 preferibilmente comprende mezzi per l’esposizione del citoplasma dei PBMC, ad esempio un tampone di lisi delle membrane cellulari. In accordo ad una variante realizzativa, l’esposizione del citoplasma è effettuata direttamente nella camera di raccolta 3.
Alternativamente a quanto appena descritto, per ottenere la separazione dei PBMC nel campione ematico il gruppo di componenti atto ad isolare i PBMC può essere costituito da un sistema micro-elettrico-meccanico che permette di avere un’azione repellente sui PBMC e quindi di isolarli (Avivabio®) o una membrana di microfiltrazione Parylene. Tale membrana può presentare una superficie filtrante fino a 36 mm<2 >ed una porosità di circa 7%–15%, con pori di diversa geometria (es. circolari, ovali e rettangolari) presentanti dimensioni critiche che si riducono fino a pochi micron. Ancora, i PBMC possono essere separati nel campione ematico mediante tecnologia Nickel electroplating o filtrazione attraverso fogli di carta o materiale plastico.
Dopo aver isolato i PBMC, questi sono trattati in maniera tale da misurare la concentrazione della proteina PLIN2, con mezzi che rendano visibile, e quantificabile, la presenza della proteina, come ad esempio sistemi di rivelazione coniugati a coloranti, in particolare fluorescenti, ad una o più lunghezze d’onda predeterminate. Ciò può essere ottenuto mediante mezzi di trattamento 16, compresi preferibilmente nella camera di analisi 11 e configurati per realizzare un legame della proteina PLIN2 ad un componente che manifesti tale proprietà, o componente di segnalazione. In una forma di realizzazione, il campione di PBMC è trattato con un tampone di lisi PLIN2 citoplasmatica, preferibilmente messa a reagire con anticorpi monoclonali anti-PLIN2 legati con un reagente fluorescente a predeterminate lunghezza d’onda, ad esempio anticorpi secondari fluorescenti, quali gli Alexa Fluor® 488. In tal modo, gli anticorpi secondari fluorescenti sono associati ai PLIN2. Il dispositivo 1 può comprendere altresì un terzo serbatoio s3 in cui sono contenuti gli anticorpi, provvisto di rispettivi mezzi di erogazione 15 degli stessi.
Ulteriormente, il dispositivo 1 preferibilmente comprende una sorgente di radiazioni 12, nonché mezzi per l’acquisizione di immagini 13, entrambi ad esempio alloggiati entro la camera di analisi 11 (o la camera di raccolta 3), affacciati su una superficie di deposizione dei PBMC isolati e trattati. La sorgente 12 emette radiazioni in corrispondenza di detta superficie di deposizione, dette radiazioni presentando una lunghezza d’onda predeterminata in maniera tale che gli anticorpi coniugati a coloranti fluorescenti siano visibili (o assumano una particolare colorazione), dunque in maniera tale da poter individuare i PLIN2 mediante un’indagine visiva. In una forma di realizzazione, la sorgente di radiazioni 12 è configurata per emettere radiazioni ad una lunghezza d’onda di 488 nm. La sorgente 12 può comprendere un micro-fluorimetro laser o altri dispositivi simili disponibili in commercio.
L’esperto del settore saprà la lunghezza d’onda necessaria per rilevare il colorante fluorescente di interesse basandosi su semplici informazioni di letteratura. Il dispositivo può comunque essere realizzato in modo tale da poter emettere diverse lunghezze d’onda e permettere quindi la rivelazione di coloranti diversi, senza vincolare quindi detto dispositivo ad un particolare e specifico colorante fluorescente.
Una volta attivata la sorgente di radiazioni 12, i mezzi di acquisizione di immagini 13 sono azionati per acquisire immagini del campione irradiato, in cui è rilevabile e, soprattutto quantificabile, la proteina PLIN2.
Il dispositivo 1 preferibilmente comprende un’unità di controllo 7, connessa a tutti i mezzi e componenti sopra descritti, programmata in maniera tale da comandare e sincronizzare la loro attuazione in accordo ad una modalità automatica, secondo parametri operativi predeterminati. Tali parametri operativi possono comprendere la durata dell’attivazione di ciascuno dei mezzi/componenti sopra descritti, nonché la pressione e/o velocità di aspirazione del campione ematico, la velocità di convogliamento dello stesso, la quantità di anticouagulante/componente per l’isolamento dei PBMC/reagente fluorescente/anticorpi-antiPLIN2 da erogare dai rispettivi serbatoi s1, s2, s3, e/o la lunghezza d’onda della sorgente di radiazione. Ancora, l’unità di controllo 7 può ricomprendere o essere connessa a mezzi di interfaccia 8, configurati per consentire all’utente di comandare l’attivazione del dispositivo 1 e/o modificare/selezionare i suddetti parametri operativi. Tali mezzi di interfaccia 8 possono comprendere ameno un pulsante di accensione del dispositivo 1.
Ulteriormente, l’unità di controllo 7 può comprendere un microprocessore di elaborazione di immagini, programmato per identificare la presenza di PLIN2 e quantificare la proteina nelle immagini acquisite mediante i mezzi 13. Ancora, il microprocessore può essere programmato per quantificare la concentrazione della proteina PLIN2 rivelata nelle immagini acquisite e fornire tale dato in output. I dati di output possono essere trasmessi a dispositivi elettronici esterni, ad esempio mediante mezzi di connessione cablata o wireless ricompresi nel dispositivo 1 stesso, oppure a mezzi di visualizzazione che possono essere integrati nei suddetti mezzi di interfaccia 8, ad esempio comprendenti un display.
Il dispositivo dell’invenzione 1, in particolare il microprocessore dell’unità di controllo 7, può essere ulteriormente preferibilmente programmato per confrontare automaticamente il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto mediante l’analisi delle immagini acquisite mediante i mezzi 13 con un dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento, che può essere la concentrazione di PLIN2 associata ad un soggetto sano (per semplicità a seguire: dato di riferimento). In questo caso il dispositivo ha una funzione unicamente diagnostica.
Il suddetto dato di riferimento può anche essere memorizzato in un modulo di memoria, ad esempio ricompreso nell’unità centrale 7 e connesso al microprocessore, in cui possono essere memorizzati anche dati di concentrazione della proteina PLIN2 precedentemente rilevati mediante il dispositivo stesso, sullo stesso paziente su cui si sta effettuando l’analisi, per tener traccia dell’evoluzione della malattia o per valutare l’efficacia di un trattamento terapeutico.
In particolare, i mezzi di interfaccia possono essere configurati per visualizzare un grafico in cui è mostrato l’andamento del valore di concentrazione di PLIN2 rilevato in funzione del tempo.
Ulteriormente, i mezzi di interfaccia 8 possono essere configurati per visualizzare automaticamente dei segnali visivi in accordo ad un codice di colore predeterminato, e/o per riprodurre segnali acustici, in accordo all’esito del confronto del dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto mediante l’analisi con il dato di riferimento.
Ad esempio, quando è effettuato un monitoraggio dell’andamento della malattia se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è minore del dato di riferimento, è rilevato un miglioramento della NAFDL, che può corrispondere all’accensione di una luce verde. Invece, se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è maggiore del dato di riferimento, è rilevato un peggioramento della NAFDL, che può corrispondere all’accensione di una luce rossa e/o alla riproduzione di un allarme sonoro. Ancora, se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è uguale al dato di riferimento, è rilevata una stasi della malattia, che può corrispondere all’accensione di una luce gialla.
In caso di utilizzo diagnostico è possibile utilizzare un sistema analogo.
Ulteriormente, è possibile modificare e/o scegliere un diverso dato di riferimento, e/o modificare le impostazioni di visualizzazione/riproduzione automatica dei segnali luminosi/sonori, mediante i medesimi mezzi di interfaccia 8.
Preferibilmente, il dispositivo 1 è realizzato in maniera tale da risultare portatile, per consentire la misurazione della concentrazione di proteina PLIN2 anche in siti dislocati rispetto agli ospedali o centri medici. In particolare, il dispositivo 1 può comprendere propri mezzi di alimentazione energetica che consentono di svincolarlo dalla rete elettrica, quali ad esempio batterie ricaricabili e/o dispositivi a ricarica fotovoltaica o eolica.
Sarà compreso come il dispositivo portatile in accordo a quanto descritto può essere inteso come idoneo a consentire, oltre alla misurazione della concentrazione della proteina PLIN2, anche la misurazione della concentrazione di altri tipi di proteine nel siero/plasma o PBMC, con opportuni adattamenti e modifiche del caso che sono alla portata del tecnico del ramo.
È anche oggetto dell’invenzione l’uso del dispositivo in qualsiasi delle forme di realizzazione sopra descritte per attuare i metodi oggetto della presente invenzione. È infine oggetto dell’invenzione un metodo terapeutico per il trattamento di pazienti affetti da NAFLD in cui è effettuato il monitoraggio qui descritto.
ESEMPI
METODI
Sono stati arruolati 19 soggetti obesi di entrambi i sessi affetti da NAFLD (10 donne e 9 uomini, di età media 38.5±1.9 anni e BMI 36.79±4.43 kg/m<2>) che sono stati sottoposti ad intervento di chirurgia bariatrica. Un prelievo di sangue venoso periferico con l’aggiunta di EDTA è stato effettuato dopo 12 ore di digiuno notturno al momento dell’arruolamento. I pazienti hanno firmato il consenso informato allo studio ed all’intervento chirurgico.
L’anamnesi è stata raccolta per tutti I soggetti. L’esame obiettivo che includeva l’altezza, il peso e le misure antropometriche è stato anche effettuato. L’indice di massa corporea (BMI) è stato calcolato dividendo il peso (kg) per l’altezza (m<2>). Una lista dettagliata dei farmaci usati è stata raccolta.
I criteri di esclusione erano: (1) assunzione di alcol regolare e/o eccessiva (>20 g di alcol al giorno per le donne e >30 g di alcol al giorno per gli uomini); (2) evidenza clinica di NAFLD secondaria a malattie gastrointestinali iatrogene o ad immunodeficienza (infezione da HIV); (3) evidenza clinica di malattie epatiche non NAFLD inclusa epatite B o C, o emocromatosi, (4) malattia di Wilson, (5) glicogenosi, (6) deficit di alfa-1 antitripsina, (7) epatite autoimmune, (8) malattia da colestasi epatica, (9) presenza di malattie rilevanti cardiovascolari, gastrointestinali o respiratorie o qualsiasi disordine ormonale, (10) evidenza clinica di malattia epatica scompensata (Child-Pugh score>7 punti), (11) abuso in atto di sostanze stupefacenti, (12) malattie sistemiche rilevanti, (13) gravidanza.
Le biopsie epatiche erano ottenute durante gli interventi chirurgici.
Tutti i soggetti sono stati sottoposti ad una curva da carico di glucosio (OGTT) con prelievi a 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minuti per misurare la glicemia e l’insulina plasmatici. La sensibilità insulinica è stata misurata come OGIS (acronimo per Oral Glucose Insulin Sensitivity) che è un metodo che permette di calcolare la sensibilità insulinica da una curva da carico di glucosio. L’OGIS dà un indice che è analogo all’indice di insulino sensibilità ottento col clamp (Mari A, Pacini G, Brazzale AR, Ahrén R. Comparative evaluation of simple insulin sensitivity methods based on the oral glucose tolerance test. Diabetologia 2005; 48:748-751).
Istologia epatica
Frammenti delle biopsie epatiche poste in formalina erano lavate accuratamente con isopropanolo al 60% che poi veniva vaporizzato. Una soluzione di Oil Red O (ORO) era aggiunta per 10 minuti e successivamente rimossa ed i campioni lavati 4 volte in acqua. Una volta che il Red Oil O era rimosso i pezzi venivano incubati in isopropanolo al 100%. Anche i monociti sono stati sottoposti alla stessa colorazione ORO.
I campioni erano quindi osservati ad un microscopio confocale LSM 510 dotato di un appropriato filtro.
Inoltre, una parte del materiale bioptico ottenuto durante l’intervento chirurgico era montato su vetrini da archivio preparati da pezzi fissati in formalina al 10% ed inclusi in blocchetti di paraffina e colorato con ematossilina ed eosina per valutare la percentuale di steatosi. La lettura dei vetrini è stata effettuata da un’anatomopatologa specialista del fegato in cieco.
E’ stata usata la classificazione di Brunt (Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol.1999;94:2467–2474) per valutare il punteggio istologico e lo stadio di NAFLD/NASH (non alcoholic steato-hepatitis). In particolare, la steatosi era definita con i seguenti punteggi 0, assenza (<1%); 1, 1%–25%; 2, 26%–50%; 3, 51%– 75%; e 4, >75% di grasso nei lobuli. L’infiammazione riceveva i seguenti punteggi: 1, leggera (linfociti isolati o aggregati in piccole formazioni all’interno del tratto portale e dei lobuli); 2, moderata (come per il grado 1 ma con maggiore infiltrazione portale e lobulare); e 3, grave (lo stesso che nel grado 2 ma con infiammazione più intensa). La fibrosi era stadiata come 0 se assente, 1 se centro lobulare pericellulare; 2, se periportale e pericellulare; 3, fibrosi a ponte; e 4, cirrosi.
Isolamento dei monociti
PBMC erano ottenuti da sangue intero mediante centrifugazione in gradiente standard su Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ). PBMC erano poi lavati ed i monociti isolati mediante il kit Pan Monocyte Isolation Kit.
Isolamento degli epatociti
Frammenti di biopsie epatiche erano sminuzzati e lavati in HBSS per rimuovere le tracce di sangue. Il tessuto era poi trasferito in provette da 50 ml contenenti tampone EGTA (HBSS, 0.5 mM EGTA, 0.5% BSA) ed agitato per 10 minuti a 100 rpm in un bagno con acqua mantenuta a 37°C. Il tessuto era poi posto in un tampone di digestione (HBSS, 0.05% collagenasi IV, 0.5% BSA senza acidi grassi, 10 mM CaCl2) ed agitato per 10 minuti a 100 rpm in un bagno con acqua mantenuta a 37°C. Il sovranatante era raccolto e filtrato attraverso un filtro con pori di 100 μm e la sospensione cellulare centrifugata ad 80 g per 5 min a 4 °C ed il sovranatante buttato.
Colorazione delle gocciole lipidiche
I monociti e gli epatociti isolati erano incubati per 20 minuti con formalina al 4% e colorati con Nile Red (100ng/mL). I nuclei erano colorati con DAPI.
Le fotografie erano prese con un microscopio confocale Spinning Disk; Crest X-Light Confocal Imager (Germany) e per analizzare le immagini, MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices).
Misurazione di PLIN2
I monociti e le biopsie epatiche erano omogenizzati in tampone RIPA contenente un cocktail di inibitori di proteasi. Gli omogenati erano centrifugati a 13.000 rpm per 30 minuti a 4°C. Il contenuto proteico era misurato con Bradford Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA). I lisati proteici (30 μg) erano separati su 10% SDS-PAGE e trasferiti su membrane PVDF. Le membrane erano incubate durante la notte con anticorpi anti-PLIN2 (LS-BIO, Seattle, WA) ed anti-βActina. L’analisi quali/quantitativa è stata effettuata con Chemidoc XRS Image system e Image Lab 5.0 software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tutti i dati erano normalizzati per i livelli di βActina (8H10D10).
Statistica
I dati sono espressi come medie ± SD se non altrimenti specificato. La correlazione di Spearman è stata usata per misurare il grado di correlazione di due variabili. La concordanza fra i due metodi è stata misurata mediante plot di Bland Altman. I risultati di Bland-Altman mostrano la differenza ed i valori medi ottenuti coi due metodi (livelli di PLIN2 nei monociti e nel fegato). La deviazione standard (SD) delle differenze fra i due metodi è l’SD bias. I limiti di concordanza erano misurati come bias medio, ossia la media delle differenze fra i due metodi di misura più o meno 1.96 per SD bias.
L’analisi statistica è stata effettuata mediante SPSS versione 13.
RISULTATI
Il grado di steatosi epatica valutata mediante biopsia epatica e con NAFLD Activity Score (NAS), metodo istologico per definire il grado di NAFLD, la media del grado di steatosi di tutti i pazienti esaminati era di 2.42±1.17 ed i soggetti mostravano un grado di steatosi fra 1 e 4.
Per dimostrare che l’accumulo di grasso ectopico avviene anche nei monociti si è usato il Nile Red per colorare le biopsie epatiche ed i monociti (Figura 1, Panello A). Nei monociti i lipidi si aggregano in goccioline più grandi.
L’espressione di PLIN2 nei monociti correla fortemente e positivamente con l’espressione di PLIN2 nel fegato (R=0.84 P<0.0001). Un esempio di espressione proteica di PLIN2 mediante Western blot è riportato in Figura 1, Panello B
La figura 2 invece riporta la colorazione ORO in una sezione epatica ed in monociti di uno stesso soggetto.
I livelli di PLIN2 nel fegato ben correlavano col grado di steatosi epatica (R = 0.91, P<0.001) ed i livelli di PLIN2 nei monociti correlavano bene col grado di steatosi epatica (R = 0.89, P<0.001).
La Figura 3 riporta il grafico di Bland Altman che paragona i due metodi di dosaggio, cioè i livelli di Plin 2 nei monociti e nel fegato. La differenza fra i valori ottenuti con le due misure è riportata sull’asse delle Y mentre la media è sull’asse delle X. Le linee punteggiate riportano il 95% dei limiti di congruenza fra le due misure. Il grafico dimostra che tutti i punti si trovano all’interno dei limiti di congruenza il che significa che il metodo della presente invenzione è valido.
E’ stato anche trovato che vi è una buona correlazione fra i livelli di PLIN2 misurati nei monociti mediante citofluorimetria, espresso come intensità mediana di fluorescenza (MFI, Figura 4), ed i livelli di PLIN2 misurati con Western blot (R = 0.92; P<0.0001).
I livelli (MFI) di PLIN2 nei PBMC 48.88±5.80 (SEM) dimostrano un’ottima correlazione (R = 0.98, P = 0.0004) con i livelli nei monociti, 42.90±5.77 (SEM).
A dimostrazione della correlazione della gravità della steatosi epatica non alcolica con i livelli di PLIN2, è stato trovato che sia i livelli di PLIN2 nel fegato che nei monociti correlavano molto bene in maniera inversa con la sensibilità insulinica espressa come OGIS, l’equazione della regressione per i monociti era
OGIS = −44.59*PLIN2 411.3
con un R<2 >di 0.91 ed una P<0.0001
OGIS è un acronimo per oral glucose insulin sensitivity index ha come unità di misura ml x min<-1 >x m<-2>. La Plin2 è misurata con western blot in unità relative alla proteina di riferimento bata-actina.

Claims (18)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la diagnosi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) comprendente i passaggi di a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo b. confrontare il valore ottenuto al punto a. con il valore di concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo sano, c. diagnosticare steatosi epatica quando il valore misurato in a. è maggiore del valore misurato in b.
  2. 2. Metodo per il monitoraggio dell’efficacia di un trattamento terapeutico della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente comprendente i passaggi di a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0 a partire dal quale si effettua detto monitoraggio b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di una efficacia di detto trattamento terapeutico.
  3. 3. Metodo per il monitoraggio della progressione della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente comprendente i passaggi di a. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un istante di tempo t0 a partire dal quale si effettua detto monitoraggio b. misurare il valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo affetto da NAFDL ad un uno o più istanti di tempo tn, in cui n è un numero intero maggiore di 0, e in cui ciascun tn corrisponde a istanti di tempo successivi a t0 in cui una diminuzione della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativa di un miglioramento della NAFDL mentre un aumento della concentrazione della proteina PLIN2 in uno o più di detti istanti di tempo tn è indicativo del peggioramento della NAFDL.
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detto campione ematico è un campione di sangue periferico.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detti leucociti sono cellule polimorfonucleate e/o monociti.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detta misurazione è effettuata mediante Western blot, oppure Citofluorimetria, oppure ELISA, oppure PCR quantitativa.
  7. 7. Programma per elaboratore per la diagnosi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) in un individuo da analizzare, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto individuo da analizzare o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico e un secondo valore di concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico di un individuo sano, implementano i seguenti passi: confrontare detto primo valore con detto secondo valore e diagnosticare steatosi epatica non alcolica (NAFDL) quando detto primo valore è maggiore di detto secondo valore.
  8. 8. Programma per elaboratore per il monitoraggio dell’efficacia di un trattamento terapeutico della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo t0 e un secondo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo successivo a t0, implementano i seguenti passi: confrontare detto primo valore con detto secondo valore e rilevare una efficacia di detto trattamento terapeutico se detto secondo valore è minore di detto primo valore.
  9. 9. Programma per elaboratore per il monitoraggio della progressione della steatosi epatica non alcolica (NAFDL) su di un paziente, comprendente una lista di istruzioni che, quando eseguite su un calcolatore elettronico, fornito un primo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo t0 e un secondo valore della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di detto paziente o in un campione di leucociti estratti da detto campione ematico ad un istante di tempo successivo a t0, implementano i seguenti passi: confrontare detto primo valore con detto secondo valore e rilevare un miglioramento della NAFDL se detto secondo valore è minore di detto primo valore, rilevare un peggioramento della NAFDL se detto secondo valore è maggiore di detto primo valore, rilevare una stasi della NAFDL se detto secondo valore è circa uguale a detto primo valore.
  10. 10. Dispositivo (10) per la misurazione automatica della concentrazione della proteina PLIN2 in un campione ematico di un paziente, comprendente: − mezzi per l’isolamento (14, 5, 6) di polimorfonucleati (PBMC) da un campione ematico; − mezzi per la misurazione (16, 12, 13) della concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di detti polimorfonucleati (PBMC), e − un’unità di controllo (7) connessa a detti mezzi per l’isolamento (14, 5, 6) e mezzi per la misurazione (16, 12, 13), programmata in maniera tale da: comandare e sincronizzare l’attuazione di detti mezzi per l’isolamento (14, 5, 6) e mezzi per la misurazione (16, 12, 13) in accordo ad una modalità automatica, secondo parametri operativi predeterminati, e confrontare automaticamente il dato di concentrazione della proteina PLIN2 misurato nel citoplasma di detti polimorfonucleati (PBMC) con almeno un dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
  11. 11. Dispositivo (10) secondo la rivendicazione precedente, in cui detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento è un dato associato al medesimo paziente e rilevato in un istante temporale (t0) precedente ad un istante temporale (tn) in cui è stato rilevato detto campione ematico, ed in cui detta unità di controllo (7) è ulteriormente programmata per rilevare: − un miglioramento della steatosi epatica non alcolica (NAFDL), se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è minore del dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento, − un peggioramento della steatosi epatica non alcolica (NAFDL), se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi campione è maggiore del dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento, − una stasi della steatosi epatica non alcolica (NAFDL), se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è uguale al dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
  12. 12. Dispositivo (10) secondo la rivendicazione 10, in cui detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento è un dato associato ad un soggetto sano ed in cui detta unità di controllo (7) è ulteriormente programmata per rilevare una condizione di steatosi epatica non alcolica (NAFDL) se il dato di concentrazione della proteina PLIN2 ottenuto dall’analisi del campione è maggiore di detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
  13. 13. Dispositivo (10) secondo una delle rivendicazioni da 10 a 12, in cui detti mezzi per la misurazione (16, 12, 13) della concentrazione della proteina PLIN2 nel citoplasma di detti polimorfonucleati (PBMC) comprendono: − mezzi per il trattamento (16) dei polimorfonucleati (PBMC) isolati con detti mezzi per l’isolamento (14, 5, 6), configurati in modo tale da permettere il legame della proteina PLIN2, quando presente, con un reagente specifico per tale proteina, in cui detto reagente è fluorescente o presenta una specifica colorazione ad una o più lunghezze d’onda predeterminate; − almeno una sorgente di radiazioni (12), configurata per emettere radiazioni ad una lunghezza d’onda predeterminata in corrispondenza di detti polimorfonucleati (PBMC) isolati e trattati, in maniera tale che detto reagente emetta fluorescenza o presenti detta specifica colorazione; − mezzi per l’acquisizione di immagini (13) del campione irradiato mediante sorgente di radiazione (12); ed in cui detta un’unità di controllo (7) è connessa a tutti detti mezzi e a detta sorgente di radiazioni (12) ed è programmata in maniera tale da comandare e sincronizzare la loro attuazione in accordo ad una modalità automatica, secondo parametri operativi predeterminati, ed è ulteriormente configurata per: elaborare le immagini acquisite mediante detti mezzi per l’acquisizione di immagini (13) in maniera tale da determinare un dato di concentrazione della proteina PLIN2 presente in detto campione ematico e confrontare automaticamente detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 con detto dato di concentrazione della proteina PLIN2 di riferimento.
  14. 14. Dispositivo (10) secondo una delle rivendicazioni da 10 a 13, in cui detti mezzi per l’isolamento (14, 5, 6) di polimorfonucleati (PBMC) da un campione ematico comprendono: − mezzi di miscelazione (14) configurati per miscelare detto campione ematico con un componente atto a legarsi ai polimorfonucleati (PBMC) presenti in tale campione, e ove necessario, con una sostanza anticoagulante; − mezzi di movimentazione (5) configurati per applicare una sollecitazione meccanica di vibrazione e/o rotazione alla miscela ottenuta mediante detti mezzi di miscelazione (14) e per convogliare detta miscela a mezzi filtranti (6); − detti mezzi filtranti (6), configurati per ritenere detto componente legato ai polimorfonucleati (PBMC) e lasciare eluire il resto di detta miscela; e − mezzi di separazione (19) di detti polimorfonucleati (PBMC) dal componente a cui erano legati configurati per favorire la separazione tra detti polimorfonucleati (PBMC) e detto componente.
  15. 15. Dispositivo (10) secondo la rivendicazione 14, in cui mezzi di movimentazione (5) e detti mezzi filtranti (6) sono integrati e realizzati mediante un nastro trasportatore filtrante.
  16. 16. Dispositivo (10) secondo una delle rivendicazioni da 13 a 15, in cui detta sorgente di radiazioni (12) può emettere radiazioni ad una lunghezza d’onda di 488 nm.
  17. 17. Dispositivo (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 16 comprendente inoltre mezzi di puntura (2) atti a forare la pelle di un individuo da cui deve essere prelevato detto campione ematico e, opzionalmente, mezzi di convogliamento (4) di detto campione ematico ad una camera di raccolta (3) fluidicamente connessi a detti mezzi di puntura (2) e a detta camera di raccolta (3).
  18. 18. Uso del dispositivo (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17 per l’implementazione del metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
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