IT202000009625A1 - Polinucleotidi codificanti antigeni di sars-cov-2 e relativo uso in campo medico come vaccini. - Google Patents
Polinucleotidi codificanti antigeni di sars-cov-2 e relativo uso in campo medico come vaccini. Download PDFInfo
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Description
Polinucleotidi codificanti antigeni di SARS-CoV-2 e relativo uso in campo medico come vaccini
La presente invenzione concerne polinucleotidi codificanti antigeni di SARS-CoV-2 e relativo uso in campo medico come vaccini. In particolare, l?invenzione concerne polinucleotidi codificanti antigeni della proteina Spike del Coronavirus SARS-CoV-2 e relativo uso in campo medico come vaccini nella prevenzione e nel trattamento dell?infezione COVID-19.
La diffusione della nuova malattia da coronavirus denominata COVID-19, causata dal coronavirus SARS-CoV-2 e correlata alla sindrome respiratoria acuta, ? rapidamente progredita in una pandemia. In pochi mesi, da dicembre 2019, COVID-19 si ? diffuso in tutto il mondo con oltre 2.959.929 casi e oltre 202.733 decessi confermati al 29 Aprile 2020, 10.00 am (sito web OMS).
Questa situazione richiede con massima urgenza lo sviluppo di agenti preventivi e terapie sicure ed efficaci contro l'infezione da SARS-CoV-2. Ad oggi, nessuna terapia o vaccino ? stato approvato contro i coronavirus capaci di infettare l?uomo.
Le strategie attualmente in corso per innescare un'efficace risposta immunitaria nell'uomo contro SARS-CoV-2 stanno sfruttando le precedenti esperienze su altri coronavirus come SARS-CoV e MERS-CoV (1, 2). Poich? il virus SARS-CoV-2 condivide una importante somiglianza strutturale e conservazione della sequenza con questi due coronavirus letali, le strategie di immunizzazione sfruttate contro i virus SARS e MERS sono state adottate per guidare la progettazione di nuovi vaccini SARS-CoV-2 (3).
L'immunizzazione con uno o pi? antigeni di subunit? SARS-CoV-2, somministrati come proteine purificate o espressi da vettori virali, a RNA o a DNA, ? uno degli approcci possibili per la progettazione di un vaccino.
Tra gli obiettivi pi? importanti per la vaccinazione ci sono le proteine strutturali che decorano la superficie di SARS-CoV-2. Questi includono la proteina S (Spike) dell'involucro, la proteina E dell'involucro piccolo, la proteina M della matrice e la proteina N del nucleocapside (4).
Uno studio iniziale su un vettore ricombinante che esprime la proteina S della SARS-CoV ha indicato che questa proteina ? altamente immunogenica e protettiva contro la SARS-CoV nel criceto, mentre, al contrario, le proteine N, M ed E non hanno dato un contributo significativo a una risposta anticorpale neutralizzante o immunit? protettiva (5).
Dato quanto sopra e poich? la proteina S del coronavirus ? una glicoproteina esposta in superficie e media l'ingresso nelle cellule ospiti interagendo con l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2), essa ? diventata rapidamente il principale bersaglio molecolare da neutralizzare con anticorpi e il focus della progettazione terapeutica e dei vaccini (6).
L'evidenza del ruolo chiave della proteina S nella lotta contro l'infezione da coronavirus ? emersa da studi sugli anticorpi neutralizzanti nell'uomo da rare cellule B della memoria di individui infetti da SARS-CoV (7) o MERS-CoV (8). In tali studi gli anticorpi diretti contro la proteina S della SARS-CoV sono risultati efficaci nell'inibire l'ingresso del virus nelle cellule ospiti. Pi? recentemente, ? stato scoperto che la proteina S di SARS-CoV induce risposte anticorpali policlonali, neutralizza potentemente l'ingresso nelle cellule di SARS-CoV-2 mediato proprio dalla proteina S, incoraggiando cos? ulteriormente l'uso di questo target molecolare per la vaccinazione e le immunoterapie (9).
Gli studi strutturali sugli anticorpi in complesso con le proteine S di SARS-CoV e MERS-CoV hanno fornito informazioni sul meccanismo di inibizione competitiva sul recettore (10). ? stato identificato il dominio di legame del recettore (RBD) nella proteina S di SARS-CoV-2 e si ? scoperto che si lega fortemente al recettore ACE2. Gli anticorpi specifici per RBD di SARS-CoV possono cross-reagire con la proteina RBD di SARS-CoV-2 e il virus SARS-CoV-2 ? neutralizzato dagli antisieri indotti da RBD di SARS-CoV-2, fornendo ulteriori prove che un vaccino avente come bersaglio questo dominio della proteina S potrebbe essere efficace (11).
L'eterogeneit? molecolare e l?evoluzione di SARS-CoV-2 hanno sollevato preoccupazioni circa l'ampiezza e l'efficacia della protezione con specifiche tipologie di vaccino e la possibile fuga del virus dalla pressione selettiva esercitata dal sistema immunitario.
Un nuovo studio ha scoperto che la capacit? del nuovo coronavirus di mutare ? stata ampiamente sottovalutata e diversi ceppi possono spiegare i diversi impatti della malattia in varie parti del mondo (12).
Sars-CoV-2 ha acquisito mutazioni in grado di cambiarne sostanzialmente la patogenicit?, fornendo la prima prova concreta che la mutazione potrebbe influire sulla gravit? della malattia o del danno nel suo ospite. I ceppi virali isolati da 11 pazienti Covid-19 scelti a caso in Hangzhou, nella provincia orientale dello Zhejiang, sono stati testati per la capacit? di infettare e uccidere le cellule. Questi isolati virali mostravano una variazione significativa degli effetti citopatici e della carica virale, fino a 270 volte, quando si infettavano le cellule Vero-E6, una variazione intrapersonale e 6 diverse mutazioni nella proteina S, inclusi 2 diversi SNV che hanno portato alla stessa mutazione missenso. Pertanto, sono state fornite prove dirette che il SARS-CoV-2 ha acquisito mutazioni in grado di cambiarne sostanzialmente la sua patogenicit?. Le mutazioni pi? mortali nei pazienti dello Zhejiang sono state trovate anche nella maggior parte dei pazienti in tutta Europa, mentre i ceppi pi? lievi erano le variet? predominanti trovate in alcune parti degli Stati Uniti, come lo stato di Washington. Questa scoperta potrebbe far luce sulle differenze nella mortalit? regionale. L'infezione della pandemia e il tasso di mortalit? variano da paese a paese e sono state proposte molte spiegazioni come l'et?, le condizioni di salute o persino il gruppo sanguigno. Negli ospedali, Covid-19 ? stata trattata come una malattia e i pazienti hanno ricevuto lo stesso trattamento indipendentemente dal ceppo infettivo. Lo sviluppo di farmaci e vaccini deve dunque necessariamente tener conto dell'impatto di queste mutazioni che si accumulano. Tuttavia, l?osservazione che una risposta eterotipica blocca l'ingresso mediato dalla proteina S di SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti e l?analisi della sequenza e della conservazione strutturale della proteina S di SARS-CoV-2 e di SARS-CoV suggeriscono che l'immunit? contro un virus pu? potenzialmente fornire protezione contro virus correlati.
In un recente studio, ? stato scoperto che furetti e gatti sono altamente sensibili alla SARS-CoV-2, mentre i cani hanno una bassa suscettibilit? e il bestiame tra cui maiali, galline e anatre non ? sensibile al virus (13).
Tra i modelli preclinici, infatti, i furetti sono stati spesso usati come modello animale per lo studio dei virus respiratori umani (14, 15). A differenza dei virus influenzali e di altri SARS-coronavirus umani, che si replicano nel tratto respiratorio superiore e inferiore, SARS-CoV-2 si replica solo nel turbinato nasale, nel palato molle e tonsille di furetti. Pu? anche replicarsi nel tratto digestivo, poich? l'RNA virale ? stato rilevato nei tamponi rettali dei furetti infetti da virus, ma il virus non ? stato rilevato nei lobi polmonari, anche dopo che i furetti sono stati inoculati per via intratracheale con il virus. Il fatto che SARS-CoV-2 si replica in modo efficiente nel tratto respiratorio superiore dei furetti li rende dunque un modello animale candidato per la valutazione di farmaci antivirali o candidati vaccinali contro COVID-19.
Tra gli animali domestici, SARS-CoV-2 replica nei gatti in modo efficiente e si trasmette ad altri gatti. Furetti e gatti hanno solo due differenze di aminoacidi nelle regioni a contatto di picchi SARS-CoV-2 di ACE2. ? stato infatti segnalato che i gatti di Wuhan sono sieropositivi per SARS-CoV-2 (16). La sorveglianza per SARS-CoV-2 nei gatti deve pertanto essere considerata in aggiunta all'eliminazione di COVID-19 nell'uomo.
Uno dei problemi pi? importanti riguardo all'attuale pandemia di coronavirus COVID-19 ? il possibile peggioramento della malattia da parte di immunoterapie come conseguenza di un potenziamento anticorpale (ADE) dell'infezione con SARS-CoV-2 (17). L?effetto ADE ? stato una delle principali preoccupazioni per l'epidemiologia, lo sviluppo di vaccini e la terapia farmacologica basata su anticorpi, quando ? stato scoperto che l'ingresso virale nella cellula bersaglio poteva essere mediato dal recettore Fc II e non dall'ACE2 canonico (18). ? stato suggerito che l?ADE potrebbe spiegare le differenze geografiche nella gravit? di COVID-19 a causa della precedente esposizione a epitopi antigenici simili (19). Un altro studio ha dimostrato che l'anticorpo contro la proteina S di SARS-CoV media l'infezione potenziata di cellule di origine monocitica. Tuttavia, i macrofagi con infezione da ADE non supportano la replicazione produttiva di SARS-CoV e in effetti non ? stato osservato alcun rilascio rilevabile del virus della progenie (20). In un modello murino di vaccinazione per SARS-CoV con approcci diversi tra cui il virus inattivato, il vaccino proteico basato sulla proteina S ricombinante ha portato all'immunopatologia polmonare. Comunque, nonostante il peggioramento del profilo istopatologico polmonare dei topi vaccinati, tutti i vaccini SARS-CoV hanno indotto anticorpi e protezione contro l'infezione da SARS-CoV (21). ? stato scoperto che concentrazioni pi? elevate di anti-sieri sono in grado di neutralizzare l'infezione da SARS-CoV, mentre anti-sieri altamente diluiti hanno aumentato significativamente l'infezione da SARS-CoV. I risultati dei test di infettivit? indicano che l?ADE ? principalmente mediata da anticorpi diluiti contro la proteina S (22). Tuttavia, la rilevanza dell'ADE nell'infezione da coronavirus non ? ancora del tutto chiara in quanto non ? stata trovata alcuna prova diretta nel modello di vaccinazione. Infatti, ? stato dimostrato che la vaccinazione di scimmie del genere Rhesus con SARS-CoV attenuato non ha indotto esacerbazione dell'infezione anche diverse settimane dopo, quando il titolo anticorpale si era sensibilmente ridotto (23).
Alla luce di quanto sopra esposto ? evidente l?esigenza di disporre di un vaccino per la prevenzione e per il trattamento della malattia causata da SARS-CoV-2.
Il disegno molecolare di un vaccino contro la SARS-CoV-2 dovrebbe quindi seguire una strategia altamente specifica per regioni che possano bloccare l?interazione del virus con il suo recettore naturale e che minimizzi il rischio di indurre un effetto ADE. Allo stesso tempo una piattaforma vaccinale molto efficiente e capace di indurre non solo anticorpi, ma anche una risposta cellulo-mediata ? altamente desiderabile.
Diverse aziende e istituti di ricerca hanno avviato dunque lo sviluppo di vaccini che hanno come bersaglio la proteina S di SARS-CoV-2. Le diverse strategie di vaccinazione hanno una capacit? diversa di indurre nell'ospite sia una risposta umorale mediata da anticorpi sia una risposta cellulare mediata da linfociti T CD4 o CD8 in modelli preclinici. Questo obiettivo ? stato guidato dalla precedente storia preclinica di comprovata efficacia delle immunoterapie contro la proteina omologa di SARS-CoV.
Mediante l'allineamento della sequenza della Proteina S del nuovo coronavirus SARS-CoV-2 con la spike del SARS-CoV, ? stato osservato un grado di similarit? complessiva di circa il 76% (vedere Figura 1). Da notare che la met? delle dissimilarit? (? 56%) ricade nel dominio N-terminale (residui 14-294, ID UNIPROT SARS-CoV-1 P59594) e un buon ? 24% nei tre domini C-terminali denominati CTD1, CTD2 e CTD3 (residui 320-666, ID UNIPROT P59594 SARS-CoV-1) della subunit? S1.
Il rimanente ? 20% di dissimilarit? tra le due proteine analizzate coinvolge invece la subunit? S2 C-terminale (residui 667-1190, ID UNIPROT P59594 SARS-CoV), che ? coinvolta nell'attivit? di fusione virale sulla membrana ospite.
Si evidenzia che nella nuova proteina S di SARS-CoV-2 i domini non sono ufficialmente identificati come CTD2, CTD3. Ad esempio in UNIPROT questi domini non vengono associati a nessuna nomenclatura, mentre in un lavoro di Science di Cryo-EM sono denominati SD1, SD2. In questo contesto detti domini saranno indicati come CTD2, CTD3 sulla base della nomenclatura dei domini utilizzata per SARS-CoV-1.
Il CTD1 (residui 306-527, ID UNIPROT SARS-CoV-1 P59594), chiamato anche ?dominio legante il recettore? (RBD), ? responsabile del riconoscimento del recettore cellulare ACE2. Sebbene nell?RBD del SARS-CoV-2 siano state identificate alcune variazioni di sequenza rispetto alla pi? ancestrale controparte SARS-CoV-1, la similarit? di sequenza complessiva tra i 2 domini ? di circa il 75%, indicando quindi l'ipotesi che entrambi i virus condividano lo stesso recettore ACE2. Ipotesi ormai confermata da diversi lavori scientifici pubblicati. Precedenti studi strutturali hanno identificato 14 aminoacidi all'interno del SARS-CoV RBD umano che contattano il recettore ACE2 (35). Di questi, 8 sono conservati mentre 6 sono mutati nell'RBD del nuovo coronavirus, inclusi 2 residui critici nelle posizioni 479 e 487. Tuttavia, recenti analisi hanno suggerito che tali cambiamenti potrebbero non influire sulla capacit? di riconoscimento di ACE2 del Coronavirus recentemente identificato (18).
Secondo la presente invenzione, sono stati ora messi a punto vaccini basati su un costrutto di DNA plasmidico esprimenti specifici domini della proteina S del virus SARS-CoV-2 che comprendono la regione RBD per la prevenzione e per la terapia della malattia causata dal virus SARS-CoV-2. Il sistema viene denominato COVID-eVax. Nel percorso sperimentale descritto pi? avanti, si ? cercato di capire quali varianti fossero pi? immunogeniche tramite un saggio di sieroconversione in topi vaccinati e in grado di indurre un maggiore titolo anticorpale.
In particolare, l?esempio 1 descrive il criterio con cui sono state identificate le regioni funzionalmente rilevanti della proteina S. Il criterio ha tenuto anche conto della probabilit? di conformazione tridimensionale pi? vicina a quella fisiologica.
L?esempio 2 mostra l?analisi della proteina S di 1977 genomi sequenziati del SARS-CoV-2, dove si evidenzia che c?? un totale di 26 mutazioni e la frequenza delle mutazioni nella regione RBD ? quindi molto bassa (1,3%).
Nell?esempio 3, le varianti sono state generate, le sequenze nucleotidiche ottimizzate per codon-usage e sono state inserite in un vettore di DNA plasmidico e somministrato tramite elettroporazione (DNA-EP).
Nell?esempio 4, gruppi di topi sono stati vaccinati usando la tecnologia della DNA-EP. In particolare, sono state usate diverse condizioni elettriche per ottenere una migliore espressione genica e induzione della risposta immunitaria.
L?esempio 5 mostra come sono state prodotte le proteine RBD-Fc e RBD-6His per i saggi di sieroconversione e titolazione anticorpale. Queste proteine sono anche utilizzate per la generazione di anticorpi monoclonali anti-Spike.
L?esempio 6 mostra i risultati ottenuti sulla sieroconversione degli animali e sul livello del titolo anticorpale ottenuto dopo la vaccinazione e utilizzando la proteina ricombinante RBD-6His.
L?esempio 7 indica che gli anticorpi generati sono in grado di legarsi alla proteina S espressa sulla superficie delle cellule, quindi nella sua conformazione nativa.
L?esempio 8 mostra i dati del saggio funzionale sul virus SARS-CoV-2, dove si vede che i sieri degli animali vaccinati sono in grado di bloccare l?infettivit? del virus in vitro su cellule.
L?esempio 9 indica come il vaccino COVID-eVax verr? somministrato al soggetto.
Sulla base dei risultati sperimentali, ? stato osservato che tutte le varianti sono in grado di generare anticorpi contro la regione RBD. In particolare proprio i costrutti che contengono una regione specifica della proteina S, e non tutta la proteina S, hanno dato il maggiore titolo anticorpale e il maggiore potere neutralizzante su SARS-CoV-2 quando comprendenti la porzione RBD.
Questo risultato ? sorprendente poich? molti studi hanno dimostrato che la proteina S full length di SARS e MERS dava maggiori titoli anticorpali.
In particolare, la presente invenzione propone l?uso di un vaccino contro SARS-CoV-2 in forma di vaccino a DNA da somministrare tramite elettroporazione o altri sistemi che possano aumentare l?espressione genica in vivo. Nell?esempio 4 ? mostrato che l?espressione genica del transgene dipende da un sistema di trasduzione come l?elettroporazione in vivo e varia in base al metodo di uso.
L?efficacia del sistema di vaccinazione e dei correlati immunologici come ad esempio i risultati dell?analisi delle risposte specifiche dipende, infatti, dalle condizioni elettriche utilizzate.
Il vaccino della presente invenzione fornisce l?importante vantaggio di poter essere somministrato varie volte nel tempo, senza l?induzione di anticorpi neutralizzanti contro il vaccino stesso, come invece accade nel caso di vaccini vettoriali basati su virus.
Secondo la presente invenzione, le sequenze del virus sono selezionate da allineamenti di genomi isolati in Cina e in vari paesi del mondo, allo scopo di generare un vaccino capace di neutralizzare il SARS-CoV-2 sia in specifiche regioni geografiche sia a livello globale.
La risposta immunitaria mediata dalle cellule T riconosce i peptidi del virus come non-self e attiva quindi una risposta citotossica per uccidere le cellule che li esprimono. Il termine non-self ? impiegato per indicare le risposte contro gli epitopi virali che eliminano la cellula contenente il virus e quindi l?infezione.
Un ulteriore importante aspetto del vaccino contro COVID-19 secondo la presente invenzione ? la possibilit? di colpire pi? mutazioni accumulate dal virus nel tempo. In particolare, questo approccio ? dipendente dalla funzione biologica della proteina S e pu? essere ridisegnato seguendo l?evoluzione mutazionale del coronavirus nel tempo, ossia ? possibile inserire nel vaccino nuove sequenze identificate dall?analisi epidemiologica.
Il vaccino secondo la presente invenzione ? in grado di indurre nel paziente una risposta immunitaria cellulare di tipo B e di tipo T contro la proteina S del SARS-CoV-2.
Un ulteriore vantaggio della presente invenzione ? la possibilit? di somministrazione senza necessit? di una formulazione complessa come nel caso di lipoparticelle con peptidi o RNA cos? come nel caso di nanoparticelle di altra natura caricate con un vaccino.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica comprendente detto polinucleotide o vettore di espressione in combinazione con uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili,
in cui il polinucleotide comprende o consiste in una sequenza scelta tra SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:21, ciascuna codificante per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione il polinucleotide pu? comprendere o consistere nella sequenza SEQ ID NO:2 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nei domini NTD e RBD, dall?estremit? N terminale a quella C terminale, della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere o consistere nella sequenza SEQ ID NO:3 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nei domini NTD, RBD, CTD2 e CTD3, dall?estremit? N terminale a quella C terminale, della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere o consistere nella sequenza SEQ ID NO:5 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nella proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere o consistere nella sequenza SEQ ID NO:6 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, detto dominio essendo fuso al sito di trimerizzazione avente sequenza SEQ ID NO:13 mediante il linker avente sequenza SEQ ID NO:14.
Secondo una forma di realizzazione dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze leader come ad esempio l?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), IgK, growth hormone, albumina sierica o fosfatasi alcalina. La sequenza leader ? legata all?estremit? N terminale della sequenza amminoacidica.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, il polinucleotide pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT). La sequenza amminoacidica pu? comprendere anche una o pi? sequenze linker.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere o consistere nella sequenza SEQ ID NO:4 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, detto dominio essendo fuso all?estremit? N-terminale alla sequenza leader IgK e all?estremit? C-terminale alla sequenza immunomodulatoria Fc.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, il polinucleotide pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze antigeniche del virus SARS-CoV-2 diverse da quelle della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo la presente invenzione, il vettore di espressione pu? essere scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, il polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica sono in forma di vaccino a DNA, a RNA o proteico.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione anche un polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica come definiti sopra per l?uso in campo medico.
La presente invenzione concerne inoltre un polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica comprendente detto polinucleotide, vettore o sequenza amminoacidica in combinazione con uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili,
in cui detta sequenza amminoacidica comprende o consiste nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia causata dal virus SARS-CoV-2, come ad esempio la polmonite interstiziale.
Secondo un aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente uno o pi? domini della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2 scelti dal gruppo che consiste in NTD, CTD2, CTD3. In particolare, la sequenza amminoacidica pu? comprendere ad esempio RBD (Spike-A), oppure dall?N terminale al C-terminale pu? comprendere NTD e RBD (Spike-B), oppure NTD, RBD, CTD2 e CTD3 (Spike-C), oppure l?intera sequenza Spike (Spike-FL).
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, uno o pi? domini della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2 pu? essere fuso a un dominio di trimerizzazione, ad esempio il dominio RBD (RBD trimerica). Il dominio di trimerizzazione potrebbe essere legato anche a regioni pi? ampie come Spike B e Spike C.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze antigeniche del virus SARS-CoV-2 diverse da quelle della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze leader come ad esempio l?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), IgK, growth hormone, albumina sierica o fosfatasi alcalina). La sequenza leader ? legata all?estremit? N terminale della sequenza amminoacidica. La sequenza leader ha la funzione di trasportare gli antigeni all?esterno della cellula dell?organismo trasfettata con il vettore o plasmide, ad esempio per elettroporazione.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, detta sequenza amminoacidica pu? comprendere ulteriormente una o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT). Ad esempio, la sequenza amminoacidica pu? essere IgK-RBD-Fc. La sequenza amminoacidica pu? comprendere anche una o pi? sequenze linker. L?utilizzo di sequenze leader e di sequenze immunomodulatorie forniscono l?effetto tecnico di migliorare il titolo anticorpale. In particolare, la sequenza leader ha la funzione di trasportare gli antigeni all?esterno della cellula dell?organismo trasfettata con il vettore o plasmide, ad esempio per elettroporazione. La sequenza leader aumenta la secrezione della proteina, mentre le sequenze immnomodulatorie stimolano il sistema immunitario a produrre anticorpi. Inoltre, il polinucleotide secondo la presente invenzione pu? essere sotto il controllo trascrizionale di un promotore e di un elemento trascrizionale regolatorio.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione per l?uso sopra menzionato, il polinucleotide pu? essere scelto tra un polinucleotide come definito sopra e nelle rivendicazioni da 1 a 8.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza amminoacidica pu? essere scelta nel gruppo che consiste in SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.
Secondo un aspetto della presente invenzione, sempre in relazione all?uso sopra menzionato, il polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo la presente invenzione sono usati come vaccino a DNA, a RNA o proteico.
In particolare, quando il vaccino ? un vaccino a DNA o a RNA, detto vaccino pu? essere somministrato per elettroporazione, preferibilmente nelle seguenti condizioni: 8 impulsi di 20 msec ciascuno di 110V, 8Hz, con un intervallo di 120 msec tra ciascuno di essi.
L?elettroporazione consente di ottimizzare l?efficacia del vaccino. Preferibilmente la somministrazione avviene nel muscolo o sottocute. Il trattamento di elettroporazione pu? comprendere l?utilizzo di elettrodi di profondit?, di superficie, elettrodi piatti e/o aghi. Il vaccino secondo la presente invenzione pu? essere somministrato in un unico sito o in pi? siti. Ad esempio, diversi vaccini contro virus mutati possono essere somministrati in parte nel quadricipite della gamba destra, i successivi, diversi dai primi, nel quadricipite della gamba sinistra, i successivi nel deltoide del braccio destro, i successivi ancora nel deltoide del braccio sinistro.
I principi dell'elettroporazione sono molto semplici. La membrana lipidica di una cellula pu? essere considerata come un elemento dielettrico interposto tra l'ambiente extracellulare e quello citoplasmatico, che sono entrambi conduttivi. Un campo elettrico applicato a una cellula induce un potenziale transmembrana: quando si supera il potenziale dielettrico della membrana, pori transienti appaiono nella membrana, un processo chiamato elettroporazione (24, 25). Se il campo elettrico viene mantenuto abbastanza a lungo, la membrana diventa permeabile (elettropermeabilizzazione) perch? i pori transitori vengono stabilizzati e diventano abbastanza grandi da consentire a macromolecole cariche, come il DNA, di accedere al citoplasma. Le cellule rimangono in uno stato porato per un periodo limitato di tempo e rapidamente si richiudono dopo che il trattamento elettrico cessa. La durata dell'impulso elettrico deve essere sufficientemente breve da evitare danni irreversibili della membrana cellulare e morte cellulare. Il potenziale transmembrana aumenta linearmente con l'intensit? del campo elettrico applicato, ma al di sopra di una certa soglia (generalmente 0,5-2 V) diminuisce, indicando che la conducibilit? della membrana aumenta a causa della formazione di pori idrofili (26,27). Poich? le molecole di acido nucleico come il DNA o RNA sono troppo grandi per penetrare attraverso i pori idrofili per semplice diffusione, un campo elettroforetico deve essere mantenuto per un tempo sufficiente per consentire ai polianioni di muoversi ed entrare nella cellula. Il DNA deve essere in prossimit? della membrana cellulare prima che il campo elettrico venga applicato. Le molecole di DNA attraversano i pori della membrana tramite un processo elettro-diffusivo. La progressione del DNA verso il nucleo ? postulata avvenire tramite una combinazione di elettroforesi classica e diffusione passiva secondo un gradiente di concentrazione. Pertanto, gli impulsi devono essere ottimizzati per ottenere la migliore combinazione di permeabilizzazione cellulare seguita dall'effetto elettroforetico desiderabile. In generale parametri degli impulsi sono arbitrariamente suddivisi in impulsi brevi ad alta tensione, superiore ai 400V/cm con una durata nella gamma dei ?sec e impulsi a bassa tensione, inferiori a 400 V/cm con una durata nell'intervallo dei msec. Un trasferimento genico efficiente ? stato dimostrato sia utilizzando solo una sequenza di impulsi ad alta tensione o solo impulsi a bassa tensione. Tuttavia, in teoria, la strategia pi? efficace sembra essere la combinazione di brevi impulsi ad alta tensione iniziale seguita da una sequenza di impulsi a bassa tensione di durata pi? lunga. L'espressione proteica nel muscolo ? solitamente migliorata di 100-1000 volte dopo elettroporazione del DNA (DNA-EP) rispetto all'iniezione del DNA nudo, soprattutto grazie al maggiore assorbimento cellulare <14? >16. Esistono diversi dispositivi per la DNA-EP. Le tecnologie pi? avanzate sono quelle in fase di sviluppo da parte Inovio Pharmaceuticals (http://www.inovio.com), Ichor Medical Systems (http://www.ichorms.com) e IGEA (http://www.igeamedical.com ).
Il muscolo scheletrico ? l'organo bersaglio pi? frequente per la DNA-EP. I muscoli scheletrici sono facilmente accessibili sotto la pelle e sono fatti di cellule post-mitotiche in grado di esprimere il transgene a lungo termine dopo trasfezione (28-31). Inoltre, il danno al tessuto viene rapidamente riparato e senza segni di degenerazione muscolare (32). La DNA-EP del muscolo ? una procedura invasiva che richiede aghi per l'iniezione dell'acido nucleico seguita dalla scarica elettrica. In piccoli animali questo ? realizzato con elettrodi piatti posizionati sulla pelle intorno il volume iniettato, mentre nelle specie pi? grandi compreso l'uomo richiede una matrice di aghi inseriti nel tessuto. Negli studi clinici questa procedura ha dimostrato di essere ben tollerata e non causare grave dolore (33, 34).
Il metodo di somministrazione del vaccino non si limita solo al DNA plasmidico ma pu? essere dato nella forma di peptidi o vettori virali in sequenza di prime/boost. Il vaccino plasmidico con EP pu? essere utilizzato per il mantenimento della risposta immunitaria nel tempo dopo vaccini virali che sono neutralizzati dalla risposta immunitaria contro il vettore virale gi? dopo la prima somministrazione, ossia vettori derivati da adenovirus.
Secondo la presente invenzione, detto vettore di espressione pu? essere scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
La presente invenzione pu? essere vantaggiosamente impiegata per i mammiferi come ad esempio l?uomo o animali come ad esempio il gatto, cane, cavallo, mucca, topo o ratto. Pertanto, i prodotti secondo la presente invenzione possono essere impiegati sia in medicina umana sia in medicina veterinaria. In particolare, il vaccino COVID-eVax potr? essere usato per vaccinare animali da compagnia, come cani e gatti, in particolare i gatti, perch? non rappresentino un serbatoio naturale del virus. Allo stesso tempo, il vaccino potr? essere usato in animali di grandi dimensioni, come gli equini, per generare sieri iperimmuni capaci di neutralizzare il virus se somministrati in pazienti con la patologia COVID-19.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un kit per la prevenzione e il trattamento della malattia causata dal virus SARS-CoV-2, detto kit comprendendo o essendo consistente in: a) un polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, un vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o una composizione farmaceutica come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8; e b) un sistema di somministrazione per elettroporazione o altro device per la trasduzione genica in vivo.
La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per trattare o prevenire la patologia SARS-CoV-2 in un paziente che ha bisogno di cure comprendente la somministrazione di un vaccino contro il virus SARS-CoV-2 nella forma di un vettore o plasmide comprendente sequenze nucleotidiche codificanti varianti della proteina S del virus, somministrato ad esempio mediante la tecnica dell?Elettroporazione nel muscolo.
Il numero di somministrazioni pu? essere una volta, due volte con frequenze bisettimanali, mensili, semestrali e annuali.
La presente invenzione pu? quindi essere vantaggiosamente impiegata in un metodo per prevenire, trattare o rallentare l?infezione da SARS-CoV-2 in un mammifero (come ad esempio l?uomo o un animale come ad esempio il gatto), che prevede la somministrazione ad un mammifero, per il quale tale trattamento di prevenzione e rallentamento ? necessario o desiderabile, di detta combinazione. In conseguenza alla somministrazione ? quindi generata una risposta immunitaria contro detta infezione che viene quindi prevenuta, curata o rallentata. A seguito della somministrazione della combinazione secondo la presente invenzione verranno generate risposte immunologiche del tipo anticorpale e cellulare T citotossico che esibiscono propriet? di inibizione della proliferazione del virus e eliminazione delle cellule infettate dal virus.
Il vaccino a DNA secondo la presente invenzione pu? essere preparato mediante un procedimento che comprende a) preparazione di una sequenza nucleotidica codificante una sequenza antigenica che consiste in o comprende uno o pi? antigeni del virus SARS-CoV-2; b) clonaggio della sequenza nucleotidica in un vettore di espressione o plasmide per l'espressione in cellule di mammifero; e c) amplificazione del vettore plasmidico in un microrganismo batterico adatto, e isolamento delle stesse dal microorganismo oppure d) amplificazione tramite PCR.
Le sequenze sono estratte dai dati di genomica del SARS-CoV-2 e membri della stessa famiglia di virus a RNA. Le sequenze sono disegnate in laboratorio usando l?ottimizzazione dei codoni per l?uomo. La sequenza del vaccino viene inviata ad un provider esterno che provvede alla sintesi e clonaggio nel vettore pTK1A-TPA o pTK1A. Il vettore finale una volta sequenziato per confermare la correttezza della sintesi ? inviato alla officina medicinale GMP che provvede alla produzione necessaria di plasmide che oltre al trattamento delle persone serviranno per le analisi di rilascio del farmaco.
La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento ad esempi e alle figure dei disegni allegati, in cui:
- la Figura 1 mostra A) Allineamento della sequenza aminoacidica della proteina S di SARS-CoV-2 (Query) con la proteina S di SARS-CoV-1 (Sbjct, ID UNIPROT SARS-CoV-1 P59594) ottenuto tramite il tool BLAST, Global Align(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). B) Rappresentazione schematica della sequenza primaria della proteina S di SARS-CoV-2 con domini.
-la Figura 2 mostra l?allineamento di 1977 genomi completi per la regione genomica 20000-250000 tramite il programma MAFFT in Snapgene. In particolare, sono mostrate le mutazioni amminoacidiche mappate nella regione RBD di tutte le sequenze Europee disponibili sul sito GISAID al 12 aprile 2020. 1977 genomi completi di SARS-CoV-2 sono stati importati in Snapgene e le regioni codificanti per la proteina spike sono state selezionate per un primo allineamento con il software MAFFT. Queste sono poi state esportate in FASTA format e riallineate con Jalview che calcola le frequenze dei cambiamenti amminoacidici. Le informazioni sono state graficate con SnapGene.
- la Figura 3 mostra l'analisi di ottimizzazione del codone di un cDNA che codifica per la proteina S di SARS-CoV-2. A) Regolazione del bias del codone. La distribuzione della frequenza di utilizzo del codone lungo la lunghezza della sequenza genica. Un CAI di 1,0 ? considerato perfetto nell'organismo di espressione desiderato e un CAI di> 0,8 ? considerato buono, in termini di alto livello di espressione genica. B) Frequenza dei codoni ottimali (FOP). La distribuzione percentuale dei codoni nei gruppi di qualit? codone calcolati. Il valore di 100 ? impostato per il codone con la pi? alta frequenza di utilizzo per un dato aminoacido nell'organismo di espressione desiderato. C) Regolazione del contenuto del GC. L'intervallo percentuale ideale del contenuto di GC ? compreso tra il 30 e il 70%. I picchi di% di contenuto GC in una finestra di 60 bp sono stati rimossi.
- la Figura 4 mostra l?espressione della luciferasi nel muscolo di topi iniettati col plasmide pGL3-Luc (Promega) usando diverse condizioni elettriche (EGT, ECT, solo iniezione DNA). In particolare, la figura mostra l?espressione della luciferasi in topi trattati con le seguenti condizioni: A) espressione a 72 ore dopo condizioni EGT, condizioni ECT e non elettroporati. B) cinetica di espressione della luciferasi nel tempo fino al giorno 14.
- la Figura 5 e la Figura 6 mostrano la proteina IgK-RBD-Fc e la RBD-6His purificata, in particolare l?analisi dell?integrit? strutturale tramite Western Blot e SDS-PAGE analisi delle proteine RBD-Fc (pannello superiore) e RBD-6xHis (pannello inferiore) sia in condizioni denaturanti che non denaturanti.
- la Figura 7 mostra l?analisi della risposta anticorpale IgM (A) e IgG (B) contro la porzione RBD della proteina S tramite ELISA al giorno 14 dopo il primo trattamento.
- la Figura 8 mostra la titolazione degli anticorpi IgG anti-RBD tramite ELISA al giorno 21 dopo il primo trattamento.
- la Figura 9 mostra la qualit? degli anticorpi generati al giorno 14 tramite citofluorimetria. Cellule HEK293 sono state trasfettate con un costrutto che esprime la proteina S full length e incubati con siero dei topi vaccinati e poolati per gruppo. A) Mediana della fluorescenza delle cellule trasfettate. B) percentuale di legame delle cellule trasfettate. L?analisi ? stata fatta ad un CytoFlex (Beckman Coulter). EV, empty Vector; CEA, antigene carcinoembrionico.
ESEMPIO 1. Disegno molecolare degli antigeni.
Sono stati progettati 6 diversi costrutti (Tabella 1), compresa proteina full-length, che sono stati sottoposti a screening negli studi di vaccinazione.
Tabella 1
Il costrutto Spike-A comprende il solo RBD. Il costrutto Spike B comprende il dominio RBD e il dominio altamente variabile sito all?N-terminale (NTD) mentre il costrutto C tutta la subunit? S1.
Il primo costrutto (A) ? stato scelto poich? principale candidato nel riconoscimento del recettore. Da studi di biologia strutturale ? emerso che in soluzione e in presenza di ACE2 il dominio RBD mantiene un ?folding? che gli permette di interagire con il suo partner.
Nel costrutto Spike-B ? stato inserito l?NTD il cui ruolo, anche se non del tutto chiaro, potrebbe essere importante nei cambiamenti conformazionali per il riconoscimento del recettore ACE2.
Il terzo costrutto (Spike-C) comprende tutta la subunit? 1 che ? quella pi? esposta nell?ambiente extracellulare ed ? stato visto che la maggior parte degli anticorpi prodotti dal sistema immunitario ?targettano? proprio questa subunit? (in SARS-CoV).
Un ultimo costrutto prevede la fusione della RBD con un sito di trimerizzazione. La struttura della proteina determina il tipo di anticorpi che vengono indotti, questo concetto ? stato ampliamente studiato nel vaccino per HIV e recentemente una versione trimerica della proteina env ? entrato nella sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov: NCT03699241). La proteina S nella sua forma nativa ? trimerica ed esiste in diverse conformazioni tridimensionali. La forma nota come prefusion espone all?esterno il sito RBD ed ? quindi in grado di legare il recettore ACE2. La stabilizzazione della forma esposta trimerica di RBD non solo concentra la risposta anticorpale contro la parte rilevante per il legame al recettore ma riduce la produzione di anticorpi contro conformazioni irrilevanti per la neutralizzazione. E? noto dallo studio di anticorpi monoclonali neutralizzanti contro SARS-CoV che alcuni riconoscono l?RBD nella sua forma trimerica. Al fine di aumentare la quantit? e la diversit? degli anticorpi contro RBD includendo anche epitopi conformazionali ? stata generata una proteina trimerica fondendo l?RBD ad un linker (GGGSG) (SEQ ID NO:14) e poi al sito di trimerizzazione Foldon (YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) (SEQ ID NO:13) (36). La proteina sar? espressa a valle del TPA e quindi secreta all?esterno della cellula.
ESEMPIO 2. Studio di comparazione tra le sequenze di SARS-CoV-2 note al 12 Aprile 2020 in Europa
Lo studio del genoma del virus SARS-CoV-2 fornisce informazioni importanti per disegno del vaccino. A differenza della SARS che fece un numero limitato di infetti (circa 8000) e poi fu bloccata dall?isolamento sociale, Covid-19 ? una malattia divenuta pandemica con oltre 2x10^6 di casi confermati e un numero di siero positivi stimato di almeno 100x10^6 (sito web OMS). Questo livello di diffusione fa pensare che il virus posso circolare globalmente e ripresentarsi in focolai di ritorno dai paesi che vanno incontro alla stagione fredda in modo simile al virus dell?influenza. Sebbene queste siano solo ipotesi, il vaccino dovrebbe mirare a colpire non solo le regioni immunogeniche ma anche quelle che sono maggiormente conservate nella struttura della proteina S. Nella precedente epidemia di SARS si ? visto che gli anticorpi neutralizzanti erano principalmente diretti verso la regione RBD. A questo scopo sono state analizzate le sequenze depositate da laboratori Europei sul sito GISAID al 12 aprile 2020.
1977 genomi completi sono stati scaricati localmente e la regione genomica 20000-250000 allineata con il programma MAFFT in Snapgene (www.snapgene.com). Le sequenze sono poi state riallineate tenendo conto solo delle regioni codificanti per la proteina S. Al fine di stabilire la frequenza delle mutazioni a livello proteico, le 1977 sequenze sono state tradotte in proteine e rianalizzate con Jalview. Le mutazioni sono state graficate con Snapgene (Fig.2) e sono riportate nella seguente tabella 2:
Tabella 2
Come si vede nella figura ci sono 21 residui amminoacidici che presentano un variazione, di questi solo due con una frequenza di due volte (K458R) e cinque volte (K356F) per un totale di 26 mutazioni. La frequenza delle mutazioni nella regione RBD che ? il target dei nostri vaccini ? quindi molto bassa (26/1977=1,3%). Come atteso queste mutazioni non sono state riscontrate tra i 28 genomi italiani depositate alla data del 12 aprile.
ESEMPIO 3. Disegno e costruzione dei vettori a DNA Il disegno di un cDNA ottimizzato per aumentare i livelli di espressione dell?antigene o ottimizzazione del cDNA consiste nella sostituzione dei codoni originali con triplette nucleotidiche riconosciute dai tRNA pi? frequenti ed efficienti nelle cellule dell?organismo di interesse ed ? stato basato sulla sequenza originale spike genes dello strain Wuhan-Hu-1 (GenBank: MN908947). Mutazioni specifiche vengono introdotte per silenziare potenziali attivit? tossiche o inibire la formazione di strutture secondarie.
Le varianti della proteina S ottimizzate per codon usage hanno tenuto conto della promiscuit? dell'utilizzo del codone, del contenuto di GC, del contenuto di dinucleotidi CpG, della struttura secondaria dell'mRNA, dei siti di giuntura criptica, dei siti prematuri di PolyA, dei siti chi interni e dei siti ribosomiali, delle isole CpG negative, del motivo di instabilit? dell'RNA (ARE), ripetizione sequenze (ripetizione diretta, ripetizione inversa e ripetizione diade) e siti di restrizione che possono interferire con i clonaggi. Inoltre, per migliorare l'iniziazione e la traduzione proteica, sono state inserite nei geni sintetici sequenze di Kozak e Shine-Dalgarno. Per aumentare l'efficienza della terminazione della traduzione, alla fine dei cDNA sono stati inseriti due codoni di stop consecutivi. Un esempio dell'analisi di un cDNA che codifica la proteina S full length ottimizzata ? mostrato nella Figura 3. In questo caso, il gene nativo impiega codoni rari in tandem che possono ridurre l'efficienza della traduzione o persino disimpegnare il macchinario della traduzione. E? stata aumentata la tendenza all'utilizzo del codone in Human aggiornando il CAI a 0.94. Il contenuto di GC e i picchi sfavorevoli sono stati ottimizzati per prolungare l'emivita dell'mRNA. Le strutture Stem-Loop, che influenzano il legame ribosomiale e la stabilit? dell'mRNA, sono state eliminate. Inoltre, il nostro processo di ottimizzazione ha esaminato e modificato con successo quei siti negativi che agiscono in cis.
Le risultanti sequenze nucleotidiche sono le seguenti, in cui RBD ? evidenziata in grassetto:
SEQ ID NO:1
SEQUENZA SPIKE A AGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGTGCGCTTTCCTAATATCACAAACCTGTGCC CATTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACCAGGTTCGCAAGCGTGTACGCATGGAATAG GAAGCGCATCTCTAACTGCGTGGCCGACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCT TTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGTGTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCT TTACCAACGTGTACGCCGATTCTTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGAT CGCACCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCAGACGAT TTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCG GCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAGCCCTTCGA GAGGGACATCTCTACAGAAATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCTTGCAATGGCGTG GAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACAAACG GCGTGGGCTATCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGC ACCAGCAACAGTGTGCGGACCCAAGAAGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGC GTGAACTTC
SEQ ID NO:2
SEQUENZA SPIKE B GTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATTCCTTCACCC GGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTTAGAAGCTCCGTGCTGCACTCTACACA GGATCTGTTTCTGCCATTCTTTAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTG AGCGGCACCAATGGCACAAAGCGGTTCGACAATCCCGTGCTGCCTTTTAACGATG GCGTGTACTTCGCCTCTACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTTGG CACCACACTGGACTCCAAGACACAGTCTCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAAC GTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCCTTCCTGGGCGTGT ACTATCACAAGAACAATAAGAGCTGGATGGAGTCCGAGTTTAGAGTGTATTCTAG CGCCAACAATTGCACATTTGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAG GGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATG GCTACTTCAAAATCTACTCTAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGCGACCTGCC TCAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCACTGGTGGATCTGCCTATCGGCATCAACATC ACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCCGGCGACT CCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCAGCAGCCTACTATGTGGGCTATCTGCAGCC TAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCCGTGGAT TGCGCCCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGTACACTGAAGTCCTTTACCGTGG AGAAGGGCATCTATCAGACATCCAATTTCAGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGT GCGCTTTCCTAATATCACAAACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACC AGGTTCGCAAGCGTGTACGCATGGAATAGGAAGCGCATCTCTAACTGCGTGGCCG ACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGT GTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTACGCCGATTCTTTC GTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCTGGACAGACAGGCAAGATCG CCGACTACAATTATAAGCTGCCAGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAA CAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTG TTTAGAAAGAGCAATCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCTACAGAAATCTACC AGGCCGGCAGCACCCCTTGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCACT GCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCTTACCGCGTG GTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCCAAGA AGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTC SEQ ID NO:3
SEQUENZA SPIKE C GTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATTCCTTCACCC GGGGCGTGTACTATCCTGACAAGGTGTTTAGAAGCTCCGTGCTGCACTCTACACA GGATCTGTTTCTGCCATTCTTTAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTG AGCGGCACCAATGGCACAAAGCGGTTCGACAATCCCGTGCTGCCTTTTAACGATG GCGTGTACTTCGCCTCTACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTTGG CACCACACTGGACTCCAAGACACAGTCTCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAAC GTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCCTTCCTGGGCGTGT ACTATCACAAGAACAATAAGAGCTGGATGGAGTCCGAGTTTAGAGTGTATTCTAG CGCCAACAATTGCACATTTGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAG GGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATG GCTACTTCAAAATCTACTCTAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGCGACCTGCC TCAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCACTGGTGGATCTGCCTATCGGCATCAACATC ACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCCGGCGACT CCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCAGCAGCCTACTATGTGGGCTATCTGCAGCC TAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCCGTGGAT TGCGCCCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGTACACTGAAGTCCTTTACCGTGG AGAAGGGCATCTATCAGACATCCAATTTCAGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGT GCGCTTTCCTAATATCACAAACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACC AGGTTCGCAAGCGTGTACGCATGGAATAGGAAGCGCATCTCTAACTGCGTGGCCG ACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGT GTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTACGCCGATTCTTTC GTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCTGGACAGACAGGCAAGATCG CCGACTACAATTATAAGCTGCCAGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAA CAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTG TTTAGAAAGAGCAATCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCTACAGAAATCTACC AGGCCGGCAGCACCCCTTGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCACT GCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCTTACCGCGTG GTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCCAAGA AGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGAC CGGAACAGGCGTGCTGACCGAGTCCAACAAGAAGTTCCTGCCATTTCAGCAGTTC GGCAGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGCGACCCACAGACCCTGGAGA TCCTGGATATCACACCCTGCTCTTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACACCAGGAAC CAATACAAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTATCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTG CCTGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCAACATGGCGGGTGTACAGCACCG GCTCCAACGTGTTCCAGACAAGAGCAGGATGTCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAA CAATTCCTATGAGTGCGACATCCCAATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCTTACCAG ACCCAGACAAACTCTCCA SEQ ID NO:4
SEQUENZA SPIKE IgK-RBD-Fc
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggatcca caggaagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaactt gtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttgg aacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccg catcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatct ctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcaga caaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccag atgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggt tggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaacct tttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatg gtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccac taatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttcta catgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaaca aatgtgtcaatttcgtcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctga actcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag accctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaa gacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctc accgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcca acaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacc actacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO:5
SEQUENZA SPIKE Full length
gatctgccaccatgtttgtcttcctggtcctgctgcccctggtctcctctcagtg cgtgaacctgactactagaactcagctgcctcccgcttacaccaattccttcacc cggggcgtgtactatcctgacaaggtgtttagaagctccgtgctgcactctacac aggatctgtttctgccattctttagcaacgtgacctggttccacgccatccacgt gagcggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatcccgtgctgccttttaacgat ggcgtgtacttcgcctctaccgagaagagcaacatcatcagaggctggatctttg gcaccacactggactccaagacacagtctctgctgatcgtgaacaatgccaccaa cgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtg tactatcacaagaacaataagagctggatggagtccgagtttagagtgtattcta gcgccaacaattgcacatttgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctgga gggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgat ggctacttcaaaatctactctaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgc ctcagggcttcagcgccctggagccactggtggatctgcctatcggcatcaacat cacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacccggcgac tcctctagcggatggaccgcaggagcagcagcctactatgtgggctatctgcagc ctaggaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgccgtgga ttgcgccctggatcctctgagcgagacaaagtgtacactgaagtcctttaccgtg gagaagggcatctatcagacatccaatttcagggtgcagccaaccgagtctatcg tgcgctttcctaatatcacaaacctgtgcccatttggcgaggtgttcaacgcaac caggttcgcaagcgtgtacgcatggaataggaagcgcatctctaactgcgtggcc gactatagcgtgctgtacaactccgcctctttcagcacctttaagtgctatggcg tgtcccccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtgtacgccgattcttt cgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcacctggacagacaggcaagatc gccgactacaattataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctgga acagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggct gtttagaaagagcaatctgaagcccttcgagagggacatctctacagaaatctac caggccggcagcaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttcccac tgcagtcctacggcttccagcccacaaacggcgtgggctatcagccttaccgcgt ggtggtgctgagctttgagctgctgcacgcaccagcaacagtgtgcggacccaag aagtccaccaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctga ccggaacaggcgtgctgaccgagtccaacaagaagttcctgccatttcagcagtt cggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgacccacagaccctggag atcctggatatcacaccctgctctttcggcggcgtgagcgtgatcacaccaggaa ccaatacaagcaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgtaccgaggt gcctgtggccatccacgccgatcagctgaccccaacatggcgggtgtacagcacc ggctccaacgtgttccagacaagagcaggatgtctgatcggagcagagcacgtga acaattcctatgagtgcgacatcccaatcggcgccggcatctgtgcctcttacca gacccagacaaactctccaaggagagcacggagcgtggcatcccagtctatcatc gcctataccatgtccctgggcgccgagaattctgtggcctactctaacaatagca tcgccatcccaaccaacttcacaatctctgtgaccacagagatcctgcccgtgtc catgaccaagacatctgtggactgcacaatgtatatctgtggcgattctaccgag tgcagcaacctgctgctgcagtacggcagcttttgtacccagctgaatagagccc tgacaggcatcgccgtggagcaggataagaacacacaggaggtgttcgcccaggt gaagcaaatctacaagaccccccctatcaaggactttggcggcttcaatttttcc cagatcctgcctgatccatccaagccttctaagcggagctttatcgaggacctgc tgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattg cctgggcgacatcgcagcacgggacctgatctgtgcccagaagtttaatggcctg accgtgctgccacccctgctgacagatgagatgatcgcacagtacacaagcgccc tgctggcaggaaccatcacatccggatggaccttcggcgcaggagccgccctgca gatcccctttgccatgcagatggcctataggttcaacggcatcggcgtgacccag aatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaactccgccatcg gcaagatccaggacagcctgtcctctacagcctccgccctgggcaagctgcagga tgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaataccctggtgaagcagctgagctcc aacttcggcgccatctctagcgtgctgaatgatatcctgagccggctggacaagg tggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcacaggcagactgcagtctctgca gacctatgtgacacagcagctgatcagggcagcagagatcagggcaagcgccaat ctggcagcaaccaagatgtccgagtgcgtgctgggccagtctaagagagtggact tttgtggcaagggctatcacctgatgtccttccctcagtctgccccacacggcgt ggtgtttctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccacagcc cctgccatctgccacgatggcaaggcccactttccaagggagggcgtgttcgtgt ccaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccccagatcat caccacagacaataccttcgtgagcggcaactgtgacgtggtcatcggcatcgtg aacaataccgtgtatgatccactgcagcccgagctggacagctttaaggaggagc tggataagtacttcaagaatcacacctcccctgacgtggatctgggcgacatcag cggcatcaatgcctccgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgag gtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgatctgcaggagctgggcaagtatg agcagtacatcaagtggccatggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgat cgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacatcctgctgttcttgc ctgaagggctgctgtagctgcggctcctgttgtaagtttgatgaagacgattccg agcctgtcctgaagggcgtgaagctgcactatacctctagataatgag
SEQ ID NO:6
SEQUENZA Trimerica RBD
AGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCC CCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAG GAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGC TTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCT TCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGAT CGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGAC TTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCG GCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGA GAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTG GAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACG GCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGC CCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGC GTGAACTTCGGCGGCGGCAGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCCAGGGACGGCCAGG CCTACGTGAGGAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTGTGATAA
in cui la sequenza nucleotidica che codifica per RBD ? fusa al sito di trimerizzazione SEQ ID NO:23 TACATCCCCGAGGCCCCCAGGGACGGCCAGGCCTACGTGAGGAAGGACGGCGAGT GGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTG
mediante il linker SEQ ID NO:22 GGCGGCGGCAGCGGC Pertanto, le sequenze nucleotidiche che codificano per RBD e che sono comprese nelle sequenze polinucleotidiche sopra riportate sono le seguenti:
SEQ ID NO:1 (Spike A) AGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGTGCGCTTTCCTAATATCACAAACCTGTGCC CATTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACCAGGTTCGCAAGCGTGTACGCATGGAATAG GAAGCGCATCTCTAACTGCGTGGCCGACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCT TTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGTGTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCT TTACCAACGTGTACGCCGATTCTTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGAT CGCACCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCAGACGAT TTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCG GCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAGCCCTTCGA GAGGGACATCTCTACAGAAATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCTTGCAATGGCGTG GAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACAAACG GCGTGGGCTATCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGC ACCAGCAACAGTGTGCGGACCCAAGAAGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGC GTGAACTTC SEQ ID NO:15
Agagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcc cttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacag gaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatca ttttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgct ttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaat cgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgat tttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtg gtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttga gagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgtt gaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatg gtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgc accagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgt gtcaatttc
SEQ ID NO:21
AGGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCC CCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAG GAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGC TTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCT TCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGAT CGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGAC TTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCG GCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGA GAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTG GAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACG GCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGC CCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGC GTGAACTTC
Le sequenze polinucleotidiche sopra riportate codificano per le seguenti sequenze proteiche:
SEQ ID NO:7
SEQUENZA SPIKE A
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSAS FSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDD FTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKC VNF SEQ ID NO:8
SEQUENZA SPIKE B VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHV SGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATN VVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE GKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINI TRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNAT RFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV VVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF SEQ ID NO:9
SEQUENZA SPIKE C VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHV SGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATN VVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE GKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINI TRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNAT RFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRL FRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV VVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQF GRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEV PVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQ TQTNSP SEQ ID NO:10
SEQUENZA SPIKE IgK-RBD-Fc
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAW NRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKP FERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELL HAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:11
SEQUENZA SPIKE Full length
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlf lpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttl dsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssann ctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgf saleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtf llkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfp nitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvspt klndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnn ldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsy gfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtg vltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtnts nqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsy ecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaip tnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgi aveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnk vtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallag titsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiq dslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveae vqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgk gyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngt hwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldky fknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyi kwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvl kgvklhytsr
SEQ ID NO:12
SEQUENZA RBD trimerica
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSAS FSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDD FTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV EGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKC VNFGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
in cui RBD ? legata a un linker (GGGSG) (SEQ ID NO:14), a sua volta legato al sito di trimerizzazione Foldon (YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) (SEQ ID NO:13).
Le sequenze sono poi state incorporate nel vettore di espressione pTK1A-TPA (Spike A, B, C, trimerica) o pTK1A (Spike Full-length o IgK-RBD-Fc) Entrambi i vettori hanno il promotore e l?introne A del citomegalovirus (CMV) umano, un sito polylinker per i clonaggi e il bovine Grwth Hormone (bGH) come polyA per la terminazione della trascrizione. Il vettore pTK1A-TPA comprende anche la sequenza nucleotidica della sequenza leader del Tissue Plasminogen Activator (TPA) SEQ ID NO:16
ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCT TCGTTTCGCCCAGC che codifica per la sequenza amminoacidica SEQ ID NO:17 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS.
ESEMPIO 4. Trattamento di topi con il vaccino contro SARS-CoV-2
Con riferimento all?Articolo 170bis CPI, si dichiara che gli studi su organismi geneticamente modificati citati di seguito sono avvenuti all?interno dell?impianto con livello di contenimento BSL2, con ID notifica RM/IC/Imp2/04/001, autorizzato in data 09/04/2015.
Al fine di ottenere una risposta delle cellule B e T contro gli antigeni di interesse ? stata adottata una vaccinazione genetica basata sulla elettroporazione del DNA nei muscoli scheletrici. Questa tecnologia consente di esprimere una sequenza di diversi antigeni opportunamente ingegnerizzati al fine di presentarli al sistema immunitario ed indurre una risposta effettrice contro il virus. Il vettore plasmidico utilizzato, pTK1A o pTK1-TPA, codifica per varianti della proteina S espresse, le cui sequenze amminoacidiche sono state descritte in precedenza.
Il protocollo di vaccinazione consisteva in una iniezione in entrambi i muscoli quadricipite di topi BALB/c o C57/B6 femmina di 6-7 settimane (Envigo, Olanda), il DNA era formulato in Phosphate Buffered Saline (PBS) alla concentrazione di 0,2 mg/ml. La DNA-EP ? stata effettuata con un elettroporatore di tipo Cliniporator IGEA, utilizzando un elettrodo ad aghi (elettrodo A-15-4B). Per la DNA-EP nel muscolo, sono state applicate le seguenti condizioni elettriche:
Condizioni EGT (Electro-Gene-Transfer): bassa tensione (Low Voltage), 8 impulsi di 20 msec ciascuno di 110V, 8Hz, con un intervallo di 120 msec tra ciascuno di essi.
Condizioni ECT (Elettrochemioterapia): alta tensione (High Voltage), 8 impulsi di 100?sec ciascuno di 400V, 5000Hz.
Le condizioni EGT ed ECT sono state usate per paragonare il livello di espressione genica e immunogenicit?, pensando ad una immediata applicazione del Cliniporator che ? gi? disponibile in tutta Europa in modalit? ECT, mentre va adattato per convertirlo in modalit? EGT.
Come controllo dell?espressione genica, ? stato usato un plasmide che esprime la luciferasi (pGL3-Luc, Promega).
Come gruppo di controllo negativo, i topi sono stati iniettati col DNA ma non elettroporati.
A 72 ore dopo il trattamento, come riportato dal grafico e mostrato nell?immagine strumentale, i risultati mostravano la quasi totale assenza di espressione quando il DNA esprimente la luciferasi non veniva elettroporato (1,5 x10^5 p/s), una espressione in media di 1,4x10^7 p/s quando si usavano le condizioni ECT e una espressione 4000 volte superiore quando infine si usavano le condizioni EGT (6x10^8 p/s).
Nell?immagine strumentale (IVIS 200) (vedere figura 4) ? evidente la differenza del segnale di bioluminescenza nei 3 gruppi di animali in cui ? stato iniettato il plasmide esprimente la luciferasi: controllo negativo senza elettroporazione(CTL-), elettroporazione con condizioni ECT ed elettroporazione con condizioni EGT.
ESEMPIO 5. Produzione della proteina RBD-Fc e RBD-6His
Le proteine RBD-Fc e RBD-6xHis sono state prodotte mediante trasfezione transiente delle cellule ad alta densit? Expi293F con il reagente cationico lipidico di trasfezione ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. Il supernatante contenente le proteine ? stato raccolto a distanza di una settimana e sottoposto a chiarifica tramite centrifugazione e filtrazione per i successivi passaggi di purificazione. La proteina RBD-Fc ? stata purificata tramite cromatografia di affinit? all?AktaPure system con colonna di proteina A (TOYOSCREEN AF-RPROTEIN A HC-650F; Tosoh Bioscience). In breve, la colonna ? stata equilibrata con binding buffer (Buffer Phospate 0.1M pH8) e caricata con il supernatante diluito 1:1 con lo stesso buffer. Dopo lavaggio della colonna, la proteina ? stata recuperata tramite eluizione acida in buffer citrato 0.1M pH3, neutralizzata in Tris-HCl pH9 e sottoposta a dialisi in PBS1X con le slide-A-lyzer (Thermo Fisher) secondo quanto indicato dal datasheet del prodotto.
La proteina RBD-6xHIS ? stata purificata tramite cromatografia di affinit? di residui His Tag per metalli immobilizzati all?AktaPure system con colonna HisPur? Ni-NTA Chromatography Cartridges (Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. In breve, la colonna ? stata equilibrata in PBS1X/Imidazolo 5mM e caricata con il supernatante diluito 1:1 con lo stesso buffer. Dopo lavaggio, la proteina ? stata eluita con PBS1X/Imidazolo 0.3M, pH 7.4 e dializzata in PBS1X con le slide-A-lyzer (Thermo Fisher) secondo quanto indicato dal datasheet del prodotto. Una volta recuperate dalla dialisi le proteine RBD-Fc e RBD-6xHis sono state quantificate allo spettrofotometro tramite assorbanza a 280nm (Figure 5 e 6).
La purezza delle proteine ? stata valutata tramite analisi SDS-PAGE e Western Blot, condotta sia in condizioni ridotte che non ridotte e tramite metodiche standard.
ESEMPIO 6. Misura del titolo anticorpale contro la proteina S.
Le piastre ELISA vengono funzionalizzate tramite coating con la proteina RBD-6xHis ad una concentrazione di 1 ug/ml ed incubate 18 ore circa a 4C. Successivamente le piastre sono bloccate con 3%BSA/0,05% Tween-20/PBS per 1 ora a temperatura ambiente e quindi la soluzione in eccesso viene eliminata per rovesciamento. Vengono quindi aggiunti i sieri dei topi immunizzati ad una diluizione di 1/100 e 1/100, in duplicato, e le piastre incubate 2 ore a temperatura ambiente. Dopo un doppio lavaggio con 0,05% Tween-20/PBS, viene aggiunto l?anticorpo secondario anti-murine IgG o anti-murine IgM coniugato con la fosfatasi alcalina e le piastre sono incubate per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un doppio lavaggio con 0,05% Tween-20/PBS, il legame del secondario viene rilevato mediante aggiunta del substrato per la fosfatasi alcalina e misura dell?assorbanza a 405nm tramite lettore ELISA dopo incubazione di 2 ore. E? stata valutata la risposta anticorpale IgM (A) e IgG (B) contro la porzione RBD della proteina S tramite ELISA al giorno 14 dopo il primo trattamento (Figura 7).Inoltre, ? stata effettuata la titolazione degli anticorpi IgG anti-RBD tramite ELISA al giorno 21 dopo il primo trattamento (Figura 8).
ESEMPIO 7. Qualit? degli anticorpi contro la proteina S tramite FACS.
Al fine di confermare la validit? dei vaccini si ? analizzata la capacit? degli anticorpi di legarsi alla proteina spike espressa sulle cellule umane. Cellule 293 sono state trasfettate con il costrutto pNEBAd6-Spike-FL, che ha anch?esso come gli altri gli elementi di regolazione del promotore CMV umano e il bGH come sito di terminazione, e dopo 24 ore sono state incubate con diverse diluizioni dei sieri murini. Un gruppo di topi vaccinati con un costrutto che esprime CEA (antigene Carcino Embrionico) e cellule trasfettate con lo stesso costrutto sono stati usati come controllo positivo dell?esperimento. I risultati mostrano che gli anticorpi riconoscono in modo significativo la proteina S presente sulla superficie delle cellule in tutti i casi analizzati (Fig.9)
ESEMPIO 8. Titolo neutralizzante contro SARS-CoV-2.
Questi studi sono stati eseguiti nel rispetto delle norme vigenti presso l?Istituto Spallanzani di Roma, che per primo in Italia ha isolato il virus SARS-CoV-2 e dispone di strutture autorizzate dal Ministero della Salute BSL-3 e BSL-4 per poter maneggiare il virus, che non ? stato modificato geneticamente e pertanto non rappresenta un OGM.
Per verificare se i sieri degli animali vaccinati possano neutralizzare l?infettivit? del virus SARS-CoV-2, ? stato effettuato un saggio di neutralizzazione. Cellule Vero (10.000 cellule/pozzetto) sono state seminate 24 ore prima dell'infezione in una piastra a 96 pozzetti (Costar). Il giorno dell'infezione, le cellule sono state lavate due volte. I campioni di siero dei topi sono stati incubati a 56 ? C per 30 minuti e quindi diluiti 2 volte in terreno di coltura cellulare. Aliquote (100 ?L) di campioni di siero diluito (da 10 volte a 10240 volte) sono state aggiunte al terreno di coltura cellulare contenente 100 viral particles di nCoV/Italy-INMI1, (virus isolato dall? ospedale Spallanzani di Roma, sequenza depositata in GISAID e GenBank, numeri di accesso MT008022, MT008023, MT066156 and MT077125) su una piastra da 96 pozzetti e incubato a 37 ? C per 30 minuti in CO2 5% vol/vol. La miscela di anticorpi virus ? stata quindi aggiunta alle cellule in piastre da 96 pozzetti e le piastre sono state incubate a 37 ? C con esame microscopico per l'effetto citopatico dopo un'incubazione di 3 giorni. La massima diluizione del siero che ha mostrato attivit? di inibizione del SARS-CoV-2 ? stata registrata come titolo anticorpale neutralizzante. I test sono stati eseguiti in duplicato con campioni di controllo negativo da topi non vaccinati e positivo da un paziente che ha risolto il COVID-19 con un buon titolo neutralizzante.
I risultati preliminari dell?esperimento mostrano che tutti i costrutti hanno indotto la produzione di sieri murini in grado di neutralizzare SARS-CoV-2.
Considerando che i topi sono stati trattati con una singola vaccinazione, che il saggio ? stato eseguito 21 giorni dopo, quando l?affinity maturation ? in corso, i dati sono molto promettenti.
ESEMPIO 9. Somministrazione del vaccino secondo la presente invenzione.
Sulla base della sequenza del Coronavirus che causa una epidemia o una pandemia, viene disegnato il vaccino basato su DNA plasmidico o per PCR. Il vettore viene inviato alla CDMO per la produzione in scala e qualit? GMP. Una volta effettuati i test di rilascio il vaccino COVID-eVax ? inviato all?ospedale che provvede alla vaccinazione con il Cliniporator? oppure altro sistema di elettroporazione o di somministrazione del DNA. Un esempio di trattamento: 1 mg di vaccino formulato in 1 ml di PBS o soluzione fisiologica ? iniettato nel deltoide del paziente dopo anestesia locale e sottoposto ad EP con il Cliniporator? usando un elettrodo N-10-4-B o a geometria variabile. Per la DNA-EP nel muscolo, vengono applicate le seguenti condizioni elettriche a bassa tensione (LV): 8 impulsi di 20 msec ciascuno di 110V, 8Hz, intervallo 120msec tra ciascuno di essi.
Il paziente ? sottoposto a vaccinazione e trattamento dopo 4 settimane per il richiamo e dopo un anno. Biomarcatori dell?avvenuta immunizzazione sono la sieroconversione usando i metodi descritti negli esempi precedenti.
La presente invenzione ? stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.
Claims (25)
1) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica comprendente detto polinucleotide o vettore di espressione in combinazione con uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti, in cui il polinucleotide comprende o consiste in una sequenza scelta tra SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:21, ciascuna codificante per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
2) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1,
in cui il polinucleotide comprende o consiste nella sequenza SEQ ID NO:2 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nei domini NTD e RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
3) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2,
in cui il polinucleotide comprende o consiste nella sequenza SEQ ID NO:3 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nei domini NTD, RBD, CTD2 e CTD3 della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
4) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3,
in cui il polinucleotide comprende o consiste nella sequenza SEQ ID NO:5 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nella proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
5) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1,
in cui il polinucleotide comprende o consiste nella sequenza SEQ ID NO:6 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, detto dominio essendo fuso al sito di trimerizzazione avente sequenza SEQ ID NO:13 mediante il linker avente sequenza SEQ ID NO:14.
6) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5,
in cui il polinucleotide comprende ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze leader come ad esempio l?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), IgK, growth hormone, albumina sierica o fosfatasi alcalina.
7) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6,
in cui il polinucleotide comprende ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT).
8) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1, 6-7,
in cui il polinucleotide comprende o consiste nella sequenza SEQ ID NO:4 che codifica per una sequenza amminoacidica consistente nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, detto dominio essendo fuso all?estremit? N-terminale alla sequenza leader IgK e all?estremit? C-terminale alla sequenza immunomodulatoria Fc.
9) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8,
in cui il polinucleotide comprende ulteriormente una o pi? sequenze codificanti per una o pi? sequenze antigeniche del virus SARS-CoV-2 diverse da quelle della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
10) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9,
in cui detto vettore di espressione ? scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adenoassociated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
11) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in forma di vaccino a DNA, a RNA o proteico.
12) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o composizione farmaceutica come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, per l?uso in campo medico.
13) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica comprendente detto polinucleotide, vettore o sequenza amminoacidica in combinazione con uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti,
in cui detta sequenza amminoacidica comprende o consiste nel dominio RBD della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2, per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia causata dal virus SARS-CoV-2, come ad esempio la polmonite interstiziale.
14) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente uno o pi? domini della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2 scelti dal gruppo che consiste in NTD, CTD2, CTD3.
15) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-14, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui uno o pi? domini della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2 ? fuso a un dominio di trimerizzazione, ad esempio il dominio RBD.
16) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-15, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente una o pi? sequenze antigeniche del virus SARS-CoV-2 diverse da quelle della subunit? S1 della proteina Spike del virus SARS-CoV-2.
17) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-16, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente una o pi? sequenze leader come ad esempio l?attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), IgK, growth hormone, albumina sierica o fosfatasi alcalina.
18) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-17, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detta sequenza amminoacidica comprende ulteriormente una o pi? sequenze amminoacidiche immunomodulatorie, come ad esempio Frammento cristallizzabile (Fc), proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato, la subunit? B della Heat labile Toxin di Escherichia Coli (LTB) o la tossina del tetano (TT).
19) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-18, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui il polinucleotide ? scelto tra un polinucleotide come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
20) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-19, per l?uso secondo la rivendicazione 13,
in cui la sequenza amminoacidica ? scelta nel gruppo che consiste in SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.
21) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-20, per l?uso secondo la rivendicazione 13, come vaccino a DNA, a RNA o proteico.
22) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 21, per l?uso secondo la rivendicazione 13,
in cui quando il vaccino ? un vaccino a DNA o a RNA, detto vaccino ? somministrato per elettroporazione, preferibilmente nelle seguenti condizioni: 8 impulsi di 20 msec ciascuno di 110V, 8Hz, con un intervallo di 120 msec tra ciascuno di essi.
23) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-22, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto vettore di espressione ? scelto nel gruppo che consiste in un plasmide, ad esempio plasmidi batterici, un RNA, un RNA che replica, ampliconi ottenuti da PCR, un vettore virale come ad esempio adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
24) Polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, sequenza amminoacidica codificata da detto polinucleotide, o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-23, per l?uso secondo la rivendicazione 13, detto uso essendo per i mammiferi come ad esempio l?uomo o animali come ad esempio il gatto, cane, cavallo, mucca, topo o ratto.
25) Kit per la prevenzione e il trattamento della malattia causata dal virus SARS-CoV-2, detto kit comprendendo o essendo consistente in: a) un polinucleotide che codifica per una sequenza amminoacidica, un vettore di espressione comprendente detto polinucleotide, o una composizione farmaceutica come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8; e b) un sistema di somministrazione per elettroporazione o altro device per la trasduzione genica in vivo.
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