IT8123207A1

IT8123207A1 - Derivati fluorescenti di composti biologicamente interessanti

Info

Publication number: IT8123207A1
Application number: ITMI1981A023207A
Authority: IT
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-28
Publication date: 1983-01-28
Also published as: CA1160626A; FR2487835A1; JPS5758695A; DE3129705A1; BE889788A; AU554360B2; IT1137630B; SE8104227L; DE3129705C2; FR2487835B1; GB2081257A; IT8123207A0; GB2081257B; AU7203681A

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

DESCRIZIONE ?. J *v

La presente invenzione riguarda in generale composti fluorescenti che si sono rivelati particolarmente utili in una variet? di procedimenti di immunofluorescenza per rivelare e.per determinare quantit? di piccole no lecole interessanti dal punto di vista biologico in fluidi corporei. Tra le sostanze di basso peso molecolare che si desidera rivelare oppure controllare sono comprese sostanze medicinali somministrate a scopo terapeutico, sostanze medicinali aventi un potenziale noto per l'abuso - e diver si altri composti che sono interessanti nella diagnosi di malattie o nel controllo della terapia.

Mentre i composti rivendicati possono venire impiegati in una va riet? di tecniche di immunofluorescenza, essi sono particolarmente utili in un procedimento denominato immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza.Un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza combina la specificit? di un immunosaggio con la velocit? e la praticit? di un metodo omogeneo.Quando un coniugato fluorescente viene collegato a un anticorpo, la luce polarizzata linearmente che viene usata per eccitare il coniugato fluorescente rimane altamente polarizzata all'atto della emissione poich? il fuoroforo?trattenutodal ruotare nel periodo di tempo compreso tra il momento in cui la luce viene adsorbita e il momento in cui la luce viene emessa. D'altro canto, quando il coniugato fuorescente non ? legato da un anticorpo, la sua rotazione ? molto pi? rapida, le molecole sono orien tate pi? con disposizione casuale e la luce emessa ? depolarizzata. Una polimerizzazione di fluorescenza, quindi, realizza una misura diretta del coniugato fluorescente legato e libero in un immunosaggio di legame compe titivo. Il coniugato fluorescente compete per i punti di legame per l'anticorpo con il conposto che interessa nel campione prelevato dal paziente. Quanto pi? elevata ? la concentrazione del composto da misurare, tan to maggiore ? la frazione di coniugato fluorescente non legato da un anti_ corpo e, pertanto, si omette un -gradomaggioredi lucedepolarizzata. La precisa relazione tra la concentrazione dell'analita e la polarizzazione viene stabilita tracciando una curva standard. Si leggono calibratori con quantit? note di analita e si registra la polarizzazione. Quando,si leggo un calibratore non noto, si valuta la sua concentrazione mediante interpolazione tra standard.

Coniugati fluorescenti di derivati di composti di basso peso molecolare non sono unici. Il brevetto U.S.A. 3-998-943 (1976) descrive specificamente la preparazione di insulina marcata con marcatura fluorescente usando fluoresceina isotiocianato (FITC) e morfina marcata con marcatura fluorescente usando cloridrato di d-ararcino-fluoresceina.

I derivati fluorescenti della presente invenzione vengono marcati con dicloro-triazinilammino-fluoresceina che viene comunemente indicata C? me DT?I?. BTAF ? il prodotto della reazione di amminofluoresccina,e di cloruro cianurico. In un articolo di BlakeGlec e altri, Journal of Immunologi cal Ilethods, 13, 305-320, (1976), il DTAF ? stato descritto come un reagen te efficace per coniugare fluoresceina a immunoglobuline (igG) aventi pesi molecolari di almeno 160.000.

La presente invenzione descrive e rivendica l'uso di BTAP per con ferire fluorescenza a un'ampia variet? di composti interessanti dal pun to di vista biologico che, quando vengono marcati, possono essere caratterizzati da.lla formula:

X-

in cui X ? una porzione interessante dal punto di vista <">biologico avente un peso molecolare inferiore a 2000 e avente almeno un sostituente reattivo scelto dal gruppo costituito da un'aramina primaria o secondaria oppure un gruppo ossidrilico mediente il quale esso si collega a un atomo di carbonio dell'anello delle,triazina; e Z ? scelto dal gruppo costituito da 4~? minofluoresceina c da 5-&?rinoiluoresceina collegata, tramite il gruppo 4-amr.inico oppure tramite il gruppo 5~sra^inico, rispettivamente, all'atomo di carbonio numero 2 dell'anello della,triazina.

DTAI<1 >pu? venire preparato facilmente secondo il metodo adottato da Blakeslee e altri (vedi sopra). DTAP Isomero I viene preparato da 5<-smm:>i-<no_ >fluorcsccina; Isomero II viene ottenuto dalla 4<-aram>i<no_>i'lu-oresceina.

La coniugazionedi unoo l<t>altroisomero di DTAP a composti che sono interessantipu?<? >venire effettuata in generale sciogliendo uguali quantit? molari di DTAF e di un composto avente un gruppo amminico attivo (primario oppure secondario oppure un gruppo ossidrilico^in un opportuno solvente per esempio acqua, metanolo, dimetilformammide oppure dimetilsolfossido. Se l<1>ammana reattiva ? un sale, ci aggiunge una base adatta alla miscela di rea zionc per formare la base libera della ammina reattiva. Terminata la reazione, i prodotti coniugati possono venire purificati adottando una cromato grafia su strato sottile oppure una cromatografia su colonna.

I composti biologicamente interessanti impiegati nella presente in venzione devono avere almeno un gruppo amminico primario oppure secondario oppure un gruppo OGsidrilico mediante il quale essi possono reagire con un atomo di carbonio dell'anello della triazina e possono collegarsi ad un a? tono di carbonio dell'anello della triazina. Il gruppo reattivo pu? essere specifico nei composti biologicamente attivi come ? nella chinidina, nella procainammide, nella tiroxina e negli antibiotici amminoglucosidici, oppure pu? venire introdotto nel composto mediante una trasformazione. Tra gli esempi di composti biologici che richiedono la formazione di derivati ammi nici prima che si possano preparare coniugati di BTAF sono compresi teofil lina, acido valproico, fenobarbitale, fenitoina, primidonc, disopiraramide, digoss?na, cloroem<'>fenicolo, aspirina, acetamminofene, carbamazepina, desini primina e nortriptilina.

Tra le strutture che illustrano i composti pi? preferiti della pre sento invenzione sono comprese le seguenti :

8-.?ID.IIKOI-ETILTEOFILLQI.H - DTAF

OH

\

0

COOH

)

?

ACIDO 2 -ET I ??-5-?:?3???0???]????0 ICO - DTAF

CI

V \

/

HO-C V \

\ / /?v

CHCH2CH2CH2NH \

COOH CH3CH2

ACIDO 2-PnDPIL-5-AIffiIINOPtan?AEOICO - DTAF

OH

9 \

NH

// 9 ?

HO-C-CHCH2CH2CH2NH \

COOH

CH2CH2CH3 \

Gli escupi che seguono illustreranno la preparazione di coniugati di DTAF specifici entro 1'ambito della invenzione rivendicata. Da nota re che negli esempi che seguono, DTAF pu? essere un isomero oppure l'altro isomero a meno che non venga,specificamente indicato.

ESEMPIO I

SENTALE C INA - DTAF

Si ? sciolto solfato di gentaraicina (200 mg) in 1 mi di acqua di stillata. Il pH ? stato regolato a 9?0 con circa 0,8 mi di idrossido di so dio 1,0 II. Si ? sciolto DTAF (20 mg) in 1,5 mi <? >di metanolo e lo si ? aggiunto goccia a goccia alla soluzione di gentajnicina sotto agitazione e ci ? lasciato reagire per 1 ora. La miscela di reazione ? stata introdotta in una colonna a maglie medie di-cellulosa DEAI!e il gentamicin-DTAF cos? ottenuto ? stato eluito con tampone fosfato 0,111a pH 8,0.

?5????0 II

TOBRAtJCIMA - DTAF

Si ? sciolta la tobramicina (25? mg) in 2 mi di tampono carbonato, 0,1M, pH 9,0. Si ? sciolto DTAF (20 mg) in un mi di metanolo e si ? aggiun to ad 1 mi della soluzione di tobramicina.Dopo circa 5 minuti, si ? purificata la miscela di reazione introducendola in una colonna di cellulosa DEAE da 20 mi e effettuando la equilibratura con tampono fosfato 0,1 ila pii8,0. Si ? eluito il prodotto di reazione usando il medesimo tampone.

ESEMPIO III

ALIGACUTA - DTAF

Si e sciolta amicucina (24 mg) in 0,2 mi di acqua e si sono posti in sospensione 4,5 mg di DTAF in 0,2 mi di metanolo. La sospensione metan? lice-di DTAF ? stata aggiunta alla soluzione di amicacina sotto agitazione. Le piccole particelle di DTAF 31 cono sciolte rapidamente in modo che la mi scela di reazione non ? stata sottoposta ad agitazione. Dopo 30 minuti, la miscela di reazione ? stata introdotta in una.colonna da 17 mi di eellu Iosa DEAF equilibrata con tampone fosfato pH 8,1,0,1 M. Si ? eluito il prodotto di reazione usando il medesimo tampone.

3SEKPI0 IV

DESETIIr-Ii-ACETIIr-EROCAIIiAtlMIDE - DTAF

Si sono sciolti acido para-acetammidobenzoico (1,79 g) e 1,15 g di li-idrossisuccinimmide in 15 mi di piridina. Quindi, si sono aggiunti e ci sono sciolti 2,3 g di ??,??'-dicicloeDilcarbodiimmide.

La miscela di reazione ? stata raffreddata in un frigorifero per due ore e, quindi, ? stata filtrata. I cristalli sono stati lavati con cir ca 2 mi di acetone. Si ? aggiunta Il-etiletilendiammina (0,88 g) al filtrato piridina-acetone combinato. La miscela ? stata sottoposta ad agitazione per 2 ore e quindi ? stata raffreddata in un frigorifero per circa 24 ore. I cristalli cos? ottenuti sono stati filtrati e sono stati lavati con acetone. I cristalli (2,0 g) sono stati sciolti in 50 mi di acqua distillata c la soluzione e stata regolata a pH 10 con una soluzione di idrossido di sodio 6lT. Un precipitato bianco ? stato filtrato e ? stato essiccato in un essiccatore. Si ? formato il coniugato DTAF sciogliendo uguali quantit? molari di desetil-II-acetilprocainammide e di DTAF in metanolo. Si ? portata a termine la reazione in circa 10 minuti. Si ? effettuata la purificazio ne mediante cromatografia in strato sottile su gel di silice, usando un solvente di sviluppo costituito da cloroformio/acetone (1:1).

ESEMPIO V

iy-p-AGSTAI.II-nDOEENZOILUTILSl'.IDIAIJJM - DTAF

Si ? ripetuto il procedimento dell'Esempio XV usando 0,9 g di etilendiammina inevece di IT-etiletilendiammina. Si ? sottoposta ad agitazione la miscela di reazione per 1 ora c la si ? raffreddata per 1 ora e mezza. Si ? filtrato il precipitato e lo si ? lavato con acetone. Si ? preparato il coniugato DTAF uguale a quello descritto nell'Esempio IV, ma si ? usato metanolo come solvente di sviluppo.

A-

ESEIIPIO VI

IT-r-ACETAI???????????IL???-?<1>-ETIL-IT<1>-??-?.??????????????????????^???-???]?<1 >Si sono sciolti desetil-K-acctil procainammide (lj25 g) ottenuta nell'Ssempio IV e 0,8 g di cloroacotilcloruro in 25 ni di acetone e si?po sto sotto riflusso per 2 ore. Dopo riflusso, la miscela ? stata filtrata e il filtrato ? stato evaporato a secco. Il residuo giallo ottenuto dal fil trato e 0,75 S di ioduro di sodio sono stati sciolti in 20 mi di acetone e sono stati posti sotto riflusso por 1 ora. La soluzione ? stata filtrata e il filtrato ? stato evaporato a socco. Il residuo rosso ? stato sciolto in 20 mi di metanolo. Si ? aggiunto idrossido di ammonio concentrato (20 ni) alla soluzione^che ? stata posta sotto riflusso per 1 ora e mezza. Dopo raffreddamento, si ? estratta la miscela due volte con 20 mi di cloroformio. Gli estratti riuniti sono stati essiccati su solfato di sodio, sono stati filtrati e sono sts.ti evaporati. Il coniugato DTAi<1 >? stato prepara/fco in modo uguale a quello descritto nell'Esempio IV e ? stato purificato mediante cromatografia su strato sottile (cloroformio/acetone (l:l)).

SSEIPIO VII

AI-iniIO-PRII-HDOlE - DIA?

Si ? sciolto il primidone (1,1 g) in 10 mi di acido solforico con centrato. Si ? aggiunta un?altra soluzione di 1 mi di un acido nitrico con centrato e di 2 mi di acido solforico concentrato alla miscela di reazione, lentamente, senza raffreddamento. Si ? quindi sottoposta a sbattimento la miscela a temperatura ambiente per 45 minuti e si ? versata la miscela di reazione su 5^ mi di ghiaccio e i cristalli di para-nitro-primidone sono stati filtrati e sono stati lavati con acqua. I cristalli (1,17 g) t pun to di fusione 225?-228?C sono stati sciolti in 200 mi di etanolo caldo. Si sono aggiunti polvere di ferro (1,5 g) <e >100 mi di acqua. La miscela ? sta ta riscaldata all'ebollizione, si sono aggiunti 2 mi di acido cloridrico concentrato e si ? posta sotto riflusso la miscela per 2 ore. La miscela calda ? stata filtrato,e il filtrato ? stato evaporato a secco. Il residuo ? stato sciolto in etanolo al 100<:>/J ed ? stato fatto precipitare aggiungendo dietiletere. Si ? filtrato.il precipitato ottenendo cos? 0,8 g di cristalli igroscopici bruni. Si ? preparato il coniugato DTAF sciogliendo 5 rag di DTAF e 5 mgdei cristalli bruni in 0,5 mi di metanolo. La reazione ? sta ta completata in 10 minuti e il prodotto coniugato ? stato purificato mediante cromatografia in strato sottile su gel di silice usando cloroformio/me tanolo (3:1) come solvente di sviluppo. Si ? effettuata la purificazione finale mediante cromatografia su strato sottile usando cloroformio/metanolo (2: 1 ) .

ESEIIPIO Vili

ACIDO 2-1JI<1>IL?? 5-AI-SHNO-Hffi!TAJJQICO - STA? <?>

Si ? scioltoHelta 5-valerolattarne (7,5 g) in 60 mi di tetraidrofurano anidro, cotto atmosfera di azoto anidro e si ? introdotto n-outidillio (l,6li, 90 mi) in esano, goccia a goccia, nel pallone di reazione e si ? raffreddato con un <">bagno di ghiaccio secco-acetone. Dopo che ? stato aggiunto tutto il n-butillitio, la miscela di reazione?? stata sottoposta ad agitazione a temperatura ambiente per 1 ora, ? stata posta sotto riflusso per 30 minuti od c stata raffreddata a temperatura ambiente (ancora sotto atmosfera di azoto anidro). Si ? introdotto 1-bromoetano (8,0 g) len temente nel pallone di reazione raffreddando il pallone di reazione in un bagno di ghiaccio. Si ? quindi sottoposta ad agitazione la miscela per 16 ore a temperatura ambiente e quindi ci sono aggiunti lentamente 100 mi di acqua. Questa miscela ? stata sottoposta ad agitazione a temperatura arabien tc per 30 minuti e lo strato organico ? stato separato. Lo strato acquoso ? stato estratto con 50 mi di dietiletere e gli strati organici riuniti sono stati essiccati su solfato di sodio. Si ? evaporato il solvente ottenendo cos? un olio scuro che, lasciato a se, ? cristallizzato ?d ? stato rieri stallizzato da etere di petrolio ottenendo cos? 3,8 g di prodotto. Questo prodotto (2,8 g) ? stato posto sotto riflusso in 25 mi di acido cloridrico 6li per 6 ore. L'acqua ? stata evaporata ottenendo un olio denso, scuro. Il coniugato DTAF ? stato ottenuto sciogliendo quantit? equimolari di acido 2-etil-5-amnino-pentanoico e di ET?? in metanolo. La reazione ? stata com pletata in circa 10 minuti. Il prodotto ? stato purificato mediante cromatografia in strato sottile su gel di silice con clorofoncio/metanolo (3:1) come solvente di sviluppo.

ESEMPIO x

B-TIROXINA - mas?

Si ? sciolto ETAE (5 mg) in 0,5 mi di metanolo. Si sono aggiunti 5 mg di E-tiro;aLna e quindi si ? aggiunto dimetilsolfocsido goccia a goccia fino a che si ? formata una soluzione limpida. Si sono aggiunte due goc. ce di trietilammina e il coniugato si ? formato dopo circa 16 ore. Si ? pu rificato il prodotto mediante cromatografia in strato sottile su gel eli si_ lice usando cloroformio/metanolo (3:1) come solvente di sviluppo.

ESEMPIO XI

L-TIR0XIHA DTAP

\ 0 ?4V

Si ? preparato questo coniugato seguendo il procedimento dell'E-sempio X, ma sostituendovi L-tiro::ina.

ESEMPIO XII

3 ,3<1 >^-TRIIOBO-Ir-TlIiOHIM ????

Si ? preparato questo coniugato seguendo il procedimento dell'E-sempio X,ma sostituendovi 3,3',5~triiodo-L-tironina.

ESEMPIO XIII

5-ALI-INO-EIBSHZQQICLOEPTANO - DTAF

Si sono sciolti in 50 mi di metanolo: 8,00 g di acetato di ammonio, 630 mg di cianoboroidruro di sodio, e 2,10 g di 10,1l-diidro-pH-dibenzo

l a, d_/ cicloepten-p-one. La soluzione ? stata posta sotto riflusso per 24 ore e quindi ? stata evaporata a secco. E<1 >rimasto un residuo di colore marrone che ? stato sciolto in 25 mi di acido cloridrico 2?? ed ? stato e? stratto due volto con 25 mi di diclorometano. Si ? aggiunto idrossido di co dio 6lT alla fase acquosa fino a che il pH ha raggiunto 14? Ha iniziato a formarsi un olio bruno e la soluzione ? stata raffreddata in un frigorifero per 16 ore. Tutta,l'acqua ? stata evaporata e il residuo ? stato ripreso in metanolo efiltrato.Ilfiltrato?stato evaporato ottenendocos?unresiduobianco* Si c preparato il coniugato DTAP sciogliendo quantit? equimolari di DTAF e del residuo bianco in metanolo. Si ? purificato il prodotto mediante cromatografia in strato sottile cu gel di silice usando cloroformio/acctone (1:1) cono solvente di sviluppo.

ESEMPIO XIV

7) ??????0 SUBEEOHE IDRAZOME - DTAE

Si sono posti sotto riflusso il 10 , 11-diidro-5H-dibe2izo J_ a, ciclocpten-5-one (10 r) e 18 [<? >di dimctilidrazina por 24 ore in etanolo al 100/?. Si sono aggiunti 100 ni di acqua distillata e si ? estratta la solu zione gialla con dietiletere fino a che gli estratti erano incolori. Gli estratti eterei riuniti cono stati lavati con 25 mi di acido cloridrico 2N. La face organica ? stata quindi essiccata su solfato di sodio ed ? stata evaporata. Il residuo era un olio denso di colore arancione, ossia il diben zosuberone dimetilidrazone. Questo prodotto (2,0 g) ? stato posto sotto riflusso per 12 ore con 3 g di idrazina in 10 ni di etanolo al100/?. La ni scela di reazione ? stata versata su 10 mi di acqua e ghiaccio, quindi ? stata estratta due volte con 25 mi di dietiletere. Gli estratti eterei riu niti sono stati anidrificati su solfato di sodio e sono stati evaporati a secco ottenendo cos? un olio giallo, ossia il dibenzosuberone idrazone. Si ? preparato il coniugato PTA? come descritto nell*Esempio XIII5 ma usando cloroformio/mctanolo (3:1) come solvente di sviluppo.

ESTIJFIO XV

5-( gama-miNDPSOPILIDENE )-5H-DIBEHZ0-l a , ?J- 10 , 11 -DIH!HO-CIGLOKPmiE-DTAF

Si sono preparati il p-( gamia-bromo pr? pi li dcne )-5H-dibcnzo _/ a,d_/-10.11-diidro-cicloeptene c il suo precursore 5<_>ciclopropil-5"idrossi-<,>5H-di benzo j~ a,d_/-10,11-diidrocicloepteno mediante il procedimento descritto in Journal Orgenie Chemistry, Voi. 27, pag. 4134 - 4137 (19^2) da R.D. Hoffsomcr, D. Taub, e li.L.bendier. Si ? seguito il procedimento (b) per la prepa razione del prodotto finale, 5~(summa-bromopropilidene)?5H-dibenzo ^/~a,d_/? 10.11-diidrocicloeptene, impiegando il bromo-propiliden-derivato al posto del cloro-propilidcn-derivato. Si ? preparato il coniugato DTAF sciogliendo quantit? equimolari di ???? e della ammina in metanolo. Si ? aggiunto una quantit? in eccesso di trietilammina c si ? terminata la reazione in 30 mi nuti. Si ? purificato il prodotto di reazione mediante cromatografia in stra to sottile su gel di silice usando cloroformio/metanolo (2:1) come solvente di sviluppo.

ESEMPIO XVI

H-ALnUMOAGaTILIMIINOSTIIuBSME - PTAF

Si ? sciolto imminodibenzile (6,0 g) in 30 mi di cloroformio. Si ? aggiunto cloroacetilcloruro (6 mi) c si ? posta sotto riflusso la miscela per 45 minuti. Si ? aggiunto,acqua (60 mi) e si ? sottoposta ad agitazione la miscela por 30 minuti a temperatura ambiente. Si ? separato lo strato cloroformico c lo si ? essiccato su solfato di sodio e lo si ? evaporato a secco. Si ? sciolto il residuo in 25 mi di acetone e si ? aggiunta una solu zione di 4*5 E di ioduro di sodio sciolti in 25 mi di acetone. Si ? posta sotto riflusso questa miscela per 30 minuti, si sono aggiunti 100 mi di acqua e si ? estratto il prodotto di reazione due volte con 50 mi di cloroformio e lo si ? evaporato a secco. Si ? sciolto il residuo in 40 mi di metanolo. Si ? quindi aggiunto idrossido di ammonio concentrato (60 mi) o si ? posta sotto riflusso la miscela per 1 ora. Si ? evaporata la soluzione fi no a secco e si ? ripreso il residuo in 100 mi di cloroformio e si ? lavato due volte con 30 mi di acido cloridrico 2?J. Si ? essiccata la fase organica su solfato di sodio e la si ? evaporata a secco. Si ? preparato il coniugato ???? sciogliendo 5 nu;di DTAF e 5 della ammina in 0,5 mi di metanolo. Il coniugato ci ? formato in 10 minuti ed ? stato purificato adottando il medesimo procedimento dell'Esempio XIII.

*

ESEMPIO XVII

N-AJ.IT Ziro ACETI LDX3 IPRAIGCHA-DTAF

Si sono sciolti cloridrato di desipramina (1,33 g) e 0,80 g di cloroacctilcloruro in 25 mi di cloroformio. Si ? posto sotto riflusso per 2 ore, quindi si ? e\raporato il cloroformio. Si ? sciolto il residuo in 25 mi di acetone. Si ? aggiunto ioduro di sodio (0,75 g) e si ? posta sotto riflusso la soluzione per 30 minuti. Si ? filtrata la soluzione e si ? lava io il sale precipitato con acetone. Si ? evaporato il filtrato acetonico e si ? ripreso il residuo in 20 mi di metanolo. Si ? aggiunto idrossido di aa monio concentrato (20 mi) e si ? posta sotto riflusso la soluzione per 1ora, si? estratta la miscela di reazione tre volte con 25midi cloroformiosisono riuniti gli estratti, si sono essiccati su solfato di sodio, si sono filtra ti e evaporati. Si ? preparato il coniugato sciogliendo 5 mg di DTAP e 5 mg della ammina in 0,5 mi di mete-nolo. Si sono aggiunti circa 5 gocce di dinetilsolfossido per sciogliere il precipitato. La reazione ? stata completata in 10 minuti e ci ? effettuata la purificazione adottando il procedimento dell?Esempio XIII usando cloroformio/netanolo (3:1) come solvente di sviluppo ,

ESEMPIO XVIII

8-AIIITiroi??IL-T5QFILUNA - DTAF .

Si sono sciolti DTAF (10 mg) o 8-armainoraetil-tcofillina (5 rag) in 0,5 mi di trimetilsolfossido. Dopo 5 minuti In reazione era completa e si ? purificato il coniugato mediante cromatografia in strato sottile su gel di silice, usando cloroformio/acetone (1:1) come solvente di sviluppo.

ESEMPIO XIX

*tr <?>A

8-???-??'???'??L-TSO?ILLINA -_ DTAP

Si ? adottato il medesimo procedimento dell'Esempio XVIII impiegando 8-amminoetil?teofiliina al posto del metil?derivato.

ESEIIPIO XX

CHINIDIITA - DTAF

Si sono sciolti DTAB<1 >(5 mg) e chinidina anidrs,(5 mg) in 0,5 mi di dimetilformammide. Uopo lo ore la reazione era terminata e si ? puri ficato il coniugato mediante cromatografia in strato sottile su gel di si_ lice, usando cloroformio/metanolo (3:1) come solvente di sviluppo.

Come indicato sopra, i traccianti marcati mediante fluorescenza preparati secondo la presente invenzione possono venire usati in una variet? di procedimenti di immunosaggio. I saggi che seguono vengono, descritti per dimostrare la idoneit? della campionatura rappresentativa di questi tracciatori in saggi di polariazazione di fluorescenza.

In tutti gli esempi si ? seguito il medesimo protocollo fondanen tale:

1) Un piccolo volume di. siero standard oppure di siero in esame viene introdotto in un tuboda saggio e viene diluito con un tampone;

2) Un piccolo volume di un tracciatore fluorescente concentrato contenente un agente tensioattivo viene quindi?introdotto in ciascun tulio da saggio;

3) Da ultimo, si aggiunge un volume di antisiero diluito; e 4) Si sottopone a incubazione la miscela di reazione a temperatura ambiente.

ESEIIPIO XXI

tu * \V

SAGGIO CON ACIDO VALPROICO - CONIUGATO DTAF -ACIDO 2 STIL-^-AiamiQ-PEIITAITOICO

Sostanze necessarie :

1) Tampone: fosfato 0,111, pH 7,5, contenente 0,01/3 (p/v) di sodio a,zide e 0,01$ (p/v) di gammatio?oulina di<' >bue (BGG).

2) Tracciatore: coniugato DTADJ/acido 2-otil-5?anunino-pentanoico 50 x 10 ' H in tampone cloridrato tris 0,1K, pH 7*8, contenente 0,1$ (p/v) di dodeciIsoliato sodico, 0,01$ (p/v) di gammaglobulina di bue e 0,01$ (PA) di sodio azide.

3) Anticorpo: anticiero di pecora per acido valproico diluito 1:3,75 in tampone.

4) Standard oppure prodotti non noti: siero umano (oppure un altro fluido biologico) contenente acido valproico nell'intervallo di concentrazione compresa tra 0 e 150 mierogrammi/mi.

5) Polarimetro di fluorescenza: strumento capace di leggere la,po _o larizzazionc di fluorescenza di una soluzione di fluoresceina 1 x 10 ^ Il finoa ? 0,001 unit? di polarizzazione.

Protocollo :

1) 0,75 microlitri di un campione standard o di un campione non no to poeti in un tubo da coltura (vaschetta) a perdere da 12 x 75 nm. Si effettua ci? pipcttando 20 microlitri di standard oppure di campione non noto in un recipiente di prediluizione e aggiungendo quindi 5^0 microlitri di tampone. Successivamente, ci pipettano 20 microlitri del campione diluito nel tubo da coltura da 12 x 75 e si aggiungono quindi 400 microlitri di tam pone.

2) Nella vaschetta si introducono 40 microlitri di tracciatore e 800 microlitri di tampone.

3) Nella vaschetta si introducono 40 microlitri di antisiero e 800 microlitri di tampone. Il contenuto della vaschetta viene mescolato e viene sottoposto a incubasione per 15 minuti a temperatura ambiente.

4) Si legge la polarizzazione di fluorescenza. Risultati tipici so no presentati nella Tabella I.

TABELLA.I

Concentrazione di acido valproico (.micromrgmmi/ml) Polarizzazione

0 0,217 12,5 0,186

25 0, 165

50 0,132

100 0,099

150 0,081

La polarizzazione varia in nodo regolare al variare d.ella concen trazione di acido valproico consentendo di tracciare una curva standard. I campioni non noti vengono trattati in modo identico; dalla polarizzazione di fluorescenza del campione non noto, si pu? determinare la concentrazione di acido valproico nel campione non noto riferendosi alla curva standard.

ESEHPIO XXII SAGGIO DELLA GENTAHICINA

Sostanze

1) Tanpone: (vedi saggio dell'acido valproico)

2) Tracciatore: gentamicin-DTAJ<1 >a 100nM in un tampone cloridrato ? \>=

tris pH 7,5 contenente 0,125?/<j >di dodecilsolfato di sodio, 0,01yw di sodio aside e 0,01/S di gammaglobulina di bue.

3) Anticorpo: antisiero di coniglio o di pecora verso la gentamicina opportunamente diluito in un tampone. <~>

4) Standard oppure prodotti non noti: siero umano (oppure altro fluido biologico) contenente gchtamicina.

5) Polarimetro di fluorescenza: (vedi saggio dell'acido valproico). Protocollo:

1) Si introducono 1,8 microlitri di standard oppure di campione non noto in un tubo da coltura a perdere da 12 r 75 ^ (vaschetta). S? effettua ci? pinettando 20 microlitri di campione e successivamente 200 microlitri di tampone. Si pipettano quindi 20 microlitri di campione diluito nella vaschetta e si pipettano quindi nella vaschetta 200 microlitri di tampone.

2) 40 microlitri 6.1 un tracciatore e 1000 microlitri di tampone vengono introdotti nella,vaschetta,

3) 40 microlitri di anticorpo e 1000 microlitri di tampone vengono aggiunti, il contenuto della vaschetta viene mescolato e viene sottopo sto a.incubazione per circa 1p minuti a temperatura ambiente.

4) La polarizzazione di fluorescenza viene letta dopo la incubazione. Risultati tipici sono presentati nella Tabella II.

tu?vv

TABELLA.II

Concentrazione di <?>ontanicina nierogrammi/mi 1 Polarizzazione 0 0,178 o,5 ?0,158 1.0 0,140 2.0 0,115 4.0 0,050 0,o 0,074 La polarizzazione varia in nodo regolare consontendo di tracciare una curva standard. Campioni non noti vengono esaminati in nodo ideiitico e si determina il contenuto di gentamicina riferendosi alla curva standard. L'utilit? del tracciatore gentamicina-BTAF per determinare la concentrasi^ nc di gentanicina in campioni biologici viene cos? illustrata.

ESEIIPIO :KIII

SAGGIO pi IT-ACSTIL PROCAINAI-HIHIE

Sostanze necessarie:

1) Tampone: (vedi saggio dell'acido valproico)

2) Tracciatore:coniugatoDTAF/desetil-?I-<acetil procainanmide _o

ad una concentrazione di jj ?? TO ' M in una soluzione al 5J75$ (p/v) di tolucnsolfonato di sodio.

3) Antisiero: antisiero di coniglio verso la IT-acctilprocainammide diluita.1 a 6 in tampone.

4) Standard oppure campioni non noti: siero umano (oppure un altro fluido biologico).

5) Poiariractro di fluorescenza:(vedi saggio dell'acido valproico).

Protocollo : O

1) Si introducono 0,48 microlitri di standard oppure di campione non noto in una vaschetta pipcttando 10 microlitri di campione in un recipiente di pre-diluizione c mescolando con 200 microlitri di tampone. Quindi, si pipcttano 10 microlitri di campione diluito nella vaschetta e si pi_ pattano quindi 200 microlitri di tampone.

2) 40 microlitri di -tracciatore e 1000 microlitri di tampone vengono introdotti nella vaschetta.

3) 40 microlitri di antisicro e 1000 microlitri di tampone vengono successivamente aggiunti nella vaschetta. Il contenuto della vaschetta viene mescolato e viene sottoposto a incubazione a temperatura ambiente per cir ca 15 minuti.

3) La polarizzazione di fluorescenza viene letta dopo il periodo di incubazione di 15 minuti. Risultati tipici per la N-acetil?procainanuaidc sono rappresentati nella Tabella III.

TABELLA III

l'T-aoctil procainammide (raicro grammi /mi) Polarizzazione 0 0,239 1 0,218 2 0,209 4 0,190 8 0,173 16 0,158 Si pu? tracciare una curva standard dai dati della Tabella III. Campioni non noti trattati in modo identico agli standard possono venire

Claims

RIVENDICAZIONI

1 - Composto fluorescente di formula :

ri

in cui X ? una porzione interessante dal punto di vista "biologico, avente un peso molecolare inferiore a 2000 e un sostituente reattivo scelto dal gruppo costituito da un'asinina primaria o secondaria oppure da un gruppo o_s sidrilico mediante il quale esso si collega,a un atomo di carbonio dell'anello della, triazina; c Z ? scelto dal gruppo costituito da 4-cnninofluore scciua e da 5-?????????luorssceina collegato tramite il gruppo 4?animino oppure tramite il gruppo 5-ammino9 rispettivamente all'a/tono di carbonio nu mero 2 dell'anello della triazina.

2 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? un antibiotico costituito da un amminoglicoside.

3 - Composto secondo la rivendicazione 2 in cui l'amrainoglicoside ? gentamicina.

4 - Composto secondo la rivendicazione 2 in cui.1'anminoglicosidc ? tobramicina.

5 - Composto secondo la rivendicazione 2 in cui 1'araninoglicoside ? ajiiicacina.

6 - Comoosto secondo la rivendicazione in cui X ? anmino-ieno barrii; clic.

7 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? deseti1-IT-ace ti1pr?cainammide.

8 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? N-para-acetam midobcnzoil etilendiammina.

9 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? li?acetanmidobenzoi1-Il<1>-ctil-K<1>-amminoacctiletilendiammina.

10 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? para-amminopri maone .

11- Composto secondo la rivendicazione in cui X ? acido 2-etil-5-a;nninopentanoico .

12 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? D-tiro:-:ina. 13 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? Ir-ti rovina, 14 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? acido 2-propil-5-3-nminopentanoico.

15 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? 3?3<1 >?5-???? do-L-tironina.

16 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? 2-(2-amminoji til)-5,5-difenil idantoina.

17 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? 8-amminometilteofillina.

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13 - Composto secondo la rivendicazione 1 in cui X ? 8-(2-arminoetil) tcofillina.

19 - Composto sccondo/'-3va rivendicazione 1 in cui X ? chinidina.

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(Pietro MG