IT8222784A1

IT8222784A1 - Processo per la preparazione di derivati dell'insulina

Info

Publication number: IT8222784A1
Application number: ITMI1982A022784A
Authority: IT
Original assignee: Novo Ind A/S
Priority date: 1981-08-10
Filing date: 1982-08-09
Publication date: 1984-02-09
Also published as: AU549066B2; AU8697482A; ES8306181A1; FI79142B; NO157506C; BE894070A; IT1152492B; DE3229674A1; GB2105342A; GB2105342B; FR2511036A1; CH661746A5; FI822773L; FI822773A0; IE53712B1; JPS5836399A; NO822704L; LU84327A1; SE451073B; ATA303582A

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

"PROCESSO PER LA PREPARAZIONE DI DERIVATI DELL'INSULINA"

R IA S SU N T O

La resa di derivati di treonina dell 'insulina umana quando si amida la des(Ala )-insulina con un derivato di L-treonina in una miscela di acqua e di un solvente organico miscibi le con acqua in presenza di tripsina viene aumentata sostanzialmente quando il contenuto di acqua nella miscela di reazione ? compreso tra 30 e 10$.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

La presente,invenzione riguarda un processo per la preparazione di insulina umana.

Processi diversi per la preparazione di insulina umana sono noti. Esempi di tali processi sono, inter alia, l'estrazione da ghiandole pancreatiche umane, la sintesi dagli aminoacidi costituenti, processi di ingegneria genetica e la conversione di insulina di porco in insulina umana. Alcuni dei processi per trasformare l?insulina di porco in insulina umana procedono attraverso la des-ottapeptide-(B23-B30)-insulina e alcuni procedono attraverso la des(Ala )-insu lina.

In particolare la presente invenzione riguarda la conversione della des(Ala )-insulina porcina in insulina umana -n-50

attraverso un derivato di treonina dell'insulina umana. Nel trattamento del diabete mellito le preparazioni di insulina derivate da insulina porcina o bovina sono state generalmente usate. Le insuline bovina, porcina e umana pre sentano piccole differenze rispetto alla loro composizione di aminoacidi, la differenza tra l'insulina umana e porcina essendo limitata ad un unico aminoacido nel senso che l'ammi noacido B30 dell*insulina umana b treonina mentre quello dell'insulina porcina b alanina.

Un processo per preparare insulina umana da des(AlaB^?)-insu lina ? stato descritto nella domanda di brevetto europeo n. 80.101.966,vide anche Nature 280 (1979)? 412. Secondo tale domanda di brevetto l'amidazione viene effettuata preferibilmente in un mezzo che contiene da 0 a 65$, preferibilmente da 40 a 60$, di solvente organico. Inoltre la temperatura di rea zione preferita ? compresa tra 20 e 40?G, la temperatura di 37?G essendo usata in tutti gli esempi. La resa dell'accoppia mento, secondi i tre esempi, ? stata determinata mediante HPLC (high pressure liquid chromatography) nel senso di 75, 80 e circa 50$. Secondo la pubblicazione su Nature la resa era del

Un ulteriore processo per la preparazione di insulina umana da des(Ala )-insulina ? stata descritto in Proceedings of th? 2nd International Insulina Symposium, Aachen, Repubblica Federale di Germania, 1979? Secondo tale pubblicazione l'amidazione ? stata effettuata in?un mezzo contenente circa 60$ di solvente organico e la reazione h stata effettuata a 38?0. La resa dell?accoppiamento ? stata determinata in 67$ mediante HPLC.

Un altro processo ancora per la preparazione di insulina umana B"?0

da des(Ala )-insulina ? stata descritto in Proceedings of th? 16th European Peptide Symposium, Helsingfrfr, Danimarca, 1980. Secondo tale pubblicazione il processo ? stato effettua to in un mezzo contenente circa 60$ di solvente organico. Probabilmente la temperatura di reazione era di 37?C. Dopo un tempo di reazione di 30 minuti la resa era di 85$, ma la resa risultava diminuita a 70$ dopo 22 ore.

Uno dei motivi per le inferiori rese dovute ai processi noti ? la perdita di insulina in conseguenza di reazioni secondarie indesiderate, per esempio la formazione di D0I-Thr(R )-0R , dove DOI rappresenta la des-ottapeptide-(B23-B30)-insulina por-1 2

cina e R e R sono come descritti in seguito.

Lo scopo della presente invenzione era quello di trovare un processo mediante il quale la resa di prodotto di reazione fosse estremamente elevata, preferibilmente superiore al 90$.

E* stato ora trovato sorprendentemente che una resa cos? elevata ? ottenibile mediante l'impiego di una concentrazione di acqua nella miscela di reazione molto inferiore rispetto ai processi noti e inoltre che ? preferito effettuare il processo ad una temperatura di reazione sostanziai^ mente inferiore rispetto a quella dei processi noti.

Il processo secondo la presente invenzione comprende la reazione di des(Ala )?insulina oppure di un sale o complesso di essa con un derivato di L-treonina della formula generale I

Thr(R2)-0R1 I dove R^ rappresenta un gruppo protettore del carbossile e 2

R rappresenta idrogeno oppure un gruppo protettore dello idrossile oppure un suo sale in una miscela di acqua, un sol_ vente organico miscibile con acqua e tripsina, dove il contenuto di acqua nella miscela di reazione ? compreso fra 30 e 10$. La temperatura di reazione preferita ? compresa tra circa 0?C e la temperatura ambiente, cio? circa 25-20?C.

Il processo secondo la presente invenzione pu? essere effettua to sciogliendo des(Ala^ ^)-?nsulina, un derivato di L-treonina della formula I e tripsina in una miscela di acqua e almeno un solvente organico idromiseitile, eventualmente in presenza di un acido.

I solventi organici adatti per realizzare la presente invenzione sono solventi polari che sono miscibili con acqua e preferibilmente tali da essere in grado di contenere ivi elevate concentrazioni di composti insulinici e di estere treoninico. Esempi di tali solventi organici adatti sono solventi aprotici come ?,?-dimetilformamide, N,N-dimetilacetamide, N-metilpirrolidone, esametilfosforotriamide, dimetilsolf ossido, diossano, acetone, tetraidrofurano, for mamide e acetonitrile, e solventi protici come etanolo, me_ tanolo, 2-propanolo e 1,2-etandiolo. La natura del solvente influenza il sistema nel suo insieme e le correlazioni adatte per un solvente che produce .un?elevata resa di amidazioni possono non valere con un solvente diverso. I migliori risul tati di rendimento sono stati ottenuti con solventi aprotici e i solventi aprotici sono i pi? preferiti per la pratica della presente invenzione.

Dipendentemente da quale solvente organico miscibile con acqua venga usato, dalla temperatura di reazione scelta e da!L la presenza di un acido nella miscela di reazione, il contenuto di acqua nella miscela di reazione deve essere inferiore a circa 30$ (v/v), preferibilmente inferiore a circa 25$ (v/v), e pi? di circa 10$ (v/v), preferibilmente superiore a circa 15 (v/v)..

Un vantaggio della diminuzione della quantit? di acqua nella miscela di reazione ? che in tal modo si diminuisce la formazione di sottoprodotti. Analogamente, aumentando la quantit? di acido nella miscela di reazione ? possibile diminuire la formazione di sottoprodotti. L'aumento di resa ? correlato positivamente con un basso contenuto di acqua nella miscela di reazione. Allo scopo di impedire la denaturazione del l'enzima nella miscela di reazione con un basso contenuto di ac qua, la temperatura di reazione deve essere preferibilmente sostanzialmente inferiore alle temperature di reazione tradizionalmente usate nella sintesi dei peptidi con tripsina, cio? inferiore a circa 37$.

Il tipo di tripsina non ? importante per la pratica della presente invenzione. La tripsina ? un enzima ben caratterizzato che ? reperibile in commercio in condizioni di elevata purezza, soprattutto da fonti bovine e porcine. Inoltre si pu? usare tripsina di origine microbica. Inoltre la forma della tripsji na, per esempio tripsina cristallina (forma solubile), tripsina immobilizzata o anche derivati di tripsina (purch? l'attivit? tripsinica venga mantenuta) non sono importanti per la realizzazione pratica della presente invenzione. Il termine tripsina nel senso qui usato vuole includere le tripsine che provengono da tutte le sorgenti e tutte le forme di tripsina che mantengono l'attivit? di amidazione, comprese le proteasi con specificit? tripsinosimile, cio? per esempio protessi di Achromobacter lyticus, vedi Agric.Biol, Chem. 42, 1443.

Come esempi di derivati con attivit? tripsinica si possono citare la tripsina acetilata, la tripsina succinilata, la tripsina trattata con aldeide glutarica e i derivati tripsinici immobilizzati. Se una tripsina immobilizzata viene usata essa b sospesa nel mez zo.

Acidi organici o inorganici come acido cloridrico, acido formico, acido acetico, acido propionico e acido butirrico e/o basi come piridina, TRIS, N-metilmorfolina e N-etilmorfolina si possono aggiungere per realizzare un adatto sistema tampone. Sono preferiti gli acidi organici. Tuttavia la reazione pu? essere effettuata senza tali aggiunte. La quantit? di acido aggiunta b normalmente inferiore a circa 10 equivalenti per equivalente di derivato di L-treonina di formula I. Preferibilmente la quantit? di acido b compresa tra 0,5 e 5 equivalenti per equivalente di L-treonina della formula I, Gli ioni che stabilizzano la tripsina come gli ioni calcio possono essere aggiunti.

Il processo pu? essere effettuato ad una temperatura nell'intervallo tra 37?0 e punto di ebollizione della miscela di reazione. Le reazioni enzimatiche con tripsina vengono effettuata normal^ mente a circa 37?C allo scopo di fornire una velocit? di reazione sufficiente. Tuttavia allo scopo di evitare l'inattivazione della tripsina ? vantaggioso effettuare il processo secondo la presente invenzione ad una temperatura inferiore a quella ambientale.

In pratica sono preferite temperature di reazione superiori a circa 0?C.

Il tempo di reazione ? normalmente tra poche ore e pochi giorni, dipendentemente dalla temperatura di reazione, dalla quan tit? di tripsina aggiunta e da altre condizioni di reazione. In misura elevata l'azione della tripsina ? controllata da una correlazione tra acqua e contenuto di solvente, il rapporto acido/base e la temperatura di reazione in modo da favorire la sua azione di amidazione e da sopprimere le reazioni laterali indesiderate catalizzate da tripsina. Diminuendo la concentrazione di acqua nella miscela di reazione si effettuano entrambi i fenomeni,ma si aumenta anche la velocit? con la qua le avviene la denaturazione irreversibile della tripsina. Tut tavia quest*ultima pu? essere almeno parzialmente contrastata diminuendo la temperatura di reazione. Riducendo la temperatura di reazione si riduce anche la velocit? di ammidazione, ma tale riduzione ? compensata dall'aumento del tempo di reazione. Il rapporto ponderale tra tripsina e des(Ala )-insulina nella miscela di reazione ? normalmente superiore a circa 1:200, preferibilmente superiore a circa 1:50 e inferiore a circa 1:1.

B30

I derivati di treonina dell'insulina umana che derivano da^L 1*amidazione possono essere rappresentati dalla formula generale

(Thr(R2)-0R1)B3?-h-In II B30

dove h-In rappresenta il componente di des(Thr )-insul?na umana e R1 e R2 sono come definiti in precedenza.

I derivati di L-treonina applicabili della formula I sono quel-1

li nei quali R ? un gruppo protettore di un carbossile il qua-B30

le pu? essere eliminato da un estere di treonina dell'insulina umana (formula II) in condizioni che non determinino una alterazione irreversibile sostanziale nella molecola dell'insuli^ na. Come esempi di tali gruppi protettori del carbossile si possono citare i gruppi alchilici inferiori, per esempio metile, etile e tert-butile, i gruppi benzile sostituito come p-metossi? benzile e 2,4,6-trimetilbenziLe e difenilmetile e i gruppi della formula generale -CH^CH^SO^R3? dove R3 rappresenta alchile inferiore come metile, etile, propile e n-butile. Adatti gruppi pro-

2

tettori dell'idrossile R sono quelli che possono essere elimi

B"?0

nati dal derivato treonina dell'insulina umana (formula II) in condizioni che non provochino un'alterazione irreversibile sostanziale nella molecola dell'insulina. Si pu? citare come esem 2

pio di tale gruppo (R ) il tert-butile.

I gruppi alchilici inferiori contengono meno di 7 atomi di carbonio, preferibilmente meno di 5 atomi di carbonio.

Ulteriori gruppi di protezione normalmente usati sono descritti da WUnsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV/1 , a cura di: Eugen Mtller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1974), che viene qui incorporato mediante riferimento.

B30

Un processo per la preparazione di des(Ala )-insulina ? descritto in Hoppe-Seyler, Z. Physiol, Chem. 359 (1978), 799 .e seg.

Alcuni derivati di L-treonina della formula I sono composti noti e i restanti derivati di L-treonina possono essere preparati in analogia con la preparazione di composti noti.

I derivati di L-treonina della formula I possono essere basi libere oppure adatti loro sali organici o inorganici, preferibilmente acetati, propionati, butirrati e alogenidrati come cloridrati.

Si desidera usare i reagenti, per esempio des(Ala J )-insulina e i derivati di L-treonina della formula I in concentrazioni elevate. Il rapporto molare tra il derivato N.-treoninico della formula I e di des(Ala )-insulina ? preferibilmente superiore a circa 5:1.

Si desidera che la concentrazione di derivato di L-treonina della formula I della miscela di reazione superi 0,1 molare. L'insulina umana pu? essere ottenuta dai derivati di treonina J dell ?insulina umana (formula II) mediante eliminazione del gruppo protettoreR1 e di ogni gruppo protettore R2 mediante 1 metodi noti o analogamente a metodi noti. Nel caso in cui R sia metile, etile oppure un gruppo -CH^CH^SO^R , dove R ? come definito in precedenza tale gruppo protettore pu? essere eliminato in condizioni leggermente basiche in mezzo acquoso, preferibilmente ad un valore di pH compreso tra circa 8 e 12, per esempio circa 9,5. Come base pu? essere usata ammoniaca, trietilammina, tamponi bicarbonato/carbonato oppure idrossidi di metalli alcalini come idrossido di sodio. Nel caso in cui sia tert-butile, benzile sostituito come p-metossibenzile oppure 2,4?6-trimetilbenzile o difenilmetile, tale ?

gruppo pu? essere eliminato mediante acidolisi, preferibilmente con acido trifluoroacetico. L'acido trifluoroacetico pu? essere non acquoso oppure pu? contenere una certa quantit? di acqua oppure pu? essere diluito con un solvente or-2

ganico come diclorometano. Nel caso in cui R sia tert-butile, tale gruppo pu? essere eliminato mediante acidolisi, vedi in precedenza.

Preferiti derivati di treonina dell?insulina umana della 2

formula II sono composti nei quali R e idrogeno e questi possono essere preparati da derivati di L-treonina della for 2

mula I dove R b idrogeno.

O*1r\ Come esempi di un complesso o di un sale di des(Ala )-insulina si pu? menzionare un complesso di zinco oppure un sale di zinco.

La scelta delle condizioni di reazione secondo la spiegazione suddetta, tenendo in considerazione le condizioni di reazione negli esempi seguenti, rende possibile una resa di derivato B30

di treonina di insulina umana (formula II) che ? superiore a 90io o anche superiore a 95$.

Un procedimento preferito per preparare insulina umana da un derivato di treonina dell'insulina umana ? il seguente: D se ? rimasta una attivit? tripsinica dopo l'amidazione, si preferisce eliminarla, per esempio in condizioni nelle quali la tripsina e inattiva, per esempio in mezzo acido al di sotto di un valore di pH di 3. La tripsina pu? essere eliminata mediante separazione secondo il peso molecolare, per esempio mediante gel-filtrazione su un gel di "Sephadex G-50" oppure su un gel di "Bio-gel P-30" in acido acetico, vedi Nature 280 loc. cit,

2) Impurezze come des(Ala )-insulina non reagita possono essere eliminate mediante l'impiego della cromatografia a scambio anionico o cationico.

?D-JQ

3) Successivamente il derivato di treonina dell'insulina umana (formula II) viene sbloccato e l'insulina umana viene isolata, per esempio cristallizzata, in modo di per se stesso noto. Mediante questo processo l'insulina umana di purezza farmaceutica accettabile pu? essere realizzata ed essere ulteriormente purificata se lo si desidera.

Le abbreviazioni usate sono in accordo con le regole approvate (1974) da IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, vedi Collected Tentative Rules & Recommendations of th? Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd, ed,, Maryland 1975.

Ogni nuova caratteristica o combinazione di caratteristiche qui descritte ? considerata essenziale.

Il processo per la preparazione di derivati insulinici umani e di insulina umana ? illustrato negli esempi seguenti che tut tavia non devono essere considerati come limitativi. Gli esempi illustrano alcune realizzazioni preferite del processo secondo l'invenzione.

ESEMPIO 1

10 Mg di des(Ala J )-insulina porcina vengono sciolti in 100 yul di acido acetico 10 M. A 50yul di questa soluzione si aggiungono: 100yul di Thr-OMe 2 M (Me indica metile) in ?,?-dimetilacetamide, 60yul di N,N-dimetilacetamide, 15 yul e acqua e 10yul di una soluzione di tripsina (8$ peso/volume) in cloruro di calcio 0,05 M. Dopo incubazione a 4?C per, 24 ore il prodotto ? stato precipitato con 8 mi di acetone, isolato mediante centrifugazione, lavato con 8 mi di acetone, isolato mediante centrifugazione e asciugato sotto vuoto. La resa di (Thr?OMe) -h-In ? stata determinata mediante HPLC. Il prodotto ? stato sciolto in 2 mi di acido acetico 1 M e 100 yul della soluzione sono stati applicati a una "Nucleosil 5 C^g column" da 4 x 200 mm per la HPLC in fase inversa, usando tampone di solfato di ammonio 0,2 M portato ad un valore di pH di 3,5 e contenente 26,8$ (volume/volume) di acet? nitrile come eluente. Con una velocit? di flusso di 1 ml/min la des(Ala^ ^)-insulina viene eluita dopo 18 minuti e (Thr-OMe (Thr-OMe) -h-In dopo 24 minuti. Il sottoprodotto della reazio ne, cio? (Thr-OMe) -des-eptapeptide-(B24-B30)-insulina si eluisce a 7 minuti. L'identificazione e la quantificazione delle proteine ? stata basata sull'estinzione a 280 nm. L'analisi ha dato la seguente distribuzione di composti:

(Thr-OMe) h-In: 97,1$ des(Ala )-insulina: 2,5$ (Thr-OMe) des-eptapeptide(B24-B30)-insulina

ESEMPI 2-16

I seguenti esempi 2-16 nella Tabella sono stati effettuati analogamente all'esempio 1, variando i parametri della reazione come indicato in tale tabella. Tuttavia in tutti gli esempi

10 /al di 8$ di tripsina in soluzione acquosa, 100 yul di solvente organico contenente un derivato treoninico della formula ?3??

I e 50/al di acido acetico contenente 20$ di des(Ala )-insulina sono stati aggiunti. La molarit? del derivato treoninico della formula I in tale solvente organico e di tale acido acetico risulta dalla Tabella. Il tempo di reazione era di 24 ore. Nella Tabella sono state usate le seguenti abbreviazioni.

HOAc ? acido acetico, DMAA ? N,N-dimetilacetamide, BMP ? N,N-dimetilf ormamide, DMSO ? dimetilsolfossido, NMP ? N-metilpirro lidone e THF ? tetraidrofurano.

Nel caso nel quale ? stato sintetizzato (Thr-OBu^)^ ^-h-In, vedi l'esempio 15, l'eluizione mediante HPLC ? stata realizzata applicando un gradiente in acetonitrile da 26,8$ a 40$ (v/v).

TABELLA

cono entrazione Esem Solvente molarit? altra aggi* approssimata del deri ta di sol-"

pio stimata di acorganico molarit?

vato treo di vent? orga temp. qua nella misee n. ? ninico HOAc nico H2O resa

R1 R2 la di reazione M M yU?

/ni ?C % ?- (*)

2 DMAA 2 10 60 15 12 . 97 Me H 20

3 DMAA 2 10 60 15 25 97 Me H 20

4 DMAA 2 10 75 0 4 93 Me H 13

5 DMF 2 10 60 15 4 97 Me H 20

6 DMF 2 10 60 .15 12 97 Me H 20

7 DMF 2 10 60 15 25 97 Me H 20

8 DMSO 2 10 60 15 4 97 Me H 20

9 DMSO 2 10 60 15 12 94 Me H 20

10 NMP 2 10 60 15 4 96 Me H 20

l? NMP 2 10 60 15 12 97 Me H 20

12 DMAA 2 4 60 15 12 88 Me H 27

13 DMAA 2 4 75 0 12 94 Me H 21

14 DMF 2 4 60 15 -22 90 Me H . 27

15 DMAA 2 10 60 ' 15 12 97 But H 20

16 DMAA 2 10 60 15 12- 91 But B 20 ESEMPI 17-34

Questi esempi sono stati effettuati in analogia con gli esempi 1-16 con la condizione che il tempo di reazione era di 4 ore. In ciascuno di questi esempi la resa era uguale a quella ottenuta rispettivamente negli esempi da 1 a 16.

Risulta da un confronto degli esempi da 1 a 16 con gli esempi da 17 a 34, rispettivamente, che le stesse rese sono state ottenute e questo, tra l?altro differenzia il nuovo processo descritto in tali esempi dal processo noto descritto in Proceedings of th? 16th European Peptide Symposium, vedi sopra. Di conseguenza ? stata eliminata la dipendenza dal tempo.

ESEMPIO 35

D?)?\

250 Mg di (Thr-OMe) -h?In cristallino sono stati dispersi in 25 mi di acqua e sciolti mediante l?aggiunta di soluzione di idrossido di sodio 1 N sino a un valore di pH di 10,0. Il valore del pH h stato mantenuto costante a 10,0 per 24 ore a 25?G. L'insulina umana formata ? stata cristallizzata mediante aggiunta di 2 g di cloruro di sodio, 350 mg di acetato di sodio triidrato e 2,5 mg di acetato di zinco diidrato seguito dall'aggiunta di acido cloridrico 1 N per ottenere un valore di pH di 5,52. Dopo accumulo di 24 ore a 4?C i cristalli romboedrici sono stati isolati mediante centrifugazione, lavati con 3 mi di acqua, isolati

Claims

RIVENDICAZIONI

1 Processo per preparare insulina "umana o derivati di treonina J dell?insulina umana oppure un loro sale o com B30

plesso mediante reazione di des(Ala )-insulina porcina o un sale o complesso di essa con un derivato di L-treonina della formula generale I

Thr(R2)-0R1 I

1 2 dove R rappresenta un gruppo protettore del carbossile e R rappresenta idrogeno oppure un gruppo protettore dell'idrossile, oppure un suo sale in una miscela di acqua, un solven te organico miscibile con acqua e tripsina, caratterizzato dal fatto che il contenuto di acqua nella miscela di reazione ? compreso fra 30 e 10$ (volume/volume) e che la temperatura di reazione ? inferiore a circa 37?C in presenza eventuale di un acido, dopo di che il derivato risultante, se lo si desidera, viene sbloccato per formare insulina umana.
2. Processo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la concentrazione del derivato di L-treonina di formula I nella miscela di reazione supera 0,1 molare, che la temperatura di reazione ? superiore al punto di congelamen to della miscela di reazione e che la miscela di reazione non contiene pi? di 10 equivalenti di un acido per equivalente di derivato di L-treonina della formula I
3. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che la temperatura di reazione e inferiore a circa quella ambiente e superiore a circa 0?C.
4. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il contenuto di acqua nel la miscela di reazione ? inferiore a 25i? (volume/volume)*
5. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il contenuto di acqua nella miscela di reazione ? superiore a 15 (volume/volume).
6. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il rapporto molare tra B30

il derivato di L-treonina della formula I e eies(Ala )-insulina e superiore a 5:1?
7 Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il solvente organico \dro_ miscibile ? metanolo, etanolo, 2?propanolo, 1,2-etandiolo, acetone, diossano, tetraidrofurano, formamide, N,N-dimetilformamide, ?,?-dimetilacetamide, N-metilpirrolidone, esametilfosforotriamide , acetonitrile o DMSO.

8. Processo secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che il solvente ? formamide, ?,?-dimetilformamide, N,N-dimetilacetamide, N-metilpirrolidone, esametilfosforotriamide , acetonitrile o DMSO.

9. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che l'acido ? un acido organi^ co, preferibilmente aoido formico, acetico, propionico o butirrico, 10* Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni preceden ti caratterizzato dal fatto che la quantit? di acido nella miscela di reazione h tra 0,5 e 5 equivalenti per equivalente di derivato di L-treonina della formula I.

11. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni preceden ti caratterizzato dal fatto ohe il rapporto ponderale tra tripsina ?OlQ

e des(Ala J )-insulina nella miscela di reazione ? maggiore di 1:200, preferibilmente di 1:50, e minore di 1:1.

12. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che viene effettuato in presenza di ioni calcio.

13. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto ohe viene effettuato in un sistema tampone.

14. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che il derivato di L-treonina della formula I viene aggiunto come acetato? propionato, butir rato o alogenidrato come cloridrato.

15. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che la temperatura di reazione e il contenuto di acqua e acido nella miscela di reazione sono scelti cosicch? la resa del derivato di treonina J di insulina umana nella miscela di reazione sia superiore a 90$, preferibil mente superiore a 95$.

16. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che R1

? alchile inferiore, benzile sostituito o difenilmetile o un gruppo di formula -CHoCHoS0 R\ dove R^ rappresenta alchile inferiore.

17 Processo secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che R^ ? metile, etile, tert-butile, p-metossibenzile, 2,4,5-trimetilbenzile oppure un gruppo della formula -OH^HgSO^ dove R^ ? metile, etile, propile o n-butile.

gOQ

18. Derivati di treonina dell'insulina umana preparati con il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 17.

19. Derivati di treoninaB30

dell'insulina umana preparati con il processo secondo uno qualsiasi degli esempi 1-34.

20. Processo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che lo sbloccaggio si effettua in mezzo acquoso in presenza di una base, preferibilmente a pH fra circa 8 e 12.

21. Processo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fat_ to che lo sbloccaggio viene effettuato mediante acidolisi, preferibilmente con acido trifluoroacetico.

22. Insulina umana preparata mediante il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 17? 20 e 21.

23. QualBiasi nuova caratteristica o combinazione di caratteristiche qui descritta.