IT8223974A1 - REATTIVO PER LA DETERMINAZIONE DELLE β-LIPOPROTEINE - Google Patents

Description

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Descrizione dell'invenzione avente per titolo:

"REATTIVO PER LA DETERMINAZIONE DELLE |? -LIPOPROTEINE"

dell'Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano "SOLAVO"

S.p.A. *

LI RI:S JO <1 >Inventori: Alessandro TABACCO, Edoardo MODA, Paolo TARLI.

2& un.1982 <. >23 97 4 A/ 82

Ri a s s u n t o

Le ? -lipoproteine vengono determinate, qualitativamente

o quantitativamente, impiegando un reattivo colorimetrico

costituito fondamentalmente da uno tra i derivati del trifenilmetano, in cui ? indispensabile la presenza

costante dei sostituenti all'idrogeno indicati nella

formula (?)

xooc eoo/:

dove R^ ed R^, uguali o diversi tra loro, sono alogeni ed

x pu? essere idrogeno od un catione monovalente, mentre

gli idrogeni arilici non evidenziati possono anche essere sostituiti.

Tra questi derivati del trifenilmetano particolarmente

adatti sono risultati il Mordant Bleu 1 (C.I. 43830) ed

il Mordant Bleu 29 (C.I. 43825).

Per brevit? indicheremo da ora in poi i derivati sopra definiti come " |3 -Lipoproteine coloranti".

D e s c r i z i o n e

La presente invenzione ha per oggetto l'uso di un " -Liporpoteine colorante" nella identificazione delle ^ -Lipoproteine; pi? particolarmente essa si riferisce al-l'uso di un " |? ?Lipoproteine colorante" in soluzione tamponata ed in presenza di opportuni tensioattivi cationici o non ionici e di gruppi anionici provenienti da sali di metalli o da acidi inorganici nella determinazione semiquantitativa o quantitativa delle -Lipoproteine.

Le lipoproteine, ? noto, veicolano i liquidi nel sangue.

Esse si possono suddividere in quattro frazioni principali distinte per la composizione dei liquidi trasportati, delle proteine vettrici, per la grandezza, per la densit?, la mobilit? elettroforetica e le loro caratteristiche antigeniche .

Nel siero prelevato a digiuno si possono determinare tre frazioni lipoproteiche : VLDL (Very Low Density Lipoproteins), LDL (Low Density Lipoprotein), HDL (High Density Lipoprotein ).

Nel siero post-prandiale si riscontra una quarta frazione, i chilomicromi , la cui presenza in soggetti a digiuno ? patologica.

La determinazione delle varie frazioni lipoproteiche riveste un notevole interesse clinico in quanto esse sono tra l'altro collegate direttamente alla patologia della arteriosclerosi. Attualmente i metodi di dosaggio delle varie frazioni lipoproteiche sono:

1) Elettroforesi

2) Ultracentrifugazione

3) Metodi immunologie! ed immunoelettroforetici

4) Metodi immunonefelometrici

Sono noti anche dei metodo colorimetrici che risalgono pi? o meno approssimativamente alla concentrazione delle proteine dosando il colesterolo ed i lipidi ad esse legati .

In particolare per quanto riguarda le LDL, le proteine che attualmente vengono considerate direttamente correlate alla patologia della arteriosclerosi, non sono noti per la loro determinazione, metodi spettrofometrici diretti.

Noi abbiamo trovato, e ci? costituisce parte integrante della presente invenzione, che le J? -lipoproteine reagiscono in maniera specifica con un " j? -lipoproteine colorante" .

Forma pertanto un primo oggetto della presente invenzione l'uso (nella identificazione delle J3 -lipoproteine) di un " ? ?Lipoproteine colorante" scelto tra i derivati del trifenilmetano, in cui ? indispensabile la presenza costante dei sostituenti all'idrogeno indicati nella formula generale

xooc COO X

dove R ed R uguali o diversi tra loro sono alogeni ed x pu? essere idrogeno od un catione monovalente, mentre gli idrogeni arilici non evidenziati possono anche essere sostituiti .

Un secondo oggetto della presente invenzione ? costituito da una opportuna composizione comprendente:

i) " -Lipoproteine colorante" in soluzione tamponata; ii) un agente chelante in grado di chelare ioni metallici interferenti presenti nel campione, con lo scopo di ottenere una reazione pi? specifica;

iii) gruppi anionici inorganici;

iv) ed eventualmente tensioattivi cationici o non ionici. Cos? la composizione definitiva potr? comprendere:

a) un sistema tampone in grado di mantenere il pH tra 3 e 7.

b) Un agente chelante in grado di chelare ioni metallici ed in particolare il ferro.

Tra questi particolarmente adatti sono l'acido citrico

ed i suoi sali, l'EDTA ed i suoi sali, che possono

fungere anche da coppie tamponanti.

/y c) Un tensioattivo cationico o non ionico ed in par iiT ticolare, tensioattivi cationici, sali di basi ammoniche quaternarie in cui i gruppi non idrofobici siano

alchilici. Tra questi particolarmente adatto ? risultato il cetiltrimetilammonio bromuro.

d) Gruppi anionici, quali alogenuri, nitrati, solfati,

fosfati etc. che possono venir aggiunti alla miscela

sotto forma di sali od in forma acida.

L'efficacia del metodo secondo la presente invenzione ?

stata determinata isolando cromatograficamente le proteine

di un pool di sieri umani che davano, nelle opportune

condizioni, reazione positiva con un " p -Lipoproteine

colorante? ed identificandole immunologicamente con antisieri specifici.

Nello stesso tempo abbiamo verificato che le altre

proteine sieriche frazionate non davano, in analoghe

condizioni, reazione positiva col " |3 -Lipoproteine colorante" .

Esempio 1

Composizioni di reattivi per la identificazione delle

lipoproteine

A) Reattivo: Tampone K-acetato 0,5 M

Cetiltrimetilammonio bromuro 270 mg/litro

Mordant Bleu 170 mg/1, MgCl^.eH^O 60 g/1 M SHARMCAM:uIBiMOLILMO Acido citrico 0,026 M, Na Citrato tribasico

0,038 M.

B) Reattivo identico al precedente in cui il Mordant Bleu

1 ? sostituito dal Mordant Bleu 29 alla concentrazione

di 80 mg/1.

Esempio 2

Identificazione delle j? -lipoproteine in un siero umano

A) 0,1 mi di siero vengono aggiunti a 2 mi del reattivo A

sopra descritto.

Allo spettrofotometro viene letto lo spettro di assorbimento della miscela di reazione cos? ottenuta

contro un bianco costituito da 2 mi di reattivo e 0,1

mi di fisiologica. Un picco tra i 640-590 nm con un

massimo di assorbimento tra i 600-610 nm indica la

presenza di -lipoproteine nel siero.

B) 0,1 mi di siero vengono aggiunti a 2 mi del reattivo B

sopra descritto operando in maniera analoga all'esempio

2A) ; un picco tra i 640-570 nm con un massimo di assorbimento tra i 580-590 nm indica la presenza di

|3 -lipoproteine nel siero.

Esempio 3

Composizione di un reattivo per la determinazione delle

lipoproteine

Il reattivo ? costituito da:

- Soluzione Cromogena analoga ai reattivi al punto 1.

- Soluzione Bianco : identica alla soluzione cromogena ma priva dei -Lipoproteine coloranti".

Esempio 4

Determinazione delle lipoproteine in sieri umani Pipettare in provette secondo lo schema qui riportato:

Campione Bianco 1 Bianco Campione Bianco 2 Siero mi 0,05 0,05

Fisiologica mi 0,05 0,05 Soluz.crom. mi 1,5 1,5

Soluz .bianco 1,5 1,5 Attendere 20'/min e leggere a 615-620 nra la D.0. del campione contro Bianco 1 (A ) e la D.0. del Bianco Campione contro Bianco 2 (C^). La A = A -A ? proporzionale alla concentrazione delle ipoproteine presenti nel siero.

Esempio 5

Confronto

Con la tecnica esposta all'esempio 4 si sono saggiati 80 sieri umani.

Negli stessi sieri sono state dosate le ^ -lipoproteine mediante la tecnica di immunodiffusione radiale (piastre fornite dalla Ditta Behringwerke A-G).

Il coefficiente di correlazione dei risultati ottenuti con i due metodi ? r = 0.86.

R i v e n d i c a z i o n i

l) Reattivo colorimetrico per la determinazione delle

-1ipoproteine compredente, quale reagente fondamentale, un derivato del trifenilmetano, in cui ? 5od]j indispensabile la presenza costante dei sostituenti

all'idrogeno unicati nella formula generale (I)

xooc cooX

(x?

dove R ed R , uguali o diversi tra loro, sono alogeni

ed x pu? essere idrogeno od un catione monovalente,

mentre gli idrogeni arilici non evidenziati possono

anche essere sostituiti.

2) Reattivo colorimetrico come da rivendicazione 1 in cui

il derivato del trifenilmetano ? preferibilmente scelto

tra Mordant Bleu 1 (C.I. 43830) e Mordant Bleu 29 (C.I.

43825).

3) Reattivo colorimetrico secondo le precedenti rivendicazioni comprendente:

a) almeno un composto di formula generale (I), come

specificato nella rivendicazione 1, in soluzione

tamponata ;

Claims (4)

1. b) un agente chetante in grado di chetare gli ioni metallici interferenti;
2. c) gruppi anionici inorganici;
3. d) ed eventualmente tensioattivi cationici o non ioni-ci.
4. 4) Uso di reattivo colorimetrico secondo le precedenti rivendicazioni nella identificazione delle

   proteine.

   per Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano "SCLAVO" S.p.A.

   ANIC S.p.A.

   d ~ A~ C_ c-? 3

   280TT 1982