IT8248497A1 - Composti peptidici lineari aventi attivita' antigenica, in particolare per produrre vaccini riduttori di fertilita' - Google Patents

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

ni wi

a? ?G-4,G-5 DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione

I

avente,per titolo:._ __ _ S

? ' " ~ i

I

."Composti peptidici lineari aventi,attivitacantig?--I

nica, in particolare per produrre vaccini riduttori

di fertilit?"

a-nome: NQRTHWESTERN UNIVERSITY,..

RIASSUNTO .1

_ La.presente invenzione si..riferisce,a composti.

"T? !

' ? peptidici antigenici,disposti in una sequenza da?am- OoC O

! Q rainoacidi N-terminali a_.C-terminali scelti_dalla__ ?? -3-.classe costituita,da:_ _ __

? i_ a)..Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-

C_D Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Prq-Glu-Asp-...^^

Lvs-Leu.. .1_

C_)_Giu-Gin-Leu-11e-Gln-Asn-Leu -Va1-Pro-Glu-Asp-

'V

Lys-Leu-Ser

d) Glu-Gln-LeuAlle-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-G?u-Asp?

\

.Lys-Leu-Ser-Arg_ _

_ e )-Cvs'-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-LeurVal-Pro-Glu-! ? " I

I . . .J.isp-TLys...._ .._ _ r_ :_ 1

-f) Cys Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro Glu-

U~ Asp-Lys-Leu....

g) Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-leu-Val-Pro-Glu-? Asp-Lys-Leu-Ser- -- :- L_

h)?..Cys- Glu-Gln-Leu-Ile')Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Gl?-.Asp-lys-Leu-rSer.-Arg._

-i)_11e-Sex-Gly-Phe-Pro-Va1r-Gly-Arg,

- l1)--H e,^Ser-Gly-Fhe-Pro-Val-Gly-Arg-Va1-,-_ k)_.G1y-11e-Ser-Gly-Phe-Pro-Va1 Gly-Arg,_

- 1-)_Gly-Ile-Ser-Gly-Phe)Pro-Val-Gly-Arg-Val ,-- m)-Ser.-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly^Thr-Asp-Ly s,?e- -4 c/j _n)...Cys-Ser-Leu-Asn-Pr.o-Ala-Ile-Gly-Thr-Asp-Lys

O

ad in_.cui~Gly..raprresenta-la-glicina e Giu Gin-,--Leu,

Ci -Ile.,?As.n,..Val,?Pro Asp Lys Ser-,-Arg-,?Cys P-he-,--Ala

_ e_Thr,.rispettivamente rappresentano le -forme-L-amm r?-.? c=3 ? :? inoacide di.acido-glutammico, glutammina, leucina,-iso-? r^j Od Jle.ucina,-asparagina,-.valina,-pr?lina,.-acido-asparti-. -<

C D

_!col,__li sina,, aerina, _arginina, _cisteina,. .f.enilalanina,

_ lalanina _e . .tre.onina .

_ __I)ES CR IZ IONA-DELLA. INVEII Z I ONE. _ : _ ; _ :

_ Sonogi?_not i da molti anni .gli snermatozoi dei_

\

_ lanini i ? e r i.. c o in e- an t i g e ni ci Pi ? _ di.. r.e.e ente., __?__s t ato di- -I .

_ _ mostrato, chelo-sperma-dei mammiferi? contiene. un_en-, -! !

_ ?zima-.antigenic.o,.che .?_noto..come_C^..isozima_di..latta-_

i

j

.. ?ito-deidrogenasi (LDH-X,...LDH-C^).,_I1_LDH-C.^_.?.stato_

! ?

Isolato in forma cristallina pura,datesticoli di topi,_

: i

Goldberg. (1972) -J.-Biol.-Chem..247:2044-2048. L'en- _

z ima p0ssiede...pes0jno1eco1ar.e_di.140..000_ed_?_compo-

st o-da -4-sub-unit? C~-identiche.-La-seouenza-ammino-d

.addicale la_.struttura tridimensionale di-LDH-C.^.

stata._studiata parzialmente determinata_da..un. er-

.t.Q-numero..di-studiosi._Si_veda_p.er^questo_.Kusic?i_ed

I

altri?(1976X.J._Mo]_ Biol....104:__6.59-668.p_a Wheat__ed!

altri- (1977)-Biochem. &-Bioohys'i-Res._Comm. 74-N.o.l

ex i.

3:1066-1077.?Wheat ed altri .hanno.deterrainato.la_.se!-_ si_

! < quenza .del peptide tiolico essenziale?dallJamminoaci-_ -n o dO-159-_al-ITI,?ed hanno__.trovato?che_quest_a?.?_nuas_i_j_ _.o._

l.dent.ica..ai_peptidi...tiolici_essenaiali presi da al-

tri LDH isozimi-dib?vertebrati._

_ .Nel.1974, Il Dr._Erwin Goldberg ha..passato.in..

ras segna.gli_ eff e1ti_de11'immuni zzazione-C.on__LD.H-JL.

X

(iLDH-C^)..sulla.,fertilit?,.ed_ha?avanzato?la-possibi- _

.1it.L secondp__la__quale "mediante l'impiego di un co-j_

s.tituente.macromole.oolare....?ef.inito....de.llo_soerma._di-!_ UB?AA(i;r.

! venta possibile rendere?chiapa_la_sua.struttura ori-:_

i mari a ..in? t e rrai ni di su c c e s sione di amrainoaci di, _pe p _ _

i costruire, la..mappa..in maniera_specifica_de?..determi'-_

* l nante o..dei_jleterminanti antigeniei_,_jresponsabili_ !_

I

del--f atto? diindurr e? li-infertilit?, _ e ..poi? costruire.

peotidi .sintetici,contenenti- questi-determinantl...

II fatto._di_p.ossedere.la-Capacit?_di sintetizzare

una molecola avente tali prooriet?, rende oossibile

i

liapproccio,immunologie? al controllo della .fertilit?". Karolinska Symposia on Research.Kethods in ReJ-jproductive Endocrinolo'gy, 7.mo Symposia.: Immunologia

cal Approaches to Pertility Control,.Genev.a,.1974?

202-222. Tuttavia, tali rpeptidi antigenic.i siatetici

GL

oO sono.rimasti .un fine e -non un obbiettivo raggiunto,

sebbene sia stata riconosciuta la loro desiderabilit?

o a. teorica. Nel 1979 il Dr. Erv/in Goldberg ha_riassuntjo "?z?~ come segue lo stato del-ramo relativo: _ ?

oO _ .".In conclusione, e.su.base .pratica,la. ? iQ immunoterapia per il controllo .dell.e_.nascite C?

?<? OQ

richiede pi? che.efficienza specificit?, rever CJ5 sibilit?,ed assenza di un.a_reazione^collaterale^sistemica . Quantit? piuttpsto grandi.dell_'

antigene devono-.essere-disponibili -in forma

inequivocamente-.pura._Questa,condizione,probabilmente-.non pu?4.essere soddisfatta da un antig^!^_

ne.enzimatico -Come prod?tto.naturaie__da_sperma.

o testicoli..Piuttosto,.la.tecnologia...contrac-.cettrfra .richiede..un frammento peptidico_sinte?-tizzabil.e-che?trattiene-il-.caratter.e antigenijco.

e provoca.una.risp?sta.che danneggia la fertilit?. Il completamento dell'analisi strutturile.di I/MI-C^ dovrebbe...permettere.la formazione

della mappa dei determinanti antigenici e la -_sintesi-di -tall-peptidi. per li-impiego- -in- una- ; ? ; nuova -tecnologia contraccettiva. "-"Recent-advances_in_Reproduction and Regulation of-Fertili? iy--,_.G_.P_._Talwar,-editore,-Elsevier/North-Holr? land Biomedicai.Press (197-9).

E??stato-scoperto che peptidi?altamente-antige--j ts? nici..possono essere .preparati-mediante-la-sintesi-di--! ' i o -successioni lineari di amninoacidi_le-..auali-.succes~-:_

oQ _sion:L_sono ritenute.corrispondere..ad una_successione Cs? j ; -*S. _<^.i? amrainoac idi._ pre sente. _ne llJ.anz ima ..naturale- LDH-C.^

I j ?--(ijueste successioni includono:-acido-glutammino-gl-u? |-Oer -teLmfiiina-leucina-isoleucina-glutammina-asparagina-leu-? ~225? ? ? ..isrina-rvalina-prolina-acido-glutammico-acido-aspartico --l1isina che-si-ritiene corrispondere-agli-amminoacid ii- :? -LDH-C^.da -5 a-16f isoleucina-serina~glicina-fenilala-.n iina-propilnau-valina-gllc.ina-arginin'a', ..che_si'._rit.ien!e_ -corrisponda_agli-amminoacidi-,IDH-.C^..da?152?a?159;?*ei ? serina-leucina-aspara^ina-prolina-alanina^-isoleucina-.

i <

....glicina-treonina-aci d_o. _a spartico-1 ?sina., _c.he__?..._.r.i te- _

| ? nu t a- c o r r i s p ond e r ?- a gl i- amm in o a c id i ..ED H-C.4-.-d a .211? a _

Ea..successione-da-l-52_.a?1-59?corrisponde?&Ila

-mappa-provisoria -pubblicata-di?LDH-Si^,?ma-le-succes- -.1ioni-da._5_a-16 e_que11e da...211_a.-220_no._Si_veda peri -questo-Musick-.ed.altri_Cagosto_25?,?1979)-v- i.,-254, No. 16: 7621-7623?.

I_composfci_che?reali zzano le?.s.equenze .antigeni

che _sopra .identificate...inclu?ono.-jL..seguent?_c.omposti

specifici;_ :_

_ _ a)_.N-Glu-Gln-Leu~Ile-Gln-Asn-Le.u-^al-Pro-Glu^_?

- Asp-Lys-C , -- :_ __ _

_ b ).._N-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-?sn-Le.u-Val-Ero.-.Glu-_

_ Asp-Lys-Leu-C ,_ _ _

_ cX.N-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pr.o-Glu-.. _ ?W "cc-.

1_ _ _ Asp-Lys-Leu-Ser-C,_ ? _ :_ g*?*

O

Oc. _ _ d.)_N-Glu-Gln-LeuT-Ile-Gln-Asn-Leu-Y.al-Pr.o-Glu=_

_ Asp-Lys-Leu-Ser-Arg-C, _

?

_ e ).N-Cys-Glu-G1n-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-_ Giu -Asp-Lys-C,_

f ) N-Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro- B _ _ Glu-As.p+Lys-Leu-C-,_ __ __

? -- g)-N-Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-^al-r-Pro-?

_ Glu-Asp-Lys-Leu-Ser-C ,_

? _ h) N-Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-_. _

_ Glu-Asp~.Lys-Leu-Ser-Arg-C_ ,_

_ i )._lT-I?e__Ser-Gly-PheAPro-Val-Gly-Arg-C._ ;_

__ 4) N-T1e-Ser-Glv-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Yal-C _

\

_ k) H-Gly-IIe-Ser-Glv-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-C _

_ 1) N-Gly-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-C

_ m) N-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Tbr-Asp-Lys-C ,

n>- N-Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Thr-Asp-Ly_Sr-_C , _

- Nelle-formule?Orecedenti la-lettera? "N"?indica--I! ..Llamminoacido -N-terminale, -mentre la - lettera? C -- -in-[ t dica_lLamininoacido._C-terminale._Gly rappresenta -la-L-glieina,-.e.-Gly,.Gin, .Leu,?Ile, Asn,?Val,?Pro, Asp,_

1 iys ,__Ser,-Arg,._Cys,-Phe,_Ala,?e_Thr,-rappresentano-O rispettivamente le_f orme-X-amminoacide - dell ' acido-? glutammico, -dell a glutammina , della JLeucina,? de.ll-L s od isol.eucina, ..dell ' asparagina,_ della vaiina, _ della.vpro- -?Qr ! lina,-dell-acido aspartico, della lisina, della-seri-?C na , deIliarginina,-de1la..cisteina,_della-feni1alani- -C na.,?dell1alanina, e-della treonina.?

Come-sar?-notato , i-composti-da a)-ad-h) inelu ..la._sequenza-di-12.amminoacidi,_par-tendo_< I -acido-glutammico -e-finendo con_la lisina.che si?ri?-? i tiene- corrisponde-.,-agli.._amminoacidi_da_5-a-16._di-jnDH--Gli-amminoacidi_aggiuntivi_.dei_..comp.osti_b-)_,?C-' ie_d.)_ sono ritenuti-corrispondere_agli?amminoacidi I pross.mi_s.uc.cessivi_di._.LDH-.C.^,?cio? i_numeri-16,?17-e_..18_,_Il_composto d) perei? potrebbe contenere gli ;_ _ i-amminoacidi_de1la_sequenza~da?5?a-18 I?compos11-da'-!I i _ La.)...ad.h)..inc.ludono.-le.._medesime._se.auenze antigeniche,_

| i _ jrispettivamente,.dei..composti..da a)..ad-_e.),_.ma_la_ci~_

_ ! iSteina.-?-stata aggiunta-.all 1 estremit? . .con-termina ?le i N.allo scopo di facilitare la copulazione di ouesti c.omposti_con._.proteine.hel.preparare,vaccini antige I-^

pici.-Analogamente ,_il_composto n) contiene,la mede-Lsima_suc cessione_antigenica_de.l_compos.to.m

che-la-cisteina- ? stata aggiunta all'estremit? con

.terminale N._con_il_medesimo .proposito.?_

-C I composti_d.a_1)__ad e)_includono tutti la sue-~ CSC

cessione d?_8_amminoacidi che_iknizia con la.isoleu-_

? f-lC . -.-e _cina .e che .termina con la.vaiina..Per .il .composto_ ...? ? r^j tj)?la vaiina_viene_aggiunta alllestremo-Con.termina-, oCi ? l.e_C__per_agire._come .amminoacido distanfeiatore ed -? or. aumentare -inttal...modo_il carattere immunogeno,_Qu_e- OQ CT3 ...st.o_far? .spostare_i1.centro.legantelantigenico ul-?

-.teriormente.dal gruppo,.carbossilico.libero.._..Come__

alternativa-o in.aggiunta.la..glieina..pu?._esse.re__ji.n-.trodotta sull'estremo.con .terminale._N cos?.da__servi--re .come--distanziatore_per._migliorare.il carattere^

-immunogeno,?come,fornito,,rispettivamente,-nei-comU

posti~.H)?e-1).Altri -amminoacidi possono-analogamen

te-essere-usati come-distanziatori- agli-estremi-ter

i

minali -delle .successioni, antigeniche, sopra- -descritr-..

_.t.e Inoltre,_corae_.sar?_.e.vldente..a_c.oloro_c.he_s.ono_

...esperti.nel.ramo dell'.immunolog?a,_.altri_ammino.acidi.

_C_-1erminali e.N-_.terminal.i_p.o.ssono..essere_s_ostituiti_

.trattenendo per? o anche aumentando il carattere an

tigenico. Tuttavia, i comnosti preferiti sono quelli

che. sopra_sono ..stati enunciati. -Si -ritiene che i com-

!pos.t.i_da,:a)_aeL..h)? siano_.par.ticolarmente efficienti. ?

1 I_c .omp o s t i _p e p t i d i c.i?d e 11 a_ p r e s e nt e__inven z ion e. _ _

p.ossono-essere-sintetizzati-partendo^ dai_loro- animi

j

n.oacidi costituenti. Per_esempio, _la isintesi_pu?_es-_

! s e r e- c ond o 11 a -medi ant e J. 1-pr oc e dim en t o -in? fa s e~ s oli' ?

da.di. Merrifield come, descritto-nelle - rivista -J-.A-..C..-i c c S_._.85 : 214:9-2154- ( 1963) .?Questo? procediraento. in. f.a- ? c

! se . solida. per.. sintetizzare le... sequenze. di? animinosela

; j di_?.__ anc h e _.des cri 11 o .ne 1? volura e_ d i__S t ey/pr .t__e__ Y.ou.ng .

i S o 1 id Pha s e_ Pe p t id e _ S.vnt he s i s .. (il. . H . -2?r.e.eman? C.o... , ! ?

tv

San-Prancisco,--1969X,? pagine? l-*4-.._In? questa -tecnica, - 5 i |?r l-iamminoacido .C-term?nale,? come? ad? esempio ,la_ lisina?

per? i... c omposti _ a.) ed_e )_. o~.la_leucina-.per? i-c omnost i ?

i b_)? e-f ) , ? ?-attaccato_alle-.perline-di-copolimero-dii ?

poli stirene .dorarne ti 1 a t o-divinil benzene ._Ci ascun _ i _

. .

amminoacido? C-onsecutivo,-. con_adat.to.-gruppo? protetti- _ ! V-0.v?Viene? aggiunto? in._succ.e ssione. alla. _c.atena_.in? cre-

sci ta_. Per_e_semp io., _come^ de scritto fieli ' artico lo_di

i ? ? ? i Me r r i f i e ld i 1...gruppo . pr? t et.t ivo pu? _ e ss e re__un_ grup^_

1 p?. c arbobenzo s s ilic_o_ ,_j Con_la__t eenlca__d.el.la? c_opu.la=_; _

zione ,-^011' allontanamento -dei-gruppi? protettivi,? e. .

I

della .copulazione-deli *.amminoacido-prossimo.- successi

v.o, -si_:possono .produrre? la._des.id?r at a _sequenza di_

inoacidi e.la desiderat?~lunghezza di catena. Coin?.stadio finale,.11.gruppo..protettivo viene rimosso

dalliamminoacido-M-terminale,. e_1'amminoacido C-ter?

minaiavviene -scisso dalla resina,_usando_un_adatto ? cL? reattivo, per esempio,acido.,trifluoroacetico.ed.aci -=s -p?-do..bromidrico.-I composti da.a)_a..n-').-come-Sopra..de s a scritto , sono..preparatiimediante questa tecnica_di ? ?-4 cintesi per _1_' uso nel. _ridurre...la_fertilit?_dei mamtni_-_ _

-o feri _ _

r-J cut Allo scopo, di utilizzare_i_peptidi jmtigenici _oa__ c iella presente_invenzione nella._forma di^vaccini^che zo

riducono _la._fertilit?,.il_pepetide viene..coniugato

s.on ..una _ mo 1 eco la . di__support o , che ? di preferenza u - _

i

:ia..proteina_che.stimola essa .stessa.una._risppsta_anpi-;.

5enica_e-.che?pu? essere.,con sicure.zza._sommin?strata.?_

Per .esempi.o,__i1_pep.etide pu? .essere copulato con il_

fcossoide.del .tetano.._per_JLa_s_Qmministrazione a mezzo_ ._

li. _.iniezione_intramusc.olare . frer esempio, una miscela

i i _.1 m i c o r mol e d i.__t o ss ? id e del tetano ? 60 microm oli! _

di-pep s t.id.e._ant igeale o, .e 18_mmp.li di cloridrato dii

l-etil~3-(3-dim.etilamrn.inopropil)carbpdiimmide innacqua. (pH fi) per 12 ore a temperatura ambiente e 24 ore a...4.?_Xo.m isee..un prodotto contenente 3,3 moli di

pept ide/mo1e_di tossoide del tetano. I reagenti in

[eccesso?possono..essere,rimossi mediante dialisi o

jfiltrazione su gel. Per questo si veda il lavoro di! -- .Piqu? ed altri, Immunochemistry, 15: 55-60 (1978'). ;

- Come alternativa,-il pepetide pu? essere-copulato imj i piegando la benzidina bis-diazotata (vedi Bassiri? - ^ed-altri, Endocrinology, 90:-722.(1972)) ovvero la glutaraldeide . - :- - <y> Per.,la.iniezione..intramuscolare,_il_peptide..coUX? pulato pu? essere sospeso in una soluzione salina.. .---?isotonica sterile, ovvero altro veicolo convenziona-O0 le,..e-se.si desidera pu? essere incluso un agente ausiliario. Un impiego preferito di tale vaccino ?-? ? ?

CQ

oer-la.somministrazione ..agli esseri umani'di_s.esso :? c.d-! ? femminile. Verranno formati anticorpi,..i__quali..appa-_ riranno-nei fluidi .dell'.ovidotto.e.cos? raggiungeran-_ _ j no una riduzione._di_fertilit? significativa._ Per_ i_ _questo proposito,...la quantit?,da somministrare._varie-__ | ir?.da.circa..1 a 10_mg__del _peptide_anfeigenico.._ _ ?_

i _ I? compost i_pe.pt idici ..della, .predente ..invenzione. _ . ed-il-loro-procedimento?di?preparazione sono-ulterior^ :

i ente illustratidagli esempi che_seguono.- !-_ Esempio..I _

? _ ? _ Preparazione. di_peptide__l.ineare . di _

_ C.ysr-Glu^GlnrrLeu-Ile.-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-_ _4 - - - - Glu-Asp-Lys - ! -iI _.La.sintesi del peptide .di.cui_sopra,.qui indicato come .composto- e) , -pu? - essere- .condotta-impiegando-le _

i t.ecnicheL.J.n?fase-solida?ora.-ben-note-nel-ramo--rela--t ivo*-.In _una? tecnica^pref.er ita., _la_lisina- Lamminor-.pro^-.

t etta , - che- rapar esenta- il _.grupp.o_. t erminale_-?LOOR_

<ie1-.p_eptide_di_cui...sopra, viene copulata__con_una__.re-_

sina..di_ sintesi,peptidica..c onye nz?onale...in fase...soli

,da_ad_esempio_c.l.orometi1polistir.ene-_r.e_ticolato_cpn_

.1-2..%..di divinilbenzene II gruppo protettivo dell

ammina_y.iene_.quindi selettivamente rimosso utilizzan-C

do-un . adatto -reattivo_la._cui_natura_jiipender_?_dal

? c gruppo-protettivo--impiegato-.-NeIla -realizzazione-pre-.

!

ferita il gruppo terz-butilossicarbonilico (BOC) vie- ??_ ne utilizzato per-la .protezione de]_ gruppo_amminicQ? C ' e 1?acido.-.trifluoroacetico al_4_Q.__$__in__cloruro di.me- oa CJD

til.e_ne__?_.l'agente di deprotezione selettivo._

-Dopo l'allontanamento della protezione, il complesso...di vai ina^-re sina _vi.en e t ra tt.at_0-.c_on acido aspartic-O-^ro.tet.t.o^-pref efib.iirne.nte ^acidp. N BOC-O.

-benzilaspartico.r.e 1a_dicicl.o.e_s_i.l.c_.arbodiimmide_in_

_ .manier.a_gi? nota_di per,s? cos? da formare un legamejpetidico tra_il grum o amminico libero del residuo

!

della lisina ed il gruppo carbossilico dell?acido

- asoart-ico protetto.- -- --II?eie1o -di_deprotezi.one.e..di...cop.u.la_zione,_con

de riv.at i di . animino acido e la dicicloesilcarbodilmmi

le viene poi ripetuto con i rimanenti amminoacidi

i nell'ordine di successione del peptide di cui sopra.

! Alcuni amminoacidi richiedevano dei gruppi bloccanti

?< i 4. iella catena-later?le-oltre -Ila-protezione dell'alfa-

animino gruppo. Tali amminoacidi e-tali gruppi-bloc-

canti sono i seguenti:- --

? ? Cys(MBzl), Glu(oBzl),-Asp(oBzl),-Lys(Cl-z)-

tove oBzl ? benzile, Cl-z ? orto-clorobenzilossicar-

sonile-e MBzl-? metossibenzile.-

_ -II.completamento_della sintesi forniva,i seguen-| ti- pepetidi copulati__con? la resina?.copolimerica delr

? -lo st?rendivinilbenzene: - ^ - = ? = -

_ _ TFA-Cys(MBzl)Glu(oBz1?-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leui

. . _Val-Pro-Glu(c5Bzl)-Asp(oBzl^-Lys(Cl.-.s).-Res_ L_

t

I

?- La.decopulazione del peptide-dalla resina viene

- -eIffettuata-mediante-trattamento-con acido fluoridri-iI _ co_1iauido con._scissione concornitante .di tutti__i.,grup-_

toAMO?po R 2S hZ?N?G B 1N. pi protettivi?in modo-da?produrre il -peptide desidera-

to..

Sintesi in-fase-solida-di-K-Boc--

-Lys(Cl-z-)-resina-

_L'unione_.di-N-Boo=Lys(Cl-z.)?,alla_resina .cloro-

metilica veniva-realizzata mediante il-procedimento,

! ! del.sale di cesio.-Un-campione-di resina-clorometilii ca._(200. g.) contenente_0, 7^ mmoli di cloruro per. gratti,mo-.viene--tra-t.tata-.con-il-sale-di-cesio di.Boc-Xys?

... (Gl -z )_r isult ant e.. dalla-neutralizz azione- della- Hocli s ina -c onld 1 c arb ona t o .. di . e esi o.. ?Gire a _ 7-3 ,-8._g _d i

BOC-lisina-venfeono-disciolti-in-fiOi^. d?ometanolo-e-20_#._di-acqua-e__regolati.-ad un-pH-di?'7,0?con.-circa

29?g~^di~carbonato-di-cesio.?La soluzione-risultante

i_essiccata_su_un_.e-vaporator.e...rotante.,_.poi.?

essiccata_per.-tre? V01.te _ancora.-dopo_tre- aggiunte di

_lQO._ml-di -xilene. -Al -sale-di- -cesio- di-- BOC-Xys(Cl-z)j

venivano ..aggiunti_20Q. g~ di resina- clorometilica -Co O ni e?S opra _ed _una._q.uantit?__sufficiente.-di-.-l-metil^2- 3

OD

pirrolidinone_.per- ottenere, un volume ~.totale_dd_circa

l490-litri-.--Xa-iniscela--r.isultante._v.iene_agi.tat.a._a

_552C?per_48_or.e-.__La_resina veniva poi .1avata_.apbondantemente c??_metano1o.,_p.o.i_con-acqua,?e.-nuovamente

infine -Con__metanolo.._.La_r.esina_v_eniva.essiccaJ:a^all;l_

aria ,...ooi_veniy_a_.es.s_iccata.sotto vuoto. Dopo la scissione della..lisina..dalla resina con HF, l'anali?i delllamminoacido_dava?un-pic.c_0-.c._or.risp.ondente.a_0,

mmoli/g._

_Un..campione della.resina_aprena _de_scritta (6_,0_g) \

v.en1va...sott_opo.st.o_al seguente schema di sintesi: (1)

lavaggio con tre porzioni del volume di 100 mi di

c.loruro.di..metile.ne.;_(2.1 rimozione del gruppo Boc

con 40 % di TffA in cloruro di metilene mediante la

vaggio della durata di un minuto ed un periddo di reazione della durata di 20 minuti; (3) lavaggio ;

i i con tre porzioni del volume di 100 mi di cloruro di

?

metilene; (4).lavaggio con due porzioni di..100 .mL_j. di isopropanolo; (5) lavaggio con tre porzioni del; volume di 100 mi di cloruro di metilene;-(6) lavag-! gio di.un minuto e poi.10 minuti di.neutral?zzazio-i- Tr i _ne_.con porzioni del volume di 100 mi di trietilammi na al 10 in-cloruro di.metilene; (7) lavaggio con

! tre.porzioni del volume di 100 mi di cloruro di me-l? t?lene; (8) aggiunta-di 2,5 equivalenti (7,2 mmoli) di Boc amminoacido e di-2,5-equivalenti -(-7,2-mmoli)

*? di dicicloesilcarbodiimmide dn cloruro di metilene;. c-3

CD

.ed.agitazione..per 2.ore; (9) lavaggio oon_tre_porr4 zioni del.volume di-100 mi di cloruro di_metilene;.!

i (10) lavaggio con tre porzioni,delvolume _di 100_ml

| di-isopropanolo ;-(11)-lavaggio,con..tre-porzioni_del

di-100 mi di-Cloruro di metilene._Il cic?o. di cui sopra veniva ripetuto per i seguenti ammino-.acidi ??-protetti:_ __ L_ -_ | . . Boc-Arg(Tog)_ _ __ -J - Boe-G-ly?

? ..Boc-Val...-- Boc-Pro?.

Boc-Phe

__Boc.-Gly_ __

_ Boc-Ser(oBzl)_ :_

Boc-Ile

.Boc-Glyi

la _res.ina. p.ept idica pr? t etta__e r a _s pt t pp.ps t a_ a 1- cL

L'.eliminazione della orotezioneco s? da dare il sai?

O

a& con.-TF? della resina_pept.idica .proLtet.t_a?__La_res.ina

o OH essicca a. era agi t at.a_.in__pr e senza di 6 mi di anisol? ?c r-j 60 mi di HB. liquido., a 0?C per 1 ora . L'HF era rim?s oa -O Z

30-mediante .protezione di_vuoto.ed il.residuo oleosp. -<X o? ?ra lavato con due-porzioni.del_volume__di_5_0^jnl__di. QQ CO

3E stero etilico. Il peptide_.veniva._estr.a11o__dal1a_resjU-._

ia-.mediante__tre__porzi.oni?d.el.__volume..di 50 .tnl di__ac_?-_

o aceti.co 1 M ed i filtrati combinati erano liofi-_

izzati?in_maniera.da.-dare-.&,66_g..di._peptide^greggip.

Ln_camp ione_(1,5 g) ara purificaio mediante 230 tra-

apparecchio,di distridozIone- con-

tro-c.orrente._e_recupero deIle frazioni appropriaie

:con..ottenimento di 0,994 g di ,?.pefttide molto purifi

cato .-11_.sIstema_s_oIvente ner il frazionamento di

iu i -S opraL_era_.c.o sti tu i.t.o._ d a hutan ole /acido acetico/

acqua nei rapporti 4/1/5 * _ ?

_ Llanalisi degli amminoacidi del peptide dopo

,1 idrolisi_acida_dava Arsr-00,_^erlv05 , -Pr^ ^ 01.,

!Gly.705 ^-V-al2708?-ILe079'8EheiT05*?I1?V " P^Ptide-^av-a

macchie singole in due sistemi nella cromatografia a strato sottile su gel di silice. Questi sistemi ! . -erano lo strato superiore di butanolo/acido acetico/

?

.acqua.nel-rapportO?4/1/5 ed.il sistema cloroformio/ _ .metanolo/acqua nel.rapporto 60/30/5..H.valori R?. ! .per il peptide nei due-sistemi era-di-O,20 e_0,32,, .._cv ??7 rispettivamente.. Nella elettroforesi.su carta,?iL-<r peptide-dava,una macchia singola che..migrava .verso. ?o i Q oz .il.catodo con un valore R^,in paragone con 1-acido. -<* i .picrico,di _0,54,_Le,condizioni di elttroforesi era-_

} .no carta_V/hatman _3MM- con un -tampone, di piridina-ace-r_ OC

tato_a pH,5-,6? co _ I__c_omposti..da._a)__a d)..e da?f.)__ad_h)?contenenti _ ? la medesima,sequenza di antigeni.-del-Composto._.e^_ ,_ -sono~preparaii -nel?medesimo-.modo.e .sono .caratteriz--, i zat?_nel_medesimo__mod_o._

-EsempiO-.il?

Preparazione ..del_peptide lineare _

Gly-Ile-Se r-Gly-Phe-Pro.-Val-G-ly-Arg-.Val ...

__ _ La_sintesi del peptide di cui sopra_allo scopo

? ;

.di pt-tenere?il__C-ompbsto_gi?-_citat.o._come-c.omposto_.l') _ .pu??essere condotta-impiegando?tecniche,in,fase..so-- -lida attualmente-ben.note nel ramo..relativo.-In una _. tecnica preferita,....la.vaiina ammino-protetta, che \ __ rappresenta .il .gruppo terminale -GOOH del peptide

i

,!di._cui__sopra,_viene? cppulata_con_unjL_resin_a_d_i_ein=

tesi-peptidica-in fase--solida.convenzionale._c_ome.._ad!

esempio._cloromet.ilp.Qlistirene reticolato con una Quantit?. da_l -a_2.?_di_divinilbenzene...Il gruppo protet-_

tiv-? del- gruppo..amminico piene _poi_sele.ttiv.amen.te

rim osso-uti1izz?nd.o_un_adatto reagente la cui natura

O

dipender? .dal..gruppo..protettivo usato.__Nella_realiz- un !

zazione prefer.ita-13_ grupr.0-_terz-b.utilossicarboni1ioo cr (BOC) viene utilizzato.per_..la protezione del gruppo;_ S amminico ed_acido _trifluoroacetico._.al_40_.?_in_..clQrup_

ro_di..meti1ene ?.1lagente.delettivo di deprotezione'.

Dopo..ladepro.te.zione, il complesso di vaiina- _ r-~

??? or resina -.viene tratiato..c.on _ar_ginina__prjotetta,..dipre-

! & f e.r_e.nza_N-Boc-^ -tosilarginina, e dioicioesilcarbodiimmide..secondo.una.tecnica_..gi? nota di per s? coi

j

s?-da forma're un_le.game__p.eptidico tra il gruppo am-j

minier?..libero,del residuo della vaiina ed il gruppo

car.bossilico_de.llarginina_protet.t.a,_

___It_cielo_di_all.ont.anamento della,.proiezione e

di-copulazione..con..derivati_?i_.amminoacldo_-e_cnn_di

ci.cl.oe.sil.darb.odiimmide.._v.ien.e_poi_ri.p..etut_o_ce.33_i_rimanenti? amminoacidi-neLU ordine_di_auce.essione de.l

peptide_di cui .s?pra,.Alcuni,degli.,amminoacidi_rl-_

chic devano..gruppi_.b1oc.canti_delia catena Intera1e__

oltre alla protezione alfa-amminica. Tali amminoac

di ed i grupui bloccanti sono come segue: - ?

. . Ser(oBzl) e_Arg(Tos) - -

dove-oBzl_ ? benzile'-e Tos ? guanidino-para-toluensol

fonile

Il completamento della -sintesi forniva il se-

guente decapeptide copulato-con -la resina di-stire-

nedivinilbenzene :copolimerica : - -

TFA.?Gly-Ile-Ser(oBzl? -Gly-PhelPro-Val-Gly-ArgCTos)-- h ' 1 ' t? Vai-resina -- - - - -? - il? C

:_ La operazione di decopulazione del-peptide del

la resina viene ottenuta mediante trattamento,con?

acido-fluoridrico -liquido con concomitante scissio

ne. di- tutti i__gruppi -protettivi? per_ produrre il.jpe-

ptide-desiderato.

-Sintesi in. fas.e. solida _di-

Gly-Ile-Ser-GLy-Plie-Pro-Val-Gly?

_ ^_ -Arg-Val _

.??-?oc-Vai-resina

_ Il collegamento,della N-Bo.c-valina_con la .resi-Ii na clorometilica era-eff ettuato-con -il. .procedimento

[ I jd e 1 ~s a 1 e - d i ~c e s ? o . -Un - camp ione d i-xe s ina -c Lo r om e t i -j. -

I i Lica~ (200 g)-contenente-0,74-mmoli di-cloruro per -Igrammo viene trattato con il sale di cesio.di Boc-

valina risultante dalla.neutralizzazione di Boc-va-? lina con carbonato di cesio. Circa 38,6 g di Bocvalina sono disciolti in metanolo all'80 %. eaccua

a1_2.0L?__e_rego.la.ti__a..pH 7,.0__c.on cir.ca__2_9_g_di_carb?-nato_di cesio. La_soluzione_.risultante...viene._essic

cata_su-di.un.-evap?ratore^rotante,-poi .essiccata .

ancora _tre_.volte.,dopo.tre..aggiunte_di._10_0_ml__di_xi? CX <? 1ene.._.Al_sale?di__cesio..della.Boc-valinavvenivano.ag=

e"'* giunti 200.g di resina..clorometilica come_sopra ed ? G? c uria sufficiente quantit?..di lrmetil-2-pirrplidinone

rs per formare circa un volume totale.di 1,90 litri... <zr~ _La__miscela risultante viene agitata a 55?0 per 4-8 rc--L cd -ore,-La-resina-era _poi_lavata abbondantemente.c.on_

.metanolo,._poi-con .acqua, poi..di_nuovo_.con_metanolo,.

La-re?ina.era-essiccata, all.'.aria,..poi essiccata so

t o-vuoto Dopo scissione de.l1a_v_a1ina_da1la...resina

con -HF, 11ana1isi..deg1i-amminoacidi..dava_un.p?i_c_co_

corrisponde te a.0,^8 mmoli/g._ _ _

_ Un_.campione.della_resina appena _deseritta__(6_,?

g) era sottoposto al seguente programma di sintesi!i

1)_lavaggio-.c.on tre porzioni di cloruro di metilen Te

ciascuna,del-..??lume_d i_ 100..m1 _2X..rimozione_de.l_.grjj.pjj)o_Boc..con TFA al 40 % in cloruro di metilene per

.un lavaggio di un minuto e oer un tempo di reazione_

di 20.minuti; 3) .lavaggio con tre norzioni di cloruro di .me.tilene.ci?cuna del volume di 100 mi; 4)

?lavaggio con. due porzioni del volume di 100 mi di

! i .isopropanolo; 5) lavaggio con tre porzioni di 100-ml i: % ;

.di cloruro di metilene ; 6) ..lavaggio -di un .minuto _e !.

I

I

neutralizzazione- di-10 minuti -con porzioni di? 100-ml

di_trietilammina al-10 % in .cloruro di-metilene; 7)i?

lavaggio con -tre porzioni di_100 mi-di-clonuro-di? j--

- metilene ; - 8) ..aggiunta di -.2-, 5 -equivalenti pari a-7-, -2? 1 I Jmroo.li._di Boc..amminoacido..e.2.r5-_eauivalenti,.pari_a..._.

! - ! ..{7,2 mmoli di-dicicloesilcarbodiimmide in cloruro..di_ I I

! ! -metilene- ed agitando.per due-ore; 9) lavaggio-con? j-

tre .'porzioni del.volume.di 100 mi di cloruro di me-.?_ ?

jtilene;.10) lavaggio,con due porzioni-del-volume-di-

jlOO mi di isopropanolo; ll)-il-lavaggio-con tre-por CCm

jzioni di..100.ml-di-Cloruro-di .metilene IL-Ciclo..-di_l

!cui-sopra--era-ripetuto per-i seguenti?amminoacidi? -] " ' i

if-pro.te11i_ :_ :_

1 - Boc.-Asp(.oBz1-)- Boc^G-ln- - -?

Bo.c-Glu(oB.zl)_ JBo.c-Il.e

?Boc^Pro .Boc-.Leu

- Boc-Val - -Boc-Gln

1.

_ B.oc-Leu_ 3oc-Glu(-oBzl)-

-_ _Bo.c-Asn_ _Bo.c-Cys(MB.z.1).

-|La .resina-peptidica -prote11a-era-sottoposta-aIlio1

ilontanamento._de11a-_protazione-cos?._da_dare_il_sale_j_ | } 4TPA_.dellare_s.ina_.peptidica protetta. La resina essiccata (5,8B..g) era agitata.in oresenza .di.6.mi di.anisolo e60 mi-di-HF liquido-a 0.?.C per un1ora...L'HF

era_rimosso-mediante._produzione-de.l_vmoto._ed__iL_r_esiduo_o1eoso_.era_1avato con due .p_o_rzioni di etere

~Efc etilico del_yolume.di 5.0 ffil_,__Il peptide era estratio

na o dalla resi/con-tre .porzioni.del-volume-di 30 mLdi.

-orc acido-acetico 1_M..ed._i-filtrat.i_combinat.i-.eran_o_lio- cuai filizzati in.modo da.dare 2,27 g di peptide gregeio. ?-J SO

-O Questo?era purificato mediante.250.__trasfer_inenti.jir:_ -j r ?t C-t>Zl un- apparecchio di distribuzione... in...controre orre.nt e . _

CJD II. sistema .solvente, per il-frazioname.nto__d_i._cui_ sopra ac era butanolo/acido.._acetic o/a c.aua. _.a i rapporti 4/1/5.

.Erezioni alquanto purificate dall 'apparecchio

di-distribuzione_in. contro^corren.te..v_enivano_._ulte-_

riormente?purificate.mediante_cromat.ografia su colonna., su dietilamminoetilcellulosa con un gradiente

line are. -da .0 , 01..a 0, 5 ao 1 ar e_d i__.b.i_c a rb.on at o_ di

niO?cos.?__da_dare 7>56 rag_di_peptlde_p_u_ro.

L1ansli si degli amminoacidi del peptide puro

dono_liidrolisi_ acida dava; lys _ -.?ammoniaca _

1,02? 2,87

^?S^2,16^ ^lu5^82' ^ro0,96? "^yso,'85,??^a^0v97? ^^e0, j79'*

Leu ..Questo_.peptide dava una macchia singola

con un.. di 0,89-alla-cromatografia_su.strato_sotti-^

t I

.le..di._ce1lu1osa con un sistema solvente di butanolo/

acetato ..di etile/acido acetico/acqua nel rapporto

di 1/1/1

_ I_ composti da i). a k) - contenenti, la medesima .sequenza -di- -antigeni dei-composto 1)? sono -preparatine 1-medes imo -modo -e_c arat t eri z zat i_nel la-medesima _ L maniera.

-Esempio -III-LSI

_?ep_arajz ione _d.el_jpe.pt ide_l ine are._

r~ tyr1 ..Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Thr--ri - : - Asp-Lys - - - - - -la ..sintesi del . peptide_ di cui- sopra, indicato

O

-.qui_come_ composto _n)_.pu?_essere 'condotta...impiegando ivi ai tecniche, in _fase_ s olida .ora_ben-.note._ nel_.ramo relat-! CD t i?ro .-?In- una ~t ecnic a pre f er it a? la? li s ina - ammino-pr o- --tetta c.he_ rapore s enta_il_ gruppo-t erminale - SJOOH-I ! ! del? pepiide_. d:Lc_ui... sopra, _ v_iene?copulata._con_una._re-_ si na. di; ;s int es i?p ep t idi c a_in f as e_ so 1ida-c onve n z i o -? Jnale_ come?ad?esempio? clorometilpolistirene? reticola^ ? jio. con. .una_. au ant i t ?_ d a ..l_a_- ?...di_diy_ini.lb en z.ene ._ L .11. .grun po. ammin o.=pr ot ettiv o.. v i en e poi- s el?tti vame nt e | rimosso utilizzando un?adatto? reagente? la cui-natu-?-i r a_d ip e nd e r ?_d al-g rupp o_4>r o t e t ti v-O? imp i e gat o-. ? Nel 1 a

I

j realizza z i one? pre ?.eri-ta? di 1 gruppo- t e r z-but i 1 os s i- ] Learb-onilica-CBoc.)? viene-utiliz_z.at.o^per-la_protezioTT -! * ^ne-del grupno-amminico ed acido trifluoroacetico al. .

4,0__#_in. _cloruro. ..di_ me t i 1en e- .? _1 1a ge n t e.d 1 _d e.r.pro t e r _zione_selettivo impiegato.

_ Dopo la deprotezione,.la lisina.viene trattata

on.acido_aspartico_prote.tto,..di_.prefer.enza__aoldo__

J=.B.oc_-_0-b_enzil__aspartico,.e_dicic1o.esi1.c.ar.h.odiimmid

Ln-maniera nota-di-.per_s?-cos? da_formare_un_legame

peptidico tra.il-gruppo amminico libero del residuo ?ella._lisina_ed_il_gruppo__.carbossilicodell.'acido

aspartico.protetto._ !_ :_ __ __

_Il_ciclo di..deprotezione e_copulazione?conJL

derivati di amminoacido e_dicicloesilcarbodiimmide !_

viene poi ripetuto con i rimanenti amminoacidi neIla I

successione.secondo -1Jordine.del_peptide_..di_ cuinso.-pra.? Alcuni .degli-amminoacidi richiede vano_gruppi_

y1oc_c_anti_ne11ajsratena laterale oltre ?lla proteziop_

c ne_a1?a-amminica.,...._Ta1i amminoacidi ed i gruppi bloc 3o: canti-sono -1..seguenti:

.._ CysCiiBz.1)_

_Ser(oBz1.)_Thr(oBzl_)___Asp (oBzl}_Lys_(C1-z)

Lave-oBlz.._?_iUb.enzile.e.KBzi ? para-metossibenzile

Se.Cl-z ?.orto-clorobenz.11ossicarbonil_e.

_ ? completamento della sintesi forniva il see de.capeptide copulato con la resina di copoli

Imero.stirene-ditini Ibenzene:_ __ __

?TEA-Cys(iiBz1)Ser(oBzl)-Leu-Asn-Pro~Ala-Ile~Gly-?hr

_ (oBzl).-As.pCoBzl)-Lys.(Gl-z)-resina_ . .

- La decopulazione' del peptide dalla resina vieine- ottenuta, mediante. trattamento con acido fluoridrico?liquido ,__c.on__oonc omit ant e._scis sione._di? tutt i-i_ .]. gruppi -prot e 11 ivi per- -produrre-il peptide de s idera^

-4 ?O-._ i - : - : - ? - ci.

<S? _Sint e s i in _ f a s e so 1 ida . di-_re sina

0 OC

)-Ser(.oBzl)-Leu--rAsn^Pro-Ala-Ile

% -Gly-Thr(oBzl)Asp(oBzl)-Lys/Cl-z)-r-J - Il-collegamento di- N-Boc-Lys(Cl-z)? con-la- resi -I -et? na_.clorometilica . era -effettuato roediante__il .-procedi- _ ^

; C-C. ?mento -del?sale di_ cesio. ?Un canini one di -re sina ci?-- c i C ? r.ometilica -(200 . g) -contenente ? 0, 74 -nm oli- di-cloma ~-ro-per. grammo viene? trattato? con?il- cale-di -cesio di -Bo c~ 1isina-r.isul.t an te_ dall a?ne ut r a 1i z z a zi on e_ di - iij N~Boc - Ly s (C1 - z )__con _c ari o.n aio?d i ...c es i o,._Ci r.c a 73 r-8-g -i d i_JK-B oa -Lys(.C 1 - z.)___seno d i s.c io Ili? in -melano 1.0?a111-T-80?$L-ed. .acaua-al_20? quindi? re gola ti? a?pH?'7-,0-con -" i

? ' - I * circa- 29- g-di. carbonato. -di. cesio. -La-soluzione. risul.-= -innt_e__jvie.ne_cssiecata_s.u -di_ un_e.vapcr.a.tQjie? retante ^ poi- essiccala- tre? volt e-ancora-dopo?t re? agsiunte-di

L00 .ral .d i_?xi lene... Al__sa 1 e__d 1 ce s io_.di_ IL-Bo c-Lys .CUI - ss .) . ve ni v an o- -aggiun t i-2 00? g_. di-.resina? cl or omet ilio a- -di

cui -sopra-ed una -suf-f-iciente-puantit?-di? l-metil-2-j-.p.irrolidinone.. per... formare _cir.ca l.,_9_0_litri?. di volume^ totale .- La -ri su 11 ant e . _ m i s c e 1 a._v i e ne _ a gi ta i_a _a?55 ? Q

per 48 ore. La resina era poi lavata abbondantemente

con metanolo, poi con acoua, e poi di nuovo con rae-

- tanol?. La resina era essiccata all'aria, ouindi es

? siccata-sotto vuoto.-Dopo scissione della lisina de1

--[la resina con HF, l'analisi des?i amminoacidi dava

_ un.picco corrispondente,a.0,36 ramoli/g. _

- .JJn campione della resina appena descritta (~5,5

>

g.)_era .sottoposto al seguente,programma di sintesi:

Q

1)?lavaggio.con .tre.porzioni di?cloruro di metilene - TK

del-.volume di-100 mi;.2) rimozione del gruppo Boc.

o [con TF? al 40 % in cloruro di metilene per.un tempo r-j di.lavaggio di.1 minuto.e-per__un_tempo_.di reazione QQ o di_2Q minuti;._3).lavaggio,con..tr.e.porzioni di cloruro._ Zi

dicnetilene^del _volume-di 100?ml;..4)..lavaggio con

.due.porzioni.di isopropanolo.del volume_di _100__ml;

^?iavaggio.-con tre-porzioni di.cloruro..di_jnetilene._

d.e.L volume_di 100 mi; 6) lavaggio di 1 minuto e neu-

tralizzazione di 10 minuti con porzioni._di 100 ml.di

j

-trietilaramina.al.10_$._in .cloruro.di.metilene;._7)_ 1?- 7 _ vaggio con tre.-.Porzioni di .cloruro, di metilene ; 8)

_ : _ Lsi- aggiungono .2,5. equivalenti.. C7, 2 .mmoli) _di animino-; !

__ !acido Boc._e0.2,5..equivalenti_(7.2 mmoli) di diciclo-j

i

_ Lesilcarbodiimmide in cloruro di metilene e si agita

_ per.-.due_ ore ; ..9) si _lava__con _tre_jporzioni_del volume

_ ; di 100...mi -di cloruro, di .metilene ; lQ)_si_lava _con_

i ?

1

I

! ? :

' !due..porzioni, del volume.. di?lOO. mi. .di-isopropanolo ;_ i 11), si- 'lava con- tre -porzioni- d i - 100 -mi -di-clo ruro - di metilene ?..-II. ciclo di? cui-^sopra? era - ripetut o? ?er? i seguent-i?amminoacidi-N-nrotetti-; -- Boc-As p ( oB zi) - - Boc-Leu -.Boc-lhrC OBZ 1.).. -Bo c -Se r (.oB z 1-)-JBoc-Gly _ JBo C-Cys (MBzl-)-U

_Boc-Il.e_

.Boc-Ala..

C' .Boc-Pr.o..

..Boc-Asn. <XJ ?

La-. re sina^peptidica? protetta-era. sottoposta-alla-de--r-4 protezione? in -modo-da-dare -il? sale- TEA de lla-resinaf-CD

peptidica-protetta.^Una- porzione -de lla-resins^essic?? _cata._C6-g)? era.._agi-t.ata_in^presenza-di__6-ml._di? aniao.^. Lo? e _6O_jnl.-..di HE_lipyido_. a .0.^_C_-Der?unl..ora ..._Xi'.nE_e.rar _

j i r ira o.s s o medi an t e_ t rat t am e nt.o_s_o.t..t o.. vuoto? ?

duo oleoso.-era. .lavato., con __due. n orz i o ni_di_. et er e_ei; i r

1ico del volume di SO mi. Il -penti de era e stratto

d a1 1a r e s in a~ c on t r e?por z i oni-d i-5 0-ml? di a cid o?ace 1-t ico_l_t:l_e.d-i fJLLtrati -combinati -venivano- li.ofiliz-j eati.;

-II? peptide? era-dimerizzato-mediante- agi-tazione ? di .una.. s.olu ion e .. in_ a c a u a _a.-.pH ..9., .Q_ per_tre._ giorni

in? pr e se n z a-di_ar i a.... E s s.o_.er.SL_p.oi __1 i_o fili zza to_e_sp t itoposto a distribuzione in contro-corrente..nel siste-

_ ma:

jQ,1 ;?_a.c.id.o_.ac.etico/bu.tanolo/piridina_-_ll/5/3.

_Le__frazioni_pi?.,pure.,veni.v.ano_uIteriormente_

CX

i/i jpurificate-mediante-cromatograf ia su -colonna-di-caf-o:

? * jbossimetilcellulosa usando un - gradiente-di-bicarbona?- ? o oc O

O

tO-dl ammonio_da._0,01JM_a-.Q,Q5-M.y-Il-j>epetide-puro crt ~?' ?

er.a_liofilizzato_c.osi.~da dare--' 7-7- mg.. - ?

<=3 JLlanalisi-.degli- amminoacidi? del-peptide dopo- 1 ' ? - JC r-j ?idrolisi . acida dava:., lisina - , -ammoniaca ,~acir- ? C-<

1,14 ??86 | "? cd jdOL-aspart 1??^-?.? ?treonina^? 22 ser^-nao~q6 ;_/Prolinai? O?-|

glicina^-QQ^ alanina^-Q^r -cisteinaQ-^g,-isoleucina0?gg,-

e?leucinaQ-^ .?La-cromatografia su -strato sottile di-

.celluloda.-in~butanolo/acetato di-etile/acido-aceticp/ ?

acqua nel..rapporto...l/l/l/l_dava.u? valore.~R~-.di?0,64-| * ?

:con una macchia_suoeriore_minore.. Ouando si?impiegava?

I ? ^ !

a_cramato grafia_su_strato.so1til.e_di?cellulo?a_c.on \-

Ibut?nol o/piridina/acid o-ace tic o/acqua? nel? rapporto-

-J1.5-AQ/3/l2.,_.il.jvalor_e-.di_..Rf_era di -Q,45 anche? con? i

?ina macchia anneri ore minore .. L.1 e le.t_tr.of or e_s 1_ su _ca r_t a

V/hatman _.3ivIK .. con.. tamr)one._di_acetato_di_piridina_a pH

! i

|6.,A.mostrava una-macchia.-singola-nella_posizione .n.e.u^?

tra,..Rf-0,20,-con riferimento all?acido-picrico.-

_ Il-compost o..(ra).contenente.JLa_medesima..sequenza

di.antigeni del..composto-n).viene,preparato nello.

stesso modo e caratterizzato nello stesso, modo.

_ _ . _ RIVENDICAZIONI _ ....

I

_ _l..._Composti_peptidici-.ant?6?enici_disr)Osti_.in _ !_ xma-suc cessione da amminoacidi . N-terminali -ad-ammi-j j? Q <ynoacidi .C-terminali ..scelti dalla. classe. -costituita. ; : < . -Ida ! C, _ : _ aXj&lu^Gln-Leu=Ile-Gln-Asn-Leu-Val^Pr.o-Glu,-Asp--_ c-O a - - : - Lys__.. - : -) ._ ..Glu-Gln? Le u=I 1 e -Gl nr A s n? Leu? Va 1 -Pr o? Glu.;rAs p? _ . r~4

'O _ Lys-Leu - - - - - -. _

| ~? r-J oc _ _ .c)_Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Gl_u=Asp- ... -<&

CQ

_ _.Lys~Leu-Ser _ ! _ co

.d)_Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp- ... - - - Lys-Leu-Ser-Arg - = - : - -_ _ e )_ -C y s - Gl u - G 1 n- Le u - 11 e - G 1 n - A s n - Le u -V a 1 -P r o - Giu - _ _ _ Asp-Lys _

_ f } Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu- _

? * - ?,? ?- ; ? _ A.sp-Lys-Leu_ _ 1 _

! _ g.)__ C.ys-Glu-Gln-Ieu-Il.e.-Gln-Asn-Ieu-Yal^Pro-.Glu- _ _ _ As p- Ly a -Le u -S e r _ ? _ | _

! _ h)... C.ys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Ieu-Yal-Pro-Glu-. -_ ? Asp --Lys^Leu-S e r -Ar g - - - - -_ i )_ Il e r S e.r-Gly-Ph.e-Pr.Oj^Y a 1 -GlyrArg., _

_ (j )_Ile.-Ger-Gly-Phe )Pro-Val-Gl y-Arg- V a 1 , _

_ k _ G 1 y - 1 i.e - S e r - G 1 y -Ph e-Prp - V a 1 - G 1 y - A r g _ .

_ Gly^I?e-rSer-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Ar-g-Val-, - ]-

_ mX -Se r - Le u -As n-Pr.o - A 1 a-Ile-Gly-Thr~Asp -Ly s.,. _el

_ _ n X .Cy s - Se r - Leu- As n-Pr o -A 1 a- 11 e - Gly-Thr?? As p -Lyi-,

in._?cui_Gly__r.apDT.e.s.enta la..glic.ina_e__Glu,_G.ln,__Le.u;

tle ,. Asn Val-,. -Pro , -Asp Lys , - Ser ,? Arg,? Cys-,- Phe ?a. -11a_.e_.Thr., _rispe_tt ivament e .rappre sentanp.__le _forme di

o oc C^ammin oa cido. .d i _ ac id o__giu t ammitr o,... glutammina ,_.leu c

o OC :la, _is Q1 cucina _aspar agina_, _yalina,__;nr_olina , acido. '?sS

_aspar.tic.o-,..-l.isina,.-.s.e.rina-, _arginina.,__c , _f eni

O

_alanina,_alanina -e -treonina.

Si oc _ 2 ..... Corap o s t i __pe p t i d i c i .d a _ aX _ ad __h)_ de 11 a _r i ve ndi- _ <? CD nazione...! _che . includono la s.eauenza_.di._12.-_aniniinoacidi _ __

_3 C.ompos t o _p ep t id i c o eX.de.l la_riv.e ndi nazione . :L..

4?. Composti peptidici da il a 1) della rivendi-

a z i on e_l_.che._ includ ono ..1 a_ seciuenza di 8 armino

?i_iX?

5 ... -C omp o s t o._p ep t x d ? c o l.)_ d ella. ..rive ndi c a zi on e._X...

6. Composto m") e n) della rivendic a - i c?

- ? ione -1-. ? - : -!

_ 7. Composto peptidico ni della rivendicazione jl.

:_ poma.; _ 2 4 MG. 18??_ _

NORTHWESTERN:' UNIVERSITY?'

- -? U ? ING,... BARZANO & ZANARDO ROMA G .p . A ,

XMAQAU&

8237

/ ' No. di serie: 267021

Data di deposito: 26/5/81 4849 7 A/ 8 2 Cl?sse: 260

No. di grappo : 125

Richiedente? ERwIN GOLDBERG, EVANSTON, IL.

DATI DI CONTINUAZIONE.

VERIFICATO DOMANDE DEL PCT/ESTERE.

VERIFICATO

Come depositata: Stato o paese IL? Tavole di disegni 0 ;_ Riv. totali 5; Riv . indipendenti 1; Tassa di deposito ricevuta 65;

Indirizzare la corri spondenza ai_

TIMOTHY L. TILTON

TILTON, FALLON, LUNGMUS & CHESTNUT 209 S. LA SALLE, ST. , STE. 1 160

CHICAGO, IL 60604 _ _

Titolo dell* invenzione ; 11 COMPOSTI PEPTIDICI LINEARI ANTIGENICI"

Si certifica con la presente che 1 ^Ilegato costituisce copia fedele ed esatta tratta dai Registri dell "Ufficio Brevetti degli Stati Uniti del-?la domanda originariamente depositata come identif icata.

Per autori zzazione del COMMISSARIO DEI BREVETTI

F. to: Illeggibile Ufficiale Certificante (SIGILLO) data 1 1 MAGGIO 1982

26 MAGGIO 1981

267021

"COP?POSTI PEPTIDICI LINEARI. ANTI CENICI tl

RIASSUNTO :

i'

I cqmposti^^riginali^peptidici^linesrLan-L?

t i genie i del la present e inv enzione sono cajratt er i z?

zati dal fatto che forni re una sequenza di 8 ammi-?

noacidi ohe comprende i so leu c i na- s e rina-glicina-f eni 1-

a lanina-prolina-valina-glicina-arginina. tutt i gl i

| ammi noacidi con la eccezione della filicina essendo

nelle loro forme L. La isoleucina pu? comprendere

' X* estremo N-terminale oppure pu? essere legata al

_ .N-terminale della gli cina, e l? arsi nina pu? ess ere

1 ' amminoacido C-terminale ovvero pu? essere legata

alla vai ina nel C-terminale. I composti hanno utili-I

;t? nei vaccini per ridurre la fertilit? dei mammiferi,

! FONDAMENTO E TECNICA PRECEDENTE

Gli spermatozoi dei mammiferi sono noti co-

me anti genici gi? da molti anni. Pi? di recente ? sta-

to dimostrato che- lo sperma dei mammiferi contiene

rni enzima anti genico, che ? noto come C .-isozima di [ ; ^ !" ^ . -lattato-deidrogenasi (LDH-X, - L -DH-C 4. -) . LDH-C 4 ? - ? stato!

i so lato in forma cristallina pura dai testicoli di

topi . Goldb e rg (1972) J Biol. Chem 247:2044-2048.

* L' enzima possiede un peso molecolare di 140. 000 ed ? composto da quattro sub-unit? identiche G. La sequenza

I

di amminoacidi e la struttura tridimensionale di

' LIH-C^ ? stata studiata e parzialmente determinata

! da un certo numero di ricercatori. Si veda per questo Musick et al ( 1976) J. Mol. Biol. 104: 659-668;

Wheat et al ( 1977) Biochem. & Biophys. Res. Gomm, , 74.

No. 1: 1066-1077. Wheat et al hanno determinato la se-1 auenza del peptide tiolico essenziale dall' amminoacido

. 159 al 171 . ed hanno trovato che auesto ? quasi identico ai peptidi tiolici essenziali provenienti da altri LIH isozimi di vertebrati.

. .. . .. ?

Nel 1374 il Dr. Erwin G?ldberg ha passato . I

. rin rassegna gli effetti dell* immunizzazione con LBH-X

!

: I (LLH-C H,,-) sulla fertilit?, ed ha avanzato l' ipotes ..i t ;

1 della possibilit? secondo la auale "impiegando un

! costituente macro mole col are definito dello sperma i

! I

diventa possibile rendere chiara la sua stru -ttura - i ? primaria in termini di sequenza di amminoacidi , e c? --j del

i struire una mappa in maniera specifica/determinante

! o dei determinanti antigenici che sono responsabili , 1 della induzione di infertilit?, e poi costruire i

! peptidi sintetici contenenti Questi determinanti .

Il fatto di possedere la capacit? di sintetizzare

una molecola con tali propriet?, rende il tentativo

^di tipo immunol?gico di controllare la fertilit? possibile". Karolinska Symposia _on Research Methods in ? Reproductive Endocrinology, 7th Symposia; Immunologi-, i 'Cai Approaches to Fertility Control, Geneva,_J9_74202-222. ,^Tuttavia, tali-p-e-ptidi-antigenici sintetici rimaneva-pno uno scopo e non un effettivo possesso , sebbene la

; loro_ de siderabi lit? teori ca fosse stata ricono se iuta.

_Nel i_979_ii j}r , Erwin Gol db erg ha e sp o sto s ommaria- , ment e _ lo stato de 1 ramo relativo nel modo seguente:

" In conclusione, e su base pratica, _ la immunoterapia per il controllo delle nascite richiede pi? che efficienza._

+ la specificit?, reversibilit? e l'assenza di reazioni collaterali sistemiche.

+ Quantit? piuttosto grandi dell*antige-II ne devono essere disponibili in forma

i

? inequivocabilmente pura. Questa condii

zione probabilmente non pu? essere soddisfatta da un antigene enzimatico pro-

1

+ dotto naturale ottenuto dallo sperma

o testicoli. Piuttosto, la tecnologia

+ contraccettiva richiede un frammento

!

peptidico sintetizzabile che trattiene il carattere antigenico e provoca una risposta che danneggia la fertilit?.

i

<

Il comp le tomento dell 1 anali si strutturale di LDH-C ^ dovrebbe permettere la co- _ i struzione di mappe di determinanti ariti genici e la sintesi di tali peptidi per l' impiego in ula tecnologia contrae c etti va nuova". Recent Advances in Reproduction and Regulation of Fertility, G.P. Talwar, editor, Elseview/ North Holland Biomedicai Press? ( 1979) .

SO POTAR IO DELL' INVENZIONE

Ora h stato scoperto che si pu? preparare ; un peptide fortemente antigeni co medi ante la sintesi ; di una 3equenz? a lineare di otto ammiroacidi compren-! denti ; isoleucina-serina-glicina?rf enilalanina-p rolina-valina-glicinararginina. Tutti gli amminoacidi. usati per produrre il peptide precedente sono nella; loro forma L con l'eccezione della glicina . La isoleucina ? sii terminale N e l' arginina e sul terminale . C. L'azione antigenica del peptide pu? essere au-* i * [ I menila o potenziata mediante l' aggiunta della glicina al N-terminale di isoleucina, e/ ovvero l'ag? ; ' giunta di vaiina al O-terminale di arginina. Cos?, 1 composti peptidici lineari antigenici della pre- ; t sente invenzione includono almeno quattro composti i ?

: i quali hanno lunghezze di catena che vanno da 8 a 10 amminoacidi , tutti i quali includono la sequenza f di otto ammihoacidi dalla isoleucina alla arginina, . ed hanno un N-terminale di isoleucina o glieina, e come C-terminale la arginina o la vaiina. Da una . pubblicazione recente si pu? vedere che la sequenza

r antigenica primaria di otto amminoacidi, dalla isoleucina alla arginina, corrisponde agli amminoacidi ,

ci ' da 152 a 159 di LDH-C^, mentre la girila ? l'ammino- , acido 151 e la vaiina 1* amminoacido 160. Musick et al(25 Ag?sto. 1979)J. Biol. Chera. , 254, No. 16:7621-7623.

I

H? DESCRIZIONE DELL* Di YEN Z IONE

La presente invenzione si riferisce ad una classe originale di peptidi lineari anti genici i quali hanno lunghezze di catena di 8 fino a 10 amminoa->cidi e che sono caratterizzati dal fatto di contene-j I

; re una sequenza antigenica specifica. Quattro

I sti che provengono dalla classe dei composbi della presente invenziong?ono identificati come segue:

( 1 ) N-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-V al-Gly-Arg-C

(2) N-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-C (3) N-Gly-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-;C (4) N-Gly-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro -Val-Gly-Arj r_Val-C Nelle formule che precedono, la lettera

"N" indica 1' amminoacido N- termi naie, mentre la lettera "C" indica 1* amminoacido C-terminale. Gly rap l presenta la glieina, e Ile, Ser, Phe, Pro, Val, e _ Arg rispettivamente rappresentano le forme di_ L- amminoacido della isoleucina, della serina, della fenilalanina, prolina, vaiina ed arginina. Come verr? notato , tutti i composti includono la sequenza di ammano- _ acidi del c -omposto (1). Nel composto ?( ,2), la vaiina ( viene aggiunta all' estremo C-t ermi naie cos? da agire i _ ? "? I come amminoacido di stanziatore e cos? da potenziare 1 i? - :- r -'il carattere immunogeno. Questo muover? il centro ; legante antigenico ulteriormente allontanandolo dal gruppo carbossili co libero. Come alternativa, la glicina pu? essere aggiunta all?estremo N-terminale co-I

| s? da servire come distanziatore per migliorare il .

carattere immunogeno, come rappresentato dal compo- j sto (3). Altri amminoacidi possono essere analoga- !

-mente impiegati come distanziatori a .gli . estremi ter- -:minali della sequenza antigenica basica (1). Il comi posto antigenico preferito ? perci? il composto (4) J -i - ? - 1 -i che contiene TO amminoacidi con la gLicina N-termin?->

' le e la vaiina C-terminale. Come sar? evidente a coj loro che sono esperti nel ramo relativo alla immuno-| logia, altri amminoacidi C- e N-terminali possono es sj sere sostituiti, trattenendo o potenziando il carat-? tere antigenico. J :

; Negli studi che conducono alla scoperta de f i

I

composti peptidici precedenti, la lattato-deidroge-' nasi-C^ pura cristallina veniva posta a digerire con la tripsina in urea 2 molare a 37?C per 4 ore in moi do da produrre una miscela di frammenti peptidici. Questa miscela era sottoposta alla cromatografia su di uno scambiatore cationico forte. I frammenti peptidici adsorbiti venivano eluiti a 50?G con un gradiente da piridina-acetato 0,01M, a pH 3? 1 , fino a piridina-acetato 2,0M, a pH 5,0. I peptidi eluiti venivano rivelati con la fluo re s cammina. Gli eluiti provenienti | dalla colonna fornivano 1 1 miscele di peptidi . Un sag i gio veniva sviluppato per determinare il legame degli ] anti corpi dei frammenti peptidici. In un adattamento ? ' ^ - [ -di un saggio radio immunologi co su matrice solida, url ja I soluzione acquosa dei peptidi viene usata per rive- ! stire la superficie dei pozzetti di una piastra di | i microtitolazione di cloruro di polivinile. La pia- I ' stra viene poi fatta reagire con anti-LIM-G^ in mani re~-i

4 - ra tale che i p - -eptidi legati si complessino con lf an ; --I i ticorpo specifico. La quantit? di anticorpo legata ; ? viene quindi determinata quantitativamente con un secondo anticorpo marcato. Questo fornisce una misura del grado dell* interazione tra un peptide par? ; ticolare od una particolare miscela di peptidi e 1* anti corpo con LDH-C^ nativo. Le undici miscele di pepti-

i

di venivano provate con questa tecnica. Solamente una rfrazione veniva trovata attiva, che era anche mostrata essere costituita da un peptide singolo. Tutte le altre frazioni erano iiattive ovvero erano una misce-:la di peptidi. Il peptide isolato antigenieamente attivo cos? scoperto secondo quanto si trovava corri-'

l spondeva come struttura al composto (t) come: sopra e stato fissato. Questo peptide ad una concentrazione di 1 , 5 x 1(?4 M lega 1 ~?09 cpm di anti-LHI-C^ ma sol-1tanto 96 cpm di gamma-globulina di controllo._ ^_ ? _ I composti peptidici della presente inven7 t zione possono essere sintetizzati dai loro amminoacidi costituenti. Per esempio la sintesi pu? essere con- i dotta mediante il procedimento in fase solida di * ?Merrifield come descritto in J.A.C.S. 85:2149-2154 1

! . ( 1963) . Questo procedimento in fase solida per la _ . sintesi delle sequenze di amminoacidi ? anche descriti " ~ " | !to in Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis i i(W.H. Preeman and Co., San Francisco, 1969) pagine | |1-4. In questa tecnica, lfamminoacido C-terminaie come l' arginina per i composti ( 1 ) e (3) o la valin? i ! jper i composti (2) e (4) ? attaccato alle perline c?i ! j polimeriche di polistirene cloro me tilato-divinilben^? i

; zene.

Ciascun amminoacido susseguente , con un

I I

I

^adatto gruppo di protezione, viene, quindi aggiunto . , in successione alla catena in creso ita.__Per_esemp?o come ? descritto nell* articolo gi? citato di Mejalfleld il gruppo di protezione pu? essere un gruppo carhohenzo s silico. Mediante la tecnica di copulazione , allon- . J tanamento della pr? tezione . e copulazione dell? ammj- _ , no acido successivo , si pu? produrre la desiderata , I 1

, s e que nza di amminoacidi con la deside rata lunghe zza di catena. Come stadio finale, il gruppo di protezio-_ne viens rimosso dall' amminoacido N-t ermi naie e 1* am-* , minoacido C-terminale viene scisso dalla resina, us?n-.do un adatto reattivo come ad esempio lucido trifl?o-| roacetico ed acido bromidrico. Poich? questa tecnica ; di sintesi ? ben nota, non si ritiene che sar? necel-| sario descrivere la stessa ulteriormente qui. I comgo-1sti (1), (2), (3) e (4), come sopra ? stato descritto, sono preparati mediante questa tecnica di sintesi per l? impiego nel ridurre la fertilit? dei mammiferi .

^ _ Allo scopo di utilizzare un pepti de antig?? ? 1 ni co della presente invenzione nella forma di un _

)

vaccino che h capace di ridurre la fertilit?, il peptii de ? coniugato ad ina molecola di supporto o veicolo. ! eh e ? di preferenza una proteina la quale essa stes-? sa stimola una risposta antigenica la quale pu? essere somministrata con sicurezza. Per esempio il pepti? 1 \ de pu? essere copulato al toss "oide del tetano per la i ! ! somministrazione mediante iniezione intramuscolare. ? 1

( Per esempio una miscela di 1 micromole di tossoide }

i del tetano, 60 micromoli di peptide anti genico, e < 18 mmoli di 1-etil-3-*( 3 dimetil amminoprooiljcarbo-1

i diimmide cloridrato , fatti reagire in acqua (pH 6) i per 12 ore a temperatura ambiente e 24 ore a 4? for-' ? T ni sce un prodotto contenente 3, 5 moli di peptide/

? mole d? tossoide del tetano. I reagenti in eccesso

! ? i possono essere rimossi mediante di alisi o filtrazione : su gel. Si veda per questo Piqu? et al, Immunochemistry , 15 : 55-60 ( 1978) . Come alternativa il peptide pu? esi sere copulato impiegando una benzidina bi sdi azotata -i ; | (Bassiri et al, Endocrinology, 90: 722 ( 1972 -) ovvero j! -la glutaraldeide. j 1 ' . 1 , Per la iniezione intramuscolare, il pepti?-1 i : de copulato pu? essere sospeso in una soluzione sa-! ! lina isotonica sterile ovvero altro veicolo conven-! zionale, e se si desidera con agente ausiliario pu? . essere incluso. Un impiego preferito di tale vacci-! no ? per la somministrazione ad esseri umani di ses 1

! t so femminile. Si potranno formare anticorpl , che ap ! paiono nei fluidi dell'ovidotto e cos? raggiungono una riduzione significativa di fertilit?. Per questo proposito la quantit? da somministrare varier? da circa 1 a 10 mg del peptide antigenico.

Io rivendico:

1. I composti peptidici lineari aventi lunghezze di catena che vanno da 8 a 10 amminoacidi disposti in una successione da sterminale a C-terminale di amminoacido che include la sequenza antigenica 4-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg, detti composti essendo scelti dalla classe dei composti costituiti ! da:

(a) Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg,

(b) Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val , (c) Gly-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg, e (d) Gly-Ile-Ser-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val in cui Gly rappresenta la glieina, e Ile, Ser, Phe,' Pro , Val, e Arg rispettivamente rappresentano le forme di L-amminoacido di isoleucina, serina, fenilalanina, prolina, vaiina ed arginina.

2. Il peptide anti genico della rivendica-

H ? zio ' ne_ 1 av ente la sequenza di amminoacidi (a) .

_ 3. Il peptide anti geni co della rivendicazione 1 f avente la sequenza di amminoacidi (b) .

_ 4. Il penti de anti genico della rivendi cazi ne 1 avent e la sequenza di amminoacidi (c)^

5. Il peptide anti geni co della rivendi ca-, zi one 1 avente la sequenza di aromi no acidi ( d) .

(

/ No. di serie : 277623

Data di deposito: 26/6/81 44 i 1/ 8 2

Classe: 260

No. di gruppo: 125

Richiedente : ERWIN GOLDBERG, EVANSTON, IL.

'DATI DI CONTINUAZIONE,

VERIFICATO DOMANDE DEL PCT/ESTERE.

VERIFICATO

Come depositata: Stato o paese IL; Tavole di disegni 0; Riv. totali 2; Riv. indipendenti 2; Tassa di deposito ricevuta $ 75

Indirizzare la corrispondenza a:

TIMOTHY L. TILTON

TILTON, FALLON, LUNGMUS & CHESTNUT 209 SOUTH LA SALLE ST.

CHICAGO , IL 60604

titolo dell'invenzione: "Composto peptidico lineare anti genico"

Si certifica con la presente che l' allegato costituisce copia fedele ed esatta tratta dai Registri dell'Ufficio Brevetti degli Stati Uniti della ?bmanda originariamente depositata come sopra identif icata.

Per autorizzazione del COMMISSARIO-DEI*BREVETTI F.to: Illeggibile Ufficiale Certificante (SIGILLO) data 13 MAGGIO 1982

26 GIUGNO 1981

277623_

DOMANDA DI ATTESTATO DI BREVETTO PER GLI STATI UNITI

' '_C Lo mp_o st o_ .p eptidico _ linear e _an t i gen i c o "

RIAS SUNTO : II co mposto pept idi co lineare ant irenico , originale a cui si riferisce la presente invenzione comprend e una sequenza di 10 amminoacid i e cio? se? jri na-leuc i na- asparagi na-pro li na-alani na-isoleucina-' glicina-treonina-acido asxartico-lisina, tutti RL? _ amminoacidi essendo nelle loro forme L con la eccezione della glieina. Il composto possiede utilit? ? nei vaccini per ridurre la fertilit? dei mammiferi,

FONDAMENTO E TECNICA PRECEDENTE

Gli spermatozoi dei mammiferi sono gi? noti come antigeni ci da molti anni Pi? di recente ? stato dimostrato che lo sperma dei mammiferi conti e-^_ne u n en zi ma anti genico che ? noto co me_ i so zi ma C^ .. di lattato-dei drogenasi (LDH-X, LDH-C ^, ) . LDH-C 4 , ? ' ] i stato isolato in forma pura cristallina dai test ico-jli di topo. Goldherg ( 1972) J.Biol. Chem . 247: 204 4-2048. L' enzima possiede peso molecolare di 140*000 ed ? composto da quattro sub-unit? i denti che C ._ La sequenza di amminoacidi e la struttura tridimensiona- ' le - di LBH-C 4.^ - ? stato studiata ed ? stata p ^ -arzialmente determinata da un certo numero di ricercatori . Si veda Musiek et al ( 1976) J. M?l. Biol. 104: 659-668; e Wheat et al ( 1977) Biochem. & Biophys. Res. Comm. , 74-, No. 3: 1066-1077. Wheat et al. hanno determinato la sequenza del peptide tiolico essenziale dall' amminoacido 159 a 171 , ed ha trovato che questa ? quasi identica ai peptidi tiolici essenziali provenienti da altri i sozimi vertebrati di LBH.

Nel 1974 il Dr. Erwin Goldberg ha passato , in rassegna gli effetti dell? immunizzazione con LDH-X (LBH-C^ ) sulla fertilit?, ed ha avanzato la proposta della possibilit? secondo la quale "impiegando un costituente macro molecolare definito dello sperma diventa possibile rendere chiara la sua struttura pri-1

maria in termini di sequenza di amminoacidi , per costruire una mappa in maniera specifi ca del de terminante o dei determinanti ariti genici che sono responsabili della induzione della infertilit?, e quindi _ | costruire peptidi sintetici che contengono questi _ | agenti determinanti . Il fatto di possedere la capacit? di sintetiz zare una molecola con tali propriet?, rende il tentativo immunologi co di co nt rollare la , f edilit? possibile". Karolinska Sympo s i a _on Research Methods in Reproductive Endocrinology, 7th Symposi a : Inumino logicai Approache 3 to Ferti li ty Control, Geneya , 1974 202-222 . Tuttavia, tale peptide antigeni co s i n-, tetico restava uno, scopo e non un raggiungimento ef-, fettivo. sebbene la desiderabilit? teorica di tale peptide fosse stata riconosciuta. Nel 1979 il Dr. , Erwin Go ldberg ha esposto sommariamente lo stato del ramo relativo al modo seguente : _

" In conclusione e su base pratica, la J, mimino ter ap i a per il controllo

delle nascite richiede pi? che efficienza la specificit?, reversibilit? ed assenza di reazioni collaterali sistemiche. , Piuttosto, quantit? grandi dell1 anti gene ? devono essere disponibili in forma inequivocabilmente pura. Questa condizione probabilmente non pu? essere so d disfatta da un antigene enzimatico come prodotto naturale proveniente da sp erma 0 testicoli. Piuttos to, la tecnoio gi? contracc ettiva ri chi ede^ un frammento pepti dico sintetizzabile che mantiene il carattere anti geni co e provoca una risposta la quale danneggia la ferti li t ?. Il completamento dell* anali si strutturarle di LIH-C^ dovrebbe permettere la co? _ : _ sjfcruzione delle mappe dei determinanti ! antigenici e dovrebbe permettere la

| sintesi di tali peptidi per l'uso in

I ?

una tecnologia contraccettiva nuova" Recent Advances in Reproduction and Regulation of Fertility" , G.P. Talwar^ editor, Elsevier/North Holland Biomedicai Press ( 1979) .

SOMMARIO BELL*INVENZIONE

{_ Ora ? . stat.o_sc_op.e.r.to_ch.e_urLJ|?epti.de_anti genico pu?._as_se_r_e_preparato_me_dian.te_l a -sintesi di una_ 4_sequen za_ 1ine ar.e _di_._10 ammi no ac i.d i_c ompnendent e ae^? | : j_rina-leucina-asparagi.na=.prolina-alanina^ino.leucina- ' -!

! glie ina^treonirLa-acido_aspartico-lisi na. Tutti_gli _ L_ I I

! _ammi.no ac idi usati. .p_e.r_pr_o.durre_il_pep-ti.de_precedente i LsonoL_nella_loro__fo.rma_L_c.on IV ec c e z ione de lla-gldcina 1 jche possiede soltanto una forma . Il N-t.e rmi.nale_?_laU I_ s aerina ed il C-t ermi naie fe la lisina. _ Sebbene non j f ; !Sia_nat.o_con cert.ezza,_s.i?ri ti ene pe r?._che_la_sequenU^ ? iz a_pr.e c_e d en.t e . d i 10 ammi no.ac.i d i corrisponda agli a,m- I {mjnoaC idi- da 21 1 a 3P0 di LDH-0 . Questo b. eontna-rin j 4

. Iad una sequenza presentata di re_c_en_t.e_e_j)nbbllcata _ ? Icome tentativo. Si veda Musick et al ( 1979) J- Bini . _ .0Mm._.254t No. 16: 7621-762^. _

_ BES0RXZ.P0?RE.. DELL * INVENZIONE _

La presente invenzione si riferisce ad un peptide lineare originale anti genico avente una lunghezza di catena di 10 amminoacidi. La formula di questo peptide pu? essere rappresentata come segue :

N- S e r- Leu- A sn-P ro - A la- 1 le- G-ly-Th r- Asp - Lys-C Nella formula che precede la lettera "NM designa 1* amminoacido N-terminale mentre la lettera ?G" designa 1* amminoacido C-terminale. Ser, Leu, Asn, ? -

Pro , Ala, Ile, Thr, Asp e Lys rappresentano le forme di L- ammano aci do rispettivamente della cisteina, serina, leucina, asparagiaia, prolina, alanina, isoleucina, treonina, acido aspartico e lisina, e Gly rappresenta ? la glieina.

1

: Il composto peptidico della presente inve? 1? i 1 zione pu? essere sintetizzato dai suoi amminoacidi ! i !costituenti. Per esempio la sintesi pu? essere con- * dotta mediante il procedimento in fase solida di Merrifield come descritto in J.A.O. S. 85: 2149-2134 1 . Questo procedimento in fase solida per la sintesi di sequenze di amminoacidi viene anche descr?ti to in Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synth e s i s (W.H. Freeman and Co. , San Francisco, 1969) , pagine 1-4. In questa tecnica, 1* amminoacido C-terminale come ad esempio ? , la serina per il composto della presante invenzione , ? attaccato a perline copolimeriI che di poli stirene cloro met i lato -di vi ni lbenzene . Ci a-: scun amminoacido susseguente con un adatto gruppo di _ protezione viene poi aggiunto in sequenza alla cate- _ : na in crescita. Per e sempio come descritto nell?a r t i -i j colo di Merrifield, i 1 gruppo di prote zione pu? essere un gruppo carbobenzossi li co. Mediante la tecnica di copulazione , deprotezione e copulazione del- _ | | l1 amminoacido successivo , la sequenza desiderata di amminoacidi e la desidera lunghe zza di catena possono essere prodotte. Come stadio finale, _ il gruppo _ di protezione vi ene rimosso dall1 amminoacido N-tere

j minale (cio? la lisina) ,/l1 amminoacido C-terminale vi ene sci sso dalla resina, usando un adatto reattivo, come ad esempio lucido tri fluoro ac etico e l' ai

Oido bromidrico . Poich? questa tecnica di sintesi ~! - - 1 ? |? ben nota, non si ritiene che sar? necessario de? ? i : jscrivere ulteriormente la stessa in questo testo .

I III peptide della presente invenzione pu? essere pre-? iparato mediante questa tecnica di sintesi per l' impier

?

jgo nel ridurre la fertilit? dei mammiferi ,

_j_ Allo scopo di utilizzare il peptide antijgenico a cui si riferisce la presente invenzione nel-Ila forma di un vaccino che riduce la fertilit?, il [peptide ? coniugato con una molecola che agisce come; (Veicolo o supposto , che ? di preferenza una proteina 1 ? : -

i

? la quale essa stessa stimola una risposta antigenica e la quale pu? essere con sicurezza somministrata.

Per esempio , il peptide pu? essere copulato con il ? itossoide del tetano per la somministrazione mediante iniezione intramuscolare. Per esempio, una miscela di 1 microraole di tossoide del tetano , 60 micromoli di ! peptide anti genico, e 18 mmoli di 1-etil-3-(3-dime- ' tilamminopropil) carbodiimmide cloridrato reagiti in acqua (pH 6) per 12 ore a temperatura ambiente e 24 ore a 4? fornisce un prodotto contenente 3, 5 moli

di peptide/ mole di tossoide del tetano. I reattivi presenti in eccesso possono essere rimossi a mezzo di dialisi od a mezzo di filtrazione su gel. Si veda

pe rquesto Piqu? et al, Immunochemistry 15: 55-60 I H - ; - h ( 1978) . Come alternativa il peptide pu? essere copu-? ,lato impiegando la benzidina bisdiazotata (Bassiri et al, Endo c ri no lo gy , 90: 722 ( 1972) ovvero la g?utaraldeide;

Allo scopo di facilitare _1 a. _c opu la zione cos? da dare _ 'una proteina, un amminoacido aggiuntivo _c orne .J,a_c i= _ i

steina pu? essere attaccato alla s e rina N-termi naie . _ i

Per esen?)io il composto preparato in una forma per la copulazione sarebbe :

_ N-Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Thr-Asp-Lys-C. _ _ Per l'iniezione intramuscolare, il penti- . i

de copulato pu? essere sospeso in una soluzione sali' _ ( na i so toni c a sterile ovvero alt ro v e i co lo conven-_ _ . zionale e se si desidera si pu? anche includere un

l agente ausiliario. Un impiego preferito di tale vaccino ? per la somministrazione ad esseri umani di sesso femminile. Gli anticorpi verranno cosi forma-7 I ' " h : i quali appariranno poi nei fluidi dell'ovidotto ; e cosi raggiungeranno una riduzione s ignificativa di fertilit?. Per ques to proposito la quantit? da somministrare varier? da circa 1 a 10 mg del peptide anti genico.

Io rivendico:

1 , Il composto peptidico lineare antige-' - ni co avente la formula; -N? 3 e r-Leu-Asn-Pro-Ala- Ile? Gly-Thr? Asp? Lys-C in cui N-Ser ? la serina N- terminale e Lys-C ? una j , lisina C-t e mainale e Leu, Asn, Pro, Ala, Ile, Thr, ; I

, e Asp sono le forme di L-amminoacido rispettivamente 1 [ della leucina, asparagina, prolina, alanina, isoleu? | I ? ) cina, treonina, ed acido aspartico, e Gly ? la glicina.

2. Composto peptidico lineare antigenico avente la formula:

i N-Oys-Ser-leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Grly-Thr-Asp-Lys-C i in cui N-Cys ? la castina N-terminale e Lys-C ? la [ lisina C-terminale e Ser, Leu, Asn, Pro , Ala, Ile, | Thr e Asp sono le forme di L-amminoacido rispetti-

i

No. di serie : 280295 4040 i * / o d , Data di deposito: 6/7/81

Glasse: 260

No. di gnippo: 125

Richiedente: ERWIN GOLDBERG, EVANSTON, IL

DATI DI CONTINUAZIONE,

VERIFICATO DOMANDE DEL PCT/ESTERE,

VERIFICATO

Come depositata: Stato o paese IL; Tavole di disegni 0; ;Riv. totali 2; Riv. indipendenti 2; Tassa di deposito ricevuta & 75

. Indirizzare la corrispondenza a:

TIMOTHY L. TILTON

TI ITO N, FALLON, LUNGMUS & CHESTNUT 209 SOUTH LA SALT

CHICAGO f IL? 60604

Tito lo dell* i nve.nzione Compo.S_to_p.ept.i.dico_anti geni co "

Si certifica con la presente che l?al legato costituisce conia fedele ed esatta t rafcta-da 1 ! Registri dell'Ufficio Brevetti degli Stati TTni-hj della domanda originariamente deposi tata, come sop-ra i. dentif icata

Per autorizzazione del COMMIS S ARIO -DEV'BREVETTI F. to : Illeggibile

Uff?c rate Cent i f icarite

; (SIGILLO) Data 13 MAGGIO 1982

6 LUGLIO 1981

280295

"Con^posto peptidi co antigenico" RIASSUNTO : Il composto peptidico originale antigenico della presente invenzione comprende una sequenfza di dodici animino acidi , e cio? acido glutammico-: glutammina-leucinarisoleucina? glutammi na-leuc i navalina-prolina-acido glutammico? acido aspartico? lisina, tutti gli amminoacidi essendo nelle loro forme L. Il composto ha utilit? nei vaccini per ridur? re la fertilit? dei mammiferi

FONDAMENTO E TECNICA PRECEDENTE

Gi? da molti anni gli spermatozoi dei manimiferi sono noti come agenti antigenici . Pi? di recante, ? stato dimostrato che lo sperma di mammife?

4-ri contiene un - enzima antigenico, che ? noto come C^ isozima di lat tato-dei drogenasi (LDH-X, LDH-C ^ ) .j LDH-C A h stato isolato in forma cristallina pura testicoli di topo. Goldberg ( 1972) J.Biol. Chem.

247: 2044-2048. L' enzima possiede peso molecolare di 140.000 ed ? composto da quattro sub? unit? i denti? che C. La sequenza di amminoacidi e la struttura tridimensionale di LDH-C ^ ? stata studiata e parzialmente determinata da un certo numero di studiosi ^ Si veda ad esempio Musick et al ( 1976) J. Mol. Biol. 104: 659-668 e Wheat et al ( 1977) Biochem. & Biophys _ Rea. Gomm, . 74, No. 3: 1066-1077. Wheat_et aljhanno ' determinato la sequenza del peptide tiolico essenzia-I le dall' amminoacido 159 a 171, ed essi hanno trovato ! che questo ? quasi identi co ai peptidi tiolici essenzi ali prelevati da altri isozi mi LDH dei vertebrati..

I

Nel 1974 Br. Erwin Golberg ha passato in , ras s e gna gli effetti della immunizzazione con IDH-X _ sulla fertilit? , . ed ha avanzato la ipotesi ! della possibili t? che . "impiegando un costituente _ j_ macromolecolare definito dello sperma divenga possi-.bile rendere chiara la sua struttura primaria in terj-,mini di s di amminoacidi , cos? da costruire iuna mappa in maniera specifica del determinante o de i ?determinanti antigenici che sono 1 induzione della fertilit? . e poi costruire peptidi sintetici che contengono questi determinanti. Il fatto di possedere la capacit? di sintetizzare ma molecola avente tali propriet?, rende il tentativo immuno lo g? co di controllare la fertilit? possibile1*.

Karolinska Symposia on Research Methods in e lEndocrinology, 7th Synqposia; Immunologie al Approaches to Fertili ty Control, Genova, 1974 202-222. Tuttavia1 tali peptidi sintetici antigenici restavano uno sco-: po e non un fatto realmente raggiunto, sebbene la loro desiderabilit? teoretica sia stata riconosciuta.

' Nel 1979 il Dr. Erwin G-oldberg ha descritto in somma?

rio lo stato del ramo relativo come segue: |

"In conclusione e su di una base pratica.!

1 1

i la immunoterapia per il controllo delle 1

nascite richiede pi? che efficienza, la. 1 specificit?, la reversibilit? e l?assen- i

( za di reazioni collaterali sistemiche. i

? Quantit? piuttosto grandi dell*antigene

devono essere disponibili in forma ineaui-. i

; vocabilmente pura. Questa condizione pro4

babilmente non pu? essere soddisfatta da j

un antisene che ?. un en.z.im.a costitu.ito d-aj . . , un prodotto naturale proveniente dallo

sperma o dai testicoli. Piuttosto, la teJno-|, logia contraccettiva richiede un framment1o

i

| peptidico sintetizzabile il quale trattie

I ne la antigenicit? e provo?,una risposta

che danneggia la fertilit?. Il completamento dell?analisi strutturale di LDH-G.

4

dovrebbe permettere la formazione di una

mappa di determinanti antigenici e la sintesi di vari peptidi per l?impiego in una

nuova tecnologia contraccettiva". Recent

Advances in Reproduction and Regulation of Fertilit?, f G.P. Talwar, curatore, Elsevi er/NorthHolland Biomedicai ; Press ( 1979) ._

SOMMARIO DELL? INVENZIONE

Ora ? stato scoperto che un peptide anti -genico pu? essere preparato sintetizzando una succesi sione lineare di dodici amminoacidi comprendente: aci-, do glutammico-glutammina-leucina-isoleucina-glutammina-leucina-valina-prolina-acido glutammi co-acido aspar-11 i co-lisi na. Tutti gli amminoacidi usati per produrre il peptide precedente sono nella loro forma L. Il N-terminale ? acido glutammico ed il C-terminale ? la li sina. Sebbene non si sappia con certezza, si ritiene per? che la precedente sequenza di dodici animino-: tac idi corrisponda agli amminoacidi da 5 a 15 di LDH-C , .

? Questo ? contrario ad una sequenza di recente pubblir cata come tentativo. Si veda Musick et al ( 1979) J. i 'Biol. Chem. , 254, No. 16: 7621-7623

DESCRIZIONE DELL? INVENZIONE

.. ,pr_e_s.en t_e_inyenz i one_s i ri f .e rise e? acL-un I

pepti d,e_line_are_antlgeni co nuovo avente una. lunghe z^? l za di catena di 12 amminoacid i_._La._fO.rmu la^di_ques.ti |p ep_t_i_de_EucL_e 3_S_e.r_e_rapj}.re s.entata_nel_mo.do_segue nt e-:

I

'N-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-A3n-Leu-Val-Pro_-G.lu-Asp=?Ly_s-C ! N ella formula che precede la. lettera MN ' ' indica 1* amminoacido N-terminale mentre la lettera ?Cn designa l1 amminoacido C-terminale. Giu, Gin, Leu, Ile, Asn, Val, Pro , Asp e Lys rappresentano rispettivamente le forme di L-amminoacido dell* acido glutammico , della glutammina, leucina, isoleucina, vaiina, prolina, acido asjartico e lisina.

Il composto peptidico della presente invenzione pu? essere sintetizzato dai suoi amminoacidi costituenti. Per esempio la sintesi pu? essere condotta mediante il procedimento in fase solida secondo Merrifield, come descritto nella rivist a J . A.G. S .

85: 2149-2154 ( 1963) , Questo procedimento in fase soli da per la sintesi di sequenza di amminoacidi viene anche descritto da Stewart and Young, Solid Phase _ _ _ Peotide Synthesis (W.H, Preeman and Co. , San Francisco, 1969) , _pagijne^ 1-4. In questa tecnica, 1* amminoacido _ C-terminale come ad esempio l' acido glutammico per il composto al quale si riferisce la presente invenzione, ? attaccato a perline copolimeriche di polistirene clorometilato-divinilbenzene . Ciascun amminoacido susseguente:, con un adatto gruppo di protezione , viene quindi aggiunto in sequenza alla catena in accrescimento. Per esempio come ? descritto nell' articolo di Merrifield, il gruppo protettivo pu? esffire un gruppo carbobenzossilico. Mediante la tecnica della copulazione, dell?allontanamento della protezione, e della copulazione dell' amminoacido successivo, la sequenza desiderata di amminoacidi e la lundezza di catena possono essere prodotte. Come stadio f inale, il gruppo di protezione viene rimosso dall* aiaminoacido N-terminale (cio? la lisina) e l' amminoacido C-terminale viene scisso dalla resina, usando un adatto reagente, come ad esempio l' acido trifluoroacetico e l? acido bromidrico. Poich? questa tecnica di sintesi ? ben nota, non si ritiene che sar? necessario descriverla ulteriormente qui. Il peptide delh presente invenzione pu? essere preparato mediante questa tecnica di sintesi per l? impiego nel ridurre la fertilit? dei mammiferi

Allo scopo di utilizzare il peptide anti-| genico della presente invenzione nella forma di un vaccino che riduce la fertilit?, il peptide ? coniu-r gato con una molecola di supporto , che ? di preferen-. f za una proteeina la quale essa stessa stimola una risposta antigenica che pu? essere con sicurezza sommii

nistrata. Per esempio, il peptide pu? essere copulaito con il tossoide del tetano per la somministrazione j mediante iniezione intramuscolare. P er esempio, una miscela di tossoide del tetano 1 micromolare peptide antigenico 60 mi ero molare e 18 mmo li di dori drato _! _ di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide fatta reagire in acqua (a pH 6) per 12 ore a temperatura ambiente e 24 ore a 4? fornisce un prodotto contenente 3, 5 moli di peptide/mole di tossoide del tetano. I reagenti in eccesso possono essere rimossi a mezzo di dialisi ovvero di f iltraziong&u gel. Si veda ad esempio Piqu? et al, ' Immuno eh ernia try, 15 : 55-60 ( 1978) .

Come alternativa, il peptide pu? essere copulato usando ben zi dina bi sdi azotata (Bassi ri et al, Endocrinology, 90: 722 ( 1972) ovvero la glutaraldeide. Allo scono di1 f aci li tare la copulazione con una pr? te zina, si p u? attaccare alla aerina N-terminale un amminoacido co? me la cisteina. Per esempio, il composto preparato in una forma per la copulazione sarebbe; N-Cys? Glu-Gln-Leu-I le-Gln-Asn-Leu-Val-P ro-Glu-Asp-Lys -0. _

Per la iniezione intramuscolare, il pepti-^ de copulato pu? essere sospeso in una soluzione salina isotonica sterile, ovvero altro veicolo di carattere convenzionale, e se si desidera si pu? anche includere un agente ausiliario. Un impiego preferito j di tale vaccino ? per la somministrazione ad esseri umani di sesso femminile. Si formano cos? anticorpi i quali appaiono nei fluidi dell' ovidotto e cos? raggiungono una riduzione significativa di fertilit?. Per questo proposito , la quantit? da somministrare varier? da circa 1 a 10 mg del peptide antigenico. Io rivendico:

1. Il composto peptidico lineare antigenico avente la foribula: N-Glu-Gln- Leu- Ile-Gin- Asn- Leu- Vai-Pro? Giu? Asp? Lys-C , in cui N-Glu ? acido L-glutammico

f

; - N-termin -alef Lys-C ? - L- lisina G-terminale e - Gin -, Leu, Ile, Asn, Val, Pro, e Asp sono le forme di L-amminoacido rispettivamente della glutammina, leucina, is?leucina, vaiina, prolina ed acido asprtico

2. Il composto peptidico lineare antigenico avente la formula: N-Cys-Glu-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Asp-Lys-C, in cui N-Cys ? L-cistina N-terminale , Lys-C ? L-lisina C- e Giu, Leu, Ile, Asn, Val, Pro e Asp sono le forme di ammino-acido rispettivamente dell'acido glutammico, della glutammi na, leucina, isoleucina, vaiina, pr? lina ed acido aspartico.

I DICHIARAZIONE E PROCURA

(Domanda Originaria)

Come sotto citato inventore io di chiaro che:

la mia residenza, l'indirizzo dell'Ufficio Postale e cittadinanza sono come stabilito pi? oltre dopo il _ mio nome;

che io veramente ritengo di essere l'originale, primo ed unico inventore (se solo un nome e ci tato al paragrafo 201 ) ovvero un co-inventore ( se pi? inventori sono nominati qui sotto ai paragrafi 201-20 ?) de 11* invenzione dal titolo:

"Composto peptidico antigenico11 _ che ? descritto e rivendicata nella desc-ri zione allegata',

io non so e non ritengo che la presente invenzione 1 sia mai stata conosciuta od impiegata negli Stati Uniti di America prima della mia o nostra invenzione dellos tesso, _ che io non so e non ritengo che la presente invenzione sia mai stata brevettata o descritta in alcuna pubblicazione stampata in alcun paese prima della mia o nostra invenzione della stessa ovvero pi? di un anno prima della presente domanda^ _ che io non so e non ritengo'che l?invenzione era in uso pubblico od in commercio negli Stati Uniti di_ America pi? di un anno prima della presente domanda; i _ io riconosco mio dovere quello di descrivere ogni informazione della quale io sia a conoscenza che sia di importanza per Issarne della presente domanda; ^inven-

| zione non ? stata brevettata o resa soggetto di un certificato di inventore concesso prima della data della presente domanda in alcun paese estero agli Stati Uniti di America su domanda depositata da me o miei rappresentanti legali od assegnatari pi? di dodici mesi prima della presente domanda; e

per quanto riguarda le domande di brevetto o certii ? r ficato di inventore riguardanti l?invenzione deposii

|tate in alcun paese estero agli Stati Uniti di America, prima della presente domanda da me o miei rappresentanti legali od assegnatari ,

nessuna di tali domande ? mai stata depositata?

i Ed io pertanto nomino i seguenti procuratori e/o agenti per proseguire questa domanda e per trattare tutte le pratiche ad essa inerenti presso l'Ufficio Brevetti interessato:

Prego indirizzare tutte, la corrispondenza a:

Mr. Timothy L. Tilton

TILTON, FALLON, EUNGMJS & CHESTNUT 209 South LaSalte Street

Chicago, Illinois 60604

!-^Prego indirizzare tutte le chiamate telefoniche a:

Mr. Timothy L. Tilton

(312) 263-1841

_ Nome dell' inv_entore:

_ GOLDBERG ERWIN

Residenza e cittadinanza:

Evanston,_ Ill?nois U.S^A.

Claims (1)

1. _ Indirizzo _p_o.s tal e_:_

   2_73.2_Harop_to.n._P_arlcway

   _Evans_t.on,_Ill i no i.s .60.20 1..

   I.o_ino.l_txe_ d?_ch.iaro_clie _tutte le affermazioni qui... f a.t.t e_di_ mi a_ prQpria_cono.sc.enza sono, vere e_ch.e_tut.te _le_af ferma z i o ni f at_t e_in_bas.e.. ad_i

   _ mazioni_.e___fe de debbono?_e ss.er.e_ considerate _come vere _ _ _e_che_ inoltre_,_queste_ afferma zioni__sano _st.at.e_fat_t.e__ _ _sapend.o__che_.tutte._le_ _aff ermazio_ni_v.o.lont.ariament e

   _ false o simili , fatte con Jb.al i__i nt ens fon i .. s_ono__p.u-_ ni bili con ammenda o reclusione, oppure ambedue, in

   _ base al Paragrafo 1001 dell'Articolo 18 del Codice

   _ _degl i Stati Uniti , e che tali ..aff ermaz ioni volontariamente fals e possono annullare la validit? della do -manda oppure di un qualsiasi brevetto rilasciato in 1 base alla stessa? _

   Firma dell?inventore: _ _

   ERWIN GOLPBERG

   _ _Pat a_l Giugno _ 1981

   Per traduzione conforme

   Per TNG? BARZANO* & _ZANARD0 ROMA S.p.A.

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