IT8348868A1 - Antisiero di influenza a largo spettro - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo;

"Anti siero dl.influenza a largo spettro.

DESCRIZIONE DELL?'INVENZIONE

Campo _tecnico

La_presente_invenzione_.si..riferisce alla, immunochimica ed in modo pi? specifico,ai_reattivi_ inuminolog?ci ed alle reazioni che implicano i virus dell?influenza

_Tecnica.p_recedente?.

L*influenza rimane,una malattia_ep_idemica..L di primaria importanza in tuttp._i1 _mondo, nonostante_ intensi.prpgraimni di vaccinazione (1,2, in .bibliografia allegata .alla descrizione)_*_Fino.ad_oggi,.i vac-j_ cini per questi sforzi_hanno utilizzato.virus..interi.! in qualit? di antigene per sollecitare le rieposte degli anticorpi contro il.particolare ceppo di influen-r za in circolazione (3). Questi vaccini convenzionali presentano degli inconvenienti da diversi punti di vista, inclusa la scarsa caratterizzazione dovuta alla produzione di virus in uova embrionate, gravi reazioni collaterali negativ.e_e,_cosa..che ? pi?...impor tante, per effetto di una mancanza di generalit? ri-_ chiesta per poter essere efficaci contro il largo spettro.,.dei ceppi di influenza_che_possono_incontraiv.... s.i_._Lin_ben_definito__vacc1no_che__elimini__que_sti_proble i_?_nec_essario. Vengono cosi presentati studi di neutrali zzazione che uti1izzano antisieri preparati contro peptidi sintetici corrispondenti alle reg?oni del-? la molecola di emoagglutinina (HA) dell*influenza e _ vengono descritti e rivendicati peptidi, antisieri I e procedimenti che sono pi? efficienti ed alternati-1 ve ben caratterizzate ai vaccini per 1*influenza ed _ ai relativi pr?cedimenti?

o scopo fondamentale della risposta neu? _ tralizzante della vaccinazione ? la molecola di amo-_ aggi?tinina che h la glicoproteina superficiale di maggiore importanza del virus (4). Questa emoaggluti nina viene sintetizzata come molecola di precursore e viene succesalvamente scissa proteoliticamente in due subunit?, HA1 e HA-? La scissione ? necessaria perch? il virus sia infettivo (5,6), Le sequenze dei geni d? HA di diversi ceppi epidemici di influenza . sono state descritte e indicano che vi ? una rapida_^__ variazione genetica che si verifica nell?ambito di questi geni (7-10)._Que_ste,variazioni mutazionali.si riflettono come,alterazioni della struttura antigenica di HA.che...consentonp_la fuoriuscita del.virus dalla l protezione della precedente immunizzazione e la succes siya_origine_di un nuovo ceppo epidemico^ Inoltre,_ i__ viru s_sierologicamente distinti provenienti dalle pre~ cedenti__ "ep_idernie occasio.nalmente rientrano n.ella "p?-i_ polazipne f possibilmente da ospiti non umani, dove j* possono aver subito una ricombinazione genetica.- ?! E* stato precedentemente dimostrato che i peptidi sintetici corrispondenti virtualmente a tutJ .tele r.e.gion "i.della HA (H "^N ") "d".ei vi'rus dell1influe?ri-' za X-47_._sp.nq_capaci di sollecitare una risposta immune__in_animali sperimentali,_XlJ). Gli aritisieri reagiscono fortemente con i rispettivi peptidi e, nella n?ggior parte dei casi, reagiscono anche con la omqJ Ioga, molecola di emoagglutinina purificata e con il vi.ius intatto (11,12). Il presente_3tudio indica che alcuni antisieri per i peptidi sintetici che rappresentano ambedue_le_subunlt? HA^ e HAg sono capaci di neutralizzare la replicazione del virus dell?influerj-2a X-47. Inoltre^ fra di essi, alcuni sieri sono capaci di neutralizzare le infezioni virali di un di-,.. verso tipo di emoagglutinina._ __ _ _

ESPOSIZIONE DELL'INVENZIONE.

Gli anticorpi prodotti contro i peptidi sin-.. t?tici. che_rappresentano virtualmente.tutte le...regioni della emoagglutinina del_virus dell*influenza_X-_47 (?,?_) sono stati sperimentati.p_er_la loro_capacit?_; ? 2T

di neutr.alizzare in vitro l'infezione da virus. AI- ' cuni -degli immunogeni di pentidi sollecitano le riaposte degli anticorpi che effettivamente neutralizzano ambedue i virus omologhi e, cosa che ? pi? inrportante f diversi ceppi del subtipo H-. che ha dimostrato di essere il subtipo pi? divergente dal prototipo? di virus La neutralizzazione mediante combinazioni degli antisieri non presenta effetto di siner^i si3ino? ma piuttosto la semplice somma dei titoli dei sieri componenti. Gli immunogeni sintetici che foffnisconoJuna risposta neutralizzante rientrano i? due ciassi generali: 1) quelli che contengono un residuoj di cisteina che forma parte di un ponte di disolfuro nella molecola nativa; e 2) quelli che sono disposti ai bordiloppure a ponte sul posto di scissione della emoagglutinina di precursore alla forma di subunit? matura (e funzionale). Anche se ltunica logica alla base_della ^ celta degli immunogeni dei peptidi era che una parte della sequenza era esposta sulla superfide della molecolar i risultati precedentemente sottolineati indicano che si dovrebbero prendere in considerazione .altri.criteri quando,si.designano gli antigeni sintetici con uso possibile in.quali.t?-? d? .vaccinar vale a dire:_ 1) speciale attenzione,do-i_ vrebbe ..essere dedicata alle regioni dellamdfecola_di_ bersagLio_che _sgno_funzionalmente.attive; e_2)..i?peprtidi.?p_ossono_e_ssere.considereyo1mente_pi?.corti di quelli.usati_in _questo..studiose,dovrebbero essere pi? simmetrici intorno,ai_residui_cisteinici. Ino.ltre, anti.geni_sint.etici multivalenti dovrebbero produrre tito_!i__neutralizzanti..pi? efficaci. I risultati..in-L dicano__che questi antigeni possono_essere_.usati per produrre vaccini sicuri e generalizzati per 1'influe?n za.

_ _ stato scoperto che certi peptidi sono_ capaci__di splleci1are_la .produzione di anticorpi che neutralizzano p_i?__di un ceppo del virus dell*influeri-_ za._considerati utili nella prevenzione_e__nel_trattamento dell1influenza.,I peptidi specifici che_hanno dimostrato di essere pi? efficaci sono definiti dalle seguenti sequenze di animinoacidi_ _ SIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITY ,

GIFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNC, ..

EKQTRGIFGAC.

La presente invenzione comprende, come composizioni di materiale, i peptidi precedentemente de-_

finiti oppure loro porzioni, cos? come prodotti sinteticamente oppure isolati da proteine e poeono es- 1_

sere,usati da sol1.oppure..insieme..La presente .inveni_ .

zione inoltre comprende gli antisieri.risultanti.dalla esposizione di un organismo ad uno o pi? dei.sopra ???j

.definiti,peptidi ed.alle composizioni-,in._c.ui_.gli an Vwticorpi per_i.-.peptidi__di_...cui_sopra, da.soli.oppure o eT; in co.mbinazi.one_,_jrappr.esentano_un_agent.e_imimmologicamente attiv.o.._.La_pr.esente-invenzione__i.noltre.prey_?- ?? i

de..i_proC-edimenti__di-_prep.arazio.ne_di_-que_ste co.mp_o_sico zioni e l*uso di queste composizioni nel trattamento

SA

o nella diagnosi immunologica. Per esempio, la presente.__invenzione, da un suo primo punto di vista.

comprende vaccini da usare nella convenzionale vacci!

.nazione per?inoculazione o._jper ingestione, in__cui un

agente..inuminologicamente attivo rappresenta uno o

piu anticorpi per i peptidi precedentemente defini-.ti_?

_ BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI_ /_

-La figura 1 rappresenta la sequenza degli

amminoacidi della molecola di HA di X-47 derivata

dalla sequenza di nucleotidi (20):_

la figura_2 rappresenta i risultati della

micro-titolazione del virus di influenza X-47 su cellule epiteliali di rene canino Madin-Darby (KDCK);

_ la figura 3 rappresenta la neutralizzazione del virus X-47 mediante combinazioni di antisie- ! ri anti-peptidi.

DESCRIZIONE DEL MODO MIGLIORE.

Facendo in primo luogo riferimento alla figura 1f ? rappresentata la sequenza di amminoacidi della molecola HA di X-47 (20). L'intera sequenza HA.j e la^parte terminale N di HAg sono rappresentate. Le linee al disotto della sequenza rappresentano i ? peptidi che sono stati sintetizzati ed usati per la immunizzazione. Con C e Y nell'estremit? sono rappresentate le aggiunte di cisteina e di tirosina che non.si trovano nella sequenza principale. I legami di disolfuro sono indicati con C -? ? Oli antisie-j ri sono stati preparati in conigli contro i pepti- ^ di collegati a Keyhole Limpet Hemocyanin (11), eccetto dove indicato come liberi, si veda la figura 3?

Saggio di neutralizzazione

Per effettuare la sperimentazione di un gran numero di antisieri anti-peptidi, e stato sviluppato un rapido saggio quantitativo in vitro per jil virus dell'influenza che pu? essere eseguito in meno tempo rispetto a quello richiesto per i convenzionali saggi su placca (13). 40 titolazioni di vi-1 rus oppure fino a 80 neutralizzazioni di siero possono essere eseguite in mezza giornata. Inoltre, dato che molti virus o sieri possono essere titolati in un singolo giorno, numerose variabili sperimenta-?? li che potrebbero riscontrarsi da giorno a giorno s<>-no eliminate. Il saggio ? riproducibile ed il punto finale ? proporzionale all*inoculo originale del virus.

I dati rappresentati nella figura 2 sono stati ottenuti come segue: micro-titolazione del vi--rus di influenza X-47 su cellule epiteliali del rene canino Madin-Darby (MDCK). Cellule di MDCK sono state fatte crescere nel mezzo di coltura minimale di Eagles (MESI) integrato con il 10$ di siero di vitello fetale; penicillina (100 unit?/ml), strepto-* macina (100 g/ml), L-glutammina 4 mM, Na-piruvato 1 mM, brodo di triptosio fosfato a 0,075$ (Difco) e gLucosio a 0,5$. A seguito della tripsinizzazions e lavaggio nel mezzo di coltura, le cellule sono stati1 sospese fino ad una concentrazione finale di 10^ ce'-lnle/ml nel mezzo di crescita. Quindi, 50 microlitr: della sospensione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra di mierotitolazione con fondo piatto con 96 pozzetti (Falcon) contenenti altri 50 microlitri del mezzo di crescita. Le piastre sotostate messe in incubazione per tutta la notte a 3.7?. per consentire il fissaggio delle cellule per le titolazioni di virus o di siero il giorno seguente,^ Il virus viene titolato effettuando delle diluizioni in serie di due volte di 50 microlitri in una piastra di microtitolazione con 96 pozzetti in KEM contenente antibiotici (mezzo di diluizione). Ulteriori 50 microi!tri del mezzo di dili&ione ven- ! gono aggiunti a ciascun pozzetto e la piastra viene I messa in incubazione per 60 minuti alla temperatura t di 37?C (finta neutralizzazione). Il TO ZZO che copre i monostrati di cellule di MDCK nella piastra con 96 pozzetti viene aspirato e le cellule vengono lavate-con 100 microlitri di mezzo di diluizione. Il virus_titolato viene quindi trasferito ai corrisrpon-i denti pozzetti della piastra contenente^le cellule^ di KDCK lavate. Il virus viene fatto assorbire per 60 minuti a 37?0, dopo di che esso viene rimosso e_ le cellule vengono lavate con 100 microlitri di mezzo di diluizione. Le cellule vengono quindi sovrastratificate con 100 microlitri del mezzo di copertura consistente del mezzo basale (Eagle) contenente! antibiotici, 0,005$ di DEAE-destrano (Pharmacia), L-glutammira 2mM; 0,05$ di siero di vitello fetale e 0,1?S di tripsina (tipo ?li, 2x cristallizzata, Sigma). Le cellule vengono incubate per 48 ore,.al _ quale punto esse vengono osservate microscopicamente._ per effetto_.citopatico .(.CPE)._e__successivamente vengono colorate con.crystai.viole.t 0,1^,.in etanolo al 20^?a cui_yiene.fat.to?seguire.un risciacquo_in .acqu?i corrent e,__Ciascun.virus_viene_valutato__per l'ultimai diluizione che fornisce una lisi completa del mono-; strato di.MDCJK.in 48 ore_e.questa dilukipne viene usata negli esperimenti successivi per la neutralizzazipne_degl i_antijcorpi

A. Le titolazioni del virus X-47 sono fatte terminare mediante colorazione a 24 e 48 ore.

_ _ B..Le presentazioni_grafiche delle_plastre. cdorate in A dopo_lettura_in_un Titertek Multiskanj con un filtro da_492?nra. La.entit? del1'effetto CPE viene espressa,come,percentuale del pozzetto di controIlo .(C)..che..non aveva ricevuto alcunjyirus. Cir-j co1i.aperti._.e_chiusi_rappresentano.i_punti terminali a_24 e_48 ore...rispettivamente. I punti_terminali di CPE per .X-47.sonojU 5 e 1:300 per 24 e 48 ore,_ rispettivamente.

II saggio _? basato sull'effetto citopati-

co (CPE) del virus dell'influenza su monostrati di cellule epiteliali di rene canino Madin-Darby (MDCK (H ). La figura 2A rappresenta i punti terminali al primo e al secondo giorno per una titolazione del virus X-47. I punti terminali dell'effetto CPE sono molto facili da valutare visualmente e le piastre possono essere sottoposte a lettura meccanica in un dispositivo di lettura per piastre di microtitolazi -? ne ed i risultati possono essere espressi graficame5=_ te nel modo rappresentato nella figura 2B. Un saggi _ a 2 giorni ? stato scelto poich? si ? constatato eh 1*inoculo di virus necessario per un completo effetto CPE in 48 ore consente la migliore sensibiliti complessiva nella sperimentazione delle intensit? neutralizzanti degli antisieri anti-peptidi.

Il saggio di neutralizzazione viene eseguito producendo delle diluizioni in serie dei sieri in piastre di mienotitolazione e quindi aggiunge)1-do a ciascun pozzetto una aliquota del virus alla diluizione precedentemente rappresentata dalla -tito* lezione per fornire un completo effetto CPE in 48 ore. Perci?, per il virus X-47, si trattava di una diluizione 1:300 di fluido allantoico. E* stato determinato che ci? rappresenta approssimativamente 10.000 pfu per pozzetto. A seguito c?lia incubazionet i miscugli del virus e.del siero vengono trasferiti a monostrati di cellule di MDCK lavate per infezionii.

I dati rappresentati nella figura 3 sono .; stati ottenuti impiegando le stesse tecniche generali descritte in relazione alla figura 2. I sieri vengpno titolati pr?ducendodiluizioni, duplici__di _5_0_ j. raicrolitri in una piastra con 96 pozzetti _a.cui viene_ fatta seguire,l?aggiunta di 5Q microlitri,del virus ... appropriatamente diluito (1:300 dalla figura 2).._JDopo 60 minuti a 37?0t ciascun miscuglio siero-virus i_ viene trasferito alcorrispondente pozzetto della_ ;_ piastra con ^6 p.ozzetti contenente monostrati di cellule di MDCK lavate. La parte restante della tecnica ?con? ?rme alla figurai2. Il pozzetto di cqntrpllo_j (C) non contiene siero o virus._

La figura 3_rappresenta_i risultati _d?ILa^j neutralizzazione del virus X-47 mediante combinazio? ni di aitisieri anti-peptidi,_Con _NRS viene indicato! C^e 1*antisiero.che vienesqtt "o"p"o"s.to alla speri ment??-zione era d.iluito con .un v.olume uguale di si.ero_di_j_ coniglio normale percompensare il fattore di dilui-Azione quando gli antisieri erano speriroentati in combinazione I titoli sonq^espressi come il punto di neutralizzazione al^50# conc descritto nellajtabella 1. Gli antisieri sono (0) anti-virus X47; (Q ) siero di coniglio normale; (0) anti-p?ptide 23;^ ant?peptide-24; e (? ) anti-peptide-23 e -24. _ i I risultati esposti nelfe.tabella 1 dimo-

strano che numerosi peptidi sollecitano anticorpi.

con una attivit? neutralizzante in vitro contro,vi-

rus X-47 (?^?^)?

Tabella 1. Neutralizzazione del virus X-47 da anti-

peptidi (a).

Antisiero (b) . Titolo di neutralizzazi<me (c)

ftd

1 0

? 5-10

3 0

4 0

? 20-40

?

6ir 5-10

.OC

I

7 5-10

9 0

10 0

11 0

12 . 0

n o

16-libero 5-10

17-libero 0

:19 .0 ... .

20 ... 10-20...'.

?-2-1- 10-20?1 ~22 20-40-4-i :23-libero- 20-40. :

!24-libero 20-40J

-<5-?2& .40^80.

X-47

..a#.):.I.dettagli del ..saggio.di_ne.uiralizza^.

zione-sono .stati prec.edenteraente.-pre.sentati con_rife-^_ rimento -alla figura 3*_

?.) Questi.numeri__si riferiscono all*anti-k siero .contro_il.peptide_.con.-il corrispondente?:

come.rappresentato-nella .figura_l.

c.).Il -titolo...? preso come il.reciproco _nel-1*intervallo-di diluizioni_del.siero-.in cui il.CPE ? inibito al_50# del controllo. I dati sono rappresene. tativi di quattro esperimenti..

d.) Un titolo di_zero viene assegnato^quan-. do anche_la.massima concentrazione.di_.antisieri,non presenta alcun segno,di protezione rispetto ai.j;on- _ . trolli di siero di..coniglio normale..

Questi peptidi sembrano aggrupparsi,in due 'gruppi distinti con riferimento alle loro posizioni nella molecola di emoagglut?nina.

1. Regioni della molecola contenenti fonti di disolfuro comprendenti:

a.) .11 sito antigenico proposto "C" di Wiley et al (9), che h un rigonfiamento sporgente nella molecola formato da un legane di disolfuro fra cisteina 53 e cisteina 278. I peptidi nella regione di cisteina 53 (peptidi 5, 6 e 7) e cisteina 278 (peP-tidi 21 e 23) sollecitano anticorpi neutralizzanti.

b. ) Il ponte di disolfuro fra cisteina 282 e cisteina 3?6. Gli antisieri verso i peptidi 20 e 22 che comprendono queste cisteine sono neutralizzanti.

c.) Il ponte di disolfuro tra cisteina 15 di HA1 e cisteina 137 in HA0. Anche se non ? stato sintetizzato un peptide contenente quest*ultima cisteina, gli antisieri verso il peptide 2 forniscono tuttavia un basso titolo neutralizzante.

2.) La regione che circonda il sito di sciS? sione del precuare HA in HA1 e HA^ (15). Perci?, l'sntisiero verso il segmento terminale C di H?1 (peptide 20) ed il segmento terminale N di HA,,(peptide 24 ed in misura minore il peptide 25) sono neutralizzar ti. In aggiunta, un peptide che rappreeenta il sito di scissione nel precursore HA(peptide 26) fornisce anche una risposta neutralizzante. In effetti, il terminale N idrofugo di HA,, rappresenta la sequenza pi? ..fortemente conservata in HA (16) ed ? simile al. term inale amminico del componente_F^ della glicoproteina di fusione di virus di Sendai (17)_e perci? pu? essere implicato nelle fasi iniziali della replicazione_.dell*,influenza._Sebbene il terminale N di HA^ sia incorporato nel triner? di HA (18), ? stato re-! centemente dimostrato che vi ? una variazione confonmazionale nella molecola al pH che permette la fusione (19) che si ritiene esponga parti della molecola_ (21)._

In tutti i casij i titoli di_neutralizza-[ zipne_dei sieri antipeptidi sono inferiori a quelli' del siero prodotto contro i virus X-47 intatti. Per?tantOj era interessante vedere quale effetto fom irebbeno _le cqmbinazioni di sieriantipeptidi_._La_figura 3 presenta la neutralizzazione di X-4-7 mediante cqimbinazioni di antisieri suitipeptidi che hanno singolarmente presentato la massima attivit?^neutrarl?zzante. I dati JLndicano chejion vi_? effet-l to di sinergismo nella combinazione dei sieri. I tito.li. son.o la-.se?m-.plice.somma dellerbro parti.., indicando che essi agiscono indipendentemente. I titoli dei sieri contro i peptidi inn?stati da una sequenza comune non sono additivi. Gli antisieri senza alcuna attivit? neutralizzante, quando sperimentati in combinazione, non presentano alcuna attivit? neutra-? lizzante e non vengono neanche stimolati dai sieri con capacit? neutralizzante.

Reattivit? incrociata con altri virus di influenza.

-Xe?sequenze di animinoacidi.di numerose.mo-_ lecole di?HA-del-virus.-delPinfluenza sono?state derivate dalle_sequenze dei_nucleotidi dei-JLoro geni. di_HA. Considerevale_conservazione._esis.te_Jbra_le_sequenze.nono stante_la variazione_del sub_tipo_dU A (1, 7-10.) Que-st^ regioni.comprendono_quelle-4ier?le ._dimostraia una attivit?_neuiralizzanti con-gLi?antisierX_antip.eptidi_in_questio.ne.._La_taballa2_presenta_i_dati_ che_dimostrano__che_gli_antis.ier:... antipeptidi sono.in.grado di una neutralizzazione., incrociata.,dei_.vi.rua eterologhi._

(segue,.tabella)

Tabella 2. Neutralizzazione incrociata di altri virus di influenza

da antisieri antipeptidi.

Virus X-47 A/M5N/33 VSwine/76/1 b/ENG/42/2 VUSSIV/90/77 ?/?/1/73 A/Aichi/2/68 B/HK/8/73

I

Siero H3N2 B3N2 .

H3N2 H1N1 ?1N1 H3N2 H1N1

X-47 >40 10-20 0 >40 0 >40 >40 0 5 20-40 2.5-5 0 5-10 <2.5 2.5-5 20-40 0 20' 10-20 5-10 0 10-20 2.5-5 2.5-5 20-40 0 23 20-40 10-20 5-10 10-20 10-20 20-40 >40 16-20 24 >40 20-40 2.5-5 10-20 20-40 20-40 >40 10-20 26 >40 20-40 2.5-5 20-40 10-20 10-20 . >40 10-20 NRSa 0 0 0 0 0 r 0 0 0

a. siero di coniglio normale

Altri ceppi di presentano configurazioni di neutralizzazione simili a quelle di X-47. I ceppi. di non erano neutralizzati da.sieri antivirus X-| 47 con elevata titolazione, per?.erano .neutralizzati,_ da^almeno alcuni dei sieri antipeptidi.._Gli_antipeptidi 23, 24 e 26 erano particolarmente efficacia!!. grado a cui A/wSN/33 (H^N^) era_neutralizzato..da_antisiero anti -X-47 era insignificante in confron'to i; con il comportamento dell*antisiero antipeptide verso i virus del subtipo . Per i virus per i quali erano disponibili le sequenze di HA, i risultati sembrano essere in conformit? con il_grado di o.mologi?. delle sequenze di amminoacidi fra i subtipi H^ e_H^? _ E*_ stato dimostrato che peptidi sintetici. corrispondenti a regioni specifiche della emoagglutinina del virus dell*influenza sollecitano una risposta di anticorpi neutralizzanti al viruspinologo._ In Aggiunta, combinazioni di anticorpi neutralizzanti si sommano insieme per produrre un sierojneutralizzante pi? forte. Cos?, la immunizzazione simultanea con due o pi? peptidi comporta un siero capace d? una neutralizzazione concertata in una molteplicit? di siti? Gruppi di sieri inattivi non si combinano con effetto di sinergismo per neutralizzare il virus, indican do che la semplice unione di un certo numero di gran di molecole di anticorpi alle porzioni esposte della . HA non ? sufficiente per bloccare l.'infezione e la. replicazione. I dati implicano che ? necessario,?fissare l'anticorpo ad un sito funzionale nella..infezio-

.ne e nel---pr-o-cesso di replicazione oppure ad un sito i, strutturalmente distinto, come quello formato da un 1 ponte di disolfuro. I titoli relativamente bassi dei sieri antipeptidi rispetto all1antisiero di virus_ anti-47 ? probabilmente una funzione della limitata : proporzione degli anticorpi nell*antisiero antipeptij?i riconoscendo la conformazione che la corrisponden-_ te s.equenza di amminoac.idi raggiunge nel virus infettivq_. In aggiunta, 1*antisiero__antivirus X-47 contiene anticorpi nei confronti di altri componenti vira-! li, per esempio neuramidasi, che^possono migliorare.. l'attivit? neutralizzante degli anticorpi di HA in questo siero.

_ _ Nella limita.ta_sperimentazione effettuata,_ ? stato dimostrato un nuovo grado di reattivit? in-_ crociata di alcuni dei presenti antisierincontro pep-_ tidi di HA sintetici (subtipo H^) verso le varianti del subtipo HA come anche esempi rappresentativi di _ altri subtipi di HA del_virus di influenza Aj di un virus di influenza B> Ci? ^particolarmente implicali-^ te dato che 1*antisiero antivirus X-47 che presenta _ un titolo neutralizzante molto.,superiore in confronto con i sieri antipeptidi nei confronti del virus. X-47 non presenta alcuna attivit? oppure presenta una,.attivit?,sensibilmente ridott.a nei confronti^di; virus eterologhi...In .aggiunta, il precedente.lavoro di_Jjreen __et.aljia dimostrato__che JJantisiero ..anti-. virus X-47 non riconosce alcuno dei peptidi sintetici (11).La ragione di questa pu?.essere dovuta alla limitata inuminogenicit? del virus in? tatto oppure alla presenza del carboidrato. Questi dati implicano che la zdsposta immune nel confponti del.virus intatto (corne nella_immunizzazione convenzionale ) ?cqnsiderevolmente diversa da queIla che pu?.es sere ottenuta.con.peptidi^sintetici e questi ultimi, se .scelti giudiziosamente, possono essere usati efficacemente per una vaccinazione generalizzata.

Anche importante per la .presente invenzio? ne h la scoperta che la seguente sequenza presenta una attivit? ijmnunologica relativamente larga, anche se non cosi larga come le summenzionate sequenze di peptidii_ _

CNKPHRILDGINC

Questa sequenza pertanto non era nota per l'attivit? immunologica.

In definitiva, nella sua forma di realizzazlone pi?.specifica, la presente invenzione com- : prende peptidi specificamente definiti. Coloro che sono esperti nel ramo comprenderanno che minori va-. ri anti rispetto alla sequenza esatta possono essere apportate senza distruggere totalmente-le_.carat_teristiche immunologiche.dei.peptidi._! peptidi..sono definiti dalle seguenti sequenze di amminoacidi: . 1

RGIEGAlAGFIENGWEGlCDGViTGFRHQNC.,

_ EKQTRGIFGAC...

L*invenzione?_comprende conrp.os_izioni_dianticorpi, antisieri__e_procedimenti per_la_.preparazioue delle composizioni-.di anticorpi:,.ed_antisi.eri__ei peptidi..sostanzialmente._come.precedentemente.speci? ficato_per_ mezzo di sequenze.di_amminoacidi_di__peptidi _.antigenicamente attive,_I_pej)tidi, i?rela.tivi_I anticorpi.,e.gli antisieri_possono_c_omprendereoppure possono.essere-.indotti.da uno_qualsiasi dei jpep? tidi oppure da.,qualche sostanziale loro equivalente^ oppure,da una loro combinazione.

Applicazione industriale.

Sicuri_ed efficaci vaccini di peptidi sintetici possono essere,prodotti^contro l1influenza ej la.messa a.punto di un vaccino pi? universale ? reail?eticamente possibile._La vaccinazione con questi inuminogeni di peptidi pu? comportare le loro proprie configurazioni di variazione genetica. Tutfevia,^se. i peptidi vengono scelti con_riferimento ad un sito funzionalmente necessario per la replicazione virale, le risultanti mutazioni in tali regioni possono^ essere perfettamente letali.

(segue schema)

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI

   Peptide antigenico sintetico avente la !seguente sequenza di amminoacidi:

   SIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNIKPFQNVNKITY
2. 2. Peptide antigenico sintetico avente la eguente sequenza di amminoacidi:

   RGIFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFHHQNC
3. 3. P.eptide antigenico sintetico avente la seguente sequenza di amminoacidi:

   EKQTRGIFGAC
4. 4. Peptide antigenico sintetico avente la seguente sequenza di amminoacidi:

   CPKYVKQNTIKLATGMRNVPEKQTR.
5. 5. Peptide antigenico sintetico avente la seguente sequenza di amminoacidi:

   CNNPHRILDGINC
6. 6. Vaccino contro il virus dell*influenza contenente il peptide sintetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1, 2, 3? 4 o 5.
7. 7. Anticorpi contro il virus dell*influen?-za sollecitati dal peptide sintetico secondo una quiilsiasi delle rivendicazioni 1, 2, 3, 4 o 5.