IT8448100A1

IT8448100A1 - Metodo per saggiare sostanze immuno-reattive

Info

Publication number: IT8448100A1
Application number: ITRM1984A048100A
Authority: IT
Original assignee: Aladjem Frederick J; Ayengar Padmasini K
Priority date: 1983-04-29
Filing date: 1984-04-27
Publication date: 1985-10-27
Also published as: EP0153314A4; IT8448100A0; WO1984004391A1; IT1199117B; US4554257A; JPS60501228A; EP0153314A1

Description

"METODO PER SAGGIARE SOSTANZE IMMUNO-REATTIVE"

RIASSUNTO

I metodi illustrati miglioranoprocedimenti convenzionali di agglutinazione per saggiare sostan ze immunoreattive e simili, principalmente migliorando la capacit? di agglutinazione medesima. Sospen sioni contenenti particelle agglutinate vengono esaminate automaticamente, preferibilmente in maniera intermittente durante la reazione di agglutinazione ed i dati risultanti vengono trattati per identificare gli aggregati di particelle di una scelta clas se limitata che pu?, per esempio, comprendere aggre gati aventi dimensioni entro un intervello di grandezze limitato. I numeri di tali aggregati vengono confrontati con corrispondenti valori di riferimento ottenuti c?n soluzioni standard e controlli adat ti per valutare la concentrazione di una delle sostanze reattive, od altra informazione. Gli intervalli di grandezze di aggregati ed altri parametri che vengono usati per definire classi di aggregati vengono scelti di preferenza con attenzione al comportamento dettagliato di ciascun sistema in prova.

DESCRIZIONE

Schema dell'invenzione

Questa invenzione fornisce metodi migliorati per misurare il grado di agglutinazione di particelle insolubili prodotta d? reazione di sostanze immunoreattive e simili, almeno una delle quali sia presente sulle particelle. Le particelle di veicolo pos^ sono essere artificiali, come perle di lattice, oppure possono essere naturali, come cellule di sangue o tessuto oppure microorganismi.

Pi? particolarmente, la presente invenzione fornisce numeri di aggregati limitati ad una o pi? classi specifiche. Una classe di aggregato pu? comprendere ad esempio tutti gli aggregati aventi dimensioni entro un intervallo di grandezze scelto di. stinto, oppure disperdenti la luce entro un interval lo scelto distinto di intensit?. Questi numeri vengo no preferibilmente misurati e sviluppati in corrispondenza di una serie di tempi. La conoscenza rela tivamente dettagliata risultante degli schemi di sviluppo di aggregati permette la determinazione del grado di agglutinazione con campo ed esattezza migliorati .

Inoltre, per un dato sistema, ? usualmente poss sibile scegliere classi di aggregati per la misura particolarmente favorevoli insieme con un tempo spe cialmente appropriato per enumerare gli aggregati di ciascuna classe tale che i numeri di aggregato risultanti riflettono in maniera particolarmente sensibile il grado complessivo di agglutinazione.

Un altro aspetto dell'invenzione comporta lo impiego di tali misure del grado di agglutinazione per un saggio migliorato di sostanze immunoreattive e simili in soluzioni o sospensioni di prova me diante procedimenti che impiegano l'agglutinazione di particelle insolubili. Molti procedimenti conven zionali sono ben noti per ottenere almeno un saggio approssimato della concentrazione di tali sostanze itiprova confrontando il grado di agglutinazione dovuto a reazione del mezzo iiiprova con corrisponden ti dati di riferimento ottenuti con reagenti standard. Permettendo una misura migliorata dell'agglutinazione di per s?, la presente invenzione permet te direttamente che tutti i procedimenti di saggio convenzionali vengano effettuati in maniera corrispondentemente pi? esatta ed attendibile.

Inoltre ancora, la presente invenzione deriva preferibilmente la concentrazione di una sostanza in prova da numeri di aggregati di soltanto una o pi? classi scelte piuttosto che da una distribuzione media di tutti gli aggregati come ? stato tipico della tecnica antecedente. La classe o classi parti^ colari di aggregati ai quali le misure rispondono so no scelte tipicamente individualmente per ciascun sistema di prova e specialmente per la sostanza in prova particolare da saggiare. Il criterio principale per tale scelta ? preferibilmente che i numeri misurati delle scelte classi di aggregati siano specialmente ben correlati con la concentrazione dello analita. La presente invenzione elimina pertanto da_l la considerazione tutte le misure che sono meno ben correlate con il valore da determinare di quelle ottenute impiegando la classe o classi specifiche scelte .

La classe di aggregati da includere nel saggio di un particolare analita pu? venire distinta in molte maniere differenti. Gli aggregati scelti sono tipicamente caratterizzati da un campo definito di valori di un parametro di aggregato. Un tale parametro ? poi distintivo della classe nel senso che misura o calcolo del valore di parametro distin gue se oppure no un qualsiasi aggregato appartiene alla classe.

Tali valori di parametro che definiscono la classe per aggregati singoli vengono generalmente ot tenuti dai risultati di misure ottiche, elettriche o meccaniche o combinazioni di queste. Esempi di para metri ottici comprendono i coefficienti di dispersio ne, assorbanza oppure riflettanza, densit? ottica to tale e l'indice di rifrazione. Parametri elettrici comprendono la carica elettrica portata da aggregati singoli, l'impedanza e la conduttanza. Parametri che sono di natura configurazionale quali la grandezza e forma di aggregati singoli sono ottenibili in linea di principio mediante misure meccaniche ma vengono usualmente misurati molto convenientemente mediante mezzi ottici. La densit? pu? venire misurata in ter mini della velocit? di sedimentazione di aggregati singoli. Si comprender? che molti risultati di misu ra ejdi parametri di classe corrispondenti o derivati verranno ottenuti mediante una combinazione di tecniche .

Un parametro particolarmente efficace mediante il quale distinguere la classe di aggregati da ind ? dere nel saggio di una particolare sostanza ? la gran dezza di aggregato. Gli schemi di sviluppo di aggreti aventi varie grandezze specificate sono stati tro vati differire in maniera significativa uno dall'altro e dallo schema di sviluppo ottenuto quando tutte le grandezze di aggregati vengano unite insieme come ? tipico della tecnica antecedente. Pertanto, in qual, siasi data serie di condizioni di operazione, pu? ve nire ordinariamente identificato un campo limitato di grandezze di aggregato per cui il numero di aggre gati aventi grandezze entro quel campo ? una funzione specialmente sensibile della concentrazione iniziale della sostanza di prova in saggio. Quindi, considerando soltanto (oppure principalmente) aggregati in un.tale campo di grandezze ben correlate, oppure in parecchi di tali campi, e misurando in corrispodenza di tempi che sono appropriati per le particolari grandezze misurate, possono venire aumentate in maniera significativa la esattezza ed attendibilit? di prova rispetto a quanto era possibile nella tecnica antecedente. Una discussione simile si applica anche a schemi di sviluppo ed utilit? di classi di aggregati limitate definite in termini di parametri differenti dalla grandezza di aggregato.

In pratica, la classe o classi particolari di aggregati scelti da misurare ed il tempo o tempi di misura pi? efficaci per ciascuna classe, vengono scelti tipicamente con l'aiuto di esperimenti preliminari con ciascun sistema reagente. Per esempio, talune concentrazioni di riferimento note della sobile quando considerato come funzione di ciascuno de gli altri parametri, compreso il tempo di misura. Questi valori di parametro identificati definiscono condizioni di misura che sono particolarmente favore voli per saggiare la sostanza di prova in questione.

Come esempio, la misura ed analisi della distribuzione di grandezze di aggregato prodot ta dalle reazioni di riferimento descritte in un si_ sterna di prova particolare pu? dimostrare che un da to cambiamento della concentrazione iniziale della sostanza in prova provoca un cambiamento nel numero di piccoli aggregati che ? maggiore del cambiamento nel numero di aggregati pi? grandi quando misurato durante un periodo di tempo relativamente precoce ma che la misura di quelle medesime due grandezze durante un periodo di tempo posteriore inverte quella relazione. In quelle condizioni illustrative, aggregati della grandezza pi? piccola formerebbero una classe pi? favorevole per la misura nel tempo precoce e la grandezza maggiore formerebbe una clas se pi? favorevole nel tempo posteriore.

Oltre a tali etiteri, pu? venire data preferen za nella scelta di parametri a quei valori o intervalli di valori,e periodi di tempo di misura associa ti,per cui il numero di aggregato dipende dalla con? 7

stanza in prova da saggiare vengono fatte reagire inizialmente con aliquote di una sostanza complementare adatta, una di dette sostanze essendo tipicamente presente su superfici di cellule insolubili oppure di altre particelle. Gli aggregati risultanti vengono osservati e la loro distribuzione viene misurata rispetto a qualsiasi parametro venga conside rato come base potenziale per definire una classe di aggregati favorevole per saggiare la sostanza in pr? va. Queste misure di distribuzione vengono tipicamente effettuate per ciascuna concentrazione della sostanza in prova e vengono ripetute in corrispondenza di parecchi tempi durante il corso delle reazioni di riferimento. Dai dati risultanti ? possibile accertare la dipendenza dello scelto parametro e numero di aggregato da altri parametri del sistema compresi specialmente il tempo di misura e la concentrazione di riferimento iniziale della sostanza in prova. Da quella informazione di riferimento, vengono tipicamente identificate combinazioni di valori di parametri per cui il numero di aggregato varia in maniera specialmente sensibile,e viene cos? specialmente ben correlato,con cambiamenti di concentrazione della sostanza in prova. Quel numero ha preferibilmente anche un valore relativamente sta centrazione della sostanza in prova in maniera funzio naie lineare od altra maniera specifica desiderata.

L'analisi dei dati di riferimento comprende anche tipicamente considerazione di funzioni pi? complesse che sono derivabili dai numeri di aggrega to Ascritti e che possono rispondere ancora pi? seri sibilmente a variazione della concentrazione di sostanza in prova. Per esempio, la velocit? di cambia;' mento del numero di aggregato per un campo specificato di un parametro di aggregato pu? venire calco lata da numeri in corrispondenza di tempi multipli. Inoltre, tali numeri possono venire estrapolati ad un tempo fuori del campo di misura vero e proprio quale un "tempo indefinito", per esempio, in corri spondenza del quale non siverifichi pi? ulterioreJ cambiamento significativo. Estendendo il campo di ri^ cerca a tali parametri derivati, l'invenzione rende possibile una correlazione ancora pi? alta fra la concentrazione variabile osservata e la concentrazione da saggiare.

Il campo generale di applicabilit? del nuovo metodo di saggio pu? venire riassunto come comprendente la quantizzazione mediante metodi comprendenti agglutinazione in miscugli di tali diverse sostanza come farmaci, ormoni di basso ed elevato pelo

so molecolare, proteine del plasma, anticorpi, antigeni cellulari e qualsiasi materiale che possa venire scoperto mediante reazioni spefiche portanti ad agglutinazione di particelle. Quelle reazioni comprendono reazioni antigene-anticorpo, reazioni lecti^ na-carboidrato, reazioni ricettore-legante, ecc. Un campo particolarmente utile di applicazione dell'invenzione ? la identificazione di particelle naturali mediante scoperta e quantizzazione di molecole o strutture sulle loro superfici. Soggetti da scoprire cos? e quantizzare possono in generale verificar si naturalmente oppure venire accoppiati superficia_l mente sulle superfici di particelle. Esempi generali sono determinazione di cellule come la determinazione di globuli rossi prima di trasfusioni; la determinazione di globuli bianchi per esempio per quantizzare le varie sottopopolazioni di cellule B, cellule T e monociti in circolazione nel sangue di un individuo e la identificazione di altre cellule naturali che possono essere cellule singole,come microorganismi, oppure gruppi di cellule come semi e pollini.

A questo riguardo, per ovviare possibili problemi di ostacolo sterico e per ottenere sufficiente formazione di ponte fra cellule, ? spesso utile usare anticorpi od altre sostanze complementari non in soluzione ma copulate a piccole particelle oppure ad altre cellule, cio? entrambi i reagenti sono presenti su superfici di particelle.

La presente invenzione non ? limitata all'impiego delle reazioni di agglutinazione diretta ma fornisce anche una migliore quantizzazione di reagenti impiegando ciascuna delle numerose modificazioni della reazione di agglutinazione quali quelle che ri chiedono precedente manipolazione di reagenti oppure aggiunta di reagenti supplementari. Queste modifica zioni comprendono, ad esempio, il processo di Coombs, procedimenti implicanti inibizione od esaltazione di agglutinazione e la reazione di co-agglutinazione.

Nella presente descrizione e rivendicazioni, il termine anticorpo va inteso in generale comprendente,quando appropriato,anticorpo monoclonale, frammenti di anticorpo che posseggono attivit? di le gare antigene ed anticorpo etero-legante prodotto ar tificialmente . Inoltre, il termine anticorpo va inte so in generale comprendente,quando appropriato,proteina A di stafilococchi e materiali simili con attivit? di anti-immunoglobulina.

Il termine particelle va inteso comprendente particelle sia naturali che artificiali. Esempi di particelle naturali sono cellule di sangue o tessuto, microorganismi e piccoli gruppi verificantisi in natura di cellule come pollini ed organelle. Particelle artificiali possono essere formate da qualsiasi materiale adatto come perle di lattice oppure di vetro.

Verranno descritti appresso altri aspetti dell'invenzione.

Fondamento de111Invenzione

E' ben noto che la presenza di reazioni fra antigeni e loro anticorpi specifici oppure fra altre coppie di sostanze complementari che reagiscono specificamente una con l'altra, pu? venire dimostra ta mediante agglutinazione di particelle insolubili alle quali sia legata una delle sostanze. Queste particelle possono essere cellule naturali portanti ricettori specifici, antigeni oppure anticorpi, per esempio, oppure possono consistere in "perle" artifi ciali di lattice, vetro od altro materiale adatto.

Le perle vengono dapprima sensibilizzate ricoprendole, tipicamente mediante adsorbimento o legame chimico, di molecole di una sostanza reattiva. Quando le cellule o perle sensibilizzate vengono portate in contatto con una soluzione contenente la sostanza reattiva complementare, molecole dei due reagenti si le gano insieme. Se il reagente disciolto presenta valenza multipla la reazione pu? legare insieme le cellule o perle per formare aggregati. La scoperta di tali aggregati dimostra la presenza della reazione e pu? indicare i tipi di reagenti o ricettori sulle particelle oppure pu? fornire una misura semiquantitativa della concentrazione del reagente disciolto.

L'agglutinazione di cellule mediante reazione con anticorpi o simili ? uno dei procedimenti sierologici pi? antichi per la identificazione di batteri e di altri microorganismi. Essa ? stata inoltre ampiamente usata per la determinazione del gruppo sanguigno e per la prova crociata di compatibilit?. Questi procedimenti di agglutinazione comprendono varianti come agglutinazione indiretta ed inibizione di agglutinazione in cui sono richiesti stadi addizionali per produrre alla fine l'agglutinazione che deve venire misurata. Questi altri stadi comprendono tipicamente l'aggiunta di reagenti e lavaggio ed usualmente fanno seguito alla reazione principale del reagenti complemenatri originali.

La agglutinazione di particelle prodotta con l'aiuto di tali procedimenti supplementari ? ci? nonostan te considerata "dovuta" alla reazione primaria senza la quale i procedimenti supplementari sarebbero inef f icaci.

La presente invenzione ? applicabile in genera le al saggio della capacit? di agglutinazione in relazione con tutti i procedimenti noti del tipo generale indicato sopra nonch? con i numerosi procedimeli ti affini derivabili da essi mediante ovvie variazioni.

Le cellule od altre particelle possono essere ricoperte, in maniera naturale oppure artificialmente, di antigeni od anticorpi caratteristici e possono allora venire messe in condizioni di agglutinarsi per effetto degli appropriati reagenti complementari. La letteraura comprende molte descrizioni della sce_l ta, preparazione e/oppuresensibilizzazione di parti celle di veicolo per trasportare una grande variet? di sostanze per la reazione con sostanze complementa ri specifiche. Sono anche ben noti procedimenti dettagliati per effettuare tali reazioni al fine di pr? durre agglutinazione di particelle.

In generale, le particelle di veicolo possono venire sensibilizzate ricoprendole con un antigene o suo anticorpo complementare in modo che il processo di agglutinazione pu? venire impiegato per sag giare una soluzione in prova per uno o l'altro dei membri di una tale coppia di sostanze complementari. Il procedimento ? anche applicabile, con adatta sce_l ta delle particelle di veicolo, praticamente a qualsiasi sostanza che sia capace di combinarsi con una sostanza complementare in maniera specifica generai mente simile alle immunoreazioni di antigeni ed anticorpi. Per esempio, ? noto che lectine reagiscono specificamente con carboidrati particolari. In maniera simile, apteni, che non sono immunogenici, possono reagire con un anticorpo di un'appropriata specificit?. Un membro o l'altro di questa coppia pu? in generale associarsi con le particelle, naturali oppure artificiali, e tender? a provocare agglu tinazione per effetto di reazione con la sostanza complementare. Questa agglutinazione pu? venire usata per saggiare uno o l'altro dei membri della coppia di reagenti.

Molte particelle di veicolo che si rinvengono in natura, come linfotici, altre cellule e batteri, hanno siti di legame caratteristici e possono venire quantizzate direttamente mediante impiego di appropriati anticorpi oppure lectine che sono specifici per i siti e provocano la agglutinazione della par_ ticelle. Per esempio, molti tipi di batteri portano antigeni che sono caratteristici del tipo particolare. Questi batteri possono venire fatti agglutina re quando portati in contatto con un anticorpo specifico per 1'antigene portato. Questa reazione pu? venire usata per identificare batteri mediante l'agglutinazione risultante quando portati in contatto con anticorpo noto per essere specifico per 1'antigene, oppure pu? venire usata per dimostrare la pre senza nel siero di un paziente, ad esempio, di anticorpi contro un particolare tipo di batteri per effet to dell'agglutinazione prodotta quando questi batteri vengano aggiunti ad un campione del siero. Una reazione simile viene largamente usata per determinare tipicamente i globuli rossi del sangue di un paziente osservando il tipo di anticorpo che reagisce con essi per produrre agglutinazione.

Inoltre, non ? un requisito che si verifichi aggregazione rilevabile quando il reagente in prova da saggiare venga portata in contatto con la sostan za complementare; piuttosto, pu? verificarsi combi nazione dei due reagenti complementari senza aggregazione in tale stadio ed inoltre pu? essere neces saria manipolazione od aggiunta di reagenti per pr? durre l'agglutinazione mediante la quale deve venire saggiata la presenza di un agente in prova. E' illu strativo di tali procedimenti di agglutinazione indiretti la prova di Coombs. Per esempio, una reazione originale fra un antigene portato su particelle naturali od artificiali ed un anticirpo disciolto pu? legare 1*anticorpo ma pu? non riuscire a produrre un1agglutazione apprezzabile. Stadi addizionali convenzionali per produrre aggregazione comprendono allora tipicamente eliminazione di materiale non reattivo disciolto dalle particelle e loro reagenti copulati, ad esempio mediante centrifugazione e lavaggio oppure mediante cromatografia od altri metodi, seguiti dall'aggiunta di un reagente supplementare complementare per 1*anticorpo, quale un anticorpo, specifico per il primo anticorpo, prodotto in un animale adatto. L'agglutinazione di particelle prodotta con l'aiuto di tali procedimenti supplementari fornisce una misura del grado della reazione immunologica originale che pu? venire usato per saggiare un antigene sulle particelle oppure 1'anticorpo.

Un altro tipo di prova mediante agglutinazione indiretta dipende dalla capacit? di talune sostanze di inibire l'agglutinazione. La misura del grado di tale inibizione pu? venire usata per determinare la concentrazione della sostanza inibitrice in una soluzione in prova. Per esempio,1'agglutinazione dovu ta a reazione di un analita legato a particelle inso lubili con un anticorpo specifico in soluzione ? ini_ bita tipicamente dalla presenza di molecole disciolte dell1analita. L'analita disciolto reagisce con 1'anticorpo in competizione con l'analita legato, riducendo la concentrazione effettiva di anticorpo disponibile per la reazione di agglutinazione con l'analita legato.

Nella pratica vera e propria, servendosi della inibizione per analizzare una soluzione in prova per un analita, si ottiene una sensibilit? migliorata la sciando prima che la soluzione in prova reagisca con una quantit? limitata di anticorpo disciolto pri_ ma di aggiungere le particelle con l'analita legato. Se la quantit? di anticorpo in tale reazione viene re golata in modo da produrre un'agglutinazione di rife rimento leggera ma chiaramente rilevabile quando non vi sia analita nella soluzione di prova e quindi nessuna inibizione, anche una traccia di analita nella soluzione di prova tende a provocare una diminuzione percentuale relativamente grande in tale leggera agglutinazione di riferimento. Quindi, con adatte precauzioni, la prova pu? venire resa molto sensibile. Il metodo ? specialmente utile per la quantizzazione di analiti quali ormoni di peso molecolare basso oppure farmaci che si rinvengono usualmente in concentrazioni basse nel siero od altri fluidi.

Il metodo generale di inibire l'agglutinazione pu? venire usare per saggiare in una soluzione in prova una o l'altra delle sostanze complementari purch? la sostanza in prova possa venire attaccata oppure sia presente su adatte particelle. Come nel^ l'agglutinazione in generale,le particelle possono essere naturali oppure artificiali.

La sensibilit? e velocit? di saggio mediante agglutinazione pu? spesso venire esaltata mediante l'aggiunta di un materiale idrofilo ma immunologica mente inattivo quale un polietilenglicole che tenda a legare acqua. Questo pone le particelle in un ambiente pi? idrofobo esaltando la loro tendenza a legarsi fra loro.

Inoltre, a seconda del sistema particolare, la sensibilit? pu? venire aumentata ed una reazione non specifica pu? venire ridotta se, invece dell'ant_i corpo intero, viene usato per l'accoppiamento con perle soltanto un frammento di anticorpo, . un frammento univ?lente od;un frammento bivalente.

Inoltre, per rendere minima una reattivit? non specifica di superfici di particelle,quali quelle di vetro oppure lattice, si trover? vantaggioso coprire queste superfici, mediante rivestimento o copulazionetcon proteine non reattive od altri materiali adatti.

Tutti i procedimenti noti di cui sopra sono illustrativi dell'ampio campo in cui ? stata impiegata l'agglutinazione. Il campo di utilit? dei metodi della presente invenzione per scoprire clas si di aggregati e misurare l?agglutinazione ? corrispondentemente ampio e non va inteso limitato agli esempi particolari che sono stati menzionati.

Tecnica antecedente

Esistono numerosi testi e probabilmente molte centinaia di articoli che descrivono una grande variet? di reazioni di agglutinazione in generale, nonch? varie modifiche. Una grande proporzione di queste relazioni riguarda reazioni di emuagglutinazione che impiegano globuli rossi del sangue come particelle di veicolo. Procedimenti dettagliati per il trattamento di molti di tali materiali sono ben descritti, insieme con numerosi riferimenti al^ la letteratura originale, in "Methods in Immunology and Immunochemistry", pubblicato da Curtis A.

Williams e Merrill W. Chase, Volume IV, capitolo 16? pagg. 1 fino a 125; Academic Press, Ine. 1977, che ? citato come utile materiale di fondamento. Nella maggior parte di questi procedimenti la scoperta dell'agglutinazione ? visuale e determina soltanto che una di una serie di diluizioni

del reagente in prova d? ancora oppure non d? pi? agglutinazione rivelabile.

I metodi della tecnica antecedente che si pu? dire "misurano" il grado di agglutinazione hanno trattato in generale la sospensione come insieme sen za alcuna attenzione ad aggregati singoli. Tipici di questi metodi sono quelli cehe misurano una certa propriet? della luce trasmessa dalla sospensione o d_i spersa da essa in corrispondenza di taluni angoli di misura. Per esempio, il brevetto U.S.A. 4.313.929

o descrive la misura dell'intensit? di luce /della ve locit? di cambiamento dell'intensit? di luce diffu sa in corrispondenza di un angolo definito dalla so spensione come insieme.

La presenza di agglutinazione ? stata anche dimostrata misurando lo spostamento di frequenza della luce monocromatica quando diffusa quasi elasticamente dalla sospensione. Il moto Browniano di ciascun corpo sospeso provoca unospostamento di frequenza che varia statisticamente entro limiti che so no in rapporto inverso con la grandezza del corpo. L'allargamento spettrale osservato, tuttavia, rappresenta necessariamente una media di tutti gli aggregati e delle particelle singole presenti nella sospensione. Questo metodo di misura ? descritto

I

ad esempio, nel brevetto U.S.A. 4.080.264. Metodi per rendere ottimo il procedimento regolando la distribuzione di grandezze di aggregati sono discussi nel brevetto U.S.A. 4.164.558 ma senza alcuna capacit? di misurare soltanto una porzione dell'intero insieme di grandezze di aggregati. Il brevetto U.S.A. 5.984.533 impiega una tecnica generalmente simile per la misura della mobilit? elettroforetica media di tutte le particelle in una sospensione.

L'agglutinazione ? stata anche scoperta indirettamente in termini di diminuzione risultante nel numero di particelle non agglutinate nella sospensio ne. Per esempio, un campione pu? venire fatto passare attraverso le cellule in scorrimento di un dispositivo di conteggio di particelle automatico che sia stato modificato nel senso di contare soltanto particelle singole. Questo tentativo ? descritto tipicamente da Daniel Collet-Cassart e coll, in "Automated Particle-Counting Immunoassay for Digoxin" Clin. Chem. 27/7, 1205-1209(1981).

Una relazione pi? estesa di Particle Counting Immunoassay (PACIA) e di problemi illustrativi ai quali esso e la presente invenzione sono entrambi applicabili ? data in "Immunochemical Techniques (Parte C) " pubblicato da John J. Langone e Helen Van Vunakis, che ? il volume 74 di "Methods in Enzymology ", Academic Press, 1981. Questo lavoro impiega un apparecchio (vedansi specialmente pagg.

106 fino a 111) che ? messo in commercio dalla Technicon Corporation of Tarrytown N.Y. Un fascio di luce viene concentrato su una cellula in scorrimento e la luce dispersa attraverso un angolo definito piccolo caratteristico di singole particelle di veicolo viene concentrato selettivamente su una fotovalvola. I risultanti impulsi di luce forniscono un numero di particelle singole che passano attraverso la cellula.

E1 stata anche avanzata l'ipotesi, nel brevetto U.S.A. 4.191.739 che il "Metodo ad impulsi resistitivi" potrebbe fornire un metodo sensibile per misurare reazioni poich? ? capace di rispondere ad aggregati di soltanto due o tre perle ciascuno. In tale metodo, particelle vengono forzate dalla pressione oppure dalla elettroforesi attraverso un orifizio microscopico fra due camere, cambiando momentaneamente un potenziale elettrico applicato attraverso l'orifizio. Il brevetto descrive e rivendica un metodo per evitare errori dovuti ad autoaggregazione durante la sensibilizzazione delle perle. Tali errori vengono evitati sensibilizzando separatamente con un reagente perle di due differenti grandezze, poi mescolandole insieme e con l'altro reagente e rivelando soltanto quei complessi che consistono in una sola perla di ciascuna grandezza. Questi numeri escludono qualsiasi aggregato che possa essersi formato accidentalmente durante la sensibilizzazio ne di perle di una e l'altra grandezza. Questo procedimento ed i suoi vantaggi specifici sono chiaramente distinti dalla presente invenzione.

Descrizione di esecuzioni preferite

Tecniche di misura

Per determinare il grado di agglutinazione di una sospensione in prova, la presente invenzione analizza tipicamente un campo rappresentativo della sospensione in qualsiasi maniera adatta a produrre segnali elettrici che rappresentino l'intensit? del^ la luce in un insieme di posizioni elementari stret tamente distanziate nel campo.

In altra maniera, il campo di sospensione viene immaginato su una disposizione ordinata rettangolare di elementi sensibili alla luce distinti, quali diodi sensibili alla luce, che sviluppano direttamente segnali individuali; oppure una disposizione ordinata lineare di tali elementi pu? venire spazzata via trasversalmente rispetto al campo da mezzi ottici di tipo noto, facendo s? che ciascun elemento analizzi il campo lungo un percorso distinto.

I segnali di posizione individuali sviluppati durante una scansione di campo od operazione equivalente vengono tipicamente convertiti a forma digitale e registrati in un dispositivo di memoria convenzio naie insieme con una identificazione delle posizioni di campo alle quali corrispondono. Un calcolatore digitale per scopi generali adatto pu? poi venire programmato in maniera convenzionale in modo da sviluppare i dati immagazzinati per effettuare qualsia si desiderata manipolazione.

Per esempio, il calcolatore viene programmato in modo da scegliere segnali che siano caratteristici di particelle di veicolo piuttosto che del fondo del campo. Questa scelta verr? generalmente fatta in termini dell'intensit? di luce rappresentata dal segnale e pu? poi venire portata direttamente sul segnale analogo riducendola efficacemente a forma binaria prima dell'immagazzinamento. Tuttavia, se le particelle hanno un colore distintivo, ciascun segnale di posizione pu? comprendere due o pi? componenti distinti che rappresentano regioni di lunghezza d?onda rispettive che sono percepite separatamente con l'aiuto di strumenti ottici convenzionali che scompogono il fascio e, oppure filtri di colore. La discriminazione fra segnali di campo e segnali di particelle pu? poi venire fatta in termini del rapporto dei componenti del colore, ad esempio. Questa discriminazione pu? anche venire effettuata fra due o pi? tipi di particelle aventi colori differenti.

Il calcolatore viene inoltre programmato in modo da confrontare le posizioni dei vari segnali che corrispondono a particelle e di identificare gruppi di tali segnali di particelle che sono rec_i procamente adiacenti con riguardo a l?ro posizione nel campo e sono pertanto tutti associati con il medesimo oggetto fisico nella sospensione. Questo oggetto pu? essere una particella singola purch? le particelle singole siano grandi abbastanza da venire risolte mediante il sistema ottico oppure possono consistere in un aggregato di particelle agglutinate .

Secondo quella forma della presente invenzione, ciascun gruppo di segnali di particelle viene analizzato tipicamente per determinare il valore di un parametro che ? stato scelto per fare una discriminazione fra aggregati che debbono venire inclusi nell'analisi e quelli che debbono venire trascurati. Viene sviluppato un segnale per ciascun aggregato impiegando il valore di quel parametro.

Questo segnale ? distintivo della classe di aggregato scelta e verr? citato come segnale di classe. A tito lo di chiarezza della presente descrizione, il parametro scelto verr? generalmente considerato essere l'area apparente dell'aggregato come vista median te l'apparecchio di scansione ottica. I segnali di classe rappresentano allora le aree degli aggregati singoli .

Se i segnali di posizione corrispondono ad elementi di campo uniformemente distanziati, come viene preferito, l'area apparente di ciascun oggetto pu? venire determinata contando il numero di segnali di particelle in ciascun gruppo. Per esempio, se i segnali corrispondono a posizioni formanti una griglia quadrata di una distanza di un micron, l'area di un oggetto pu? venire espressa in micron quadrati semplicemente contando il numero di segnali nel gruppo associato e ciascun segnale di classe rappresenta l'area cos? determinata.

In altra maniera, se la scansione viene effettuata mediante una videocamera od altro dispositivo che sviluppi in maniera continua segnali ana loghi variabili corrispondenti a successive esplorazioni spostate lateralmente attraverso il campo, il videosegnale sviluppato durante ciascuna esplorazione pu? venire considerato comprendere piccole sezioni elementari che sono identificate mediante la loro relazione di tempo rispetto al segnale di tempo di sincronizzazione periodico che controlla le esplorazioni. Ciascun oggetto nel campo pu? poi venire associato con taluni segmenti di segnale di esplorazione che sono "adiacenti" per quanto riguarda sia le loro esplorazioni che le loro relazioni di tempo rispetto a segnali di sincronizzazione. L'area di ciascun oggetto pu? poi venire espressa come il prodotto di intervallo di scansione per la somma delle lunghezze di tali porzioni di esplorazione sovrapponentesi.

Come altro tentativo per sviluppare i segnali, il calcolatore pu? ad esempio rivelare contorni di oggetti nel campo direttamente, ad esempio confrontando segnali vicini per trovare posizioni in cui i segnali cambiano bruscamente in funzione della posizione. Ciascun oggetto viene allora definito dalla sequenza di posizioni lungo il suo contorno piuttosto che dai segnali singoli entro la sua area. L'area di un oggetto pu? poi venire calcolata, ad esempio, in termini di differenze nelle coordinate x ed y di punti di contorno . Questo tentativo facilita anche la discriminazione di particelle aventi sagome distinte, ad esempio median te 11impiego di tecniche di riconoscimento di schemi ben note. Si intender? che altri tipi di dispositivi di scansione e procedimenti di trattamento possono . venire impiegati, per ciascuno dei quali l'area ed altre propriet? desiderate dell'oggetto possono venire calcolat? in maniera approssimata per sviluja pare segnali di classe.

Pertanto, ciascuna scansione di un campo di sospensione porta tipicamente ad un elenco di numeri ciascuno dei quali rappresenta l'area apparente di un oggetto distinto del campo ed ? rappresentato da un segnale di classe. Quei segnali possono venire direttamente immagazzinati in memoria, insieme con qualsiasi desiderata ulteriore informazione su ciascuno. Si preferisce in generale, tuttavia, fornire al calcolatore almeno valori sperimentali di limiti superiori ed inferiori che definiscono una classe scelta di aggregato e programmare il calcolatore in modo da confrontare quei limiti con i segnali di classe e determinare il numero di aggregati misurati entro la classe scelta. Quei numeri di classe, tipicamente imagazzinati in memoria, diventano allora la base principale per quantizzare il grado di aggregazione.

Procedimenti di scansione ottica, quali quelli indicati sopra, hanno il vantaggio che possono venire effettuati senza alcun disturbo alle sospensioni in incubazione che sono tipicamente contenute in cavit? piccole convenzionali formate in vassoi che sono convenienti da maneggiare. I reagenti sono preferibilmente caricati entro le cavit? automaticamente in maniera convenzionale. Le sospensioni vengono agitate tipicamente ad intermittenza durante l'incubazione ed i prodotti di reazione vengo no misurati tipicamente dopo un tempo di sedimentazione definito e senza asportarli dalle cavit?. Un vantaggio della scansione ottica con registrazione e sviluppo elettronici dei risultati ? il fatto che la velocit? di operazione pu? venire resa sufficien te ad analizzare quasi simultaneamente un grande numero di cavit?. La scansione di ciascun campo sin golo ? tipicamente cos? rapida da essere praticamente te istantanea. Scansioni successive possono pertanto venire cronometrate con eccellente esattezza anche quando un numero relativamente grande di cavit? debba venire trattato in maniera strettamente confrontabile. Finch? il campo analizzato ? tipico dell'intera cavit? esso pu? essere relativamente piccolo e fornire ancora risultati che sono esattamente rappresentativi dell'intera sospensione.

Un altro tentativo per misurare le aggregazioni di particelle impiega una certa forma di flusso di cellule attraverso il quale una parte del fluido di sospensione viene fatto passare, tipicamente lungo un percorso lineare strettamente limitato. Un apparecchio di controllo viene montato adiacente al per corso, che risponde al passaggio di ciascuna particella singola od aggregato di particelle. Il dispositivo di controllo risponde tipicamente in maniera selettiva ad aggregati di grandezze differenti. Soltanto una porzione relativamente piccola dell'intera sospensione deve venire prelevata per ottenere aggregati rappresentativi dell'intero prodotto di reazione .

Una forma ben nota di flusso di cellule impie ga un fascio di luce trasversale strettamente concen trato con un rivelatore di luce che risponde soltanto a luce diffusa in corrispondenza di un certo angolo piccolo. Qualsiasi corpo che attraversa il fascio di luce fa s? allora che il rivelatore produca un segnale in forma di impulso, la cui ampiezza varia in generale secondo la grandezza del corpo.

Questi "contatori di particelle" ed apparecchiatura accessoria sono resi disponibili in commercio ad esempio dal Technicon Instruments Corporation of Tarrytown , New York, ed anche dalla sezione HIAC/ROYCO Instruments Pacific Scientific di Menlo Park, California.

Un'altra forma di rivelatore di particelle impiega un piccolo orifizio fra due camere che sono collegate a differenti potenziali elettrici. Il campo risultante in corrispondenza dell'orifizio ? disturbato dal passaggio di un corpo solido avente cartteristiche elettriche differenti da quelle del mezzo fluido. Questo disturbo ? percepito da elettro di nelle camere, che producono tipicamente un impulso di potenziale che varia in ampiezza con la grandezza del corpo. Un apparecchio di tale tipo generale ? reso disponibile in commercio dalla Particle Data, Ine. of Elmhurst, Illinois. Entrambe le forme elettrica ed ottica di apparecchi di flusso forniscono un segnale che tipicamente rappresenta la grandezza diparticelle sebbene tendano a riflettere misure differenti di grandezza, corrispondenti grossolanamente al volume ed all'area, rispettivamente .

La grandezza o grandezze di aggregato partico lare scelte per la misura possono variare molto con la natura delle sostanze reagenti e delle parti celle e con le condizioni di operazione. Se le particelle da agglutinare sono di una grandezza da essere otticamente visibili con un adatto ingrandimento, come quando vengano impiegate cellule del sangue oppure batteri, ad esempio, anche i complessi pi? piccoli possono venire misurati e contati nelle maniere illustrative gi? descritte. Se il diametro di particella ? dell'ordine della lunghezza d'onda del la luce, come avviene usualmente per perle di lattice e simili nella pratica convenzionale, gli schemi di sviluppo di aggregati possono iniziare a venire misurati appena la loro grandezza diventa sufficien te. Pertanto, la presente invenzione trova applicazione efficace nel saggio diagglutinazione di particelle di qualsiasi grandezza che sia utile per saggi convenzionali.

Per misure ottiche, la radiazione incidente nonch? la radiazione rivelata possono racchiudere un'ampia regione spettrale, dall'ultravioletto fin quasi all'infrarosso, ad esempio, oppure pu? venire limitata in maniera nota a solo un campo scelto di lunghezze d'onda o ad una singola lunghezza d'onda. Molti differenti sistemi ottici e dispositivi di trasduzione sono disponibili per percepire questa radiazione e taluni di essi saranno particoalrmente utili per talune applicazioni.

Inoltre, in certe condizioni sar? desiderabile impiegare una combinazione di sistemi ottici cos? da percepire due o pi? parametri che~si riferiscono a caratteristiche differenti della radiazione e misurare propriet? differenti degli aggregati. Quando questo venga fatto, una classe di aggregato pu? venire definita in termini di etrambi quei parametri. Per esempio, se l'analita mostra fluorescenza, allora una misura dell'intensit? di fluorescenza totale per ciascun aggregato singolo nel campo pu? fornire un parametro che definisce la classe. Se il grado di polarizzazione di quella radiazione viene anche misurato, i valori risultanti possono fornire informazioni addizionali circa lo stato del reagente fluorescente e possono venire usati per definire un'altra classe di aggregato. In maniera simile, l'indice di rifrazione di ciascun aggregato pu? venire misurato insieme con 1'intensit? della luce dispersa, ad esempio. Quando tali coppie di parametri vengano misurate per ciascun aggregato, le serie risultanti di valori, singoiar mente oppure in combinazione, possono venire usate per definire parametri di classe.

Un esempio di una classe definita in termini di due parametri specificherebbe la forma di aggregato mediante il rapporto fra lunghezza e larghezza, ad esempio. Un altro parametro configurazionale illustrativo comprende una misura della chiarezza od opacit? della struttura di aggregato quale un rapporto dela luce riflessa di un aggregato singolo di^ viso per la sua apparente area geometrica.

Misure del grado di agglutinazione possono essere utili per molti scopi quali la rivelazione di differenze sottili fra due materiali generalmente simili. Per esempio, se due campioni del medesimo farmaco ottenuti da sorgenti-differenti e riferiti di concentrazioni uguali vengono sottoposti a reazioni di agglutinazione in condizioni identiche, dovrebbero prevalere in tutte le reazioni gradi di agglutinazione identici. La scoperta di differenze nel grado di tale agglutinazione suggerirebbe mancanza di identit? dei due materiali.

Scelta di classi di aggregati per un saggio

Le misure di agglutinazione vengono ordinaria mente usate per determinare la concentrazione di un particolare reagente che prende parte al processo di agglutinazione ed ? originariamente presente in una soluzione o sospensione in prova. Un tale saggio di una sostanza in prova od analita implica normalmente la misura del grado di agglutinazione dovuto alla reazione di prova e confronto dei risultati di prova con dati ottenuti in maniera corrispondente con reazioni standard impieganti quantit? note di materiali standard e controlli appropriati. Una caratteristica distintiva della presente invenzione ? il fatto che le misure di grado di agglutinazione per entrambe le reazioni sia di prova che standard sono limitate a misure del numero di una o pi? classi specifiche di aggregati. Pertanto, un aspetto impor tante dell'invenzione riguarda la scelta di classi adatte di aggregati da prendere in considerazione nel saggiare sostanze particolari.

I fattori che influiscono sulla scelta di classi di aggregati possono meglio venire compresi dalla considerazione della dinamica di formazione e crescita di un aggregato, che influenzano direttamen te la distribuzione di aggregati fra il gruppo illu strativo di classi di aggregati definite in termini di grandezza di aggregato.

Quando una soluzione contenente un reagente venga combinata con una sospensione di particelle sensibibilizzate con il reagente complementare, i primi aggregati da formare contengono soltanto due particelle, legate tramite una molecola polivalente del reagente disciolto. Man mano che la incubazione procede, il numero di tali aggregati duplici nella sospensione aumenta e diminuisce il numero di particelle singole. Una particella singola rimanente diventa pertanto progressivamente pi? probabile da combinare con un aggregato duplice esistente piut_ tosto che con un'altra particella singola. Quindi, il regime netto di produzione di aggregati duplici diminunisce ed aumenta il regime di crescita di tripletti. In maniera simile tendono a comparire a loro volta quadripletti ed aggregati pi? grandi. In condizioni adatte, comprese la natura e concentrazioni iniziali dei reagenti e grandezze e grado di sensibilizzazione delle particelle, molti aggregati singo li possono continuare a crescere finch? raggiungono ognuno parecchie decine o centinaia di particelle.

Poich? la media di tutte le grandezze di aggregato aumenta con il tempo, il numero in qualsiasi intervallo di grandezze tende ad aumentare sempre pi? lentamente ed a passare poi attraverso un massimo e diminuire .Gli schemi di sviluppo per grandezze relativamente piccole aumentano in maniera relativamente rapida, passano attraverso un massimo relativamen te stretto e tendono a diminuire considerevolmente rispetto ai loro valori massimi. Per gli aggregati pi? grandi il numero in un intervallo limitato di grandezze ? tipicamente ancora in crescita lentamente man mano che la reazione raggiunge l'equilibrio. Questa descrizione ? alquanto semplificata a scopo di chiarezza, omettendo, ad esempio, fattori come affinit? di reagenti e tendenza per gli aggregati pi? probabili a dominare come processo statistico .

Gli schemi di sviluppo di differenti classi di aggregati dipendono in maniera significativa da molte condizioni sperimentali e specialmente dai reagenti particolari e dalle loro concentrazioni. Quindi, per ottenere un vantaggio optimum dalla presente invenzione si preferisce scegliere classi di aggregati da misurare in coordinazione con la scelta di tempo o tempi per la misura di ciascuna classe e con stretta attenzione alla sostanza particolare da saggiare ed alla sua probabile concentrazio ne nella soluzione o sospensione di prova.

Nella pratica normale, la scelta di una adatta classe di aggregato per qualsiasi saggio particolare sar? ordinariamente basata largamente sulla esperienza precedente con i medesimi reagenti e con condizioni di operazione simili. In assenza di tale esperienza, le interrelazioni fra valori di parametri per i reagenti in questione vengono esplorate sperimentalmente e sulla base dei dati risultanti vengono scelte classi di aggregati particolar mente favorevoli.

Per effettuare misure preliminare per il saggio di un antigene in soluzione, per esempio, varie quantit? standard note dell?antigene vengono fat te reagire con aliquote di un anticorpo complementare legato su particelle insolubili. Altre condizioni vengono mantenute strettamente uniformi per tutte le reazioni della serie e corrispondono alle condizioni che verranno usate per la prova vera e propria. Aggregati dovuti a ciascuna di queste reazioni vengono misurati rispetto a qualsiasi parametrovenga preso in considerazione per definire una classe di aggregato potenzialmente utile. Pertanto, per esplorare grandezze di aggregato come possibi le definizione di classe, viene misurata la grandezza di ciascun aggregato osservato, e tutte le misure di una serie vengono effettuate sostanzialmente al medesimo tempo. Le misure in altri tempi verranno discusse pi? tardi.

Dalla serie risultante di dati viene tracciato tipicamente un grafico per ciascuna concentrazione iniziale di antigene mostrante il numero di aggregati di ciascuna grandezza di aggregato in funzione della grandezza di aggregato. Queste curve di distribuzione di grandezze contengono l'informazione fondamentale in forma conveniente, il cui esame indica intervalli di grandezze di aggregato capaci

di formare utili classi di aggregati. La.scelta del la classe pu? anche venire favorita tracciando per ciascuno di tali intervalli di grandezze un grafi^

co mostrante il numero di aggregati avente dimensio

ni entro quell'intervallo di grandezze in funzione della concentrazione iniziale di antigene.

Si trover? che molti dei grafici di numero

di aggregato rispetto a concentrazione di antigene comprendono porzioni aventi una pendenza relativamente ripida, nettamente pi? ripida della pendenza media, ad esempio. Tali porzioni indicano campi della concentrazione di antigene che sono rappresentati in maniera particolarmente sensibile da numeri di aggregato per 1?intervallo di grandezze del grafico particolare.

Quindi, questo intervallo di grandezze di aggregato viene indicato come parametro favorevole per saggia

re 1'antigene in quel campo particolare di concentra zione. Per alcuni scopi, questo livello di analisi

pu? essere una base sufficiente per la scelta finale di una classe di aggregato per la prova.

Le interrelazioni di una serie di dati di ri ferimento, per quantodescritto, possono spesso veni re pi? chiaramente visualizzate programmando il cal colatore in modo da disegnare un grafico tridimensionale che mostri la grandezza di aggregato e la concentrazione di analita iniziale riportata sugli assi delle x e delle y, ad esempio, ed i numeri cor rispondenti degli aggregati riportati lungo l'asse delle z. Un tale grafico mostra chiaramente la grandezza di aggregato pi? sensibile per qualsiasi campo di concentrazione di analita, per esempio, ed indica come molte grandezze dovrebbero venire misurate per coprire con buona sensibilit? il campo pieno di concentrazioni anticipate in un particolare saggio. In alcuni casi, specialmente per saggi di natura ordinaria, la misura ed il trattamento di aggregati entro un intervallo di grandezza singolo possono dare una eccellente esattezza in tutto il campo anticipato di concentrazioni.

La precedente discussione di scelta di classe ? stata limitata a scopo di chiarezza alla misura di reazioni di riferimento in corrispondenza di un solo tempo. Per trarre vantaggio dal parametro tempo, vengono fatte serie addizionali di misure in corrispondenza di una serie di tempi, estendentesi entro un campo di tempi che pu? venire scelto con lo aiuto di prove preliminari. I parametri di reazione vengono misurati ed i numeri risultanti di aggregati vengono trattati nella maniera gi? descritta, preferibilmente per i medesimi intervalli di grandezze che in precedenza, portanti a serie simili di grafici mostranti numeri di aggregati rispetto a concentrazione di analita standard per ciascun tempo. Per ciascun tempo di misura viene preparato preferibilmente un grafico tridimensionale.

Il confronto fra gli ultimi grafici mostra tipicamente che la grandezza di aggregato pi? favorevole per un tempo differisce da quella per iun alaltro tempo. Inoltre, per una data grandezza, la relazione pi? sensibile si verifica tipicamente per una concentrazione di analita in corrispondenza di un tempo e per un'altra concentrazione in corrispondenza di un altro tempo. Sar? spesso possibile, tuttavia, trovare una singola grandezza di aggregato che fornisca buona sensibilit? in tutto il campo di concentrazioni desiderato misurando in corrispondenza di un tempo per parte di quel campo ed in corrispondenza di un altro tempo per un'altra parte.

Talvolta ciascuna porzione del campo di concentrazioni viene meglio coperta da una grandezza particolare e per un tempo particolare di misura appropriato per quella grandezza. In altra maniera, la analisi dei dati indicher? talvolta un campo particolarmente favorevole di concentrazioni dell'analita per cui ? disponibile una classe di aggregato particolarmente favorevole. La concentrazione di analita anticipata in una soluzione di prova pu? spesso venire portata nel campo favorevole mediante adatta diluizione del mezzo di prova originale.

Il procedimento di scelta di classe ? stato de scritto largamente in termini di tracciamento ed esame di grafici per rendere pi? chiari i principii del metodo. E' ben noto come trasferire tali operazioni per il trattamento con il calcolatore impiegando coefficienti di correlazione, metodi di quadra ti minimi e simili.

Specialmente quando si trovi che la scelta di classe implica un compromesso significativo fra tentativi che non sono completamente compatibili, una soluzione soddisfacente pu? spesso venire trova ta molto convenientemente impiegando tecniche convenzionali di analisi multivariate.I programmi del calcoltore sono facilmente disponibili per raggiungere un compromesso fra criteri disponibili, portanti tipicamente ad una serie di definizioni di classe che soddisfa condizioni prescritte.

Si mette in evidenza, tuttavia, che un guadagno molto significativo pu? venire ottenuto rispetto alla tecnica antecedente senza assoluta ottimizzazione della sensibilit? della classe o classi scelte. Il processo di selezionamento pu? implicare molti compromessi ed assicurare ancora un saggio basato sulla misura di un parametro che risponda di gran lunga pi? favorevolmente alla variabile che si sta determinando che qualsiasi semplice somma di tut ti gli aggregati.

DOpo queste esplorazioni iniziali con un particolare antigene ed anticorpo, ad esempio, prove ordinarie con quelle medesime sostanze possono usualmente venire limitate a misure di un numero relativamente piccolo di grandezzze di aggregati e tempi di misura. Infatti, in molti casi, i valori di parametro scelti alla fine possono comprendere soltanto un singolo intervallo di grandezza ed un singolo tempo di misura, i cui valori coordinati sono stati scelti alla luce di dati preliminari relativamente estesi. Una tale serie strettamente definita di parametri. Poich? ? stata scelta espressamente per fornire una riflessione molto sensibile della desiderata concentrazione di reagente iniziale, fornisce tipicamente una prova quantitativa pi? accurata affidabile di quanto potrebbe venire ottenuto nella tecnica antecedente misurando aggregati di tutte le grandezze uniti insieme.

Sebbene la descrizione precedente sia stata esposta per chiarezza principalmente in termini di classi definite da grandezza di aggregati, si comprender? che relazioni di altri parametri o serie di parametri o combinazioni di vari parametri posso no venire esplorate in maniera simile portanti ad identificazione di classi di aggregati favorevoli definite da scelti campi di valore di quei parametri. Questi parametri possono riferirsi sostanzialmente a qualsiasi propriet? che sia misurabile per aggregati singoli come dimensioni specifiche, assorbanza o dispersione di luce, densit? o propriet? elettriche .

Le misure di parecchi parametri di aggregati distinti in corrispondenza di tempi multipli rendono disponibili una grande variet? di classi di aggre gati dai quali possono venirne scelti uno o pi? per il confronto vero e proprio fra risultati di prova e standard. Quando per la misura vengano sceJL te parecchie di tali classi, il calcolatore viene t_i pocamente programmato per trattare i risultati di prova per ciascuna classe indipendentemente dalle altre, portando a valori di prova separati sebbene non necessariamente indipendenti per la concentrazio ne dell'analita. Quei valori sono allora tipicamente calcolati come media con appropriata carica, fornendo un risultato complessivo di maggiore esattezza ed attendibilit?.

Inoltre, classi di aggregati possono venire definite in termini di funzioni specifiche di parecchi parametri distinti oppure funzioni di valori distinti di un singolo parametro misurato ad esempio in corrispondenza di tempi differenti. Quando venga scelta una tale classe, i valori di parametro misurati vengono trattati in modo da calcolare un valore di prova della funzione, ottenuto con 1'analita in prova, che viene poi confrontato con adatti valori standard di quellamedesima funzione, ottenuti da misure con gli standard appropriati. Per esempio, misure di un parametro in corrispondenza di una serie di tempi dopo l'inizio della reazione di prova vengono trattate per derivare il regime di cambiamento di quel parametro. Un campo scelto dei valori di quel regime di cambiamentodefinisce allora una classe di aggregato che pu? venire usata come misura di concentrazione dell'analita.

Risultati di tali misure di parametro e, oppure derivazioni di funzioni per tempi differenti possono venire interpolate ad un tempo conveniente oppure possono venire estrapolate ad un tempo oltre il campo di misura vero e proprio, per esempio a 0 oppure un altro campo precedente, oppure ad un tem po effettivamente infinito dopo il quale non si veri fica pi? ulteriore cambiamento significativo. Come altro esempio di funzioni che definiscono una classe, una classe di aggregati pu? venire definita da un certo campo di valori del rapporto di due parametri distinti quali i diametri massimo e minimo misurati di ciascun aggregato. Il numero di aggregati per cui il valore calcolato di un tale parametro di prova derivato ? entro l'intervallo che definisce la classe viene confrontato con i numeri cor rispondenti di aggregati ottenuti da serie di valori standard della medesima funzione derivata in maniera corrispondente da reazioni con quantit? standard note dell'analita.

Un altro vantaggio utile dell'esplorazione con calcolatore sopra descritta di reazioni di rife rimento ? il fatto che possono venire identificate condizioni di operazioni nelle quali taluni campi di numero di aggregato od altro valore di classe vengono trovati verificarsi solo raramente oppure affatto. Queste informazioni forniscono un controllo sul funzionamento corretto del sistema; durante prove di saggio regolari il calcolatore viene programmato in modo da controllare i numeri per 1'occorrenza di qualsiasi valore di classe raro e per produrre un segnale che indichi un possibile malfunzionamento .

Quando si quantifichi un analita, verr? spesso trovato utile includere ridondanza nelle classi di aggregato che vengono scelte per la prova. In particolare, ? stato trovato che se sensibilit? soddisfacente per le condizioni impiegate, compreso un campo particolare di concentrazione di analita anti^ cipate, viene presentata da un certo intervallo di un parametro che definisce una classe, ? spesso utile scegliere non soltanto la classe definita da quell'intervallo ma anche alcune classi che mostrino una sensibilit? massima per un campo pi? basso di concentrazione di analita ed alcune che mostrino una sensibilit? massima per un campo pi? elevato di concentrazione di analita. Estendendo le misure e calcoli in modo da comprendere queste classi ridondanti, i gradi aggregazione in corrispondenza dei campi pi? basso e pi? elevato di concentrazione di analita vengono presi in considerazione e possono permettere una descrizione pi? esatta del grado di aggregazione e quindi di quantizzazione dell1analita che quando questa informazione non venga usata.

Standard di riferimento per saggi

La produzione ed impiego di standard di confronto in relazione con la presente invenzione

non sono fondamentalmente differenti da quelli gi? familiari in molti tipi di saggi bilogici. Tuttavia, i commenti che seguono possono chiariiejtaluni punti ed evitare incomprensioni.

Un problema illustrativo consiste nel saggiare una soluzione in prova per la concentrazione di un antigene che, ad esempio, sia anche disponibile

in concentrazione nota in una soluzione standard

e per cui un anticorpo specifico sia disponibile legato a particelle di lattice od altro materiale adatto. Aliquote della sospensione di anticorpo vengono fatte reagire tipicamente con una o pi? concentrazione della soluzione in prova per produrre sospensioni^di prova ed inoltre tali aliquote di sospensioni di anticorpo vengono fatte reagire con soluzioni standard contenenti una serie di concentrazioni note dell'antigene standard per produrre sospensioni standard. Le sospensioni vengono tutte incubate e poi analizzate od altrimenti misurate in una

relazione di tempo corrispondente all'inizio della

incubazione. I segnali risultanti da sospensioni di

e

prova /standard vengono trattati in maniera corrispon

e

dente per dare valori di prova/standard. Con "corrispondenti" si intende che tutte le condizioni eccetto quelle variate di proposito sono quasi uguali ]

? -fs"o od equivalenti a quanto possibili. Queste condizio- 1

?f.1 ni comprendono mescolamento e tempo di nonch? ,,/

/ fattori come grandezza di particelle, pH, concentra

zioni di sale, temperatura e possibile presenza di

altre sostanze nel fluido. Quest'ultimo fattore pu?

anche richiedere l'inclusione di altri controlli

specifici .

In tali condizioni corrispondenti, il risulta-

?

to ? una serie di valori di prova/standard direttamente confrontabili di uno o pi? parametri di aggre

gato distintivi di qualsiasi classe o classi che

siano state scelte per la misura ed il confronto.

Da questi valori di parametri misurati vengono derivati i numeri di aggregati di ciascuna classe scelta. Quei numeri di aggregate!) costituiscono l'informazione fondamentale per descrivere il grado di agglutinazione e permettere la quantizzazione dello

analita .

Il numero di aggregati di ciascuna classe scelta per le reazioni in prova pu? venire confrontato direttamente con i numeri corrispondenti per le rea zioni standard oppure un confronto efficace pu? venire fatto in termini di qualsiasi funzione adatta per cui i valori sono derivabili Ai valori di parametro. Per esempio,una funzione del genere sarebbe il regime di tempo di cambiamento del numero di aggregati di una classe particolare e verrebbe confron tata con i regimi di tempo di cambiamento di corri spondenti numeri standard di aggregati come misura di concentrazione di analita. La funzione pu? dipendere. anche da altri parametri finch? questi ulti^ mi vengono iiantenuti effettivamente costanti per le reazioni di prova e standard oppure la loro variazio ne viene presa in considerazione in maniera appropriata nei calcoli. Una tale funzione pu? venire considerata un mezzo per confrontare i valori di parametro originali oppure come parametro derivato che ? confrontato direttamente. Il riferimento nelle rivendicazioni annesse al confronto di valori

?

di prove/standard di numeri di aggregati di una scelta grandezza, ad esempio, va inteso comprendente il confronto di qualsiasi funzione adatta di tali numeri nonch? il confronto dei numeri di per se stessi.

Il confronto vero e proprio dei valori di prova con i valori standard pu? venire effettuato in qualsiasi maniera adatta e non necessita di venire descritto qui in dettaglio. Nella sua forma pi? sem plice, si potrebbero tracciare i valori standard del . parametro o parametri come funzioni della quantit? della sostanza da saggiare e trovare il punto su ta li curve che soddisfa i dati di prova.

Le curve standard usate nell'operazione di stan dardizzazione sono simili a taluni dei grafici di riferimento di parametri di aggregato rispetto a concentrazione di analita che sono stati descritti per la scelta di classe di aggregato. Infatti, entrambi possono talvolta venire derivati dallemsdesime reazioni. Tuttavia, una variet? pi? estesa di concentrazioni e misure di analita ? usualmente richiesta per scelte di classe e le curve di standardizzazione sono preferibilmente sviluppate da reazioni effettuate in parallelo con le reazioni di prova vere e proprie. Pertanto, reazioni distinte in pratica e curve distinte vengono ordinariamente usate per i due scopi.

Quando la sostanza in prova da saggiare sia inizialmente presente in soluzione, il risultato della prova viene ordinariamente espresso come concentrazione iniziale di analita nella soluzione in prova che pu? venire esposta in qualsiasi unit? conveniente come moli oppure microgrammi per volume unitario di soluzione. Quando la sostanza in prova sia inizialmente presente su superfici delle par ticelle che diventano agglutinate per effetto della reazione, la quantit? di sostanze in prova come determinata mediante saggio pu? venire espressa in qualsiasi forma che sia disponibile per definire la quantit? di sostanza presente nelle sospensioni standard impiegate per standardizzare il saggio.

Pertanto, se sono disponibili sospensioni standard che contengono una quantit? nota del reagente di prova per numero unitario di particelle oppure per massa unitaria di particelle, ad esempio, oppure per volume unitario di sospensione, allora i risultati di prova saranno usualmente molto conve nientemente espressi in unit? corrispondenti. Una propriet? di cellule naturali, quale un sito antigenico sulla superficie di cellule, pu? venire quan tizzata in termini di una concentrazione efficace di un antisiero standard oppure, se 11anticorpo ? copulato con particelle come descritto sopra nella parte "schema dell'invenzione",in termini della sospensione standard delle particelle cos? sensibilizzate.

Per il saggio mediante agglutinazione indiretta e mediante inibizione di agglutinazione, in cui vengono tipicamente implicate almeno tre specie distinte di reagenti, i risultati di prova vengono confrontati con valori standard ottenuti in maniera corrispondente con quantit? standard di tutte e tre le specie, impiegando parecchie differenti quan tit? di almeno la sostanza da saggiare.

Secondo un altro aspetto dell'invenzione, una soluzione pu? venire analizzata nei riguardi di un reagente con migliorata sensibilit? misurando l'effetto del reagente nell'esaltare l'agglutinazione. Per esempio, una soluzione in prova pu? venire analizzata nei riguardi dell'antigene, ad esempio, facendo reagire una quantit? definita di una sospensione di particelle portanti 1*anticorpo complementare con un campione della soluzione in prova ed anche con una quantit? definita dell'antigene in so luzione sufficiente a produrre un'aggregazione di riferimento leggera ma misurabile quando fatto reagire direttamente con tale sospensione di particela le. Qualsiasi antigene nella soluzione di prova aumenter? la quantit? totale di antigene disponibile per produrre agglutinazione e, in condizioni appropriate , favorir? l'agglutinazione di riferimento di una percentuale relativamente elevata. Se l'agglutinazione complessiva viene poi misurata mediante il procedimento di saggio migliorato che ? stato descritto, una appropriata scelta di classe di aggregati per tale saggio pu? migliorare ulteriormente la sensibilit? della determinazione.

Un altro aspetto dell'invenzione fa uso del fatto che molti analiti mostrano almeno due siti antigenici indipendenti (epitopi). Il lavoro di preparare anticorpi contro siti di legame specifici ? ora ben noto ed un po' di questo lavoro ? stato recentemente revisionato da J.G. Sutcliffe e coll, in Science, 219, 660, 1983. La tecnologia corrente per saggiare specificamente tali sostanze impiega materiali radioattivamente etichettati come traccianti.

La presente invenzione permette il saggio di questianaliti a pi? siti mediante una nuova forma di agglutinazione indiretta che ha il vantaggio significativo di evitare l'impiego di materiali radioattivi pur conservando la piena specificit? resa possibile dall'impiego di siti indipendenti duplici.

In una forma illustrativa della presente inven zione, anticorpo contro un sito specifico dell'analita viene copulato ad adatte particelle insolubili. L'analita in prova viene aggiunto e si legher? all 'an ticorpo legato a particellama usualmente senza produrre agglutinazione. La reazione viene meglio effettuata in un eccesso di anticorpi.

Un secondo anticorpo, specifico per l'analita in un secondo sito, viene poi aggiunto e pu? dare come risultato agglutinazione. Se si verifica aggregazione allora viene quantizzato, preferibilmente come descritto in questa descrizione. Se in quello stadio non si verifica aggregazione, si produce agglutinazione per effetto di aggiunta di anticorpo con specificit? contro il secondo anticorpo.

L'agglutinazione risultante, sia dovuta al secondo anticorpo oppure allo anti-anticorpo, viene quantizzata, preferibilmente mediante il procedimento di saggio migliorato che ? stato descritto e vie ne confrontata con standard preparati corrispondente mente per determinare la concentrazione iniziale di analita nella soluzione in prova.

Pertanto, il presente aspetto dell'invenzione fornisce una prova di agglutinazione quantitati va per una identificazione pi? attendibile della sostanza in prova di quanto precedentemente possibi. le poich? implica una duplice specificit? in corri

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Metodo per saggiare il grado di agglutinazione di particelle dovuto a reazione di una prima sostanza presente su particelle di veicolo insolubili ed una seconda sostanza complementare,comprendente le operazioni di:

identificare, per aggregati di particelle dovuti a reazione di dette sostanze, almeno una classe limitata di aggregati per cui il conteggio o conteg gi di aggregati riflettano in maniera particolarmen te sensibile il grado complessivo di agglutinazione, misurare gli aggregati di particelle dovuti alla reazione da saggiare per sviluppare segnali di classe elettrici distintivi di detta classe o classi; sviluppare i segnali per derivare il numero di aggregati di ciascuna classe,

ed impiegare il numero o numeri risultanti come misura del grado di agglutinazione.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una detta classe ? definita da un campo limitato di un parametro di aggregato e detti segnali rappresentano valori di detto parametro o parametri.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una detta classe ? definita da un campo limitato di un parametro che rappresenta una misura della configurazione di aggregato e detti segnali rappresentano valori di tale parametro.

4. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una detta classe ? definita da un campo limitato di un parametro che rappresenta una misura della dimensione di aggregato e detti segnali rappresentano valori di tale parametro.

5. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta misura di aggregati di particelle comprende le operazioni di;

analizzare automaticamente un campo ottico contenente aggregati rappresentativi per produrre segnali elettrici che corrispondono ad elementi di campo rispettivi e differenziare segnali di particelle che corrispondono ad elementi di campo occupati da particelle;

identificare gruppi di segnali di particelle tali che tutti i segnali di ciascun gruppo siano associati con il medesimo aggregato e sviluppare da eia scun gruppo di segnali un segnale di classe distinti vo di una classe di aggregato identificata.

6. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta misura di aggregati di particelle comprende l'operazione di far passare una porzione della sospensione di aggregato attraverso una zona limitata e sviluppare un segnale di classe che risponde a ciascun aggregato che passa attraverso detta zona ed ? distintivo di una classe di aggregato identificata.

7. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta misura di aggregati di particelle viene effettuata in corrispondenza di ciascuno di numerosi tempi e . segnali vengono sviluppati per derivare numeri di aggregato entro ciascuna classe identificata in corrispondenza di ciascuno di detti tempi di misura.

8. Metodo secondo la rivendicazione'1 in cui detta misura di aggregati di particelle viene effettuata in corrispondenza di ciascuno di numeros:. tempi e segnali vengono sviluppati per derivare il valore di tempo dicambiamento dei numeri di aggregato entro ciascuna classe identificata come misura delgrado di agglutinazione.

9. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta misura di aggregati viene effettuata dopo che detta reazione ha raggiunto un sostanziale equilibrio .

10. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una di dette sostanze ? un antigene e 1'altra di dette sostanze ? un anticorpo specifico per lo antigene .

11. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una di dette sostanze ? un carboidrato e l'altra di dette sostanze ? una lecitina complementare per il carboidrato.

12. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una di dette sostanze ? un ricettore specificamente presente su cellule naturali o accoppiate a particelle artificiali e l'altra di dette sostanze ? un legante specificamerte reattivo con il ricettore.

13. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui le particelle che portano detta prima sostanza sono cellule naturali ed entrambe dette sostanze so no presenti su particelle insolubili.

14 . Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui una di dette sostanze ? una sostanza di prova inizialmente presente in un mezzo liquido da saggia re per la concentrazione di tale sostanza, detto stadio di identificazione di classe di aggregato com prendendo le operazioni di:

far reagire quantit? note differenti della sostanza in prova con aliquote dell'altra sostanza, misurare gli aggregati di particelle risultanti per ciascuna di quelle reazioni e sviluppare i risultati per iden tificare una o pi?.classi di aggregata sensibili per cui il numero di aggregati nella classe dipenda in ma niera relativamente sensibile dalla quantit? di sostanza di prova in detto mezzo liquido e scegliere almeno una classe di aggregato cos? identificata per la prova del grado di agglutinazione.

15. Metodo secondo la rivendicazione 14 comprendente le operazioni di:

misurare detti aggregati di particelle in corrispon denza di numerosi tempi, sviluppare le misure per identificare almeno una classe di aggregato sensibi. le per ciascun tempo di misura e scegliere almeno una classe cos? identificata e tempo associato di misura per il saggio del grado di agglutinazione.

16. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la reazione di dette prima e seconda sostanza le lega insieme sostanzialmente senza agglutinazione di dette particelle di veicolo e detto metodo comprende l'operazione di portare in contatto il prodotto di reazione risultante con un'altra sostanza complementare per detta seconda sostanza per produrre detta agglutinazione di particelle.

17. Metodo secondo la rivendicazione 16, comprendente l'operazione di isolare detto prodotto di reazione da componenti non reattivi prima di portarli in contatto con detta altra sostanza.

18. Metodo per saggiare una sostanza di prova che sia specificamente reattiva con una sostanza com plementare per provocare aggregazione di particelle insolubili, una di dette sostanze essendo presente sulle superfici di particelle, il detto metodo comprendendo le operazioni di:

far reagire la sostanza complementare con la sostan za di prova per produrre aggregazione di particelle associate;

misurare gli aggregati dovuti a tale reazione per determinare il numero di aggregati di almeno una classe limitata scelta e .confrontare il numero cos? determinato di aggregati con numeri di aggregato standard che vengono ottenuti in maniera corrispon dente mediante reazione di quantit? standard note di dettefsostanze per determinare la quantit? di detta sostanza di prova.

19 . Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui il metodo per ottenere detti numeri di aggregato standard comprende le operazioni di:

far reagire quantit? note differenti di uno standard della sostanza in prova con aliquote di detta sostan za complementare per produrre aggregazione di parti^ celle su superfici delle quali sia presente detta sostanza e

misurare aggregati dovuti a tali reazioni in maniera corrispondente alla rivendicazione 18 per determinare per ciascuna di tali reazioni il numero di aggregati di detta classe scelta.

20. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta classe di aggregato scelta ? tale che il numero di aggregati nella classe ? una funzione relativamente sensibile della quantit? di detta sostanza in prova.

21. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta misura di aggregati comprende la determinazione del numero di aggregati in ciascuraidi numerose classi distinte in modo che i numeri per alm?no due di tali classi siano funzioni sensibili della quantit? di detta sostanza in prova per rispettivi differenti campi di quella quantit?.

22. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta classe scelta di aggregato comprende aggre gati aventi dimensioni entro un intervallo di grandez ze limitato tale che il numero di aggregati nella classe sia una funzione relativamente sensibile della quantit? di detta sostanza in prova.

23. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta misura di aggregati comprende la determinazione del numero di aggregati aventi dimensioni entro ciascuno di numerosi intervalli di grandezze scelti distinti ed il numero risultante di aggregati per ciascun intervallo di grandezze viene confron tato con numeri di aggregato standard corrispondenti per tale intervallo di grandezze per determinare un valore della quantit? di sostanza in prova.

24. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta misura di aggregati comprende misure in corrispondenza di numerosi tempi.

25. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta misura di aggregati comprende misure in corrispondenza di numerosi tempi ed i numeri risultanti di aggregati per i rispettivi tempi vengono interpolati od estrapolati rispetto ad un tempo conveniente oppure vengono estrapolati per un tempo effettivamente infinito al quale non si verifica pi? ulteriore cambiamento significativo, e detto confronto di numeri di aggregato viene fatto in termini del valore interpolato od estrapolato risultante di numero di aggregato che viene confrontato con valori corrispondenti di numeri di aggregato ottenuti mediante reazione di quantit? standard delle sostanze per determinare un valore per la quantit? del la sostanza in prova.

26. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta misura di aggregati comprende misure in corrispondenza di numerosi tempi e derivazione del regime di cambiamento del numero di aggregati di una scelta classe limitata e detto confronto di numeri di aggregati viene effettuato in termini del regime risultante di valore di cambiamento che viene confrontato con un regime standard corrispondente di valore di cambiamento ottenuto mediante reazione di quantit? standard della sostanza per determinare un valore per la quantit? della sostanza in provai

27. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta sostanza in prova ? una proteina od altro materiale immunochimicamente reattivo e la sostanza complementare ? un anticorpo specificamente reattivo con la sostanza in prova.

28. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta sostanza in prova ? un anticorpo contro detta sostanza complementare e detta sostanza complementare ? un antigene noto che ? presente su celL lule naturali note oppure accoppiate con particelle artificiali ad esempio per la scoperta e quantizzazione di anticorpi.

29. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta sostanza in prova ? un antigene o sito antigenico presente sulla superficie cellulare di cellule naturali e la sostanza complementare ? un an ticorpo di specificit? nota contro 1'antigene cellulare, per la tipizzazione quantitativa di globuli rossi del sangue,globuli bianchi del sangue, micro-? organismi od altre cellule naturali.

30. Metodo secondo la rivendicazione 29, in cui il detto anticorpo ? presente su particelle insolubili .

31. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta sostanza in prova ? una proteina o legante e la sostanza complementare ? un ricettore specificamente reattivo con la sostanza in prova e specifi^ camente presente su cellule naturali oppure accoppiate a particelle artificiali.

32. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui detta sostanza in prova ? una lectina e l'altra sostanza ? un carboidrato presente su cellule naturali.

33. Metodo secondo la rivendicazione 18, comprendente le operazioni di far reagire quantit? note differenti di uno standard della sostanza in prova ed aliquote di detta sostanza complementare per produrre aggregazione di dette particelle, misurare la distribuzione degli aggregati risultanti rispetto a uno o pi? parametri di aggregato scelti, sviluppare le distribuzioni risultanti per identificare uno o pi? intervalli sensibili di detti parametri per cui il numero degli aggregati dipende in maniera relativamente sensibile dalla quantit? iniziale della sostanza in prova e scegliere almeno uno di tali inter valli di parametro sensibile per definire detta clas se limitata scelta.

34. Metodo secondo la rivendicazione 33, in cui detto parametro di aggregato scelto ? una misura di grandezza di aggregato, dette distribuzioni di aggregato sono distribuzioni di grandezze di aggregato, detto intervallo di parametro scelto ? un intervallo di grandezze e detta classe di aggregato comprende aggregati aventi dimensioni entro quell'intervallo di grandezze.

35. Metodo secondo la rivendicazione 33, in cui dette distribuzioni di aggregato vengono misurate in corrispondenza di ciascuno di numerosi tempi.

36. Metodo secondo la rivendicazione 35, in cui dette distribuzioni di aggregato vengono tratta te per identificare un tempo di misura per cui il nu mero di aggregati di detta classe scelta ? relativamente stabile rispetto al tempo.

37. Metodo secondo la rivendicazione 35, in cui dette distribuzioni di aggregato vengono tratta te per identificare un tempo di misura ed un intervallo di valori associato di detto parametro per cui il numero di aggregati in detta classe ? relativamente rispondente a variazioni nella quantit? iniziale di sostanze in prova.

38. Metodo secondo la rivendicazione 37, in cui detto parametro di aggregato scelto ? una misura di grandezza di aggregato.

39. Metodo secondo la rivendicazione 33 comprendente le operazioni di identificare almeno un intervallo di parametro sensibile per ciascuna di dette quantit? di sostanza in prova e scegliere per detta prova almeno un intervallo di parametro che sia sensibile sostanzialmente in tutto il campo anticipato di quantit? della sostanza di saggio in prova.

40. Metodo secondo la rivendicazione 18, in 4?. cui la reazione di dette sostanze di prove/complementare le lega insieme sostanzialmente senza acj glutinamento di dette particelle di veicolo e detto metodo comprende le operazioni di portare in contatto il prodotto di reazione risultante con un'altra sostanza complementare per detta sostanza complementare per produrre detta aggregazione di particelle.

41 . Metodo secondo la rivendicazione 40 com prendente l'isolamento di detto prodotto di reazione da componenti non reattivi prima di portare in contatto con detta altra sostanza.

42. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova ? un antigene o sito antigenico presente su cellule naturali, detta sostanza complementare ? un anticorpo specifico per la sostanza in prova e detta altra sostanza ? un antianticorpo specifico per detto anticorpo.

43. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova ? un carboidrato presen te su cellule naturali, detta sostanza complementare ? una lectina specifica per la sostanza in prova e detta altra sostanza ? un anticorpo contro la lectina od una parte carboidrato reattiva con la lectina.

44. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova ? un anticorpo che non provoca agglutinazione nel miscuglio di reazione, detta sostanza complementare ? un antigene o sito antigenico presente su cellule naturali oppure legato a particelle artificiali e specificamente reattivo con la sostanza in prova e detta ?lira sostanza ? un anti-anticorpo .

45. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova ? un ricettore su cellule naturali oppure accoppiate a particelle artificiali, detta sostanza complementare ? un legante specifico per il ricettore e detta altra sostanza ? un ricettore, anticorpo anti-legante oppure una lecti na specificamente reattiva con il legante.

46. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova ? un anticorpo su cellule naturali oppure accoppiate a particelle artificia li, detta sostanza complementare ? un antigene o legante specifico per 1*anticorpo in prova e detta altra sostanza ? un anticorpo contro 1*antigene o legante .

47. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta classe ? definita da un campo limitato di un parametro che rappresenta una misura della grandezza di aggregato.

48. Metodo secondo la rivendicazione 40, in cui detta sostanza in prova viene fatta reagire con anticorpo che ? accoppiato a dette particelle ed ? presente in eccesso di anticorpo e, dopo il compie tamento di tale reazione, il prodotto di reazione viene portato in contatto con anticorpo disciolto con tro la sostanza in prova per produrre aggregazione di particelle .

49. Metodo per saggiare mediante inibizione di agglutinazione di particelle una soluzione in prova per la quantit? in essa di una sostanza in prova che sia specificamente reattiva con una sostanza compie mentare disciolta comprendente le operazioni di: portare in contatto una porzione di detta soluzione in prova ed una quantit? limitata di detta sostanza complementare per legare insieme molecole di detta sostanza, portare in contatto il prodotto di reazio ne risultante con sostanza in prova che ? stata copulata con particelle insolubili per provocare agglutinazione di dette particelle a causa di reazione della sostanza in prova cos? copulata con la sostanza complementare che non ha reagito, misurare gli aggregati dovuti a tale agglutinazione per determinare il numero di aggregati di una scelta classe limitata e confrontare il numero cos? determinato di aggregati con numeri di aggregato standard, ottenuti in maniera corrispondente mediante reazioni simili di quantit? standard note di dette sostanze, per determinare la quantit? di sostanze in prova in detta soluzione in prova.

50. Metodo secondo la rivendicazione 49, in cui detta sostanza in prova ? un farmaco, legante oppure ormone e detta sostanza complementare ? un anticorpo o ricettore specifico per la sostanza in prova.

51 . Metodo per saggiare mediante esal tazione di agglutinazione di particelle una sostanza in prova che sia specificamente reattiva con una sostanza complementare comprendente le operazioni di:

far reagire una quantit? definita di una sospensione di detta sostanza complementare legata a particelle insolubili con un campione della sostanza in prova e con una quantit? definita di sostanze in prova addizionale sufficiente a produrre una agglutinazione leggera ma misurabile se fatta reagire direttamente con detta quantit? di detta sospensione, misurare il grado di agglutinazione dovuto a tale reazione e confrontare il risultato con risultati standard di misure corrispondenti del grado di agglutinazione dovuto a corrispondente reazione di quantit? standard di dette sostanze per determinare la quantit? iniziale di detta sostanza in prova.

52. Metodo secondo la rivendicazione 51, in in cui detta misura di agglutinazione comprende la operazione di misurare gli aggregati risultanti per determinare il numero di aggregati di una scelta classe limitata per cui il numero di aggregati di tale classe riflette in maniera specialmente sensibile la quantit? di detta sostanza in prova.

53. Metodo per saggiare mediante agglutinazione indiretta una sostanza in prova disciolta che sia specificamente reattiva con almeno due anticorpi dif^ ferenti comprendente le operazioni di:

far reagire la sostanza in prova con un primo anticorpo legato a particelle insolubili, far reagire il prodotto di reazione risultante con un secondo anticorpo disciolto e quantizzare l'agglutinazione risultante come misura della concentrazione iniziale di detta sostanza in prova.

54. Metodo secondo la rivendicazione 53, com prendente, prima di detta quantizzazione di aggluti_ nazione, l'operazione di far s? che il prodotto di reazione della seconda di dette reazioni reagisca con anticorpo con specificit? contro il secondo anticorpo .

55. Metodo secondo la rivendicazione 53, in cui detta quantizzazione comprende l'operazione di misurare gli aggregati risultanti per =

/?

I

determinare il numero di aggregati di una scel ta classe per cui il numero di aggregati di tale classe riflette in maniera specialmente sensibile la concentrazione di detta sostanza in prova,