IT9022032A1 - L-2'-desossiuridine e composizioni farmaceutiche che le contengono. - Google Patents

Description

(1972)] partendo da L-arabinosio e cianammide secondo lo schema A qui di seguito riportato in cui R ed R' sono come sopra definiti, escluso H.

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

L-2'-desossiuridine e composizioni farmaceutiche che le contengono

Stato dell 'arte

L-2'-Desossinucleosidi di formula (I) in cui R = H, CH3, CH2OH ed R' = OH sono note e la loro sintesi è stata effettuata, come descritto in letteratura [Coll. Czech. Chem. Comm. 37» p.4072

è noto inoltre che derivati della 2'-desossiuridina appartenenti alla serie naturale D vengono fosforilati da timidinochinasi virali [Y.C.Cheng "Antioetabolites in Biochemistry, Biology and Medicine", Pergamon Press (1979)]· In Nucleic Acids Res. 1976. 3 (8). 2143-54 (Eng) è riportato che L-uridina, L-citidina ed L-timidina se somministrate a topi erano largamente eliminate nelle urine in forma non modificata, lasciando solo tracce di metaboliti fosforilati in alcuni tessuti.

Alla luce della letteratura citata non era quindi noto, nè poteva essere previsto, che anche 2'-desosssiuridine della serie L, non naturali, potessero avere un comportamento analogo a quello della serie D, naturali, e soprattutto potessero trovare applicazione a scopo farmaceutico.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

E' stato ora sorprendentemenete trovato, e forma oggetto della i i h i di f l l (I) i

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cioè fosforilati dall'enzima virale) mentre sono completamente inerti all'azione della timidina-chinasi di mammifero.

La fosforilazione di questi composti da parte dell'enzima virale riveste notevole importanza in quanto rende possibile

Come detto precedentememnte, alcuni di questi composti sono nuovi ed altri sono descritti in letteratura senza però che venga fatto riferimento alle loro proprietà antivirali ed al loro conseguente impiego farmaceutico.

A scopo illustrativo,ma non limitativo è ora riportata la preparazione di un prodotto secondo la presente invenzione.

ESEMPIO 1

Sintesi della l-(2-desossi-{S-L-eritro-pentafuranosil)-5-metil-2,4(IH,3H)-pirimidindione (R = CH3, R’ = OH)

Una miscela di 4,6 gr di L-2'-desossiuridina (composto di formula (I) in cui R = H, R' = OH), 20 mi di KOH 1 M e 20 mi di formaldeide acquosa al 37% viene mantenuta a 60* C per 5 giorni aggiungendo ogni 24 ore 5 ml di KOH 1 M e 5 “1 di formaldeide acquosa al 37%· La miscela di reazione viene quindi diluita con un uguale volume di acqua, si porta il pH a 3 aggiungendo la resina a scambio ionico Dowex 50 (H+), si filtra, si lava la resina con 200 mi di acqua, si riuniscono il filtrato e le acque di lavaggio e si svapora a pressione ridotta. Il residuo viene poi coevaporato 3 volte con etanolo assoluto, disciolto in 50 mi dello stesso solvente, reso alcalino per addizione di trietilammina, svaporato a pressione ridotta e anidrificato per coevaporazione con 50 mi di toluene (2 volte). Dopo essere stato tenuto per una notte a pressione ridotta su anidride fosforica il residuo viene addizionato di 200 mi di etanolo assoluto e la soluzione risultante è portata a pH 2.5 con acido cloridrico concentrato e scaldata a riflusso per 2 ore.

La miscela di reazione è raffreddata e viene alcalinizzata con trietilammina, svaporata ed il residuo è cromatografato su gel di silice eluendo con una miscela di cloruro di metilene (85 mi) e metanolo (15 mi). Il composto ottenuto viene quindi sciolto in 200 mi di etanolo assoluto, addizionato di 0,5 mi di acido cloridrico concentrato e di 1 gr di palladio al 10% su carbone e idrogenato a pressione ambiente per 3 ore. La miscela di reazione viene filtrata su Celite lavando poi la stessa con 100 mi di etanolo ed i filtrati riuniti, alcalinizzati con trietilammina e svaporati a pressione ridotta. Il residuo viene cristallizzato da 80 mi di etanolo assoluto.

Si ottengono cosi 2 gr di L-timidina [α]D20 °= - 18,5° (c= 1% in acqua).

Operando in modo analogo a quanto già descritto in letteratura per i composti derivati da D-2'desossiuridina ed utilizzando gli opportuni reagenti si possono ottenere anche gli altri composti di formula (I) precedentemente indicati.

Attività biologico

L'attività bilogica dei composti secondo la presente invenzione nel trattamento delle infezioni virali è stata valutata utilizzando TK di HSV 1 e TK cellulare.

Nella Figura 1 è mostrato l’effetto della L-timidina sulle attività enzimatiche della TK del virus Herpes simplex 1 e di quella umana.

Dalla Figura 1 si vede che la L- Timidina inibisce la fosforilazione della (D)-timidina da parte della TK Herpes simplex 1 (a), ma non da parte della TK umana (#).

Il saggio consiste nella misura della quantità di substrato (D)-timidina fosforilato a (D)-TMP (asse delle ordinate) in presenza di crescenti concentrazioni di L-Timidina (asse delle ascisse). L'enzima virale o cellulare purificato (0.07 unità) è stato incubato per 15 min a 37°C in 25 ul di una miscela contenente 30 mM Hepes-K, pH 7.5, 6 mM MGCl2, 6 mM ATP, 0.5 mM ditiotreitolo (DTT), 10 pM [3⁄4 ]Thy (25 Ci/mmole) e diverse concentrazioni di L-timidina. La reazione viene bloccata depositando 20 pi della miscela su filtri DE-81 che vengono immediatamente immersi in un eccesso di 1 mM formiato di ammonio, pH 5-6, allo scopo di eliminare la (D)-[JH]timidina che non è stata resa monofosfato e che quindi non può legarsi alle cariche positive del filtro DE-81. I filtri vengono poi lavati in acqua distillata per 5 min e quindi disidratati in alcool etilico per 5 min. Il D-TMP radioattivo legato al filtro è stato stimato in un contatore di radiazione beta.

Chiaramente si osserva.una specifica inibizione della TK virale : infatti a 5 pg/ml la TK virale è inibita del 90% quando quella umana è completamente resistente. La TK umana si è dimostrata completamente resistente alla L-timidina anche alla massima dose studiata (200 pg/ml).

La L-timidina compete con la D-timidina per il sito attivo dell'enzima virale come dimostrato dalle curve di inibizione di tipo competitivo riportate in Figura 2 che è una rappresentazione secondo Lineweaver-Burk dell'effetto della L-timidina sull'attività della TK del virus Herpes simplex in presenza di differenti concentrazioni di substrato D-[ H]Timidina (espresse sull’sasse delle ascisse come inverso del.la concentrazione). L'enzima virale (0.07 unità) è stato incubato per 15 min a 37*C in 25 pi di una miscela contenente 30 mM Hepes-K, pH 7-5, 6 mM MgCl2, 6 mM ATP, 0.5 mM ditiotreitolo (DTT), varie concentrazioni di D-[JH]timidina (25 Ci/mmole) e diverse concentrazioni di L-timidina (0 μΜ [a], 2 pM [♦ ], 5 pM [·], 10 μΜ [φ'], 15 pM [»]). La reazione viene bloccata depositando 20 pi della miscela su filtri DE-81 che vengono processati come indicato in figura 1. I valori di D-TMP sono riportati come inverso della concentrazione sull'asse delle ordinate). Da tale esperimento si ricava che la Km dell'enzima virale per la D-timidina è 2.8 pM e che la Ki per la L-timidina è 2 μΜ.

Per controllare se la L-timidina viene fosforilata dall’enzima virale, come avviene per la D-timidina, IDU, TFT, ACV ecc., o se si limita a inibire la sintesi del naturale substrato competendo per il sito attivo come avviene per altri composti da noi studiati quali la fenil-desossiguanosina (PhdG), abbiamo analizzato mediante HPLC i prodotti della reazione catalizzata dalla TK virale, tra [y- P]ATP e la L-timidina.

1 nucleosidi ed i nucleotidi studiati sono stati separati con il metodo reverse-phase usando il Bio-Rad 100 MAPS preparative System. E' stata usata una colonna reverse-phase C18 Bio Sii 0DS-5S (0.4 x 15 cm) nelle seguenti condizioni : volume iniettato 20 pi; UV : 260 nm; temperatura : ambiente; eluente : buffer A (20 mM KH2 PO4 pH 5.6), buffer B (20 mM KH2PO4. pH 5.6, 60# Metanolo).·Le condizioni specifiche per la separazione dell’ATP della L-timidina sono le seguenti : da 0 a 20 min un gradiente da O% a 70% buffer B; da 20 a 30 min un gradiente da 70* a 77% buffer B e da 30 a 32 min da 77% a 100% buffer B. Il flusso è di 0.5 ml/min. La reazione enzimatica (0.3 unità di enzima virale) è stata eseguita come descritto precedentemente eccetto che in luogo di 6 mM ATP è stato usato 100 μΜ[γ ^2P]ATP 1500 cpm/pmole e che l’incubazione a 37°C è stata fatta proseguire fino a 30 min. I risultati ottenuti sono riportati in figura 3 in cui sull’asse delle ascisse dei rispettivi pannelli A,B e C viene riportato il numero di frazioni eluite dalla colonna. In ciascuna frazione è stata determinata la quantità di radioattività che viene riportata come conte per minuto (cpm) sui rispettivi assi delle ordinate.

Nel pannello A sono riportati i dati relativi al controllo senza Thy nel saggio, nel pannello B si hanno i dati con 10 μΜ L-timidina nel saggio e nel pannello C i dati per 10 μΜ D-timidina nel saggio.

Come si vede dalla Figura 3 la TK virale fosforila la L-timidina: infatti in presenza di L-timidina si ottiene un picco di radioattività nella stessa posizione del D-TMP (pannello C). Nei 30 min di reazione la TK virale fosforila il 70% della L-timidina presente nel saggio, dato paragonabile a quello che si ottiene con la D-timidina naturale.

Composizioni farmaceutiche

Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione comprendono come componente attivo una quantità terapeuticamente efficace di una L-desossiuridina di formula generale (I) in cui R ed R' hanno il significato precedentemente indicato od un suo sale farmaceuticamente accettabile in associazione con uno o più eccipienti o veicolanti farmaceutici.

Le composizioni farmaceutiche secondo l'invenzione possono essere somministrate per via orale parenterale e topica sotto forma delle opportune formulazioni farmaceutiche, ad esempio soluzioni sterili per l'uso iniettabile, compresse capsule polveri, granulati, sciroppi, colliri, pomate, creme, supposte, ovuli, candelette ed altro.

Il principio attivo è contenuto nelle composizioni farmaceutiche secondo l’invenzione in quantità variabili fra 50 mg e 2 gr per dose a seconda del mezzo di somministrazione. Eccipienti utili nelle formulazioni secondo l'invenzione sono ad esempio agenti gelificanti, ausiliari per capsule di gelatina, antiossidanti, agenti disperdenti, emulsificanti , agenti anti-schiuma, correttori del sapore, conservanti, agenti solubilizzanti ecc.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI

   farmaceuticamente accettabili 2. Composto di formula generale (I) secondo la rivendicazione 1 in cui R = -CH=CBrH ed R'= OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili 3. Composto di formula generale (I) secondo la rivendicazione 1 in cui R = CH3 ed R' = N3 e suoi ' sali farmaceuticamente accettabili 4. Composto di formula generale (I) secondo la rivendicazione 1 in cui R = CH3 ed R' = F e suoi sali farmaceuticamente accettabili. 5. L-2'-desossi uridine di formula generale (I)

   e loro sali farmaceuticamente accettabili, come prodotti farmaceutici. 6. Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R= · H ed R' = OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili, cóme prodotto farmaceutico 7. Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R =CH2OH ed R' = OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 8. Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R =CH2OC2H5 ed R' = OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 9. Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R = CH3 ed R’ = OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 10.Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R =-CH=CBrH ed R' = OH e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 11.Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R = CH3 ed R'= e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 12.Composto secondo la rivendicazione 5 in cui R = CH3 ed R' = F e suoi sali farmaceuticamente accettabili, come prodotto farmaceutico 13.Composti secondo le rivendicazioni 5 - 12 come antivirali. 14.Uso dei composti secondo le rivendicazioni 5 _ 12 per la preparazione di composizioni farmaceutiche. 15.Uso dei composti secondo le rivendicazioni 5 _ 12 per la preparazione di composizioni farmaceutiche aventi proprietà antivirali. 16.Uso dei composti secondo le rivendicazioni 5 - 12 per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento dell’Herpes simplex 17.Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un composto secondo le rivendicazioni 5 - 12 od un suo sale farmaceuticamente accettabile ed un eccipiente o vettore farmaceuticamente accettabile 18.Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 17 in cui il principio attivo è presente in quantità fra 50 mg e 2 gr 19.Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 18 per uso parenterale, orale o topico 20.Composizioni secondo la rivendicazione 19 sotto forma di soluzioni sterili per iniezioni, compresse, capsule, granulati, polveri, sciroppi, colliri, pomate, creme, supposte, ovuli, candelette.