ITGE20120084A1 - Derivato tissutale di origine non embrionale arricchito di elementi staminali e multipotenti e metodo di preparazione di un medicamento con tale derivato - Google Patents

Derivato tissutale di origine non embrionale arricchito di elementi staminali e multipotenti e metodo di preparazione di un medicamento con tale derivato Download PDF

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ITGE20120084A1
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Description

DESCRIZIONE dell'Invenzione Industriale dal titolo: "derivato tessutale di origine non embrionale arricchito di elementi staminali e multipotenti e metodo di preparazione di un medicamento con tale derivato"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un derivato tissutale arricchito di elementi staminali e multipotenti, il metodo di preparazione di un medicamento con detto derivato ed l'uso di tale derivato, di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali.
E' noto che il tessuto adiposo contiene elementi multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali .
La possibilità di un utilizzo in medicina clinica di elementi multipotenti è ostacolata dalla bassa sopravvivenza di questi elementi in lipoaspirati crioconservati, dalla difficoltà di una espansione ex vivo, e dalla difficoltà di seguire la normativa corrente del Good Manufacturing Practice (cGMP) per cellule espanse.
E' nota in medicina l'importanza di avere un prodotto biologico ottenuto da una "manipolazione minima", non-enzimatica , del tessuto di origine, quale lipoaspirato che può essere prontamente utilizzato nella pratica clinica, senza che detto prodotto ricada nella normativa "Farmaco- Major manipulation" (regolamento EC n. 1394/2007 del PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 13 novembre 2007 sui medicinali per terapie avanzate).
Con la definizione di "manipolazione minima" delle cellule si intende che le cellule (staminali e non) non vengono espanse (coltivate e fatte proliferare in vitro in coltura) e non vengono sottoposte ad una serie di "lavorazioni" quali estrazione e dissociazioni enzimatiche, centrifugazioni e separazioni di popolazioni cellulari, arricchimento di alcune popolazioni cellulari a scapito di altre (ad esempio separazione con citofluorometria a flusso) ed altre lavorazioni simili.
Il fatto che il tessuto o le cellule siano sottoposte a manipolazione minima consente che il procedimento ed il prodotto ottenuto tramite detto procedimento non ricada nella normativa "Farmaco-Major manipulation" e che il prodotto non sia considerato come ATMPs (Adanced Therapy Medicinal Products) e di conseguenza sottoposto alla nomativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice): infatti la possibilità che cellule staminali non embrionali possano essere utilizzate in ambito clinico, se sottoposte ad una manipolazione estensiva, compresa l'espansione ex vivo, è ritardata nel tempo in modo considerevole a causa della necessità di trattare il prodotto secondo la normativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice) .
E' noto che il trapianto in vivo di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) isolate da membrane fetali di placenta a termine (FMhMSC) nel cuore di ratti sottoposti a infarto del miocardio non ha mostrato rigetto immunitario e non ha avuto bisogno di procedure di immunosoppressione.
E' stato dimostrato che il trapianto di FMhMSC in maiali sottoposti a infarto è stato ben tollerato senza nessun effetto immunologico indesiderato e senza il bisogno di immunosoppressori.
Queste scoperte, e altre osservazioni hanno dimostrato che:
le FMhMSC non inducono proliferazione di linfociti allogenici o xenogenici, sopprimendo in modo attivo la capacità di risposta dei linfociti, il trapianto di FMhMSC in maiali e ratti neonatali ha dato come risultato il microchimerismo umano in vari organi e tessuti, indicando che, le hMSC, oltre a possedere un potenziale rigenerativo/riparativo , presentano anche proprietà tollerogeniche essenziali che possono preparare il terreno per lo sviluppo di una terapia cellulare allogenica su grande scala.
E' evidente quindi l'importanza biomedica e clinica che può avere un prodotto cellulare arricchito di cellule mesenchimali e periciti che sia stato sottoposto a cosiddetta "manipolazione minima".
Il brevetto internazionale WO 2011/145075 descrive un metodo ed un dispositivo per trattare tessuto adiposo lipoaspirato , senza l'utilizzo di enzimi, ed ottenere un derivato di tessuto adiposo, non espanso, che contiene cellule staminali non embrionali (hASCs) che, come è noto, mostrano un'espressione fenotipica e genetica simile alle cellule umane staminali mesenchimali estratte dal midollo osseo e da altre fonti alternative, la cui multipotenzialità , che comprende la possibilità di riparare tessuto miocardio infartuato, la possibilità di differenziarsi in adipociti, osteociti, condrociti, elementi neuronali, epatociti, miociti pancreatici e scheletrici, le rende adatte all'utilizzo in medicina rigenerativa.
Il dispositivo descritto nella domanda internazionale W02011/145075 permette di agire sul lipoaspirato attraverso lievi forze meccaniche, in un sistema completamente chiuso, fornendo un derivato tissutale, in particolare un derivato di tessuto adiposo, non espanso, altamente arricchito di cellule staminali mesenchimali e periciti che può essere immediatamente utilizzato.
Oggetto della presente invenzione è quindi un metodo per la preparazione di un medicamento da utilizzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive che prevede la preparazione di un derivato tissutale, in particolare un derivato del tessuto adiposo, o la preparazione di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato.
Il metodo prevede:
riduzione del detto tessuto adiposo in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati, in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculostromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro,
lavaggio con soluzioni sterili del tessuto adiposo ridotto ed emulsione delle componenti fluide del tessuto adiposo sottoposto a riduzione delle dimensioni dei macroagglomerati cellulari,
essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite un dispositivo provvisto al suo interno di mezzi di riduzione quale una rete od una serie di lamine o fili taglienti e mezzi di generazione di una emulsione quali sfere o simili, ed essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo .
Il tessuto adiposo può essere ottenuto tramite aspirazione di tessuto da donatore vivo o donatore cadavere, ed è costituito da una componente fluida, comprendente almeno una componente oleosa ed una componente ematica, e da una componente solida comprendente strutture vasculo-stromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali e multipotenti.
L'aspirazione del tessuto adiposo può essere preceduta da un passo di infiltrazione nel tessuto del donatore di una soluzione contenente una sostanza o composto vasocostrittore quale adrenalina o simili.
Il derivato tissutale ottenuto con il metodo oggetto della presente invenzione può essere utilizzato direttamente in medicina clinica a scopi ricostruttivi e rigenerativi per veicolare nel paziente cellule multipotenti in grado di differenziarsi e costituire una fonte di cellule per la riparazione di tessuti ossei, cartilaginei, vascolari, cardiaci, neuronali ed endocrini, grazie al fatto che:
- è un prodotto che può non essere sottoposto ad espansione cellulare,
- è minimamente manipolato,
può essere crioconservato senza perdere la vitalità della sua intrinseca popolazione di cellule staminali non embrionali.
Il metodo di preparazione di detto derivato tissutale secondo la presente invenzione, può prevedere che prima dell'utilizzo su paziente possa essere sottoposto a crioconservazione e/o ad eventuale espansione in vitro, ossia coltivazione e proliferazione numerica in vitro in coltura.
In particolare il metodo può prevedere un passo di espansione numerica cellulare degli elementi staminali e multipotenti compresi nel derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo aspirato e trattato con detto dispositivo, ossia del derivato fresco, o scongelato, dopo il passo di crioconservazione, essendo detto passo di espansione numerica delle cellule staminali e multipotenti eseguito su terreno di coltura.
Le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato possono essere differenziate in vitro in una o più linee cellulari quali adipociti, condrociti od osteociti.
Inoltre il metodo oggetto dell'invenzione può prevedere l'applicazione di detto derivato tissutale o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate a partire da dette cellule staminali, su supporti solidi o semisolidi biocompatibili, quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato, la quale applicazione avviene in vitro su substrati successivamente impiantati su paziente o su substrati già innestati in vivo su paziente.
La presente invenzione sfrutta quindi le proprietà tollerogeniche del prodotto ottenuto tramite il dispositivo descritto nella domanda internazionale W02011/145075, che lo rendono adatto a trapianto autologo, allogenico o xenogenico, senza che si abbiano effetti immunologici indesiderati o infiammazione e senza il bisogno di agenti immunosoppressori .
Il derivato tessutale oggetto della presente invenzione può essere utilizzato come vettore cellulare per il trasferimento nel tessuto di paziente in vivo di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali.
In particolare dette cellule staminali mesenchimali non embrionali esprimono in situ sul paziente un set di geni coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari, quali geni per il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), per il fattore di crescita epatocitaria (HGF), ed il gene KDR che codifica per un recettore essenziale del VEGF.
Il derivato tissutale ottenuto dal trattamento del lipoaspirato con il dispositivo descritto nel brevetto WO 2011/145075 presenta numerosi vantaggi rispetto al lipoaspirato semplice, non trattato con il dispositivo oggetto dell'invenzione, il quale lipoaspirato semplice:
presenta bassa sopravvivenza cellulare dopo la crioconservazione ed il congelamento,
- è difficilmente espandibile in vivo,
- ha una bassa efficienza di rilascio (meno del 5% delle cellule trapiantate si conservano dopo il trapianto) ,
- non è chiaro il destino di queste cellule in vivo.
Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo e comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali perici ti e/o cellule staminali mesenchimali , o le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, o le cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, possono essere usate in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, essendo detto derivato, dette cellule staminali non embrionali o dette cellule differenziate ottenute con il metodo sopra descritto.
Oggetto dell'invenzione è anche l'uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, di un medicamento per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici, essendo detto medicamento ottenuto con il metodo sopra descritto.
Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi illustrati nei disegni allegati in cui:
la fig.l illustra schematicamente il dispositivo ed i passi di trattamento del lipoaspiato tramite detto dispositivo;
la fig. 2a illustra il confronto istologico tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo di figura 1 ed il derivato tissutale fresco ottenuto con il dispositivo di figura 1; la fig. 2b illustra i risultati dell'analisi immunoistochimica tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo di figura 1 ed il derivato tessutale fresco ottenuto con il dispositivo di figura 1;
la fig. 3 riporta i risultati delle analisi di citometria a flusso di marcatori di cellule staminali in una frazione cellulare non espansa di un lipoaspirato e nel derivato tessutale ottenuto con il dispositivo di figura 1, dopo digestione enzimatica per ottenere la frazione vasculo-stromale (media±SE; n=4 differenti donatori);
la fig.4 illustra le differenze nell'espressione dei markers nel lipoaspirato non trattato e nel derivato tissutale ottenuto con il dispositivo di figura 1, 180x116 mm (300x300DPI);
la fig.5 illustra l'espansione delle cellule staminali adipose umane, 160x132mm (300X300 DPI);
la fig.6 illustra l'espansione cellulare a partire da derivato tissutale crioconservato e messo in coltura per 10 giorni, 180X145mm (300X300DPI);
la fig.7 illustra l'analisi di citometria a flusso di cellule espanse a partire dal derivato tissutale ottenuto da cadavere o da donatore vivo con il dispositivo di figura 1; i dati sono espressi come medie della percentuale di cellule vive totali positive per i marcatori indicati.
Il dispositivo 1 descritto nel brevetto WO 2011/145075 consente di prelevare tessuto da paziente vivo o da cadavere, umano o animale, preferibilmente tessuto adiposo, di processarlo senza l'utilizzo di enzimi e di reiniettarlo nel paziente.
Nel presente testo con derivato tessutale si intende un aggregato o cluster cellulare, comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , ottenuto da tessuto adiposo trattato con il metodo ed il dispositivo 1 descritto di seguito e nel documento WO 2011/145075.
Il dispositivo 1 può essere utilizzato da qualsiasi medico, rendendo le procedure chirurgiche semplici ed efficienti.
Il dispositivo 1, grazie alla presenza di almeno una rete di riduzione 101 delle dimensioni del lipoaspirato e di elementi agitatori 103 che consentono di ottenere una emulsione delle componenti liquide del lipoaspirato, riduce progressivamente le dimensioni dei clusters o agglomerati cellulari del tessuto adiposo lipoaspirato, da clusters di forma sferoidale con un diametro da 1 a 3,5 mm a clusters di 0,2-0,8 mm, eliminando contemporaneamente i residui liquidi costituiti principalmente da olio e sangue.
Il metodo di trattamento del lipoaspirato prevede il lavaggio e la riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari in completa immersione in un liquido, quale una soluzione fisiologica sterile di lavaggio, per minimizzare l'azione traumatica del dispositivo 1 sulle cellule.
I passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite il dispositivo 1 sono eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo 1.
Il dispositivo 1 consente di ottenere agglomerati cellulari di dimensioni ridotte che migliorano integrazione cellulare post-trapianto.
La riduzione delle dimensioni, nell'arte nota, è ottenuta riducendo il calibro delle cannule da aspirazione o i loro fori, ma questo allunga i tempi di azione sul paziente e peggiora qualitativamente il lipoaspirato rendendolo ricco di oli e di frammenti cellulari, dovuti alla rottura degli adipociti nel corso del passo di aspirazione.
Usando un dispositivo 1 delle dimensioni di 225 mi è possibile in meno di 20 minuti trattare circa 100-130 mi di lipoaspirato ed ottenere circa 60-100 mi di derivato tissutale arricchito di elementi staminali e multipotenti.
La procedura di ottenimento del lipoaspirato prevede due passi: infiltrazione ed aspirazione, e la stessa tecnica può essere utilizzata su donatori vivi o su cadavere.
Nel passo di infiltrazione una soluzione salina con adrenalina (2 pg/ml concentrazione finale) è infiltrata usando cannule, preferibilmente usa e getta, con punta smussata.
La vasocostrizione in combinazione con la punta smussata della cannula evita ogni accidentale iniezione intravascolare e facilita la successiva lipoaspirazione .
E' possibile aggiungere alla miscela una sostanza anestetica quale lidocaina.
Il kit di infiltrazione comprendente una siringa ed una valvola può essere collegato direttamente ad una sacca di infusione per facilitare il passo di infiltrazione e creare un sistema completamente chiuso, ideale per il trattamento di pazienti anche in ambito ambulatoriale.
Il passo di aspirazione viene ottenuto con una cannula a punta smussata collegata ad una siringa con attacco luer-lock.
Preferibilmente la cannula presenta 5 fori ovali delle dimensioni di 1X2 mm.
Il vuoto durante l'aspirazione può essere ottenuto manualmente o bloccando lo stantuffo della siringa in un dispositivo a morsetto.
Un dispositivo 1 da 225 mi consente di trattare da 40 a 130 mi di lipoaspirato, preferibilmente 100 mi.
Per evitare la rottura delle cellule, non deve essere presente aria all'interno del dispositivo 1 durante tutti i passi di trattamento del lipoaspirato .
Il dispositivo 1 è quindi riempito, prima dell'introduzione al suo interno del lipoaspirato, di una soluzione sterile, preferibilmente una soluzione salina.
La prima riduzione degli agglomerati cellulari è ottenuta spingendo il lipoaspirato contento nella siringa di aspirazione nel dispositivo 1 attraverso la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni, mentre una corrispondente quantità di soluzione salina esce dal dispositivo 1 e viene accumulata in una sacca di raccolta (figura 1A).
Quando la quantità desiderata di lipoaspirato è stata inserita nel dispositivo 1, mantenuto verticale, con la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni in alto, lo strato galleggiante di tessuto adiposo, preferibilmente, non deve occupare più della metà superiore del dispositivo 1.
Gli elementi agitatori 103 presenti nel dispositivo 1, ad esempio sfere in metallo o simili, consentono, durante l'agitazione del dispositivo 1 (figura 1B), di formare una emulsione, tra l'olio, sangue e soluzione di lavaggio che è rimossa, dall'interno del dispositivo 1, grazie ad un flusso contro gravità di soluzione salina, mentre gli agglomerati cellulari con dimensioni ridotte si muovono verso la parte superiore del dispositivo 1 considerato in posizione verticale (figura 1B).
Quando la parte liquida all'interno del dispositivo 1 appare chiara ed il lipoaspirato giallo, il flusso di soluzione salina viene interrotto, ed il dispositivo 1 viene ruotato di 180° (figura 1C).
La seconda riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari è ottenuta facendo passare gli agglomerati cellulari attraverso una seconda rete 102 di riduzione delle dimensioni spingendo all'interno del dispositivo 1 ulteriore liquido attraverso l'apertura inferiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura le) , utilizzando ad esempio una siringa.
Il derivato tissutale ottenuto attraverso il trattamento del lipoaspirato con il dispositivo 1 sopra descritto è raccolto in siringhe collegate all'apertura superiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura 1C) ed è pronto ad essere utilizzato o conservato.
Il prodotto ottenuto tramite il dispositivo sopra descritto costituisce quindi un derivato tissutale non espanso comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali in particolare costituisce una "nicchia vascolare stromale naturale" costituita da una rete di adipociti a guisa di impalcatura legati a vasi altamente conservati, contenente una notevole quantità di cellule staminali mesenchimali e periciti .
La figura 2a illustra il confronto istologico tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo sopra descritto ed il derivato tissutale fresco: il derivato tissutale mostra un miglior mantenimento della nicchia vasculo-stromale costituita da capillari disposti tra adipociti e peduncoli stromali contenenti canali vascolari con evidente lumina. Al contrario il tessuto adiposo non trattato mostra microcanali compressi e distorti.
Come illustrato in figura 2b, per valutare le differenze quantitative nella frazione vasculostromale è stata eseguita una analisi immunoistochimica contro cellule endoteliali (CD34 e CD146), cellule murali (CD146 e ASMA), adipociti e preadipociti (proteina S-100): l'espressione quantitativa di CD34 non mostra differenze significative; l'espressione di CD146 è significativamente incrementata nel derivato tissutale .
Poiché CD146 è co-espresso da cellule endoteliali e periciti mentre CD34 è un marker della differenziazione di cellule endoteliali, questi risultati indicano che i periciti (cellule mesenchimali che si suppone abbiano le proprietà delle cellule staminali) contribuiscono in modo significativo all'incremento dell'espressione di CD146 rilevata nel derivato tessutale.
In accordo con questa osservazione, il trattamento tramite il dispositivo decritto in WO 2011/145075 incrementa l'espressione di ASMA, un marker delle cellule murali.
Il numero di cellule che esprimono la proteina S-100 è simile nel lipoaspirato e nel derivato tissutale .
Come descritto nella domanda di brevetto italiana GE2010A000057 ed internazionale WO 2011/145075, il dispositivo 1 permette di agire sul lipoaspirato tramite lievi forze meccaniche in un sistema completamente chiuso, evitando l'impiego di enzimi e qualsiasi altra sostanza, ed eliminando i problemi legati alla digestione enzimatica e la relativa manipolazione, ovvero centrifugazione separativa e raccolta sub-frazionata.
Queste caratteristiche ossia un prodotto cellulare non espanso e minimamente manipolato consentono l'utilizzo diretto in terapia clinica, in particolare in medicina rigenerativa per applicazioni e trapianti con cellule autologhe e allogeniche.
Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo o le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, o le cellule differenziate a partire da dette cellule staminali non embrionali, secondo il metodo di preparazione della presente invenzione, possono essere usate in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici. Il derivato tissutale può essere ottenuto sia da donatori vivi che da donatori cadavere, infatti cellule vitali possono essere ottenute anche da cadaveri (≤30 ore post-mortem) .
Le analisi di citometria a flusso mostrano che, dopo coltura, il numero di cellule che esprimono i marcatori per le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) sono presenti in circa l'80% della popolazione cellulare ed i dati ottenuti da tessuto di cadavere sono simili ai dati ottenuti da cellule isolate da un donatore vivente, come illustrato in figura 7.
Secondo una prima forma esecutiva della presente invenzione il derivato tissutale sopra descritto è direttamente utilizzato sul paziente, senza ulteriori trattamenti, a scopo ricostruttivo e rigenerativo in vari contesti clinici tra cui malattie cardiovascolari , neurodegenerative, endocrine/metaboliche .
Gli elementi staminali e multipotenti , quali perici ti e/o cellule staminali mesenchimali , contenuti all'interno del derivato tissutale potranno quindi essere trapiantati con le tecniche cliniche tradizionali e differenziarsi in specifiche cellule mantenendo e ripararando gli organi ed i tessuti in cui sono state trapiantate.
Questa forma esecutiva prevede l'utilizzo del derivato cellulare non espanso ossia un aggregato di cellule del tessuto estratto da paziente, vivo o cadavere, che non viene messo in coltura e pertanto gli elementi cellulari (staminali e non) in esso contenuti non vengono sottoposti a proliferazione (definita anche espansione) in vitro.
Ad esempio il derivato tessutale può essere utilizzato in interventi di trapianto con iniezione diretta nell'area da trattare ossia può essere utilizzato ad esempio per iniezioni nel tessuto sottocutaneo, nel tessuto muscolare e nell'osso, il quale avendo natura porosa si comporta come substrato di sostegno e sviluppo del materiale cellulare iniettato: l'espansione cellulare avverrà quindi in vivo sul paziente.
In combinazione od alternativa il derivato tissutale, le cellule staminali ottenute da detto derivato o le cellule differenziate a partire da dette cellule staminali non embrionali, possono essere utilizzate per la preparazione di innesti ossia per applicazioni su supporti solidi o semisolidi biocompatibili (cosiddetti scaffolds) quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato i quali substrati possono essere successivamente utilizzati per trapianti a scopo rigenerativo di tessuti e/o organi, quale rigenerazione di derma, cartilagine, osso o strutture simili.
Secondo una ulteriore forma esecutiva il derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1 oggetto del brevetto WO 2011/145075 può essere crioconservato .
Preferibilmente il passo di crioconservazione viene eseguito sul derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1.
Ovviamente è possibile prevedere che il passo di crioconservazione venga eseguito subito dopo il passo di lipoaspirazione o asportazione di materiale adiposo da donatore, paziente o cadavere, essendo possibile prevedere detto primo passo di crioconservazione in alternativa od in combinazione ad un secondo passo di crioconservazione eseguito dopo il passo di trattamento del tessuto adiposo nel dispositivo 1 sopra descritto.
Il metodo oggetto della presente invenzione prevede quindi almeno un passo di posizionamento e mantenimento della componente cellulare, preferibilmente come derivato tissutale ottenuto tramite il dispositivo 1, da sola od in combinazione con un supporto di innesto, in un dispositivo che ne consente la crioconservazione.
La temperatura di conservazione può ad esempio essere compresa tra -80°C e -180°C.
L'analisi morfologica del derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo sopra descritto, fresco, o del derivato tissutale scongelato dopo la crioconservazione (-180 °C in presenza di DMSO) ha dimostrato un ambiente di adipociti notevolmente conservati circondato da una architettura vascolare/stromale chiaramente evidente ed intatta.
L'analisi dell 'immunofluorescenza ha mostrato che tale rete vascolare/stromale conteneva elementi con identità pericita/perivascolare e cellule staminali mesenchimali umane (hMSC).
Al contrario, l'analisi immunoistochimica del lipoaspirato raccolto dai medesimi pazienti e non sottoposto al trattamento con il dispositivo 1 come sopra descritto ha dimostrato uno squilibrio largamente distribuito della citoarchitettura con la scomparsa della rete stromale vascolare nella maggior parte dei campi esaminati.
E' stata altresì eseguita un'analisi di citometria a flusso della composizione cellulare del derivato tissuale.
Il derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo descritto nel brevetto WO 2011/145075 fresco, il derivato precedentemente immagazzinato a 4°C per 24 h, o il derivato scongelato dopo 7 giorni di crioconservazione a
180°C sotto azoto liquido, sono stati trattati attraverso la digestione delle collagenasi per il rilascio della frazione vasculo-stromale e per la rimozione degli adipociti.
In tutti i campioni, si è osservata una vitalità cellulare prossima al 100%, come dedotto tramite il test di esclusione del colorante blu tripano, senza nessuna variazione tra ciascun gruppo.
La figura 3 riporta i risultati delle analisi di citometria a flusso di marcatori di cellule staminali in una frazione cellulare non espansa di un lipoaspirato e nel derivato tissutale.
Per l'analisi di citometria a flusso le cellule sono state incubate con 1 pg/10<6>cellule di anticorpi fluorescenti per 40 min a 4 °C al buio.
Sono stati utilizzati gli anticorpi anti-CD105, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD29 anti-CD166, anti-CD14, anti-CD34, anti-CD44, e anti-CD45.
Dopo il lavaggio, le cellule sono state analizzate su un citofluorimetro (FACSAria, BD Biosciences) raccogliendo 10.000 eventi, e i dati sono stati analizzati utilizzando il software FACSDiva (BD Biosciences).
Il derivato tessutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo sopra descritto ed oggetto del brevetto WO 2011/145075 è differente in misura significativa dal lipoaspirato, non trattato con il dispositivo 1, esibendo una proporzione significativamente più alta di elementi simili a periciti identificati sulla base della marcatura doppia positiva CD34/CD146 (circa 20% nel derivato tissutale ottenuto con il dispositivo sopra descritto, meno dell' 8% nel lipoaspirato non trattato con il dispositivo sopra descritto; risultati ripetutamente osservati da sei campioni individuali) .
La positività per PDGFR-β è inferiore nel derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto in confronto al lipoaspirato, un risultato che è conforme ad un declino di tale marcatore precoce nei periciti maturi.
La percentuale di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) è anch'essa maggiore nel derivato tissutale, quando confrontata con il semplice lipoaspirato .
In particolare, la quantità di elementi CD90<+>/CD29<+>/CD34<”>, che identificano in modo evidente una popolazione mesenchimale, è tre volte maggiore nel derivato tissutale rispetto al lipoaspirato (circa 30% nel derivato tissutale, circa 10% nel lipoaspirato; risultati ripetutamente osservati da sei campioni individuali).
La figura 4 illustra le differenze nell'espressione dei markers nel lipoaspirato non trattato e nel derivato tissutale.
La percentuale di elementi simili a ematopoietici è significativamente ridotta nel derivato tessutale in confronto al lipoaspirato (l'espressione di CD14, CD34, e CD45 è due-tre volte minore nel derivato tessutale confrontato al lipoaspirato; risultati osservati ripetutamente da sei campioni individuali).
Tutti questi tratti distintivi sono stati mantenuti anche nel derivato tessutale scongelato dopo la crioconservazione.
Al contrario, la ripresa di elementi vitali dal lipoaspirato crioconservato è stata osservata solo saltuariamente .
Secondo la presente invenzione il derivato tessutale ottenuto con il dispositivo 1 ed il metodo sopra descritto può essere trasferito, senza manipolazioni, in un terreno di coltura per ottenere facilmente l'espansione numerica delle cellule staminali (hMSC) contenute nel derivato del tessuto adiposo .
Il derivato tessutale può essere semplicemente trasferito senza qualsivoglia manipolazione nel terreno di coltura tessutale (α-MEM, contenente 20% FCS e antibiotici).
Come illustrato in figura 5 le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) vengono precocemente rilasciate dal derivato, a partire dal secondo-terzo giorno, attaccandosi alla plastica per colture tissutali, e raggiungendo una confluenza del 70-80% in 7-10 giorni.
Di conseguenza anche nell'ambito di un prodotto cellulare che deve seguire la normativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice), il derivato tissutale può essere immediatamente trasferito ad un ambiente di coltura tissutale per l'espansione, mentre nello stesso ambito, un tradizionale trattamento enzimatico del lipoaspirato , e il relativo lavaggio di olio e sangue da detto lipoaspirato richiedono periodi considerevolmente più lunghi (solitamente 40-50 min per campione), prima di poter porre le cellule rilasciate nel terreno di coltura .
Una ulteriore complicazione nell'utilizzo di un semplice lipoaspirato nasce anche dalle procedure GMP richieste per la separazione e scarto dei rifiuti.
Le cellule staminali da tessuto adiposo umano ottenute dal derivato tissutale possono essere anche facilmente espanse dal detto derivato crioconservato.
E' stato infatti dimostrato che i clusters cellulari ottenuti con il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto possono essere criopreservati come fonte di tessuto che può essere successivamente usato per isolare ed espandere numericamente le cellule staminali umane da tessuto adiposo.
Il derivato tissutale è stato lavato e sospeso in un mezzo per la crioconservazione (medium contenente 10% di DMSO,dimetilsolfossido) e congelato a -80°C.
Successivamente è stato trasferito e mantenuto congelato in azoto liquido.
Dopo 10 giorni le cellule sono state scongelate e messe in coltura per ottenere la crescita e l'espansione di ogni cellula vitale.
La figura 6 illustra che dopo 10 giorni in coltura le cellule erano in grado di crescere ed espandersi numericamente a partire dal derivato tessutale crioconservato.
E' stato dimostrato che le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) messe in coltura per ottenere specifiche linee cellulari (quali adipociti, osteociti, condrociti) mostrano il potenziale di sviluppo tipico delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs).
Al fine di indurre la differenziazione adipogenica, 10 x IO<3>cellule/cm<2>sono state messe a coltura in α-MEM addizionato con 10% FBS (siero fetale di bovino), 0,5 mM isobutil-metil xantina (IBMX), 200 μΜ indometacina, 1 mM desametasone e 10 pg/ml insulina (tutti Sigma) in camere di coltura (NUNC, Naperville, IL, USA).
Le cellule sono state sottoposte a coltura, sostituendo il terreno ogni 2-3 giorni.
Dopo 2-3 settimane di coltura le cellule contenevano lipidi neutri in vacuoli adiposi; esse sono stai fissate in formalina al 10% e colorate con soluzione oil red-0 fresco (Sigma).
Al fine di indurre la differenziazione osteogenica, 10 x IO<3>cellule/cm<2>sono state piastrate in camera di coltura (NUNC) in a-MEM addizionato con 10% FBS, 10 mM β-glicerofosfato, 0,2 mM acido ascorbico, e 10 nM desametasone, e messe a coltura per 3-4 settimane, sostituendo il terreno ogni 2-3 giorni.
Per dimostrare la differenziazione osteogenica, le colture sono state fissate e colorate con von Kossa.
Al fine di indurre la differenziazione condrogenica, aliquote di 5 x IO<5>cellule sono state fatte precipitare in tubi conici di polipropilene in 0,5 mi di α-MEM contenente 6,25 pg/ml di insulina, 6,25 pg/ml transferrina, 6,25 pg/ml acido selenioso, 5,33 pg/ml acido linolenico, 1,25 mg/ml BSA, 0,35 mM prolina, 1 mM piruvato di sodio, 0,1 mM desametasone, 0.1 mM L-acido ascorbico-2-fosfato, addizionato con 10 ng/ml Fattore di Crescita Trasformante-p3 (TGF-p3 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).
Questo terreno è stato sostituito ogni 3-4 giorni per 3-4 settimane.
I precipitati sono stati fissati con formalina, racchiusi in paraffina, esaminati morfologicamente e sottoposti a immunocolorazione per il collagene Tipo II, utilizzando il kit Vectastain elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) (Chemicon Int, Tamecula, CA, USA).
La messa a coltura delle cellule alle condizioni specifiche di cui sopra ha dimostrato che le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) del derivato tissutale, ottenuto con il dispositivo 1 sopra descritto, possono essere assegnate alla differenziazione osteogenica, condrogenica e adipogenica, dimostrando quindi che possono essere differenziate nelle classiche linee cellulari di derivazione mesenchimale.
E' stato altresì dimostrato che le hMSCs contenute nel derivato tissutale presentano un notevole potenziale vasculogenico, esprimono spontaneamente un set di geni vasculogenici, incluso 11 fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), KDR, codificante per un recettore essenziale del VEGF, ed il fattore di crecita epatocitaria (HGF).
La trascrizione dei geni di VEGF, KDR e HGF è significativamente maggiore nelle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) contenute nel derivato tissutale rispetto alle cellule staminali mesenchimali umane ottenute da lipoaspirati digeriti enzimaticamente per ottenere cellule staminali (hASCs) .
Come sopra descritto il derivato tissutale ottenuto con il metodo ed il dispositivo 1 descritto nel documento WO 2011/145075 può essere utilizzato in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per eseguire trapianti con cellule autologhe, allogeniche o per trapianti xenogenici.
Il derivato tissutale umano non espanso può essere sottoposto in modo sicuro al trapianto xenogenico in ratti sottoposti a ischemia cronica dell'arto posteriore.
L'arteria femorale è stata legata in vivo nei ratti ed è stato tagliato un tratto dell'arteria compreso tra due legature adiacenti.
Il giorno seguente tale intervento, un derivato tissutale umano, raccolto 24 ore prima dai pazienti sottoposti a liposuzione, è stato iniettato tramite una siringa da insulina nell'arto ischemico sia a livello intramuscolare (muscolo gracile) che a livello sottocutaneo.
A 7 e 14 giorni dopo tale trapianto xenogenico, è stata valutata la perfusione vascolare sia nell'arto ischemico che in quello normale opposto mediante l'aiuto di un flussometro laser doppler (Transonic System).
Il trapianto di derivato tissutale xenogenico era privo di effetti collaterali, è stato ben tollerato dai ratti riceventi. Dopo 14 giorni, non si sono osservati segni di rigetto immunitario, né infiltrati infiammatori sia all'esame fisico che istologico .
Si è quindi dimostrato che il trapianto xenogenico di un derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1 permette un'efficiente rivascolarizzazione e il recupero funzionale.
Nei ratti sottoposti a ischemia cronica dell'arto inferiore e al trapianto xenogenico del derivato tissutale, la flussimetria laser Doppler ha evidenziato una riperfusione completa dell'arto, l'assenza di amputazione spontanea delle dita, e il completo recupero della mobilità delle dita, piede, e zampa così come la normalizzazione dell'elasticità e trofismo della pelle.
L'analisi istologica ha confermato un aumento considerevole nella rete vascolare e della densità capillare nell'arto trapiantato con detto derivato tissutale .
Una notevole proporzione di cellule vascolari (ovvero cellule muscolari lisce ed endoteliali) , così come elementi che conservano caratteristiche immunofeno tipi che distintive tipiche delle linee di perici ti, erano di origine umana. Questi ritrovati indicano un homing e un'integrazione favorevole dell'innesto dopo il trapianto.
Notevole era anche la densità della rete capillare a cui mancava l'espressione degli antigeni specifici umani, rivelando il coinvolgimento del ricevente in un circuito paracrino di rivascolarizzazione e riparazione tissutale.
Un'altra caratteristica dell'arto iniettato con il derivato tisutale era la mancanza del tessuto cicatriziale .
Al contrario, l'arto ischemico sottoposto all'iniezione di PBS non ha dimostrato un recupero spontaneo agli stessi intervalli temporali, con la totale soppressione della mobilità delle dita/piede, insieme ad aree necrotiche estese, formazione di cicatrici, e frequente auto-amputazione delle dita.
Nell'insieme, si sono riscontrati risultati sovrapponibili dopo il trapianto del derivato tissutale crioconservato.
Il derivato tissutale può essere ottenuto da tessuti adiposo sia di cadaveri che di donatori vivi ed è una fonte, pressoché infinita, pronta all'uso, di cellule staminali mesenchimali non embrionali da utilizzare nelle procedure ricostruttive e in medicina rigenerativa.
Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo può essere, in maniera rapida e veloce, utilizzato per trapianti, senza richiedere espansione cellulare e manipolazione, che lo renderebbero soggetto alla normativa restrittiva imposta dalle linee guida cGMP.
Inoltre a differenza di un lipoaspirato tradizionale, il derivato tissutale sopra descritto può essere conservato, in particolare crioconservato, senza perdere la capacità di ottenere cellule staminali mesenchimali altamente funzionali e vitali, dopo scongelamento.
Anche se detto derivato tissutale, fresco o crioconservato, viene sottoposto ad espansione cellulare, la procedura per ottenere cellule multi potenti risulta essere veloce e semplice: la sola azione richiesta è infatti il trasferimento del derivato tissutale in un ambiente di coltura senza nessun passo aggiuntivo.
Il derivato tissutale posto in coltura permette di ottenere una popolazione pura di cellule staminali mesenchimali umane, non embrionali, con caratteristiche simili alle cellule staminali mesenchimali isolate da altre fonti, inclusa la capacità di differenziamento in linee osteogeniche, condrogeniche e adipogeniche.
Inoltre in maniera equivalente alle cellule staminali mesenchimali ottenute da altre fonti, le cellule staminali da tessuto adiposo contenute nel derivato tissutale mantengono la capacità di esprimere un set di geni, quali VEGF, KDR e HGF, coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari .
Dette cellule possono essere differenziate in coltura in una o più linee cellulari da utilzzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenotrapianti .
Contrariamente ad un semplice lipoaspirato che mostra un'ampia distruzione della citoarchitettura, il derivato tissutale ottenuto con il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto, mostra un'architettura vasculo stromale altamente preservata, con elementi con identità di cellula pericita/perivascolare.
Il trattamento meccanico del tessuto adiposo eseguito con il dispositivo 1 produce una popolazione di cellule staminali con tratti chiaramente distinti se comparato con un lipoaspirato semplice.
In particolare il dispositivo 1 permette di ottenere un derivato da tessuto adiposo pronto per il trapianto comprendente una elevata percentuale di periciti maturi e cellule staminali mesenchimali umane HMSCs, con una bassa quantità di elementi simili ad ematopoietici.
Queste caratteristiche sono mantenute inalterate anche nel derivato tissutale crioconservato.
Il dispositivo 1, evitando l'uso di collagenasi ed altri enzimi, tipicamente utilizzati nel trattamento di un lipoaspirato, permette di mantenere inalterato l'ambiente cellulare di superficie e la composizione del glicocalice, in maniera ottimale rispetto agli ai metodi di trattamento di tessuto adiposo tradizionali basati sulla dissociazione enzimatica .
Detto derivato, le cellule staminali mesenchimali non embrionali ottenute da detto derivato o le cellule differenziate possono quindi essere usate per la preparazione di un medicamento da utilizzare in terapia cellulare per trattamenti estetici, per rimpiazzare un tessuto od un organo, o indurre o accelerare la riparazione o la rigenerazione di tessuti.
Possono ad esempio essere utilizzati per uno o più dei seguenti trattamenti e/o procedimenti:
trattamenti estetici, quali trattamento di deficit volumetrici del corpo e del volto, di miglioramento del trofismo della cute, e/o di stimolazione biologica,
- il trattamento di patologie cardiache,
- la rigenerazione del sistema nervoso,
- i procedimenti di ricostruzione tissutale, i procedimenti di rigenerazione di tessuti dentali compresi osso e gengiva,
i procedimenti antinfiammatori e/o di immunomodulazione ,
- i procedimenti di rivascolarizzazione/crescita di nuovi vasi sanguigni,
- i procedimenti di antiapoptosi cellulare.
Il detto derivato, le cellule staminali mesenchimali non embrionali ottenute da detto derivato possono anche essere utilizzate da sole od in combinazione con altre sostanze per la preparazione di un medicamento da utilizzare per l'attenuazione o l'eliminazione del dolore nei trattamenti estetici o terapeutici .

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di un medicamento da utilizzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive caratterizzato dal fatto che prevede la preparazione di un derivato tissutale comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , o la preparazione di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, essendo detto derivato o dette cellule staminali non embrionali utilizzate per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, detta preparazione del derivato tissutale prevede i seguenti passi: - riduzione del detto tessuto adiposo ottenuto da donatore vivo o donatore cadavere, costituito da una componente fluida, comprendente almeno una componente oleosa ed una componente ematica, e da una componente solida comprendente strutture vasculostromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali e multipotenti, in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati , in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculo-stromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro, lavaggio con soluzioni sterili del tessuto adiposo ridotto ed emulsione delle componenti fluide del tessuto adiposo sottoposto a riduzione delle dimensioni dei macroagglomerati cellulari, essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite un dispositivo (1) provvisto al suo interno di mezzi di riduzione quale una rete od una serie di lamine o fili taglienti (101,102) e mezzi di generazione di una emulsione quali sfere (103) o simili, ed essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo (1).
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di crioconservazione del derivato tissutale.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di espansione numerica cellulare, in particolare degli elementi staminali e multipotenti compresi nel derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo aspirato e trattato con detto dispositivo (1), ossia del derivato fresco, o scongelato, dopo il passo di crioconservazione, essendo detto passo di espansione numerica delle cellule staminali e multipotenti eseguito su terreno di coltura.
  4. 4. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede il passo di differenziazione in vitro di dette cellule staminali non embrionali in una o più linee cellulari quali adipociti, osteociti, condrociti.
  5. 5. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede l'applicazione di detto derivato tissutale o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, su supporti solidi o semisolidi biocompatibili, quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato, la quale applicazione avviene in vitro su substrati successivamente impiantati su paziente o su substrati già innestati in vivo su paziente.
  6. 6. Derivato tessutale comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , ottenuto da trattamento di tessuto adiposo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5.
  7. 7. Vettore cellulare per il trasferimento nel tessuto di paziente in vivo di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali caratterizzato dal fatto che detto vettore è costituito da un derivato tissutale ottenuto secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5.
  8. 8. Vettore cellulare secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che dette cellule staminali mesenchimali non embrionali esprimono in situ sul paziente un set di geni coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari, quali geni per il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), per il fattore di crescita epatocitaria (HGF), gene KDR codificante per un recettore essenziale del VEGF.
  9. 9. Uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, di un derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo e comprendente una frazione vasculostromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici, essendo detto derivato, dette cellule staminali non embrionali o dette cellule differenziate ottenute con il metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5.
  10. 10. Uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive di un medicamento per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, essendo detto medicamento ottenuto con il metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003053346A2 (en) * 2001-12-07 2003-07-03 Macropore Biosurgery, Inc. Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells
EP1908820A1 (en) * 2006-10-06 2008-04-09 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Stem cell and/or progenitor cell enrichment
EP2374485A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-12 Luisa Benassi New dermal substitute and therapeutical application thereof
WO2011145075A2 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Carlo Tremolada Device and method for preparing tissue, particularly adipose tissue, for transplantation from lobular fat extracted by liposuction
WO2012047286A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-12 Spinesmith Partners L.P. Device and method for delivering mechanically released cells from liposuction aspirates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003053346A2 (en) * 2001-12-07 2003-07-03 Macropore Biosurgery, Inc. Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells
EP1908820A1 (en) * 2006-10-06 2008-04-09 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Stem cell and/or progenitor cell enrichment
EP2374485A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-12 Luisa Benassi New dermal substitute and therapeutical application thereof
WO2011145075A2 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Carlo Tremolada Device and method for preparing tissue, particularly adipose tissue, for transplantation from lobular fat extracted by liposuction
WO2012047286A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-12 Spinesmith Partners L.P. Device and method for delivering mechanically released cells from liposuction aspirates

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Advanced Techniques in Liposuction and Fat Transfer", 12 September 2011, INTECH, ISBN: 978-9-53-307668-3, article LEANDRA BAPTISTA ET AL: "Processing of Lipoaspirate Samples for Optimal Mesenchymal Stem Cells Isolation", XP055055011, DOI: 10.5772/20373 *
BETTINA LINDROOS ET AL: "The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine", STEM CELL REVIEWS AND REPORTS, HUMANA PRESS INC, NEW YORK, vol. 7, no. 2, 18 September 2010 (2010-09-18), pages 269 - 291, XP019895296, ISSN: 1558-6804, DOI: 10.1007/S12015-010-9193-7 *
GIUSEPPE CAVALLARI ET AL: "Mesenchymal Stem Cells and Islet Cotransplantation in Diabetic Rats: Improved Islet Graft Revascularization and Function by Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells Preconditioned With Natural Molecules", CELL TRANSPLANTATION, vol. 21, no. 12, December 2012 (2012-12-01), pages 2771 - 2781, XP055055183, ISSN: 0963-6897, DOI: 10.3727/096368912X637046 *
YOUNG WOO EOM ET AL: "Rapid Isolation of Adipose Tissue-Derived Stem Cells by the Storage of Lipoaspirates", YONSEI MEDICAL JOURNAL, vol. 52, no. 6, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 999, XP055055009, ISSN: 0513-5796, DOI: 10.3349/ymj.2011.52.6.999 *

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