ITGE20120102A1 - Procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l'espressione di pluripotenzialità - Google Patents
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Description
“Procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità â€
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte.
Prove sperimentali indicano che il destino delle cellule, e quindi anche il destino delle cellule staminali, à ̈ controllato a più livelli interconnessi tra loro, che coinvolgono una complessa interazione tra segnalazione cellulare e modulazione epigenetica che viene modellata a livello di assemblaggio nucleosomale, creazione architettonica di motivi di fattori di trascrizione sfaccettati, e organizzazione temporale e spaziale della cromatina in anse e domini.
Un contributo in rapida crescita per la dissezione molecolare della regolazione trascrizionale e delle modificazioni epigenetiche nasce dall’isolamento e dalla caratterizzazione di molecole chiave coinvolte nella acetilazione degli istoni, nella metilazione del DNA e nel rimodellamento della cromatina.
Fino a poco tempo fa, gli ambiti di ricerca sulle cellule staminali e la ricerca epigenetica sono stati sviluppati in modo indipendente.
Tuttavia, à ̈ ormai chiaro che questi ambiti non possono essere più considerati in modo indipendente, e che lo stato epigenetico delle cellule staminali toti/pluripotenti può essere in larga misura responsabile per la "plasticità " di queste cellule.
Similmente a tale consapevolezza, i risultati recenti indicano che anche le cellule somatiche umane adulte non staminali possono essere riprogrammate a uno stato simile a quello embrionale mediante trasduzione virale con pochi, da tre a quattro, fattori di trascrizione, venendo trasformate in lineage in cui queste cellule altrimenti non sarebbero mai state presenti.
Il trasferimento genico mediato da vettori virali può quindi essere sfruttato per fornire una prova di principio che la trasformazione di cellule somatiche in "cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)" può essere ottenuta mediante lo sblocco dei domini della cromatina che ospitano cruciali informazioni genetiche e architetturali (epigenetiche) che possono connettere le cellule specializzate mature ai loro elementi base della pluripotenzialità .
Tuttavia, il trasferimento genico di vettori virali à ̈ un approccio ingombrante, costoso e potenzialmente rischioso che non à ̈ facilmente immaginabile negli esseri umani.
E’ noto che la molecola costituita dall’acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR), à ̈ in grado di:
(i) massimizzare la cardiogenesi in cellule staminali embrionali di topo,
(ii) migliorare la differenziazione miocardica e vascolare in cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) isolate dal midollo osseo, dalla polpa dentale e da membrane fetali di placenta umana a termine, (iii) produrre il precondizionamento delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) per migliorare notevolmente la riparazione cardiovascolare mediata da hMSC in modelli animali sia di piccola taglia (ratto) che grande taglia (maiale) di infarto acuto del miocardico,
(iiii) offrire una significativa riparazione e sopravvivenza del miocardio nei cuori sottoposti a infarto (ratti), senza trapianto di cellule staminali.
L’acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) iniettato direttamente nel miocardio infartuato à ̈ in grado di aumentare l'acetilazione degli istoni sia nelle zone lontane che di margine del tessuto danneggiato.
Questo effetto à ̈ attribuibile all’azione inibitoria delle deacetilasi istoniche esercitata dalla frazione butirrica dell’HBR.
Esperimenti in vitro hanno confermato un significativo aumento nell’acetilazione dell'istone H4 ottenuta dopo il trattamento di HBR sia di cardiomiociti ventricolari cardiaci di ratti adulti e di cellule staminali mesenchimali di ratti positive a Stro-1, rispetto alle cellule non trattate.
In tutti questi studi, l’HBR ha dimostrato essere efficace nell’agire per via trascrizionale sull'espressione di un certo numero di geni cruciali coinvolti in:
(i) cardiogenesi,
(ii) vasculogenesi,
(iii) sopravvivenza cellulare,
(iiii) sintesi di mediatori trofici rilasciabili da cellule staminali, come il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e il fattore di crescita degli epatociti (HGF), agenti in modo paracrino come molecole antiapoptotiche, antifibrotiche e angiogeniche.
Questi effetti si sono verificati a livello sia delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) e delle cellule staminali di ratti positive a Stro-1 e delle cellule adulte (ad esempio cardiomiociti).
Diverse osservazioni sono state fatte sull’acido ialuronico (HA), sull’acido butirrico (BU) e sull’acido retinoico (RA).
Il recettore dell’acido ialuronico CD44 à ̈ altamente espresso da cellule cardiogeniche, e viene messa fine alla normale morfogenesi cardiaca dal silenziamento genico della sintasi-2 dell’acido ialuronico.
Frammenti di acido ialuronico promuovono la differenziazione delle cellule endoteliali in modo CD44-dipendente, e CD44 svolge un ruolo importante nella funzione delle cellule endoteliali e nella formazione di nuovi vasi sanguigni.
L’acido ialuronico può essere internalizzato mediante endocitosi mediata da recettori, venendo in seguito rilevato in stretta associazione con eterocromatina nucleare.
Le ialaderine (proteine di legame dell’acido ialuronico) possono trasferirsi verso il nucleo all’atto della stimolazione mitogenica, servendo come substrati o attivatori per le MAP chinasi, o agendo come omologhi nei vertebrati di proteine coinvolte nella crescita e nella differenziazione cellulare.
Per quanto riguarda il butirrato, la sua azione inibitoria delle deacetilasi di istoni altera la struttura della cromatina grazie alla iperacetilazione degli istoni nucleosomali, aumentando l'accessibilità dei fattori di trascrizione ai siti regolatori cis-agenti bersaglio.
Un’inferenza della segnalazione di acido retinoico con differenziazione cardiaca à ̈ supportata dalla constatazione che uno sviluppo cardiaco anormale si verifica dopo l’inattivazione del gene RXRα e combinando razze di topi con sottotipi mutanti RAR e RXR.
Inoltre, gli acidi all-trans e 9-cis-retinoici hanno aumentato l'efficienza della cardiogenesi in cellule staminali embrionali di topo ES.
L'acido retinoico gioca un ruolo cruciale nello sviluppo vascolare nei mammiferi, essendo richiesto nella proliferazione di cellule endoteliali e nel rimodellamento vascolare durante la vasculogenesi in vivo.
In nuclei isolati, à ̈ stato dimostrato che la trascrizione dei geni modulati da HBR non à ̈ stata influenzata dalla molecola intatta, ma piuttosto à ̈ stata regolata mediante esposizione ad acido butirrico e retinoico, essendo migliorata mediante una miscela dei due.
Questi risultati indicano che HBR può aver agito dopo l'idrolisi intracellulare (mediata da esterasi ubiquitarie) delle sue proprie componenti esterificate.
Nonostante questi risultati, e il fatto che il tessuto adiposo à ̈ una fonte facilmente accessibile di elementi multipotenti con profili di espressione genica e fenotipica simili a cellule staminali mesenchimali (hMSC) e a periciti, la possibilità di un’applicazione clinica del potenziale multilineage di queste cellule viene ritardata dalla scarsa/trascurabile sopravvivenza cellulare nei lipoaspirati crioconservati, dalla difficoltà di espansione ex vivo e dalla complessità degli attuali requisiti delle Norme di Buona Fabbricazione (cGMP) per le cellule espanse.
Le cellule isolate ed espanse sono infatti sottoposte a una cosiddetta “major manipulation†e sono quindi considerate ATMPs (Adanced Therapies Medicinal Products) e sottoposte alla normativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice).
Da queste osservazioni risulta quindi evidente l’importanza, in particolare per il campo della medicina rigenerativa, di sviluppare molecole sintetiche e/o di identificare molecole presenti in natura che possano sostituire le procedure di trasferimento genico mediato da vettori virali per ottenere la riprogrammazione epigenetica e l’espressione di pluripotenzialità in elementi cellulari multipotenti.
Dette molecole devono infatti essere in grado di guidare le cellule staminali e multipotenti e/o le cellule somatiche non staminali verso uno stato pluripotente, massimizzando le loro proprietà di differenziazione, e la loro capacità di secernere una serie di fattori che agiscono in modo paracrino in un tessuto danneggiato per provocare il potenziale di guarigione del ricevente.
Risulta altresì evidente l’importanza di avere una fonte di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale di facile reperimento e pronti all’uso.
E’ noto che le domande di brevetto GE2010A000057 e WO2011/145075 descrivono un dispositivo ed un metodo per la preparazione di tessuto, in particolare tessuto adiposo, per trapianto ottenuto da materiale adiposo lobulare estratto tramite liposuzione.
Secondo la presente invenzione à ̈ pertanto possibile impiegare uno o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica per riportare le cellule staminali e multipotenti adulte o cellule somatiche adulte non staminali ad uno stato con caratteristiche simili a quello embrionale ovvero per ottimizzare la potenza delle stesse ossia per ottenere una riprogrammazione epigenetica e l’espressione di pluripotenzialità al fine di poter utilizzare delle cellule a scopi terapeutici ed in medicina rigenerativa nell’ambito di vari contesti clinici, tra cui malattie cardiovascolari, malattie neurodegenerative e malattie endocrine/metaboliche.
A tal fine l’invenzione prevede il precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte, sottoponendo un derivato tissutale non espanso comprendente detti elementi staminali e multipotenti, e/o sottoponendo cellule staminali non embrionali e/o cellule somatiche non embrionali, ottenute da un campione di tessuto o da detto derivato, a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica.
Detta o dette sostanze sono in grado di svolgere una o più delle seguenti funzioni:
- aumento della acetilazione istonica, con conseguente rimodellamento della cromatina e una maggiore accessibilità del fattore di trascrizione ai domini di cromatina bersaglio;
- aumento della trascrizione dei geni associati alla pluripotenzialità delle cellule staminali, quali Oct3/4, Nanog, Sox2 e altri membri di questa famiglia, Klf4;
- aumento della trascrizione di diversi geni tessuto-specifici, insieme con i geni legati a pluripotenza, quali Mef2C, Tbx5, e geni coinvolti in cardiogenesi, come prodinorfina, Gata4, Nkx2.5, geni coinvolti in vasculogenesi, come VEGF, HGF, KDR, geni coinvolti in neurogenesi, come neurogenina1, geni che innescano l’orientamento verso isole betapancreatiche, come ad esempio neurogenina3, geni responsabili di un contesto di pro-sopravvivenza all'interno di un derivato tissutale, compresi Pim1 e Akt.
Secondo una forma esecutiva preferita della presente invenzione il procedimento prevede la miscelazione del materiale cellulare con un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
Secondo la presente invenzione quindi il materiale cellulare può essere miscelato con:
- acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR),
- una miscela di una o più delle sue frazioni, - una miscela di acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e una o più delle sue frazioni.
Secondo la presente invenzione l’uso di HBR o di una miscela di acido ialuronico (HA) e/o butirrico (BU) e/o retinoico (RA) consente di ottenere il rimodellamento della cromatina e modificazioni epigenetiche all’interno degli elementi cellulari trattati anche senza la necessità di avere l’espansione cellulare.
È stato infatti dimostrato che una miscela di acido ialuronico (HA), butirrico (BU) e retinoico (RA) à ̈ stata in grado di aumentare la secrezione di VEGF e la trascrizione di VEGF, di KDR (codificante il maggior recettore VEGF), e HGF in cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) dissociate dal tessuto adiposo (hASC).
E’ stato dimostrato che il precondizionamento chimico ex vivo di hASC con la suddetta miscela di molecole presenti in natura ha portato alla rivascolarizzazione del tessuto trapiantato dopo il co-trapianto intraepatico di isole pancreatiche/hASC in ratti diabetici singenici.
I ratti trapiantati con isole in co-coltura con hASC precondizionate hanno mostrato un controllo glicemico migliore rispetto ai ratti trapiantati con un volume uguale di isole e hASC di controllo.
Il co-trapianto con hASC precondizionate à ̈ anche associato ad una migliore rivascolarizzazione delle isole in vivo, come evidenziato dall’analisi morfologica del trapianto.
L'aumento osservato nella funzione e rivascolarizzazione dimostra quindi che il metodo di precondizionamento di cellule staminali rappresenta una nuova strategia per migliorare notevolmente l'efficacia del co-trapianto di hASC/hMSC.
Il prodotto cellulare, non espanso e pronto all’uso, ottenuto con il dispositivo oggetto del brevetto con numero di pubblicazione WO 2011/145075, qui definito per semplicità prodotto †Lipogems†, che utilizza lievi forze meccaniche in un sistema completamente chiuso, evitando l’uso di enzimi, di additivi e altre manipolazioni, risulta essere particolarmente vantaggioso nel procedimento di riprogrammazione epigenetica e di ottimizzazione della pluripotenzialità di cellule tramite l’uso di HBR o delle sue frazioni sopra citate ossia acido ialuronico, retinoico e acido butirrico.
A differenza del lipoaspirato non trattato con il detto dispositivo, il prodotto ottenuto da lipoaspirato con il dispositivo ed il procedimento brevettato, cosiddetto prodotto “Lipogems†, comprende uno stroma vascolare straordinariamente conservato, con capillari a fessura incuneati tra adipociti e steli stromali contenenti canali vascolari con evidenti lumi. L’immunoistochimica ha rivelato che la frazione stromale vascolare (SVF) del detto prodotto “Lipogems†include un elevato numero di cellule con identità di pericita e/o cellule staminali mesenchimali (hMSC) che mostrano il classico orientamento verso lineage osteogenico, condrogenico e adipogenico.
Il dispositivo del brevetto WO2011/145075 e di seguito descritto permette di preservare la nicchia vasculo stromale e consente che l’HBR (o le sue frazioni) possano agire sulle cellule contenute all’interno di detta nicchia.
L'analisi di citometria a flusso del prodotto “Lipogems†non-espanso trattato con collagenasi ha dimostrato che à ̈ composto con una percentuale notevolmente più elevata rispetto ai normali lipoaspirati ottenuti con tecniche tradizionali, di periciti maturi e di cellule staminali mesenchimali (hMSC), e una quantità inferiore di elementi ematopoietici, rispetto ai lipoaspirati enzimaticamente-digeriti.
Inoltre a differenza del lipoaspirato tradizionale, ossia non trattato con il dispositivo ed il metodo oggetto di brevetto WO2011/145075, i tratti distintivi del prodotto “Lipogems†fresco isolato da tessuto adiposo non differiscono dai tratti distintivi del prodotto “Lipogems†sottoposto a crioconservazione ossia la crioconservazione non altera le caratteristiche biochimiche del prodotto “Lipogems†.
E’ altresì da notare che le caratteristiche sopra citate sono presenti anche nel prodotto “Lipogems†ottenuto da tessuto adiposo di cadaveri.
Secondo una forma esecutiva preferita della presente invenzione à ̈ prevista la miscelazione di HBR o di una o più delle sue frazioni (o di una miscela costituita da o comprendente HBR e una o più delle sue frazioni) con il prodotto cellulare del dispositivo e del procedimento descritto in WO2011/145075 (cosiddetto prodotto “Lipogems†) per ottenere un precondizionamento chimico del detto prodotto prima del suo trapianto nello stesso donatore (procedura autologa) o in un soggetto diverso dal donatore (procedura allogenica).
Il precondizionamento chimico ha lo scopo di permettere il rimodellamento della cromatina ed una riprogrammazione epigenetica degli elementi multipotenti presenti nella frazione stromale vascolare (SVF) del detto prodotto.
Questi elementi sono i periciti e le cellule staminali mesenchimali hMSC che rispondono a HBR o alle sue frazioni con l'acquisizione di uno stato pluripotente, che a sua volta porterà all’aumento dell’orientamento verso lineage complessi, tra cui lineage del miocardio, vascolare (endoteliali e muscolari lisce) e neuronale.
La riprogrammazione epigenetica inoltre migliora la sintesi e la secrezione di molteplici fattori di crescita che agiranno in modo paracrino dopo il trapianto del prodotto “Lipogems†precondizionato per impartire “messaggi istruttivi†capaci di aumentare il potenziale di guarigione endogeno del tessuto danneggiato del ricevente.
L’oggetto del presente brevetto rappresenta quindi un procedimento innovativo in ambito biomedico e clinico in quanto consente, come meglio specificato di seguito, di ottenere la riprogrammazione epigenetica e l’espressione di pluripotenzialità sia di elementi multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, di origine non embrionali sia di cellule somatiche adulte, in particolare di elementi staminali e multipotenti contenuti nella frazione vasculo-stromale di un derivato tissutale non espanso.
Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione e dalle figure allegate in cui:
- la fig.1 illustra schematicamente il dispositivo oggetto del brevetto WO2011/145075 ed i passi di trattamento del lipoaspiato tramite detto dispositivo;
- la fig.2 mostra la struttura chimica di HBR. La sintesi e la caratterizzazione del composto HBR può essere ottenuta secondo procedure note come quelle descritte nei seguenti documenti:
- Ventura C, Maioli M, Asara Y, Santoni D, Scarlata I, Cantoni S, Perbellini A. Butyric and retinoic mixed ester of hyaluronan. A novel differentiating glycoconjugate affording a high throughput of cardiogenesis in embryonic stem cells. J Biol Chem. 2004 May 28;279(22):23574-9.
- Lionetti V, Cantoni S, Cavallini C, Bianchi F, Valente S, Frascari I, Olivi E, Aquaro GD, Bonavita F, Scarlata I, Maioli M, Vaccari V, Tassinari R, Bartoli A, Recchia FA, Pasquinelli G, Ventura C. Hyaluronan mixed esters of butyric and retinoic acid affording myocardial survival and repair without stem cell transplantation. J Biol Chem. 2010 Mar 26;285(13):9949-61.
Con riferimento alla figura 2, con la sigla HA si intende l’acido ialuronico; con la sigla BU si intende l’acido butirrico, con la sigla RA si intende l’acido retinoico.
La formula generica di esteri HA rappresenta un copolimero random (ran) di tre distinte unità ripetitive dimeriche, tra cui x sono non sostituite, y sono sottoposte a butirilazione (gruppo C3H7CO) e z sono sottoposte a retinoilazione (gruppo C19H27CO). Assumiamo n come la somma di x, y e z vale a dire il numero totale di unità di disaccaride nel polisaccaride.
DSBUe DSRAcorrispondono rispettivamente al rapporto tra y e n e tra z e n.
Ovviamente per il monoestere ialuronico (H) – retinoico (R), abbreviato come HR, il DSBUà ̈ 0 (y = 0), mentre per il monoestere ialuronico (H) – Butirrico (B), abbreviato come HB il DSRAà ̈ 0 (z = 0).
Secondo un metodo noto di preparazione, il gruppo idrossilico primario in posizione 6 dei residui di N-acetil-D-glucosamina nello scheletro del polisaccaride à ̈ il più reattivo verso l'esterificazione.
E’ stato preparato un doppio sale di tetrabutilammonio con due gruppi funzionali dell’ acido ialuronico, in particolare il suo carbossilico e 6-idrossilico, al fine di ottenere una buona solubilità in solventi polari aprotici organici e per aumentare la nucleofilicità dell'atomo di ossigeno in C-6.
La retinoilazione con retinoil cloruro, che à ̈ il fattore limitante la velocità di reazione, à ̈ stata effettuata prima della butirilazione mediante anidride butirrica e 4 - (dimetilammino) piridina come catalizzatore di acilazione ipernucleofilica.
Il grado di sostituzione (DS) à ̈ stato considerato come il numero dei gruppi esterificati OH per ciascuna unità di ripetizione di acido ialuronico (GlcNAc-GlcUA dimero).
Il peso molecolare medio ponderale di HBR, denominato come media ponderale di sodio ialuronato, Ã ̈ stato determinato mediante cromatografia ad esclusione dimensionale ad alta prestazione.
Tutti gli HBR sintetizzati possono presentare un DS con BU (DSBU) compreso tra 0,05 e 1,5, o qualsiasi altro DSBU che può risultare compatibile con la stabilità e l'efficienza/efficacia biologica di HBR.
Il DS con RA (DSRA) può essere compreso tra 0,002 e 0,1, o qualsiasi altro DSRA che può risultare compatibile con la stabilità e l'efficienza/ efficacia biologica di HBR.
Il rapporto tra DSBU/ DSRA può essere di 6, o qualsiasi altro valore che può risultare compatibile con la stabilità e l'efficienza/efficacia biologica di HBR.
Il peso molecolare medio ponderale può essere compreso tra 10.000 e 30.000 dalton, o altri valori che possono risultare compatibili con la stabilità chimica e l’efficienza /efficacia biologica di HBR.
Il dispositivo 1 descritto nel brevetto WO 2011/145075 consente di prelevare tessuto da paziente vivo o da cadavere, umano o animale, di processarlo senza l’utilizzo di enzimi, eventualmente di crioconservarlo, e di reiniettarlo nel paziente, essendo possibile prevedere che detto paziente sia uguale o diverso dal paziente donatore (trapianto autologo o allogenico).
Il dispositivo 1 consente di preparare un derivato tissutale non espanso a partire da una “manipolazione minima†, non-enzimatica, del tessuto di origine.
Preferibilmente il tessuto trattato à ̈ tessuto adiposo.
Secondo una forma attuativa particolarmente vantaggiosa, il tessuto comprende tessuto adiposo ottenuto da materiale adiposo lobulare estratto, ad esempio, tramite liposuzione, essendo il detto materiale adiposo costituito da una componente fluida comprendente una componente oleosa, una componente ematica e/o soluzioni sterili e da una componente solida comprendente strutture vasculo-stromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali.
Nel presente testo con derivato tissutale si intende un aggregato o cluster cellulare, comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali.
Preferibilmente nella presente invenzione il derivato tissutale non espanso à ̈ ottenuto da tessuto adiposo trattato con il metodo ed il dispositivo 1 descritto di seguito e nel documento WO 2011/145075.
Il procedimento di preparazione del derivato tissutale da materiale adiposo prevede la fase di suddivisione del detto materiale adiposo in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati, in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculostromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro.
In alternativa o in combinazione alla fase di suddivisione, il procedimento può prevedere almeno una fase di lavaggio degli aggregati cellulari eseguito contestualmente ad una fase di separazione della componente fluida dalla componente solida.
Secondo la presente invenzione la fase di sottoporre dette cellule/agglomerati a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica avviene per tutta la durata del procedimento o per solo una parte di esso o alla fine del procedimento.
Ovviamente à ̈ possibile prevedere di ottenere un derivato tissutale anche tramite altri metodi e dispositivi noti.
Il dispositivo 1, grazie alla presenza di almeno una rete di riduzione 101 delle dimensioni del lipoaspirato e di elementi agitatori meccanici 103, che consentono di ottenere una emulsione delle componenti liquide del lipoaspirato, riduce progressivamente le dimensioni dei clusters o agglomerati cellulari del tessuto adiposo lipoaspirato, eliminando contemporaneamente i residui liquidi costituiti principalmente da olio e sangue.
Il metodo di trattamento del lipoaspirato prevede il lavaggio e la riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari in completa immersione in un liquido, quale una soluzione fisiologica sterile di lavaggio, per minimizzare l’azione traumatica del dispositivo 1 sulle cellule.
I passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite il dispositivo 1 sono quindi eseguiti in condizioni di assenza di aria all’interno di detto dispositivo 1.
Il dispositivo 1 consente di ottenere agglomerati cellulari di dimensioni ridotte che migliorano integrazione cellulare post-trapianto.
La prima riduzione degli agglomerati cellulari à ̈ ottenuta spingendo il lipoaspirato contento nella siringa di aspirazione nel dispositivo 1 attraverso la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni, mentre una corrispondente quantità di soluzione salina esce dal dispositivo 1 e viene accumulata in una sacca di raccolta (figura 1A).
Quando la quantità desiderata di lipoaspirato à ̈ stata inserita nel dispositivo 1, mantenuto verticale, con la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni in alto, lo strato galleggiante di tessuto adiposo, preferibilmente, non deve occupare più della metà superiore del dispositivo 1.
Gli elementi agitatori 103 presenti nel dispositivo 1, ad esempio sfere in metallo o simili, consentono, durante l’agitazione del dispositivo 1 (figura 1B), di formare una emulsione, tra l’olio, sangue e soluzione di lavaggio che à ̈ rimossa contro densità , dall’interno del dispositivo 1, seguendo il flusso della soluzione salina mossa dalla gravità , mentre gli agglomerati di dimensioni ridotte della frazione vasculo stromale (contenente adipociti, vasi, periciti e cellule mesenchimali) si muovono verso la parte superiore del dispositivo 1 considerato in posizione verticale (figura 1B).
Quando la parte liquida all’interno del dispositivo 1 appare chiara ed il lipoaspirato giallo, il flusso di soluzione salina viene interrotto, ed il dispositivo 1 viene ruotato di 180°(figura 1C).
La seconda riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari à ̈ ottenuta facendo passare gli agglomerati della frazione vasculo stromale (contenente adipociti, vasi, periciti e cellule mesenchimali) attraverso una seconda rete 102 di riduzione delle dimensioni spingendo all’interno del dispositivo 1 ulteriore liquido attraverso l’apertura inferiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura 1C), utilizzando ad esempio una siringa.
Il derivato tissutale ottenuto attraverso il trattamento del lipoaspirato con il dispositivo 1 sopra descritto à ̈ raccolto in siringhe collegate all’apertura superiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura 1C) ed à ̈ pronto ad essere utilizzato o conservato.
Il prodotto ottenuto tramite il dispositivo sopra descritto costituisce quindi un derivato tissutale non espanso comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali in particolare costituisce una “nicchia vascolare stromale naturale†costituita da una rete di adipociti a guisa di impalcatura legati a vasi altamente conservati, contenente una notevole quantità di cellule staminali mesenchimali e periciti.
Secondo la presente invenzione il materiale cellulare sul quale il precondizionamento chimico può essere eseguito comprende, in alternativa od in combinazione tra loro:
- elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, contenuti nella frazione vasculo-stromale di un derivato tissutale, espanso o non espanso,
- elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali ottenuti da detto derivato o da un campione di tessuto, espansi o non espansi,
- cellule somatiche adulte non staminali (es. fibroblasti cutanei) contenute od ottenute da detto derivato o da un campione di tessuto, espanse o non espanse.
Il metodo può quindi essere applicato anche a cellule diverse dalle cellule staminali e multipotenti, come cellule somatiche adulte, umane o animali, o cellule embrionali non umane per ottenere una sorta di programmazione delle stesse.
Il metodo può essere applicato sia su materiale cellulare ottenuto da donatori vivi o donatori cadavere.
Inoltre può essere anche applicato, oltre che su materiale fresco, su materiale scongelato dopo crioconservazione a –80°C o in azoto liquido.
Si ricorda che per derivato tissutale non espanso si intende un aggregato di cellule del tessuto estratto da paziente, che non viene messo in coltura e pertanto gli elementi cellulari (staminali e non) in esso contenuti non vengono posti a coltura in vitro in un mezzo di coltura, ossia non vengono sottoposti a proliferazione (definita anche espansione) in vitro.
Nel complesso, il procedimento può comprendere le fasi di:
a) preparare un derivato tissutale non espanso a partire da una “manipolazione minima†, nonenzimatica, del tessuto di origine, quale lipoaspirato, essendo detto derivato inteso come costituito da aggregati di cellule del tessuto di origine, quali adipociti nel caso di lipoaspirato, circondati da una componente vasculo-stromale contenente cellule staminali e/o elementi multipotenti quali periciti e cellule staminali mesenchimali;
b) in alternativa od in combinazione alla fase a), preparare una sospensione cellulare a partire da un campione di tessuto o dal derivato di cui alla fase a), recuperare le cellule staminali (non embrionali) e/o le cellule somatiche adulte da detta sospensione cellulare;
c) sottoporre dette cellule staminali (non embrionali) e/o le cellule somatiche adulte del derivato tissutale od ottenute da un campione di tessuto o dal derivato di cui alla fase a), a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica, in particolare con un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
Con la definizione di “manipolazione minima†delle cellule si intende che le cellule (staminali e non) non vengono espanse (coltivate e fatte proliferare in vitro in coltura) e non vengono sottoposte ad una serie di “lavorazioni†quali estrazione e dissociazioni enzimatiche, centrifugazioni e separazioni di popolazioni cellulari, arricchimento di alcune popolazioni cellulari a scapito di altre (ad esempio separazione con citofluorometria a flusso) ed altre lavorazioni simili.
Il fatto che le cellule possono essere sottoposte a manipolazione minima consente che il procedimento ed il prodotto ottenuto tramite detto procedimento non ricada nella normativa “Farmaco-Major manipulation†.
Ovviamente à ̈ anche possibile prevedere che gli elementi cellulari di origine non embrionale (elementi staminali e multipotenti e cellule somatiche) siano sottoposti ad espansione in vitro.
Il campione di tessuto può vantaggiosamente comprendere materiale adiposo estratto, ad esempio, tramite liposuzione/lipoaspirazione, e la fase b) del procedimento prevedere di trattare enzimaticamente il materiale adiposo per il rilascio di elementi staminali e multipotenti e/o cellule somatiche dopo eventuale riduzione del tessuto adiposo in parti più piccole.
Il procedimento può quindi essere applicato sia ad aggregati cellulari non espansi (ad esempio cellule ottenute con il procedimento descritto nel brevetto WO2011/145075), che a cellule da esso derivate (e quindi espanse) o ad altre tipologie di cellule staminali (di origine non embrionale) e non (ad esempio cellule somatiche adulte come i fibroblasti) che potrebbero essere isolate ed espanse.
Dette cellule isolate ed espanse sono quindi sottoposte a una cosiddetta “major manipulation†e sono considerate ATMPs (Adanced Therapies Medical Products) e sottoposte alla nomativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice).
Le cellule staminali e multipotenti (di origine non embrionale) e/o le cellule somatiche da trattare possono essere ottenute con qualsivoglia metodo noto.
Preferibilmente le cellule staminali e multipotenti e/o le cellule somatiche da trattare secondo il metodo oggetto della presente invenzione sono contenute in un derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo descritto nel brevetto internazionale pubblicato con numero WO 2011/145075.
Secondo una forma attuativa, il contenitore entro cui à ̈ presente il materiale cellulare da trattare à ̈ quello utilizzato nel dispositivo per preparare del tessuto adiposo per trapianto descritto nella domanda di brevetto internazionale pubblicata con il numero WO2011/145075. Si tratta in pratica di un contenitore in plastica o vetro sterile, o comunque in materiale translucido, preferibilmente resistente alle alte temperature e trattabile in autoclave, all’interno del quale viene iniettato materiale adiposo lipospirato.
Grazie al metodo di trattamento, oggetto della presente invenzione, del derivato tissutale definito anche nella presente domanda di brevetto come prodotto “lipogems†ottenuto con il metodo e dispositivo del brevetto WO2011/145075 à ̈ possibile ottenere non solo materiale adiposo da usare come filler biologico, ma anche materiale ricco di elementi quali periciti e cellule staminali mesenchimali con potenza arricchita o comunque modificata, che può essere impiegato per rigenerare tessuti anche diversi da quelli da cui detto materiale à ̈ stato estratto.
Il precondizionamento chimico per ottenere la riprogrammazione epigenetica e la modulazione trascrizionale, secondo le modalità della presente invenzione, può essere eseguito non solo, preferibilmente, su un derivato tissutale non espanso come quello ottenuto con il metodo ed il dispositivo del brevetto WO2011/145075, ma anche su specifici tipi di cellule.
Questi tipi di cellule possono essere:
- tutti i tipi di cellule derivate dal cosiddetto prodotto “Lipogems†, in qualsivoglia modo isolate ed espanse in coltura per un qualsivoglia periodo di tempo; questi tipi di cellule possono essere periciti, così come cellule staminali adipose derivate contenute all'interno della frazione vasculo stremale (SVF) del prodotto “Lipogems†, o qualsiasi altro tipo di cellula presente all'interno del prodotto “Lipogems†e/o la sua frazione vasculo stromale SVF;
- cellule somatiche adulte non staminali, compresi i fibroblasti umani isolati dalla pelle e da altre fonti (ad esempio i tessuti cicatriziali); nei fibroblasti dermici umani, l’HBR, e, in misura inferiore la miscela di acido ialuronico HA, e/o acido butirrico BU, e/o acido retinico RA, sono in grado di ottenere l'espressione trascrizionale dei geni correlati a staminalità , quali Oct3/4, Nanog, Sox2 e altri membri di questa famiglia, Klf4.
Secondo la presente invenzione quindi il precondizionamento chimico, con una o più molecole di origine naturale o sintetica, implica, anche per le cellule somatiche, l’acquisizione di uno stato pluripotente con la possibilità di guidare il differenziamento cellulare verso qualsivoglia tipo di lineage cellulare derivato dai tre strati germinali.
In particolare la riprogrammazione chimica dei fibroblasti (ossia di cellule somatiche) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) rappresenta una strategia senza precedenti per la guarigione dei tessuti.
Secondo la presente invenzione il precondizionamento chimico per ottenere una sostanziale riprogrammazione epigenetica ed una modulazione trascrizionale in cellule staminali e pluripotenti di origine non embrionale o in cellule somatiche adulte, avviene miscelando il materiale cellulare con un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
La miscelazione può avvenire con acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR).
L’HBR à ̈ miscelato in un ampio range di dosi, preferibilmente ma non soltanto comprese tra 0,5 e 2,5 mg/l.
Preferibilmente quindi le dosi possono variare, da 0,5 a 2,5 mg/ml.
La miscelazione con il materiale cellulare deve avvenire gentilmente.
Il tempo di incubazione del materiale cellulare precondizionato può essere molto breve, compreso tra 1 e 2 ore, o meno, dato che l’effetto del farmaco continuerà anche dopo il trapianto del materiale cellulare sul paziente.
La miscelazione tra materiale cellulare con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica ha una durata preferibilmente compresa tra 1 o 2 ore, comunque modulabile in base alla ottimizzazione del differenziamento verso determinati lineage specifici.
Sebbene l’utilizzo di HBR rappresenti una soluzione ottimale per ottenere il precondizionamento chimico, un significativo miglioramento della pluripotenzialità e dell’orientamento delle cellule staminali non embrionali e/o delle cellule somatiche può anche essere ottenuto esponendo il materiale cellulare ad una miscela di acido ialuronico e/o di acido butirrico e/o di acido retinico.
L'esposizione del materiale cellulare a questa miscela, seppur meno efficiente in termini di riprogrammazione e modulazione della trascrizione genica rispetto al trattamento con HBR, garantisce comunque un significativo miglioramento di pluripotenzialità e regolazione trascrizionale, rispetto a materiale cellulare non trattato.
Inoltre, questi sono tutti composti presenti in natura, e le loro concentrazioni sono tutte mantenute sotto la dose farmacologica comunemente usata (cioà ̈ acido ialuronico, 1,5 mg/ml. MW 10,0000-30,000 dalton, acido butirrico 2,5 mM, e acido retinoico, 10<-8>M).
I tempi di internalizzazione cellulare di ciascuna frazione sono ovviamente non sincroni a causa della loro differente lipofilicità (acido retinoico > acido butirrico > acido ialuronico), ma ciascun componente ha dimostrato di agire efficacemente sul meccanismo di trascrizione anche quando cellule intatte sono state incubate con una miscela di acido retinoico, acido butirrico e acido ialuronico.
La molecola costituita dall’acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) da sola o miscelata con una o più delle sue frazioni, acido ialuronico e/o di acido butirrico e/o di acido retinico, o la miscela di una o più delle sue frazioni, ossia una miscela di acido ialuronico e/o di acido butirrico e/o di acido retinico può essere/possono essere utilizzate disciolte in soluzione fisiologica o in soluzioni tampone, o possono essere sottoposte a incapsulamento in "contenitori nanocolloidali/nanoparticelle intelligenti†, ovvero nanocapsule o nanofilm multistrato biodegradabili auto-assemblati, prodotti tramite la cosiddetta tecnica strato su strato (LbL), o in qualsiasi altra entità nano-strutturata che può essere adatta a tale scopo, per ottenere il rilascio efficace sia a livello intracellulare che a livello tissutale.
Preferibilmente il materiale cellulare miscelato con le molecole di origine sintetica (come HBR) o naturale come (come l’acido ialuronico, l’acido butirrico e l’acido retinico) à ̈ costituito dal derivato tissutale non espanso ottenuto con il dispositivo ed il metodo sopra descritto ed oggetto del brevetto con numero di pubblicazione WO2011/145075, definito nella presente domanda di brevetto come prodotto “Lipogems†.
L'effetto della riprogrammazione comporta:
- aumento della acetilazione istonica, con conseguente rimodellamento della cromatina e una maggiore accessibilità del fattore di trascrizione ai domini di cromatina bersaglio;
- aumento della trascrizione dei geni associati alla pluripotenzialità delle cellule staminali (quali Oct3/4, Nanog, Sox2 e altri membri di questa famiglia, Klf4);
- aumento della trascrizione di diversi geni tessuto-specifici, insieme con i geni associati alla pluripotenza, tra cui, Mef2C, Tbx5, e:
- geni coinvolti in cardiogenesi, come prodinorfina, Gata4, Nkx2.5,
- geni coinvolti in vasculogenesi, come VEGF, HGF, KDR,
- geni coinvolti in neurogenesi, come neurogenina 1,
- geni che innescano l’orientamento verso isole beta-pancreatiche, come ad esempio neurogenina 3,
- geni responsabili di un contesto di prosopravvivenza all'interno del prodotto “Lipogems†, compresi Pim1 e Akt.
Le azioni vasculogeniche e pro-sopravvivenza indotte da HBR, insieme con gli effetti antifibrotici forniti da alcuni dei fattori di crescita indotti da HBR (cioà ̈ VEGF e HGF), si traducono in un esito favorevole di guarigione in qualsiasi tessuto danneggiato che soffre di condizioni ischemiche e formazione di cicatrici, in qualsiasi modo derivanti dai contesti più vari, tra cui malattie aterosclerotiche o complicazioni del diabete.
E’ importante notare che il derivato tissutale precondizionato, in particolare il prodotto “Lipogems†, si insedia all'interno del sito di iniezione, e che il suo letto vascolare che forma la frazione vasculo stremale (SVF) stabilisce anastomosi e connessioni con la vascolarizzazione del ricevente, con conseguente progressivo innesto. Ciò a sua volta porta ad un progressivo cross-talk tra gli elementi staminali della frazione vasculo stromale (vale a dire periciti e cellule staminali mesenchimali) e l'ambiente ospite. In particolare, tale cross-talk comporterà il rilascio dalla frazione vasculo stromale di segnali di lunga vita per la sopravvivenza cellulare, riperfusione, angiogenesi, e pluripotenza cellulare che "cancelleranno" l'ambiente ostile del tessuto danneggiato del ricevente.
Il ruolo di HBR in questo contesto à ̈ cruciale. Infatti, la sua persistenza dopo l'incubazione iniziale all'interno del derivato tissutale trapiantato e la sua successiva internalizzazione negli elementi cellulari del detto derivato, tramite il recettore ialuronico CD44 (altamente espresso in periciti e cellule staminali mesenchimali della frazione vasculo stromale), conduce al rilascio intracellulare di frazioni esterificate con acido ialuronico, seguito da innesco ialuronico-mediato dell’interazione del fattore di trascrizione/proteine chinasi (essenziale per la traslocazione e traffico nucleare), l’inibizione acido butirrico-mediata delle deacetilasi istoniche e il rimodellamento della cromatina, e modulazione trascrizionale acido retinoico-mediata (ossia influenzando tutta la suddetta profilazione di espressione genica).
L’espressione guidata da HBR di pluripotenzialità ed orientamento di lineage all’interno della frazione vasculo stromale del derivato tissutale, quale quella del derivato tissutale definito “Lipogems†ha un impatto favorevole sulle dinamiche del tessuto del ricevente in quanto:
- un numero maggiore di elementi della frazione vasculo stromale sono orientati al lineage vascolare, o del miocardio, o neurale, o forniscono un aumento del rilascio di mediatori trofici con proprietà angiogeniche, antiapoptotiche e antifibrotiche;
- l’innesto progressivo del derivato tissutale, in particolare del prodotto “Lipogems†si traduce in un intreccio di segnali di salvataggio dal prodotto stesso e dal ricevente, promuovendo una profilazione cellulare per la sopravvivenza reciproca;
- la creazione di circuiti di sopravvivenza reciproca à ̈ la premessa per la sopravvivenza degli elementi orientati a lineage cellulari destinati alla sostituzione o la riparazione del tipo o dei tipi cellulari perduti all'interno del tessuto danneggiato del ricevente.
L’uso di HBR o di una miscela di acido ialuronico, retinoico e butirrico su materiale cellulare, in particolare sul prodotto “Lipogems†consente di ottenere un recupero ottimale di qualsivoglia tipo di tessuto danneggiato.
Il materiale cellulare precondizionato può essere utilizzato non solo per trapianti autologhi ma anche per trapianti in ambienti allogenici.
In particolare per il prodotto “Lipogems†umano non espanso à ̈ stato sottoposto a trapianto xenogenico in ratti sottoposti ad ischemia cronica degli arti posteriori.
Il trapianto à ̈ stato privo di effetti collaterali, à ̈ stato ben tollerato dai ratti riceventi.
Dopo 14 giorni, non si sono osservati segni di rigetto immunitario, né infiltrati infiammatori all'esame fisico e istologico.
Il trapianto xenogenico del prodotto “Lipogems†umano offre una rivascolarizzazione efficiente e un recupero funzionale nei ratti sottoposti ad ischemia cronica degli arti posteriori, anche con utilizzo del prodotto Lipogems crioconservato. Oltre alla rivascolarizzazione si assiste al mantenimento di un trofismo muscolare ottimale, risultato dipendente, all’esame istologico, da una neoformazione di fibre muscolari, verosimilmente a partenza da cellule satelliti del muscolo scheletrico.
I risultati sperimentali dimostrano che il derivato tissutale non espanso definito nella presente invenzione “Lipogems†, fresco o crioconservato, sottoposto a riprogrammazione epigenetica e modulazione trascrizionale per via chimica con le modalità oggetto della presente invenzione anche in trapianti allogenici, non ha portato al rigetto immunitario, né ha portato a risultati infiammatori locali o sistemici, e ha indotto una chiara rivascolarizzazione e riparazione del tessuto insieme con la normalizzazione della sua funzione.
Grazie a questi effetti il prodotto cellulare “Lipogems†costituisce un prodotto nuovo ed innovativo nel campo della terapia cellulare e della medicina rigenerativa.
Oggetto della presente invenzione à ̈ quindi anche materiale cellulare in particolare cellule staminali e/o multipotenti non embrionali ottenibili mediante un procedimento come sopra descritto e l’uso di dette cellule per la preparazione di un medicamento per la rigenerazione e/o la riparazione di un tessuto, umano o animale, da utilizzare a scopi terapeutici ed in medicina rigenerativa per trapianti autologhe o allogenici.
Oggetto della presente invenzione à ̈ altresì l’uso di composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide, per la preparazione di un medicamento comprendente elementi staminali e multipotenti non embrionali e/o cellule somatiche non embrionali per la rigenerazione e/o la riparazione di un tessuto, umano o animale, da utilizzare a scopi terapeutici ed in medicina rigenerativa per trapianti autologhe o allogenici.
Naturalmente l’invenzione non à ̈ limitata alle forme esecutive testé descritte ma può essere ampiamente variata.
Ad esempio à ̈ possibile prevedere di precondizionare chimicamente le cellule non solo all’interno di un contenitore ma anche in vivo ovvero direttamente sul paziente da trattare in modo da variare la potenza delle stesse già all’interno del tessuto in cui si trovano.
In questo caso la o le molecole od il composto contenente detta o dette molecole ossia acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR), acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), saranno applicate direttamente sulla o nella zona da trattare.
Il trattamento di un tessuto, in particolare di un tessuto danneggiato direttamente sul paziente prevede una o più delle seguenti fasi:
a) rimozione dell’ambiente tissutale ostile fibrotico ischemico e apoptotico associato alla inerente condizione di malattia mediante somministrazione, ad esempio iniezione nel tessuto di una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte, in particolare mediante somministrazione nel tessuto di un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide; ad esempio viene iniettato HBR, e/o una miscela di acido ialuronico e/o acido butirrico e/o retinico;
b) trapianto, in condizioni autologhe o allogeniche, con materiale cellulare precondizionato secondo la presente invenzione.
Preferibilmente il trapianto à ̈ eseguito con il derivato tissutale non espanso definito “Lipogems†precondizionato ex vivo (1-2 ore, o meno) con HBR, o una miscela di HA, BU, e RA.
Il materiale cellulare precondizionato ed utilizzato per il trapianto, in particolare il prodotto “Lipogems†precondizionato, può essere preparato fresco o crioconservato inizialmente.
Il materiale cellulare precondizionato ed utilizzato per il trapianto, in particolare il prodotto “Lipogems†precondizionato, può essere ottenuto da donatori vivi o da cadaveri, umani o animali.
Il materiale cellulare precondizonato ed utilizzato per il trapianto, in particolare il prodotto “Lipogems†precondizionato, può essere utilizzato per uso autologo o allogenico.
c) somministrazione nel materiale cellulare trapiantato secondo la fase b) e/o nel tessuto circostante di una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte, in particolare mediante somministrazione nel tessuto di un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
La fase c) costituisce una ottimizzazione posttrapianto in vivo della risposta tissutale e/o il potenziale salvataggio degli elementi multipotenti contenuti nella frazione vasculo stromale SFV del prodotto trapiantato “Lipogems†tramite iniezione nel tessuto di HBR, e/o una miscela di acido ialuronico, acido butirrico e/o retinico.
Nel complesso, l'iniezione pre-e post-trapianto di HBR, e/o la miscela di acido ialuronico e/o acido butirrico e/o retinico, aumenterà il potenziale di rigenerazione del materiale utilizzato per il trapianto, in particolare secondo una forma esecutiva della presente invenzione, aumenterà il potenziale di rigenerazione associato al prodotto “Lipogems†precondizionato, rafforzando il cross-talk di segnalazione tra il prodotto trapiantato e il tessuto ricevente, massimizzando l'azione di HBR o dell’acido ialuronico, acido butirrico e/o retinico, eventualmente rilasciati dallo stesso prodotto “Lipogems†precondizionato.
E’ stato dimostrato che il recupero del tessuto à ̈ correlato alla capacità di HBR di migliorare la densità capillare e la perfusione miocardica, di promuovere l'assunzione di cellule staminali mesenchimali endogene al sito del danno, di diminuire il numero di cardiomiociti apoptotici, di diminuire notevolmente il grado di tessuti danneggiati. Tali effetti positivi sono stati mediati a livello trascrizionale.
Secondo la presente invenzione à ̈ quindi possibile ottenere chimicamente non solo il precondizionamento, ossia una riprogrammazione epigenetica ed una modulazione trascrizionale, di cellule, derivati tissutali e/o tessuti da utilizzare per trapianti autologhi o allogenici ma anche il precondizionamento del tessuto ricevente con evidenti effetti benefici sul processo di guarigione.
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Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di precondizionamento chimico di materiale cellulare per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di sottoporre un derivato tissutale non espanso comprendente detti elementi staminali e multipotenti, e/o di sottoporre cellule staminali non embrionali e/o cellule somatiche non embrionali, ottenute da un campione di tessuto o da detto derivato, a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta o dette sostanze svolgono una o più delle seguenti funzioni: - aumento della acetilazione istonica, con conseguente rimodellamento della cromatina e una maggiore accessibilità del fattore di trascrizione ai domini di cromatina bersaglio; - aumento della trascrizione dei geni associati alla pluripotenzialità delle cellule staminali, quali Oct3/4, Nanog, Sox2 e altri membri di questa famiglia, Klf4; - aumento della trascrizione di diversi geni tessuto-specifici, insieme con i geni legati a pluripotenza, quali Mef2C, Tbx5, e geni coinvolti in cardiogenesi, come prodinorfina, Gata4, Nkx2.5, geni coinvolti in vasculogenesi, come VEGF, HGF, KDR, geni coinvolti in neurogenesi, come neurogenina1, geni che innescano l’orientamento verso isole beta pancreatiche, come neurogenina3, geni responsabili di un contesto di pro-sopravvivenza all'interno di un derivato tissutale, compresi Pim1 e Akt.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di miscelazione con un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
- 4. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che l’acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) à ̈ miscelato in un ampio range di dosi, preferibilmente, comprese tra 0,5 e 2,5 mg/l.
- 5. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detta miscelazione in vitro tra materiale cellulare con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica ha una durata preferibilmente compresa tra 1 o 2 ore, comunque modulabile in base alla ottimizzazione del differenziamento verso determinati lineage specifici.
- 6. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detta o dette sostanze di origine naturale o sintetica, quali acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o le sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), sono disciolte in soluzione fisiologica e/o in soluzioni tampone, e/o sono sottoposte a incapsulamento in contenitori biologici quali nanocapsule o nanofilm multistrato biodegradabili, contenitori nanocolloidali e/o costituiti da nanoparticelle o in qualsiasi altra entità nano-strutturata adatta ad ottenere il rilascio efficace di dette sostanze sia a livello intracellulare che a livello tissutale.
- 7. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: a) preparare un derivato tissutale non espanso a partire da una “manipolazione minima†, nonenzimatica, del tessuto di origine, quale lipoaspirato, essendo detto derivato inteso come costituito da aggregati di cellule del tessuto di origine, quali adipociti nel caso di lipoaspirato, circondati da una componente vasculo-stromale contenente cellule staminali e/o elementi multipotenti quali periciti e cellule staminali mesenchimali; b) in alternativa od in combinazione alla fase a), preparare una sospensione cellulare a partire da un campione di tessuto o dal derivato di cui alla fase a), recuperare le cellule staminali e/o le cellule somatiche adulte da detta sospensione cellulare; c) sottoporre dette cellule staminali e/o le cellule somatiche adulte del derivato tissutale od ottenute da un campione di tessuto o dal derivato di cui alla fase a), a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica, in particolare con un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che il tessuto comprende materiale adiposo estratto, ad esempio, tramite liposuzione/lipoaspirazione, la fase b) del procedimento prevedendo di trattare enzimaticamente il materiale adiposo per il rilascio delle cellule staminali e/o delle cellule somatiche dopo eventuale riduzione del tessuto adiposo in parti più piccole.
- 9. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che il tessuto comprende tessuto adiposo per trapianto ottenuto da materiale adiposo lobulare estratto, ad esempio, tramite liposuzione/lipoaspirazione, essendo il detto materiale adiposo costituito da una componente fluida comprendente una componente oleosa, una componente ematica e/o soluzioni sterili e da una componente solida comprendente strutture vasculo-stromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali, il procedimento prevedendo la fase di suddivisione del detto materiale adiposo in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati, in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculo-stromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro, la fase di sottoporre dette cellule/agglomerati a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica avvenendo per tutta la durata del procedimento o per solo una parte di esso o alla fine del procedimento.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che, in alternativa o in combinazione alla fase di suddivisione, prevede almeno una fase di lavaggio degli aggregati cellulari eseguito contestualmente ad una fase di separazione della componente fluida dalla componente solida, la fase di sottoporre dette cellule/agglomerati a miscelazione con una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica avvenendo per tutta la durata del procedimento o per solo una parte di esso o alla fine del procedimento.
- 11. Cellule staminali e/o multipotenti non embrionali ottenibili mediante un procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni.
- 12. Uso di cellule secondo la rivendicazione precedente per la preparazione di un medicamento per la rigenerazione e/o la riparazione di un tessuto, umano o animale da utilizzare a scopi terapeutici ed in medicina rigenerativa per trapianti autologhe o allogenici.
- 13. Uso di composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide, per la preparazione di un medicamento comprendente elementi staminali e multipotenti non embrionali e/o cellule somatiche non embrionali per la rigenerazione e/o la riparazione di un tessuto, umano o animale, da utilizzare a scopi terapeutici ed in medicina rigenerativa per trapianti autologhe o allogenici
- 14. Procedimento per il trattamento di un tessuto a scopo costruttivo o rigenerativo su paziente caratterizzato dal fatto di comprendere una o più delle seguenti fasi: a) rimozione dell’ambiente tissutale ostile, quale tessuto fibrotico, ischemico e apoptotico, associato alla condizione di malattia mediante somministrazione nel tessuto di una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte, in particolare mediante somministrazione nel tessuto di un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide; b) trapianto, in condizioni autologhe o allogeniche, di materiale cellulare precondizionato secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 9; c) somministrazione nel materiale cellulare trapiantato secondo la fase b) e/o nel tessuto circostante di una o più sostanze chimiche di origine naturale o sintetica per ottenere la riprogrammazione epigenetica chimica e l’espressione di pluripotenzialità di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali, e/o cellule somatiche adulte, in particolare mediante somministrazione nel tessuto di un composto comprendente acido ialuronico esterificato con acido butirrico e retinoico (HBR) e/o con un composto comprendente una o più delle sue frazioni quali acido ialuronico (HA), acido butirrico (BU) e acido retinoico (RA), essendo dette sostanze previste nel detto composto da sole od in combinazione con altre sostanze solide o liquide.
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