ITMI20000030A1 - Procedimento per la produzione di embrioni non umani di sesso predeterminato ad alto valore genetico - Google Patents
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Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
"Procedimento per la produzione di embrioni non umani di sesso predeterminato ad alto valore genetico”
CAMPO DELL'INVENZIONE
Il campo tecnico dell'invenzione è quello della fertilizzazione in vitro con materiale genetico selezionato, nel’ambito dell’industria zootecnica. TECNICA ANTERIORE
La vasta diffusione delle pratiche di fecondazione artificiale (FA) ha permesso all’industria zootecnica di rendere più efficienti i sistemi di produzione dei capi di allevamento selezionati per caratteristiche utili. Le tecniche di preselezione dei sessi rappresentano un ulteriore ottimizzazione di questo procedimento, i cui benefìci possono riguardare allevatori interessati o alla produzione di latte o alla produzione di carne o ad entrambi, controllando i capi che, a seconda delle esigenze, vengono allevati ed immessi sul mercato. Da una parte, infatti è possibile aumentare la selezione sulla linea femminile (per la produzione di latte) o su quella maschile (per la produzione di carne) e dall’altra, risulta anche possibile controllare e ridurre i difetti genetici legati al sesso.
La possibilità di dividere e selezionare il materiale seminale in base alla presenza di cromosomi sessuali diversi, procedimento spesso indicato come sessaggio, interessa il mondo zootecnico per i benefici relativi alla programmazione delle nascite di vacche da rimonta aziendale o di tori da introdurre in centri genetici. Solo con l’avvento della citofluorimetria a flusso, però, le metodiche di preselezione dei gameti maschili hanno avuto uno sviluppo standardizzabile ed un’utilità industriale.
Il citofluorimetro a flusso e' un sistema che consiste di uno o più raggi laser che attraversano il campione, di un sistema idrodinamico che immette le cellule del campione da analizzare in un flusso di un liquido isosmotico con il campione, di una serie di rilevatori di luce (fotodiodi e/o fotomoltiplicatori) e di un computer per l'analisi dei dati in tempo reale. L'analisi si basa sulla valutazione della luce emessa dalle cellule in esame una volta che incontrano sul loro percorso il raggio laser. Tali cellule vengono preventivamente colorate con fluorocromi, sostanze che emettono una particolare fluorescenza quando investite dalla luce coerente del laser. La fluorescenza viene amplificata dai fotomoltiplicatori ed analizzata da un software in grado di ottimizzare il segnale in uscita e di renderlo interpretabile. L’estrema sensibilità del citofluorimetro consente di misurare la diversa quantità di DNA presente negli spermatozoì X rispetto a quelli Y (differenza variabile a seconda della specie) usando coloranti quali il Bisbenzimide Hoechst 33342 che si lega alle regioni ricche di adenina e timidina del DNA.
In seguito, il "sorting” permette alle particelle che passano attraverso il flusso e che vengono caricate positivamente o negativamente, a seconda delle caratteristiche possedute e impostate all’inizio delle procedura di separazione attraverso la creazione di finestre (gates), di separare fisicamente cellule aventi caratteristiche quantitative di fluorescenza diverse. Due placche attirano infatti le particelle a seconda della loro carica e le deviano in due raccoglitori. Il materiale raccolto e separato può successivamente essere rianalizzato, re-immettendolo nel flusso per verificare l'efficienza della separazione.
Definendo il sorting in funzione della bimodalità della distribuzione di frequenza del contenuto di DNA degli spermatozoi (Johnson LA et al., 1989, Biol. Reprod. 41:199-203) e' possibile sia quantificare gli spermatozoi X ed Y che dividerli in due popolazioni, quella X e quella Y. La citofiuorimetria a flusso si e’ pertanto dimostrata valida, oltre che per l'analisi, anche per la separazione fisica degli spermatozoi (Garner D.L et al., 1983, Biol. Reprod. 28:312-321; Johnson L.A., 1991, Reprod. Dom. Anim. 26:309-314; Johnson L.A et al. 1989, Biol. Reprod. 41:199-203; Morell et al., 1988, Vet. Ree. 122:322-324), ma la sua bassa resa (107 spermi separabili in 1 ora) ne limita l'uso in ambito di fecondazione artificiale, dal momento che per ottenere una paillette di sperma bovino congelato, con una concentrazione adeguata all'uso in fecondazione artificiale, sarebbe necessaria un'intera giornata di sorting.
Nello studio del DNA degli spermatozoi risultano favoriti i citometri a flusso dotati di epi-illuminazione (frontale rispetto alle cellule) (Pinkel et al., 1982, Cytometry 1:1-9), mentre quelli con illuminazione ortogonale dovrebbero essere opportunamente modificati in modo tale da poter misurare la luce diffratta anche a 0 gradi (Johnson L.A. e Pinkel D., 1986, Cytometry 7:268-273) e non solo quella ritratta a 90 gradi come avviene solitamente. Infatti con i citofluorimetri ad illuminazione ortogonale la quantità' di luce rifratta a 90 gradi, comprendente la fluorescenza, e' maggiore nel caso che il raggio laser colpisca lo spermatozoo sulla superficie più larga, mentre e' minore nel caso che il laser colpisca lo spermatozoo sulla sua superficie stretta. Poiché’ le cellule immesse in un flusso acquisiscono un movimento rotatorio direttamente proporzionale alla velocità’ del flusso, è stato dimostrato che la posizione della testa degli spermatozoi, nel momento della intersecazione con il raggio laser, è prevalentemente con la parte sottile rivolta verso il rilevatore a 0 gradi, producendo una minore quantità di luce rifratta a 90 gradi e pertanto una minore fluorescenza (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). Basandosi la lettura citofluorimetrica sui livelli di fluorescenza, ne consegue che la semplice intersecazione delle cellule in una data posizione con il raggio laser, può compensare in difetto un diverso livello di fluorocromatizzazione. Tale problema non esiste per i citometri che utilizzano la epi-illuminazione (con sorgente luminosa ad arco incandescente), infatti in questo caso gli spermatozoi vengono illuminati longitudinalmente e non trasversalmente, pertanto non sussiste il problema dato dalla loro conformazione piatta (Pinkel D. et al., 1982, ibidem). Nel brevetto francese FR 2699678 è descritto un metodo di sessaggio, in cui il “sorting” delle cellule avviene senza caricamento elettrico delle stesse, quindi in condizioni che si discostano concettualmente da quanto descritto finora e che può essere effettuata sul citofluorimetro adottato in tal caso (PAS III, Partec). Nel brevetto inglese GB 2145112 è descritto un metodo di sessaggio mediante citofluorimetria a flusso, che sfrutta il caricamento elettrico degli spermatozoo effettuato in un liquido di trascinamento adatto.
Un metodo di sessaggio del seme mediante citofluorimetria a flusso, basato sullo stesso principio di separazione in base alla carica, è descritto nel brevetto europeo EP 471758, che utilizza un citometro a flusso del tipo Epics V {RTM, Coulter). La metodica di sessaggio proposta in questo brevetto, si basa su una serie di modifiche migliorative del citofluorimetro (riguardanti ad esempio l’ago della cella a flusso) tali da creare un flusso di cellule orientate con la superficie maggiore perpendicolare al raggio laser. Inoltre lo strumento con illuminazione ortogonale, viene modificato in modo tale da poter acquisire la fluorescenza anche dalla luce rifratta a 0 gradi (normalmente utilizzata solo per la valutazione dimensionale delle particelle), tramite l'applicazione di un fotomoltiplicatore al posto dei normali fotodiodi, non in grado di rilevare i bassi livelli di fluorescenza. Tali modifiche rispondono a quanto proposte in Johnson L.A. e Pinkel D., 1986, Cytometry 7:268-273. Le modifiche apportate, rendendo la lettura effettuata dall'apparecchio più sensibile, rendono più problematica la standardizzazione della metodica (soprattutto la modifica riguardante la punta dell'ago). Per questo motivo sono stati approntati una serie di protocolli per tentare di ridurre al minimo la variabilità delle rilevazioni, intervenendo da un lato per eliminare la rotazione degli spermatozoi (attraverso l'eliminazione delle code degli stessi) e dall'altro per rendere massima la decompattazione del nucleo per avere una più precisa misurazione dell’intensità di fluorescenza (Metezeau P., 1991, Molecular Reprod. and Develop. 30:250-257).
Finora quindi la vasta letteratura brevettuale e scientifica esistente in merito, conferma che i metodi e le apparecchiature utilizzate per il sessaggio del seme mediante citofluorimetria a flusso, sono oggetto di continui adattamenti e perfezionamenti in vista di una sempre maggiore standardizzazione e ripetibilità dei risultati, avendo comunque tutte in comune l’utilizzo di materiale seminale fresco.
SOMMARIO
Il procedimento descritto nella presente domanda di brevetto consente di effettuare il sessaggio mediante citofluorimetria a flusso su seme congelato. Il nuovo metodo è caratterizzato da specifiche e critiche condizioni di colorazione, separazione e raccolta, che permettono una efficiente fecondazione in vitro (IVF: In Vitro Fertilization) per la produzione di embrioni di specie mammifere non umane (quali bovini, bufali, equini, ovini suini, roditori) del sesso prescelto e ad alto valore genetico, in quanto derivanti da gameti selezionati in base a caratteristiche genetiche di particolare utilità nell’industria zootecnica. Nel procedimento della presente invenzione il liquido seminale, selezionato in base alle caratteristiche genetiche dell’animale, viene congelato secondo le procedure stabilite dall'Unione Europea e può essere trasportato, dovunque sia industrialmente utile ed economicamente vantaggiosa la produzione di embrioni ad alto valore genetico. Secondo il metodo della presente invenzione il seme congelato viene rapidamente scongelato e colorato con fluorocromo di Hoechst 33342, in condizioni tali da mantenere massima la vitalità degli spermatozoi e viene quindi separato mediante citofluorimetria a flusso, in due sottopopolazioni di spermatozoi, una che porta il cromosoma Y ed una che porta il cromosoma X. A seconda delle caratteristiche genetiche di utilità per il centro di allevamento, viene quindi utilizzato Cuna o l’altra delle due sottopopolazione per la fecondazione in vitro di oociti appartenenti alla stessa specie degli spermatozoi e per la produzione di embrioni ad alto valore genetico, di sesso predeterminato. DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: citogramma di fluorescenza a 0 e 90 gradi. In figura 1 è rappresentato il citogramma di fluorescenza a 0 e 90 gradi con evidenziata la regione di nostro interesse.
Figura 2: istogramma di fluorescenza a 90 gradi. In figura 2 è rappresentato Cistogramma di fluorescenza a 90 gradi. E’ visibile il gate che permette di valutare solamente gli spermatozoi colpiti dal raggio laser sulla superficie più larga e pertanto con FL1 maggiore.
Figura 3: istogramma di fluorescenza a 0 gradi. In figura 3 è rappresentato Cistogramma di fluorescenza a 0 gradi degli spermatozoi con FL1 maggiore. Sono evidenziabili i due picchi la cui differenza in contenuto di DNA è pari al 3.9% nella specie bovina.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
E’ stato ora trovato, ed è oggetto della presente domanda di brevetto, un metodo che consente di effettuare il sessaggio mediante citofluorimetria a flusso su seme congelato. Il nuovo metodo è caratterizzato da specifiche e critiche condizioni di colorazione, separazione e raccolta, che verranno di seguito dettagliatamente illustrate. Il seme sessato nelle condizioni descritte nella presente domanda di brevetto, è dotato di una capacità fecondante utile per una efficiente fecondazione in vitro (IVF: In Vitro Fertilization) e per la produzione di embrioni di specie mammifere non umane (quali bovini, bufali, equini, ovini suini, roditori) del sesso prescelto e ad alto valore genetico, in quanto derivanti da gameti selezionati in base a caratteristiche genetiche di particolare utilità nell'industria zootecnica. E’ evidente che il nuovo processo costituisce un notevole progresso tecnico, in quanto consente di impiegare in qualsiasi paese ed in qualsiasi momento, un seme delle caratteristiche desiderate senza le limitazioni di tempo e di luogo derivanti dalla necessità di impiegare seme fresco.
Preferibilmente il metodo dell'invenzione viene applicato alla specie bovina, ma può essere vantaggiosamente esteso a tutte le specie mammifere di allevamento, quali ovini, suini, equini, roditori.
Nel metodo della presente invenzione, il liquido seminale, raccolto nei Centri di Produzione del Seme da capi selezionati in base alle caratteristiche genetiche (ad esempio da tori, padri genetici di vacche in cui la produzione di latte è maggiore o in cui sia stata verificata l’assenza di malattie genetiche legate al sesso mediante metodiche note al tecnico del ramo), viene congelato in “paillettes” da 0.25-0.5 mi, secondo le procedure ufficialmente riconosciute dall’Unione Europea. Così conservato, il seme è trasportato, a temperatura costante e controllata, dovunque sia industrialmente utile ed economicamente vantaggiosa la produzione di embrioni ad alto valore genetico, quindi sostanzialmente senza vincoli geografici, nei vari centri di allevamento bestiame.
Secondo il metodo dell’invenzione il seme congelato, viene rapidamente scongelato in bagnetto termostatato, preferibilmente a 37°C per due minuti, diluito in una soluzione di tampone citrato, fino ad ottenere una concentrazione di spermatozoi pari a 20x10<6>/ml. Per soluzione di tampone citrato si intende una soluzione di seguente composizione: 109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico, in H20.
Nel metodo secondo l’invenzione, viene utilizzato materiale scongelato avente una motilità progressiva (percentuale di spermatozoi con VAP > 25 μm /sec e STR > 0.8), uguale o superiore al 40 %, secondo i parametri indicati dalla WHO (World Health Organization, 1992, Laboratory manual for thè examination of human semen and spermcervical mucus interaction).
Gli spermatozoi sono quindi colorati con il colorante vitale Bisbenzimide Hoechst 33342, in condizioni tali da mantenere ottimale la vitalità degli spermatozoi, ottenute aggiungendo il colorante ad concentrazione finale di almeno 100 μg/ml e per un tempo non superiore a 20’, ad una temperatura compresa tra 30°C e 38°C, preferibilmente per un tempo di 15’ ad una temperatura di 35°C. Opzionalmente, dopo la colorazione, gli spermatozoi possono essere trattati con soluzioni di lavaggio o con soluzioni di diluizione del colorante. Nel metodo dell’invenzione, al campione viene aggiunto tampone citrato in rapporto 1:3. Il sessaggio degli spermatozoi viene effettuato mediante citofluorimetria a flusso, su apparecchiature modificate secondo quanto descritto in Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7:268-273, quali ad esempio lo strumento Epics V (Coulter). Nel metodo dell’invenzione il citometro a flusso è preferibilmente il FACS-Vantage (Becton Dickinson), modificato con kit standard aggiuntivo che rispecchia le modifiche proposte da (Johnson L.A., Pinkel D. (1986) Cytometry 7:268-273) ed è equipaggiato di laser, di rivelatore consistente in un fotomoltiplicatore per la rilevazione della fluorescenza a 0° e di opportuni filtri. Il campione viene fatto fluire nel citofluorimetro in una soluzione TALP Ca<++ >FREE senza aggiunta di BSA, utilizzato come liquido di trascinamento o “sheath fluid". Per soluzione TALP Ca<++ >FREE è intesa una soluzione di composizione: NaCI 6000 mg, KCI 230 g, Na2HP0440 mg, MgCI2-6H20310 mg, Hepes 4760 mg, lattato di sodio 60% 3700 μΙ, Kanamicina 75 mg, piruvato di sodio 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4 ; mOsm=284.
Il flusso degli spermatozoi viene mantenuto pari a circa 1500 cellule/sec. L'entità della fluorescenza è proporzionale al contenuto di DNA di ogni gamete, maggiore negli spermatozoi che portano il cromosoma X rispetto a quelli che portano il cromosoma Y. Tale differenza è variabile nelle diverse specie di mammifero ed è comunque apprezzabile dallo strumento nelle condizioni descritte. Il rilevamento della fluorescenza assorbita avviene facendo passare singolarmente ogni spermatozoo attraverso un canale illuminato con luce UV di lunghezza d’onda preferibilmente compresa tra 333-364 nm, e rilevando il segnale acquisito su due diversi fotomoltiplicatori (FL1, FL2, FL3).
La lettura del segnale di fluorescenza emesso dai campioni viene effettuata mediante software CellQuest, adattato al sistema operativo MacOS 7.5.3 che acquisisce ed analizza i dati, e lo sperma, separato nelle due popolazioni X e Y in tampone TALP Ca<++ >FREE, viene raccolto in provette rivestite di BSA, ottenute preferibilmente mediante incubazione delle stesse in una soluzione di TALP Ca<+ >FREE, contenente il 5% di BSA, per almeno 8 ore.
Gli spermatozoi cosi raccolti vengono concentrati, ad esempio mediante centrifugazione a 400xg ed utilizzati per la fecondazione in vitro (IVF), effettuata su oociti primari non maturi (non ovulati) raccolti ad esempio mediante “ovum pick-up” in vivo, o da animali macellati da poco, maturati in vitro in terreni adatti, diversi a seconda della specie degli oociti, quali il terreno M199 additivato con ormoni e siero fetale bovino, o con altri sieri o fattori di crescita dipendenti dalla specie animale e che sono comunque noti al tecnico del ramo, ed in condizioni di temperatura ed atmosfera controllate. Gli oociti così maturati possono essere trattati, ad esempio con jaluronidasi, per eliminare cellule contaminanti o di rivestimento dell’oocita. La fecondazione avviene secondo metodi noti al tecnico del ramo: in particolare viene preferita la metodologia descritta in Galli C et al in: Atti XXIX Simposio Internazionale di Zootecnia: Animal production and Biotechnology, 1994, 185-189, in cui gli oociti vengono incubati in un terreno adatto alla capacitazione degli spermatozoi ed alla fecondazione con gli spermatozoi sessati ad un rapporto oociti/spermatozoi di 1/5000 in un volume finale di 50 μl per 18 ore in incubatore a C02 5%/aria, in terreno nutritivo adatto allo sviluppo dell’embrione, fino al raggiungimento dello stadio di blastocisti. Preferibilemente il terreno di sviluppo dell’embrione è il terreno SOF, di composizione: CaCI22H2O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI 580 mg, KCI 53.84 mg, KH2P04 16.2 mg, NaHC03220 mg, piruvato di sodio 3.6 mg, Hepes 476 mg, Penicillina 6.3mg, Streptomicina 5 mg, lattato di sodio 60% 47 μl, D-glucosio 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutammina 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 mi, Essential aminoacids 2 ml, H20 sterile 97 ml; pH 7.2 , mOsm=280. Lo zigote viene quindi messo a crescere in un sistema di co-coltura con cellule somatiche, che possono essere diverse a seconda della specie di provenienza degli oociti. Nel procedimento della presente invenzione, la co-coltura dell’oocita, bovino, fecondato è effettuata in presenza di un tappeto di cellule ottenute dall'epitelio tubarico di una bovina. Alternativamente, lo zigote può essere coltivato in terreno sintetico in sospensione. L’embrione così ottenuto può essere congelato o essere direttamente re-impiantato in madri surrogate per le fasi successive di sviluppo. Alternativamente, lo zigote può essere analizzato per la verifica del sesso.
Si è del tutto inaspettatamente trovato che impiegando il metodo della presente invenzione si ottengono embrioni di specie mammifere non umane, con buona efficienza, anche partendo da seme congelato.
PARTE SPERIMENTALE
La presente invenzione viene qui descritta secondo i seguenti esempi intesi a scopo illustrativo e non limitativo.
Strumentazione
Il FACS-Vantage (BD) è equipaggiato con i seguenti accessori: 1) Laser: primo laser: Coherent Innova 300C ad argon con filtri per l'emissione a 333.6-363.8 nm, raffreddato ad acqua, secondo laser: Coherent Innova 70 Spectrum basato su una miscela di gas (kripton ed argon) con filtri per emettere nella luce visibile, raffreddato ad acqua; 2) Rivelatori: un fotomoltiplicatore (PMT) per la rilevazione della fluorescenza a 0 gradi (FL2) in sostituzione del fotodiodo, quattro fotomoltiplicatori Hamamatsu per la rilevazione a 90 gradi dello scatter (SS) e di tre fluorescenze contemporaneamente (FL1, FL2, FL3); 3) Filtri: filtro dicroico scatter 8/90, filtro band pass scatter 488/10, dicroico 560 short pass, filtro band pass 424/44 per FL1 (UV), filtro band pass 424/44 per FL2 (UV); 4) Software: CelIQUEST per l'acquisizione e l'analisi dei dati, su sistema operativo MacOS 7.5.3.
L’apparecchio è modificato mediante:
1. kit standard aggiuntivo: Fotomoltiplicatore Forward Scatter, che permette la sostituzione del fotodiodo che raccoglie il segnale luminoso a 0 gradi (forward scatter) con un fotomoltiplicatore in grado di raccogliere e completare tutte le informazioni della fluorescenza emessa dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser.
2. installazione dell’ago modificato che permette di orientare una quantità maggiore degli spermatozoi nello stesso verso. L’installazione dell’ago ha previsto il suo inserimento all’interno di una nuova testa: MacroSORT™ head con modificazioni anche del sistema idraulico ed elettronico.
Le modifiche descritte al FACS Vantage rispecchiano quanto proposto da Johnson LA and Pinkel D in Cytometry 7:268-273, 1986 e sono commercialmente disponibili come kit aggiuntivi per il FACS Vantage. Questa metodica modificata permette di ottenere un citogramma in cui si evidenziano varie sottopopolazioni di spermatozoo ottenute in seguito al diverso orientamento assunto dagli spermatozoi nel loro scorrimento davanti al raggio laser. La sottopopolazione di nostro interesse è quella che, essendo composta dagli spermatozoi che incrociano il raggio laser perpendicolarmente, permette una analisi più accurata della bimodalità dovuta al diverso contenuto di DNA. In figura 1 sono riportati i citogrammi FL2 (fluorescenza “forward scatter")/FL1 ottenuti per selezionare la regione con più alta fluorescenza in FL1. In figura 2 e 3 sono invece riportati gli istogrammi della fluorescenza in FL1 ed FL2, effettuati sulla regione precedentemente selezionata per la verifica della bimodalità della distribuzione. In figura 3 vengono evidenziate le due sottopopolazioni di spermatozoi che vengono poi separate fisicamente. La finestra utile per il sortaggio è quella che seleziona le due code dell'istogramma bimodale della fluorescenza in FL2: la coda a sinistra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma Y (< contenuto di DNA, <fluorescenza), mentre quella a destra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma X (> contenuto di DNA, > maggiore fluorescenza).
Soluzioni utilizzate.
Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg/ml): Tyrode's solution 400μl, Hoechst 33342 (Sigma) 2 mg. Aliquotato in Eppendorf e conservato a -20°C.
Sterilizzata con filtro 0.22 μm piu' prefiltro. Aliquotata in 1 mi stock e conservata in azoto liquido.
TALP Ca<+ >FREE: NaCI 6000 ma. KCI 230 mg, Na2HP04 40 mg, MgCI2-6H20 310 mg, Hepes 4760 mg, lattato di sodio 60% 3700 μΙ, Kanamicina 75 mg, piruvato di sodio 110 mg, PVA 1000 mg, NaHC03 420 mg, NaOH 420 mg, H20 sterile 1000 ml; pH 7.4 ; mOsm=284. Aliquotata in 25 mi stock e conservata a 4°C.
TALP wash: NaCI 7300 mg, KCI 235 mg, Na2HP04 47 mg, MgCI2-6H20 100 mg, NaHC03 168 mg, Hepes 2380 mg, lattato di sodio 60% 1900 μl, Kanamicina 75 mg, piruvato di Sodio 110 mg, CaCI2-2H20 390 mg, BSA fraz.V 6000 mg, H2O sterile 1000 ml; pH 7.5, mOsm=280. Aliquotata in 25 ml stock e conservata a 4°C.
SOF: CaCI, 2H,O 25.1 mg, MgCI2-6H2O 10 mg, NaCI580 mg, KCI 53.84 mg, KH2PO4 16.2 mg, NaHCO3 220 mg, piruvato di sodio 3.6 mg, Hepes 476 mg, Penicillina 6.3 mg, Streptomicina 5 mg, lattato di sodio 60% 47 μl, D-glucosio 27 mg, BSA fraz. V (fatty acid free) 1600 mg, Glutammina 14.6 mg, Non essential aminoacids 1 ml, Essential aminoacids 2 ml, H2O sterile 97 ml; pH 7.2 , mOsm=280. Sterilizzata con filtro 0.22 μm piu’ prefiltro. Aliquotata in 0.5 mi stock e conservata in azoto liquido.
Lacmoide 1%: Lacmoid 100 mg, H20 sterile 5.5 ml, Acido acetico glaciale 4.5 ml. Filtrata con filtro 0.8 pm.
Esempio 1: Prove di vitalità e di diluizione dei campioni dopo colorazione con Hoechst 33342.
Sono state provate varie concentrazioni di Bisbenzimide Hoechst 33342: 5 μg/ml finali, 10 μg/ml finali e 100 pg/ml finali, con i tempi di incubazione di 15, 60, 120, 240 e 300 minuti e<1 >stato evidenziato che con 100 μg/ml. E’ stata valutata la vitalità di spermatozoi scongelati secondo quanto descritto nell'esempio 2, dopo i diversi tempi di incubazione alle diverse concentrazioni finali di colorante: la vitalità risulta massima dopo una colorazione di 15 minuti con 100 μg/ml di Bisbenzimide Hoechst 33342.
Il campione di spermatozoi colorati è stato quindi diluito con diverse soluzioni quali: PBS, Tyrode's solution ed un tampone citrato (109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico). Solo quest'ultimo si e’ dimostrato in grado di dissolvere il mestruo di congelamento permettendo la migliore definizione delle popolazioni da valutare.
Come liquido di trascinamento sono state testate diverse soluzioni come PBS, Tris pH 7 e TALP Ca<++ >free pH 7.4: si e’ evidenziato che quest'ultima dava buoni risultati sia dal punto di vista di stabilita’ di flusso che di vitalità degli spermatozoi, ma soprattutto non interferiva nella fase di fertilizzazione in vitro (IVF) in cui viene sempre utilizzata TALP.
Il liquido di trascinamento (TALP Ca<++ >free pH 7.4) ed il tampone citrato non vengono additivati con BSA, migliorando in tal modo la stabilità del flusso e conseguentemente la correttezza del "sorting”. In presenza di BSA infatti sono evidenziabili spermatozoi con teste attaccate (doppiette) indice di alterazioni della membrana cellulare, che non sono evidenziabili senza di BSA.
Per il recupero degli spermatozoi sortati sono state confrontate due modalità di raccolta: in provette con mestruo a base di Tris e tuorlo d’uovo con e senza BSA o in provette rivestite (saturate) di BSA mediante incubazione per una notte con TALP Ca<++ >free pH 7.4 addizionata di BSA al 5%. I risultati migliori sono stati ottenuti raccogliendo gli spermatozoi in TALP Ca<++ >free pH 7.4, in provette saturate con BSA che mantiene ottimale la vitalità degli spermatozoi e che non interferisce nelle successive fasi della ÌVF, contrariamente ai metodi dell’arte nota (ad es. con mestruo a base di Tris e tuorlo d’uovo con e senza BSA) che, pur conservando una buona vitalità degli spermatozoi, non permetteva un facile recupero degli stessi nelle prime fasi della fecondazione in vitro (IVF).
Esempio 2: Sessaggio del seme e separazione delle sottopopolazioni recanti il cromosoma X ed Y.
Preparazione dei campioni scongelati.
Il materiale seminale bovino congelato viene scongelato in bagnomaria termostatato a 37°C per 2 minuti ed una aliquota di almeno 200 spermatozoi viene valutata, per quanto riguarda i parametri cinetici con il sistema CASA Hamilton Thorne mod. IVOS cosi’ settato: FRAME ACQUIRED=30, MINIMUM CONTRAST= 5 , MINIMUM CELL SIZE=25, THRESHOLD STRAIGHTNESS=80, MEDIUM VAP CUT-OFF=25.0, LOW VAP CUT-OFF=24.9, LOW VSL CUT-OFF=20.0, NON MOTILE HEAD SIZE=60, NON MOTILE HEAD INTENSITY=50, 0.19 < STATIC SIZE LIMITS < 5.55, 0.52 < STATIC INTENSITÀ LIMITS < 10.00, 0 < STATIC ELONGATION LIMITS < 60.
Il seme è stato passato in citofluorimetria a flusso (sessato) solo se avente una motilità' progressiva (percentuale di spermatozoi con VAP > 25 μm/sec e STR > 0.8), superiore al 40 %, secondo i parametri indicati da World Health Organization.
Il seme è stato diluito in un tampone citrato (109 mM Sodio Citrato Tribasico Biidrato e 2.4 mM Acido Citrico) fino ad ottenere una concentrazione di spermatozoi pari a 20x10<6>/ml. Viene aggiunta un’aliquota di Bisbenzimide Hoechst 33342 (5 mg/ml in Tyrode's solution) per ottenere una concentrazione finale dello stesso di 100 μg/ml. Il campione viene poi incubato a 35°C per 15 minuti. Per la valutazione della fluorescenza e la successiva separazione degli spermatozoi, il campione viene fatto fluire nello strumento utilizzando, come liquido di trascinamento, TALP Ca<++ >free pH 7.4 senza aggiunta di BSA.
Analisi della fluorescenza
Mediante un laser ad argon Innova 300C impostato a potenza di 150 mW, gli spermatozoi fluorocromatizzati vengono quindi eccitati con luce ultravioletta a 333.6-363.8 nm.
Dalle cellule fatte fluire alla velocità di 1500-2000 cellule/sec, si procede con l'acquisizione della fluorescenza emessa, sia a 0 gradi che a 90 gradi, i dati vengono acquisiti in citogrammi ed istogrammi a 1024 canali, valutando in modo particolare:
a) il citogramma FL1 (fluorescenza a 90 gradi) / FL2 (fluorescenza a 0 gradi) per selezionare la regione con maggiore fluorescenza in FL2 (spermatozoi che fluiscono davanti al raggio laser con la superficie maggiore).
b) l’istogramma della fluorescenza in FL2 della sottopopolazione precedentemente definita per la verifica della bimodalità.
In questo modo e’ possibile raccogliere ed integrare tutte le informazioni della fluorescenza emessa nelle diverse direzioni dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser con la superficie maggiore (di piatto).
In questo modo e’ possìbile raccogliere ed integrare tutte le informazioni della fluorescenza emessa nelle diverse direzioni dagli spermatozoi incrocianti il raggio laser con la superficie maggiore (di piatto).
La definizione delle sottopopolazioni da sodare avviene mediante gates che selezionano le due code dell'istogramma bimodale della fluorescenza in FL2: la coda a sinistra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma Y (minore contenuto di DNA e quindi minore fluorescenza) mentre la coda a destra corrisponde agli spermatozoi con cromosoma X (maggiore contenuto di DNA e quindi maggiore fluorescenza).
Raccolta delle sottopopolazioni Xe Y di spermatozoi.
Gli spermatozoi sortati secondo la procedura descritta in precedenza, e raccolti in provette rivestite di BSA, vengono poi concentrati tramite centrifugazione a 400xg per 10 minuti e, dopo l’eliminazione del surnatante, viene misurato il volume del pellet.
Esempio 3: Verifica del sessaggio del seme.
La verifica del sessaggio del seme e' stata effettuata sul materiale sodato con rianalisi citofluorimetrica o con metodi genetico-molecolari. Nel primo caso il materiale sodato raccolto viene rianalizzato tramite citofluorimetria a flusso e, tramite software, e' possibile sovrapporre gli istogrammi della fluorescenza FL2 ottenuta dagli spermatozoi X ed Y.
E’ stato inoltre utilizzato un approccio basato su PCR (polymerase Chain reaction) di tipo quantitativo. Tale sistema si basa sull'amplificazione di almeno due frammenti di DNA, uno posto su un cromosoma autosomico (sempre presente negli spermatozoi) e l'altro posto solo sul cromosoma sessuale. Dopo l'amplificazione dei marcatori fluorocromatizzati frammenti viene eseguita una elettroforesi che consente di discriminarli in base alla loro velocità di spostamento in un gel di agarosio a cui e’ applicata una data differenza di potenziale. Alla fine della corsa elettroforetica i frammenti vengono colorati e fotografati. Il frammento di DNA relativo al cromosoma autosomico sarà sempre presente, mentre quello legato al cromosoma sessuale sarà tanto più evidente quanto maggiore e’ la quantità di spermatozoi X o Y presente nel campione. Questo e’ un aspetto molto importante da considerare infatti, con il sessaggio del seme, e’ possibile raggiungere un livello di "arricchimento" di spermi di un dato sesso non inferiore al 75%.
I risultati ottenuti con entrambi i metodi dimostrano che l'arricchimento degli spermatozoi recanti il cromosoma X o quello Y è sempre superiore o uguale al 75%.
Esempio 4: Fecondazione in vitro e crescita preimpianto deali ovociti fecondati.
La fecondazione in vitro degli ovociti maturati in vitro è stata effettuata sostanzialmente come descritto in: Galli C., Aleandri R., Lazzari G. (1994). Atti del XXIX Simposio Internazionale di Zootecnia: Animai production and Biotechnology, 185-189. Da 500 μl di soluzione per IVF, lasciata ad equilibrare in incubatore a C02 5% a 38°C per un minimo di 30 minuti, viene prelevata un'aliquota, pari al volume del pellet di spermatozoi sessati e precedentemente misurato (Esempio 2), che viene sostituita dallo stesso. Con tale soluzione si preparano gocce da 50 μl che vengono poi ricoperte con olio minerale caldo, precedentemente messo ad equilibrare in incubatore a CO2 5% a 38°C per circa una notte. In ognuna di queste gocce vengono posti 5 ovociti maturi e denudati, mediante jaluronidasi, del cumulo ooforo.
Dopo incubazione in incubatore a CO25% a 38°C per 18 ore, gli ovociti vengono posti in TALP wash e liberati dagli spermatozoi e dalle cellule della corona radiata tramite azione meccanica con vortex.
Alcuni di tali ovociti fecondati vengono posti su di un vetrino lavato in etanolo e vengono poi chiusi con un vetrino coprioggetto, per verificare ('avvenuta fecondazione. Dopo una notte in fissativo (etanolo:acido acetico 3:1), i vetrini vengono colorati con Lacmoide 1% per capillarità’ e subito risciacquati con acido acetico 45%. In tal modo e' possibile verificare al microscopio l’avvenuta fecondazione tramite la ricerca dei due pronuclei (maschile e femminile) e della coda dello spermatozoo penetrato o, nel caso l’ovocita non sia stato fecondato, l’avvenuta maturazione dello stesso attraverso la presenza di una metafase con un globulo polare.
Dopo la fase di fecondazione e il denudamento degli ovociti con vortex, si procede alla messa in coltura degli stessi in medium SOF. Per tale pratica, un giorno prima occcorre preparare in opportuni contenitori (four-wells) due microgocce da 20μl di tale medium ricoperte di olio minerale. Queste devono essere quindi poste ad equilibrare per un giorno in incubatore a ad una temperatura di 38°C. Gli ovociti denudati vengono quindi posti nella prima goccia di lavaggio e solo quelli non ancora divisi (quelli eventualmente in divisione dopo 18 h indicano un’attivazione partenogenetica) vengono subito trasferiti nella seconda goccia in numero di circa 20 per goccia e riposti in incubatore ad 02. Il giorno seguente è già possibile osservare la prima divisione degli ovociti fecondati (CLEAVAGE) e quelli non divisi vengono spostati nella goccia laterale di lavaggio. Due giorni dopo si procede alla sostituzione del medium aggiungendo alla goccia di coltura 20μΙ di SOF equilibrata in incubatore e aspirandone poi un uguale quantitativo. Dopo ulteriori due giorni di coltura in medium SOF, questo viene sostituito con lo stesso procedimento con medium M199 sempre con l'accortezza di averlo lasciato ad equilibrare. Tale medium supporterà lo sviluppo degli embrioni fino allo stadio di blastocisti che viene raggiunto nei due successivi giorni.
I risultati delle IVF effettuate sono riportate nella tabella X.
Tabella X
N. spermatozoi/ovocita N. ovociti N. ovociti fecondati % fecondazioni Spermi X 34 12 35.3 Spermi Y 35 14 40.0
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1) Procedimento per la produzione di embrioni di sesso predeterminato e ad alto valore genetico, derivati da gameti di specie mammifere non umane, caratterizzato dal comprendere le fasi di: a) congelamento di una soluzione contenente spermatozoi b) scongelamento di detta soluzione, c) colorazione degli spermatozoi con fluorocromo Bisbenzimide di Hoechst 33342, d) separazione degli spermatozoi mediante citofluorimetria a flusso, in una sottopopolazione di spermatozoi contenenti il cromosoma X ed in una di spermatozoi contenenti il cromosoma Y, e) fecondazione in vitro di oociti, derivati da specie compatibili con gli spermatozoi separati, con una o con l’altra delle due sottopopolazioni, f) incubazione degli oociti fecondati in terreno di crescita.
- 2) Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il passaggio b) di scongelamento viene ottenuto in un tempo non inferiore o uguale a 2 minuti e ad una temperatura di 37°C.
- 3) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il passaggio b) di scongelamento viene seguito da una diluizione della soluzione contenente gli spermatozoi per ottenere una concentrazione di spermatozoi non inferiore a 20X10<6 >spermatozoi/ml.
- 4) Procedimento secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che detta diluizione viene effettuata con una soluzione di tampone citrato.
- 5) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il passaggio c) di colorazione viene effettuato su spermatozoì aventi una motilità progressiva uguale o superiore al 40 %, secondo i parametri WHO.
- 6) Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il passaggio c) di colorazione con fluorocromo Bisbenzimide di Hoechst 33342 viene effettuato ad una concentrazione finale di fìuorocromo di Hoechst 33342 di almeno 100 μg/ml, in un tempo non superiore a 20 minuti, ad una temperatura compresa tra 30°C e 38°C.
- 7) Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il tempo di colorazione è di 15 minuti e la temperatura è di 35°C.
- 8) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il passaggio d) di separazione degli spermatozoì mediante citofluorimetria a flusso, viene effettuato su FACS Vantage (Becton-Dickinson) equipaggiato con kit standard aggiuntivo.
- 9) Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che nella fase d) di separazione il liquido di scorrimento è un terreno utilizzato per la fecondazione in vitro esente da proteine.
- 10) Procedimento secondo la rivendicazione 9), caratterizzato dal fatto che tale liquido è TALP Ca<++ >FREE. 11) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le specie mammifere non umane sono scelte nel gruppo di: ovini, bovini, bufali, equini, caprini, suini, roditori.
- 11) Procedimento secondo la rivendicazione 10), caratterizzato dal fatto che la specie mammifera non umana è quella bovina.
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