ITMI20062448A1 - Metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio dell¿ aspergillosi invasiva - Google Patents

Description

2 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL

Descrizione dell'invenzione industriale a nome dell'Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia con sede in Via Università 4, 41100 Modena (MO)

* ;STATO DELL’ARTE ;Le infezioni fungine invasive (IFI) rappresentano una rilevante causa di morbidità e mortalità nei pazienti affetti da emopatie maligne, non soltanto sottoposti a trapianto di midollo allogenico, ma anche sottoposti a chemioterapia standard. Il rischio di morte dei pazienti affetti da IFI raggiunge anche percentuali del 90%. ;L’agente eziologico maggiormente responsabile delle IFI è rappresentato da funghi della specie Aspergillus, che tiene conto di quasi il 90% di tutte le infezioni invasive. Le cause di una mortalità così elevata risiedono nella mancanza di metodiche diagnostiche che permettano una diagnosi di Aspergillosi Invasiva (IA). Gli strumenti a disposizione dell’ematologo clinico sono infatti limitati da invasività, lentezza, bassa sensibilità, mancanza di standardizzazione e cinetica variabile (Hope WW 2005; Mennink-Kersten M 2004; Patterson TF 2005). ;Le metodiche attualmente in uso per la diagnosi di aspergillosi invasiva sono ad oggi l’esame istologico, la tomografia assiale computerizzata ad alta risoluzione del torace (HRCT), gli esami colturali, esami sierologici (galattomannano, 1-3-beta-glucano) e la reazione polimerasica a catena per acidi nucleici fungini (PCR). ;Solo l’esame istologico e quello colturale danno tuttavia la certezza assoluta che si tratti di IA, ma hanno limiti di invasività e bassa sensibilità 3 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;(positivi in una percentuale minore di circa il 30%). La HRCT non è specifica mentre il GM ha una sensibilità estremamente variabile (in un intervallo tra il 30% e il 100%) in quanto influenzato da numerosi fattori, che ne limitano l’applicazione, tra i quali l’utilizzo della profilassi antifungina e/o la dieta dei pazienti. Sia il beta-glucano che la PCR mancano ancora di standardizzazione ed hanno una cinetica completamente non prevedibile. ;Inoltre, la rilevazione del DNA dell’Aspergillus attraverso PCR è impedita dalle difficoltà di comprensione del rilascio e della cinetica del DNA fungino oltre che da barriere di tipo tecnico (Hope WW, Denning DW. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis 2005; 5: 609-622). ;Studi recenti, dapprima in ambito murino, poi anche nell’uomo, hanno dimostrato che l’immunità adattattiva, ovvero quella rappresentata dalle cellule T, svolge un ruolo preponderante nelle difese dell’ospite contro i funghi (Cenci E 1997; Hebart H 2002; Romani L 2004). In particolare, un’immunità cellula-mediata polarizzata a cellule T helper di tipo 1 (TH1), produttrice di interferone gamma (IFN-γ) risulta protettiva nei confronti di infezioni fungine, specialmente IA; mentre un’immunità cellula-mediata polarizzata a cellule T helper di tipo 2 (TH2), produttrice di interleuchina 10 (IL-10) risulta permissiva nei confronti di IA (Cenci E 1997; Hebart H 2002; Romani L 2004). ;La metodica ELISPOT (ElisaSpot o Enzyme-linked ImmunoSpot Assay) si è dimostrata uno strumento sensibile e specifico nella diagnosi di infezione da micobatterio della tubercolosi o in infezioni di origine virale sia in 4 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;soggetti immunocompetenti che in soggetti immunodepressi (Lalvani 2001), mediante la ricerca di cellule T specifiche per il micobatterio, o per l’isolamento di cellule T specifiche per il virus di Epstein-Barr in pazienti sottoposti a trapianto di rene (Comoli 2002). ;ELISPOT è un saggio basato sulla risposta immunologica cellulare verso uno specifico antigene. Tale metodica viene eseguita generalmente su piastre a 96 pozzetti coattati da anticorpi monocolonali specifici nei quali le cellule e l’antigene specifico vengono incubati per 6-48 ore. ;Durante tale periodo avviene la risposta cellulare e vengono prodotte le citochine specifiche a seconda del tipo di anticorpo/antigene utilizzato che generano macchie (spot) rilevate e contate attraverso comuni software di analisi dell’immagine. ;La metodica ELISPOT per una generica valutazione dell’attività cellulare del sangue è descritta nella domanda di brevetto europeo EP0957359 (Volkmar et al.), qui incorporato per riferimento. ;La metodica ELISPOT applicata ai linfociti T per la diagnosi o il monitoraggio di malattie come l’epatite B, l’epatite C, la tubercolosi, la malaria, l’HIV o l’influenza è descritta nella domanda di brevetto internazionale WO98/23960 (Lalvani et al.), qui incorporato per riferimento. ;La metodica ELISPOT applicata ai linfociti T reattivi agli antigeni derivanti dalla proteina ESAT-6, espressa dal Mycobacterium Tubercolosis, per la diagnosi della tubercolosi o anche solo al contatto dell’ospite con il patogeno (malattia latente) è descritta nella domanda di brevetto internazionale WO00/26248 (Lalvani et al.), qui incorporato per 5 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;riferimento. ;Ulteriore metodica ELISPOT applicata ai linfociti T reattivi non solo agli antigeni derivanti dalla ESAT-6 ma anche dalla proteina CFP-10 è descritta nella domanda di brevetto internazionale WO2004/005925 (Lalvani et al.), qui incorporato per riferimento. ;La metodica ELISPOT è stata fino ad oggi pertanto utilizzata unicamente per infezioni e malattie di origine virale oppure per il Mycobacterium Tubercolosis. ;DESCRIZIONE ;Si è ora trovato che saggi immunoenzimatici, in particolare ELISPOT, possono essere vantaggiosamente utilizzati per la diagnosi, in particolare una diagnosi precoce e/o il monitoraggio anche di infezioni fungine, in particolare in caso di aspergillosi invasiva ;Lo scopo dell’invenzione è infatti quello di utilizzare tali saggi, in particolare il saggio ELISPOT per l’identificazione e la conta di cellule T specifiche per Aspergillus, in modo tale che o la semplice rilevazione di tali cellule o il rapporto quantitativo tra quelle produttrici di IFN-γ e quelle produttrici di IL-10, per la definizione del rischio di infezione, per la diagnosi di aspergillosi invasiva, per il monitoraggio dell’infezione attiva o pregressa e per migliorare la gestione clinica dei pazienti a rischio e/o affetti da tale patologia. ;Oggetto della presente invenzione è pertanto un metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della aspergillosi invasiva che comprende l’esecuzione di un saggio immunoenzimatico in vitro su piastre di microtitolazione, come ad esempio del tipo a 96 pozzetti caratterizzato dal fatto di porre a contatto 6 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;il fluido biologico prelevato dal paziente con un antigene di Aspergillus fumigatus, in particolare un antigene estrattivo di Aspergillus fumigatus. Secondo un aspetto della presente invenzione, detto metodo consente l’identificazione e la conta di cellule T specifiche per Aspergillo, al fine di verificare la presenza e/o definire un rapporto tra quelle produttrici di IFN-γ e quelle produttrici di IL-10. ;Il valore soglia per l’ IFN-γ o per IL-10 che permette di definire la positività del metodo secondo la presente invenzione è compreso tra 15 e 25 SFCs (Spot Forming Cells), preferibilmente 20 SFCs. ;Secondo la presente invenzione detto saggio immunoenzimatico è ELISPOT (ElisaSpot o Enzyme-linked ImmunoSpot Assay) e detto antigene, preferibilmente antigene estrattivo, può essere ottenuto da conidi di Aspergillus fumigatus o da ife di Aspergillus fumigatus. ;I conidi (o conidiospore) sono le strutture riproduttive, prevalentemente unicellulari, del fungo che si formano all’apice delle ife che, a loro volta, sono i filamenti unicellulari o pluricellulari di forma cilindrica che, disposti uno sull’altro, formano il micelio ovvero il corpo vegetativo dei funghi. In particolare, secondo una realizzazione della presente invenzione detto antigene, è ottenuto da conidi di Aspergillus fumigatus che vengono raccolti dopo tre giorni di coltura, preferibilmente terreno agar saboraud, filtrati attraverso una garza sterile, ed infine uccisi al calore per 1 ora a 100°C. In seguito vengono lavati in soluzione salina (PBS) e conservati a –20°C. Secondo un’ulteriore realizzazione della presente invenzione detto antigene, preferibilmente antigene estrattivo, è ottenuto da ife di Aspergillus fumigatus che vengono omogenate, ad esempio utilizzando un mortaio con 7 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;biglie di un materiale inerte, preferibilmente biglie di vetro in tampone, preferibilmente tampone 50 mM Tris-Hcl con un pH di circa 7.5 L’estratto proteico così ottenuto è recuperato dopo centrifugazione tra 10 e 20000 rpm per circa10 minuti e conservato ad una temperatura tra circa -30 e -10°C, preferibilmente –20°C. ;Ai fini della presente invenzione con l’espressione “antigene di Aspergillus fumigatus” si intende quindi costituenti della struttura del fungo trattati in maniera tale che sia capaci di elicitare una risposta di cellule T specifiche. Il fluido biologico utilizzato secondo il metodo della presente invenzione può essere sangue, liquido da lavaggio bronchioalveolare (BAL) o liquido pleurico da pazienti a rischio di IA o già infetti. ;In particolare, tale fluido può essere ottenuto da prelievo endovenoso citratato, preferibilmente di 20 ml, da prelievo di liquido pleurico citratato, preferibilmente di 20 ml, o da prelievo di liquido da BAL citratato, preferibilmente di 30 ml. ;Detto sangue può essere utilizzato secondo il metodo della presente invenzione come sangue totale o come linfociti T isolati. ;Secondo la presente invenzione, il campione di sangue, di liquido pleurico o di liquido di lavaggio bronchioloalveolare viene diluito con circa un ugual volume di terreno di coltura, ad esempio RPMI 1640, e quindi sottoposto a centrifugazione su gradiente di densità (Ficoll, Lymphoprep) per separare la popolazione delle cellule mononucleate (PBMCs). Dopo 2 lavaggi, ad esempio in RPMI 1640, le cellule sono congelate in azoto liquido preferibilmente in presenza di 20% DMSO e 50% di siero fetale bovino (FBS) per gli esperimenti ELISPOT. ;8 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;I campioni cellulari vengono poi scongelati lentamente in bagno termostato 35-40°C, preferibilmente a 37°C. Viene aggiunta DNAse alla concentrazione finale di circa 10mg/ml e lasciata agire a temperatura ambiente per circa 20 minuti. Le cellule vengono trasferite in una provetta e risospese delicatamente con circa 10 ml di terreno RPMI 1640 addizionato di circa 5% di FBS che viene aggiunto goccia a goccia. Dopo una prima centrifugazione a circa 1000 rpm per circa 10’, il pellet cellulare ottenuto viene nuovamente risospeso in terreno di coltura R10 (RPMI 1640; 10% FBS; 1% sodio piruvato; 1% ampicillina ; 0.5% gentamicina; 18 UI/ml IL-2) e quindi le cellule vengono contate in camera di Bürker. ;Per la separazione delle cellule T CD3+ è stato utilizzato il “Pan T cell Isolation Kit human” distribuito da Miltenyi Biotech S.r.l. (Calderara di Reno, Bologna, Italia). La separazione delle cellule T CD3+ avviene per deplezione delle cellule non-T (selezione negativa). Le cellule non-T marcate con un cocktail di anticorpi monoclonali biotina-coniugati (CD14, 16, 19, 36, 56, 123 e Glicoforina A ), sono fatte reagire con anticorpi monoclonali anti-biotina coniugati a MicroBiglie magnetiche. Il passaggio delle cellule marcate (cellule non-T) e non-marcate (cellule T CD3+) attraverso una colonna MACS-MS (Miltenyi) in presenza di un campo magnetico determina il passaggio delle cellule T CD3+ e il blocco delle cellule non-T. La procedura di separazione è stata eseguita su campioni cellulari dopo scongelamento, seguendo le indicazioni descritte da Miltenyi. ;Secondo una ulteriore realizzazione della presente invenzione detto antigene può essere ottenuto da conidi di Aspergillus fumigatus che sono 9 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;raccolti dopo 2-4 giorni di coltura (ad esempio su terreno agar saboraud) mediante lavaggio dello strato superficiale della coltura fungina con acqua sterile. Il liquido di lavaggio ottenuto viene filtrato attraverso una garza sterile e sottoposto a centrifugazione tra 10000 e 15000 rpm, preferibilmente a 12000 rpm per 5-15 minuti, preferibilmente 10 minuti. Il surnatante viene eliminato e il pellet di conidi così ottenuto viene congelato in azoto liquido per circa 12 ore. In seguito il pellet di conidi viene scongelato, risospeso in acqua sterile e fatto bollire a bagnomaria per circa 1 ora e 30 minuti. Dopo centrifugazione (circa 10 minuti a 12000 rpm) per eliminare il surnatante, il pellet di conidi viene risospeso in circa 500 microlitri di PBS 1X. I conidi così ottenuti vengono utilizzati nell’esperimento Elispot alla concentrazione di circa 100.000 conidi/ml. L’antigene ottenuto può essere utilizzato subito o può essere storato mediante congelamento a circa -20°C ed utilizzato in seguito. ;Secondo una ulteriore realizzazione della presente invenzione detto antigene estrattivo può essere ottenuto da ife di Aspergillus fumigatus che vengono raccolte per raschiamento di più piastre di coltura con una lama di bisturi e risospese in acqua sterile. Dopo aver vortexato si procede alla filtrazione attraverso una garza sterile per eliminare l’eventuale agar. Il micete così ottenuto viene sottoposto a centrifugazione a circa 15000 rpm per circa 10 minuti, quindi, eliminato il surnatante, viene congelato in azoto liquido per circa 12 ore. In seguito, il micete scongelato, viene omogeneizzato in un mortaio in presenza di un volume di biglie di materiale inerte, preferibilmente biglie di vetro, pari a quello del micete, in tampone, preferibilmente tampone 50 mM Tris-Hcl, ad un pH di circa 7.5. ;10 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;L’estratto proteico così ottenuto è recuperato dopo centrifugazione a circa 14000 rpm per circa 20’. Dopo valutazione del contenuto proteico, l’estratto da ife, viene utilizzato nell’esperimento Elispot alla concentrazione di circa 6-10 microgrammi/ml. ;L’antigene ottenuto può essere utilizzato subito o può essere storato mediante congelamento a circa -20°C e utilizzato in seguito. ;PARTE SPERIMENTALE ;1. Metodo ELISPOT per cellule T produttrici di IFN-gamma Aspergillus-specifiche ;Per tutti gli esperimenti ELISPOT secondo la presente invenzione sono state utilizzate piastre di microtitolazione da 96 pozzetti distribuite da Mabtech (Nacka Strand, Svezia). Il fondo dei pozzetti della piastra, costituito da nitrocellulosa è coattato con un anticorpo monoclonale specifico per IFN-γ. Le piastre vengono rimosse dall’imballaggio e lavate 4 volte con PBS 1X (200 µl/pozzetto). Le piastre vengono fissate con R10 (200 µl/pozzetto), e incubate a temperatura ambiente per ≥30’. ;Il mezzo di fissaggio viene rimosso e 100.000-200.000 cellule in terreno R10 vengono dispensate nei singoli pozzetti (volume finale di 100-150 µl/pozzetto) e quindi stimolate con conidi inattivati dal calore (1x105 conidi/ml) o con estratto proteico (6-10 µg/ml) durante una incubazione a 37°C in presenza di CO2 (5%) per circa 20 ore. ;I controlli positivi sono costituiti dalle medesime cellule incubate con fitoemagglutinina (PHA) (25 µg/ml) o con un pool di 23 peptidi virali, ristretti per il complesso maggiore di istocompatibilità di classe I, derivanti dal citomegalovirus, virus di Epstein-Barr e dall’influenza virus (CEF 11 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;Peptide pool, Mabtech); il controllo negativo è costituito dalle sole cellule, senza alcuna stimolazione. Tutti gli esperimenti vengono condotti in triplicato. ;Dopo incubazione la piastra viene svuotata e sottoposta a 5 lavaggi successivi con PBS 1x e 0.5% di Tween 20. I complessi citochina-anticorpo vengono colorati mediante reazione enzimatica e aggiunta di un substrato cromogenico: in ogni singolo pozzetto vengono distribuiti 50 µl di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina, distribuito da Mabtech, diluito 1:200 in PBS 1x e dopo 90’ di incubazione a temperatura ambiente viene aggiunto il substrato (BCIP/NTB-plus), anch’esso distribuito da Mabtech. La reazione con il substrato viene arrestata dopo 10’ lavando la piastra con acqua corrente. La membrana di nitrocellulosa, viene fatta seccare all’aria per almeno 4 h. Ogni singola macchia (spot) che compare sul fondo del pozzetto corrisponde alla secrezione della citochina di una singola cellula (spot forming cell: SFC). Gli spots vengono quindi contati automaticamente mediante uno strumento per l’analisi di immagine (AID ELISPOT Reader System, Amplimedical) gestito da un software in grado di fornire una valutazione facile e veloce degli spots in base alla loro taglia e intensità. ;2 METODO ELISPOT PER CELLULE T PRODUTTRICI DI IL-10 ASPERGILLUS-SPECIFICHE ;PER TUTTI GLI ESPERIMENTI ELISPOT SONO STATE UTILIZZATE PIASTRE DI MICROTITOLAZIONE DA 96 POZZETTI (MULTISCREEN HTS IP STERILE PLATE) DISTRIBUITE DA MILLIPORE (BEDFORD, MA, USA). IN 12 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;QUESTO CASO LE PIASTRE NON SONO PRECEDENTEMENTE COATTATE, MA NECESSITANO DI COATTAZIONE CON L’ANTICORPO MONOCLONALE ANTI-IL-10. SI PROCEDE NEL SEGUENTE MODO: LE PIASTRE VENGONO RIMOSSE DALL’IMBALLAGGIO E LA MEMBRANA VIENE BAGNATA CON ETANOLO 70% (15 µL/POZZETTO) PER UN MINUTO A TEMPERATURA AMBIENTE. LE PIASTRE VENGONO, QUINDI, LAVATE 5 VOLTE CON ACQUA DISTILLATA (200 µL/POZZETTO). L’ANTICORPO ANTI-IL-10 (9D7), DISTRIBUITO DA MABTECH, UTILIZZATO PER COATTARE, VIENE DILUITO A 15 µG/ML IN PBS 1X STERILE E A PH 7.4. E AGGIUNTO IN QUANTITÀ DI 100 µL PER POZZETTO ALLA PIASTRA CHE VIENE INCUBATA PER UNA NOTTE A 4-8°C. ;Dopo incubazione la piastra viene sottoposta a lavaggi successivi con PBS 1x (200 µl/pozzetto). Le piastre vengono fissate con un mezzo contenente lo stesso FBS al 10% utilizzato per sospendere le cellule (200 µl/pozzetto), e incubate a temperatura ambiente per ≥30’. Il mezzo di fissaggio viene rimosso e 50.000-100.000 cellule in R10 vengono dispensate nei singoli pozzetti (volume finale di 100-150 µl/pozzetto) e quindi stimolate con conidi inattivati dal calore (1x105 conidi/ml) o con estratto proteico (6-10 µg/ml) durante una incubazione a 37°C in presenza di CO2 (5%) per circa 20 ore. I controlli positivi sono costituiti dalle medesime cellule incubate con fitoemagglutinina (PHA) (25 µg/ml) o con anti-CD3 (Mabtech); il controllo negativo è costituito dalle sole cellule, senza alcuna stimolazione. Tutti gli esperimenti vengono condotti in triplicato. ;13 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;Dopo incubazione la piastra viene svuotata e sottoposta a 5 lavaggi successivi con PBS 1X. L’anticorpo secondario (12G8-biotina) viene diluito a 1 µg/ml in PBS-05% FCS, aggiunto alla quantità di 100 µl/pozzetto e incubato per 2 h a temperatura ambiente. Si procede a 5 lavaggi successivi con PBS 1x. Il complesso Streptavidina-fosfatasi alcalina(1:1000) viene diluito in PBS-0.5% FCS, aggiunto alla quantità di 100 µl/pozzetto e incubato per 1 h a temperatura ambiente. Si procede a 5 lavaggi successivi con PBS 1x. La soluzione contenente il substrato (BCIP/NBT) viene aggiunta in quantità di 100 µl/pozzetto e lasciata sviluppare finché non compaiono gli spots. Lo sviluppo del colore viene inibito con abbondante lavaggio in acqua corrente. Si rimuove la membrana basale della piastra e si lava anche la base della piastra. La membrana di nitrocellulosa, viene fatta seccare all’aria per almeno 4 h. Gli spots vengono quindi contati automaticamente mediante uno strumento per l’analisi di immagine (AID ELISPOT Reader System, Amplimedical) gestito da un software in grado di fornire una valutazione facile e veloce degli spots in base alla loro taglia e intensità. ;ESEMPI ;Esempio 1 ;Preparazione dell’antigene da conidi di Aspergillus fumigatus ;Dopo tre giorni di coltura dell’Aspergillus fumigatus su terreno agar saboraud i conidi vengono raccolti mediante lavaggio dello strato superficiale della coltura con 30 ml di acqua sterile. ;Il liquido di lavaggio viene filtrato attraverso una garza sterile e successivamente sottoposto a centrifugazione a 12000 rpm per 10 minuti. ;14 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;Il surnatante viene eliminato e si procede al congelamento del pellet di conidi per 12 ore in azoto liquido. Il pellet di conidi viene poi scongelato e sospeso in 1-2 ml di acqua sterile e bollito a bagnomaria per una ora e mezzo. ;Si procede quindi ad una ulteriore centrifugazione a 12000 rpm per 10 minuti e il pellet di conidi viene risospeso in 500 µl di PBS 1X. ;Infine i conidi ottenuti possono essere direttamente utilizzato nell’esperimento ELISPOT secondo la presente invenzione ad una concentrazione di 100.000 conidi/ml. In alternativa i conidi vengono congelati a –20°C fino al momento dell’utilizzo secondo la presente invenzione. ;Esempio 2 ;Preparazione dell’antigene da ife di Aspergillus fumigatus ;Da coltura di Aspergillus fumigatus su terreno agar saboraud si procede al raschiamento di più piastre di coltura e sospensione in 30 ml di acqua sterile del prodotto raschiato. ;La sospensione ottenuta viene agitata su vortex, filtrata attraverso una garza sterile e centrifugata a 15000 rpm per 10 minuti. ;Il surnatante viene quindi eliminato e si procede al congelamento del pellet di micete per 12 ore in azoto liquido. ;Il pellet di micete viene poi scongelato e si procede con l’omogenizzazione in mortaio con pari volume fungo/biglie in tampone 50mM di Tris-HCl ad un pH di circa 7.5. ;L’omogenato ottenuto viene centrifugato a 14000 rpm per 20 minuti e viene valutato il contenuto proteico. ;15 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;Le ife ottenute possono infine essere direttamente utilizzate nell’esperimento ELISPOT secondo la presente invenzione ad una concentrazione di 6-10 µg/ml. In alternativa le ife vengono congelate a – 20°C fino al momento dell’utilizzo secondo la presente invenzione. ;STUDIO CLINICO ;Per valutare se la conta delle cellule T producenti IFN-γ-TH1 e IL-10 (IL-10-TH2) Aspergillo specifiche attraverso un saggio immunospot enzimatico (ELISPOT) potesse migliorare la diagnosi e il monitoraggio clinico della IA, sono stati eseguiti test clinici su una serie di 10 pazienti ematologici con neutropenia e infiltrazioni polmonari, tre dei quali con una infezione IA provata e due donatori sani. ;Cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs) sono state separate da ciascun paziente o soggetto sano attraverso centrifugazione a gradiente Ficoll-Hypaque (Linaris Bettingen an Main, Germany e poi seminate in piastra a 96 pozzetti polivinilidene di fluoruro con anticorpi monoclonali sia anti-IFN gamma o IL-10 (Mabtech, Nacka Strand, Sweden). Le cellule sono state cimentate con conidi inattivati dal calore preparati da Aspergillus fumigatus isolato da paziente o con un estratto cellulare idrosolubile di Aspergillus fumigatus e con PHA 1x10<5>cellule/pozzetto e 2,5x10<4>cellule/pozzetto sulle suddette piastre coattate per saggio IFN gamma e IL-10, rispettivamente, per sedici ore. ;Tutte le condizioni del test sono eseguite in triplicato e i risultati vengono considerati positivi se il numero delle cellule formanti macchie (SFC)/106 cellule in pozzetti antigene-Aspergillus stimolati è doppiamente maggiore che i pozzetti di controllo (cellule in pozzetti non antigene-Aspergillus 16 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;stimolati) e vi sono almeno 20 macchie (spot). ;Il primo paziente è una donna di 59 anni, affetta da leucemia mieloide acuta (LMA), che, durante la fase neutropenica del trattamento chemioterapico di induzione (Fig. 1B) ha presentato febbre e una lesione nodulare, circondata da un alone di attenuazione a vetro smerigliato, nel polmone sinistro, rilevata alla tomogrofia computerizzata ad alta risoluzione (HRCT). Gli esami colturali e molecolari di sangue, urine, feci e del liquido di lavaggio bronchioloalveolare (BALf) sono risultati ripetutamente negativi per la presenza di batteri, funghi o virus. La ricerca del galattomannano (GM) è risultata negativa sia su siero che su BALf. La paziente è rimasta febbrile nonostante terapia antibiotica ed antimicotica con vancomicina, meropenem e amfotericina liposomiale (L-amB), al dosaggio di 3 mg/kg/die. Una seconda HRCT del torace rilevava ingrandimento della lesione nodulare e persistenza dell’alone di attenuazione a vetro smerigliato. Il GM serico è rimasto negativo (Fig. 1B) La dose di L-amB è stata incrementata a 5 mg/kg/ie. Alcuni giorni dopo, la paziente ha ottenuto l’apiressia, in concomitanza con la completa ripresa midollare. Dopo una settimana, HRCT ha mostrato la lieve riduzione sia delle dimensioni della lesione polmonare che dell’alone circostante (Fig. 1B) La paziente è stata sottoposta a resezione del focolaio broncopneumonico per via videotoraoscopica (VATS). Gli esami istologico ed immunoistochimico del pezzo operatorio hanno rilevato un’ Aspergillosi Invasiva (IA) polmonare. Il secondo paziente, è una donna di 67 anni, che ha sviluppato febbre e infiltrati polmonari bilaterali durante la fase neutropenica successive ad un ciclo chemioterapico di induzione per AML. Gli esami colturali e 17 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;molecolari di sangue, urine, feci e del liquido di lavaggio bronchioloalveolare (BALf) sono risultati ripetutamente negativi per la presenza di batteri, funghi o virus. Con una terapia antibiotica empirica di seconda linea è stata ottenuta la risoluzione di tutti I focolai polmonari tranne uno, che si dimostrava ingrandito alla HRCT. Gli esami colturali e molecolari di sangue, urine, feci e del liquido di lavaggio bronchioloalveolare (BALf) sono rimasti negativi per la presenza di organismi patogeni responsabili di infezione. La ricerca del galattomannano (GM) è risultata negativa su siero, mentre ha mostrato positività su BALf. Terapia con L-amB è stata intrapresa al dosaggio di 3 mg/kg/die. Alla completa ripresa midollare la paziente ha presentato remissione completa dell’emopatia. Dopo un mese di trattamento antifungino, l’infiltrato polmonare si è ridotto lievemente, presentando un piccolo segno di escavazione. Prima di eseguire la chemioterapia di consolidamento, la paziente è stata sottoposta a resezione chirurgica polmonare lobare destra. Gli esami istologico ed immunoistochimico del pezzo operatorio hanno rilevato una IA polmonare. Alcuni giorni dopo l’intervento chirurgico, la paziente ha presentato recidiva dell’AML ed è deceduta di progressione di malattia. ;Il terzo paziente è stato un ragazzo di 24 anni affetto da leucemia linfatica acuta (ALL), che ha sviluppato febbre e una lesione nodulare peri-ilare del polmone sinistro, durante la fase neutropenica della chemioterapia di induzione. Gli esami colturali e molecolari di sangue, urine, feci e del liquido di lavaggio bronchioloalveolare (BALf) sono risultati ripetutamente negativi per la presenza di batteri, funghi o virus. La ricerca 18 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;del galattomannano (GM) è risultata negativa sia su siero che su BALf. L’esame citologico di BALf ha rilevato la presenza di ife fungine settate. La terapia antifungina con voriconazolo è stata intrapresa alla dose di 200 mg endovenosa due volte al giorno. Dopo due settimane di trattamento, la lesione nodulare era invariata di dimensioni ed era comparsa una piccola area di escavazione. Poiché il paziente ha presentato un episodio di emottisi, è stata decisa la resezione chirurgica del segmento superiore del lobo polmonare inferiore sinistro. Gli esami istologico ed immunoistochimico del pezzo operatorio hanno rilevato una IA polmonare. Il paziente ha ottenuto la remissione completa dell’emopatia, ha completato due cicli di chemioterapia di consolidamento. ;Nella paziente 1, la metodica ELISPOT secondo la presente invenzione è stata eseguita su campioni di sangue periferico raccolti tra la prima e la seconda HRCT, contemporaneamente con la terza HRCT, e dopo una e tre settimane dall’esecuzione della VATS, rispettivamente. L’ELISPOT è risultato positivo per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H2 e produttrice di interleuchina 10 (IL-10), in ogni determinazione, e ha mostrato una positività crescente per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H1 e produttrice di interferone-gamma (IFN-γ)(Fig. 1A) ;Nella paziente 2, la metodica ELISPOT secondo la presente invenzione è stata eseguita al tempo della prima HRCT, alcuni giorni prima dell’intervento chirurgico e al tempo della recidiva della AML. L’ELISPOT è risultato positivo per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H2 e produttrice di IL-10, alla prima e alla seconda 19 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL ;;determinazione, e ha mostrato positività per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H1 e produttrice di IFN-γ, alla seconda determinazione. La terza determinazione è risultata negativa per qualunque tipo di risposta T-cellulare specifica (Fig. 1C). ;Nel paziente 3, la metodica ELISPOT è stata eseguita contemporaneamente e quindici giorni dopo l’intervento chirurgico, prima del primo e del secondo ciclo chemioterapico di consolidamento. L’ELISPOT è risultato positivo per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H2 e produttrice di IL-10, alla prima e alla seconda determinazione, e ha mostrato positività per una risposta di cellule T Aspergillus-specifiche, polarizzata tipo T H1 e produttrice di IFN-γ ad ogni determinazione (Fig. 1D). ;Risultati clinici: ;La metodica secondo la presente invenzione ha pertanto fornito la prova della Aspergillosi Invasiva in tutti e tre i pazienti. In particolare, la positività dell’ELISPOT secondo la presente invenzione è l’unica prova dell’infezione nel paziente 1 nel quale la diagnosi era stata alternativamente raggiunta unicamente con l’intervento chirurgico essendo tutte le altre metodiche risultate negative. La metodica ELISPOT secondo la presente invenzione rappresenta poi un effettivo miglioramento del potere diagnostico del GM su BAL e della citologia del BAL nei pazienti 2 e 3, rispettivamente permettendo una diagnosi certa e non solo sospetta. ;La Fig. E rappresenta i risultati di ELISPOT in pazienti affetti da polmonite ad eziologia non fungina come controlli negativi. *

Claims (13)

1. 20 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della aspergillosi invasiva che comprende l’esecuzione di un saggio immunoenzimatico in vitro in cui il fluido biologico prelevato dal paziente è messo in contatto con un antigene di Aspergillus fumigatus.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto antigene è un antigene estrattivo di Aspergillus fumigatus.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto antigene è ottenuto da conidi di Aspergillus fumigatus.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto antigene è ottenuto da ife di Aspergillus fumigatus.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 3 in cui detto antigene è ottenuto attraverso i seguenti passaggi: a. incubazione dei conidi per 3 giorni, b. raccolta dei conidi mediante lavaggio della coltura fungina con acqua sterile, c. filtrazione e successiva centrifugazione del liquido di lavaggio, d. eliminazione del surnatante, e. congelamento e successivo scongelamento del pellet di conidi, f. sospensione in acqua sterile, g. bollitura e successiva centrifugazione, h. eventuale congelamento. 21 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 4 in cui detto antigene è ottenuto attraverso i seguenti passaggi: a. raccolta di ife da piastre di coltura attraverso raschiamento e successiva sospensione in acqua sterile, b. filtrazione e successiva centrifugazione, c. eliminazione del surnatante, d. congelamento e successivo scongelamento del pellet di micete, e. omogeneizzazione del micete in presenza di un volume di biglie di materiale inerte pari a quello del micete, f. centrifugazione, g. eventuale congelamento.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6 in cui dette biglie sono di vetro.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto fluido biologico è scelto tra sangue, liquido di lavaggio bronchioalveolare o liquido pleurico.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui detto fluido biologico è scelto tra tutte le cellule mononucleate del sangue, del liquido di lavaggio bronchioalveolare, del liquido pleurico, o linfociti T del sangue, del liquido di lavaggio bronchioalveolare, del liquido pleurico.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detto saggio immunoenzimatico è il saggio ELISPOT.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui viene verificata la presenza e/o il rapporto di cellule produttrici di IFN-γ e cellule 22 DRAGOTTI & ASSOCIATI SRL produttrici di IL-10.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11 in cui il valore soglia per IFN-γ o IL-10 è compreso tra 15 e 25 SFCs.
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12 in cui detto valore soglia è di 20 SFCs. Il Mandatario Dr. Roberto Pistolesi Della Dragotti & Assocaiti Srl (Iscr. Albo No.853) LB/ac