ITMI20071083A1 - Processo per rivestire una superficie di un elemento metallico per aumentarne l'osteointegrazione e dispositivo protesico che include detto elemento - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:

“Processo per rivestire una superficie di un elemento metallico per aumentarne l'osteointegrazione e dispositivo protesico che include detto elemento”

La presente invenzione si riferisce ad un processo per rivestire almeno un elemento metallico di un dispositivo protesico, allo scopo di ottenere un'elevata integrazione ossea tra la superficie dell'elemento metallico e la struttura ossea ricevente, ed al dispositivo protesico che include tale elemento metallico rivestito.

I dispositivi protesici sono ad esempio: impianti, mezzi di sintesi, sistemi di fissazione esterna, sistemi di stabilizzazione, gabbie di fusione, impianti dentali, viti, da impiegarsi a scopo clinico/chirurgico in campo ortopedico, maxillofacciale e neurochirurgico.

L’osso umano è tra gli esempi più complessi di materiale biomineralizzato esistenti in natura. Esso è prevalentemente costituito da componenti inorganiche quali idrossiapatite (HA) ed acqua (70-80%) e da componenti organiche quali collagene di tipo I, proteoglicani e altre proteine non collageniche (20-30%). Durante la formazione ossea nanocristalli di idrossiapatite si accumulano in intimo contatto con fibrille di collagene di tipo I generando un insieme ordinato composito nano strutturato a struttura gerarchica con determinate caratteristiche meccaniche ed elastiche in grado di conferire al sistema scheletrico proprietà strutturali in grado di sostenere tutti gli organi del corpo umano. Tale intimo meccanismo di deposizione di nanocristalli di idrossiapatite allinte di fibrille di collagene viene mediato da cellule competenti quali fibroblasti e osteoblasti. La perdita di sostanza ossea con conseguente necessità di ripristino del volume mancante o l’esigenza di un aumento di volume osseo già esistente rappresenta una delle maggiori problematiche in campo ortopedico, maxillo-facciale e neurochirurgico. Numerose soluzioni sono state proposte per far fronte alla mancanza di volume osseo, in particolare sono state impiegate varie sostanze di derivazione naturale, inorganica sintetica o solo sintetica con funzioni di sostituto osseo. Tuttavia, lo straordinario comportamento meccanico dell’osso naturale reso proprio dalla sua struttura gerarchica nanocomposita è stato dimostrato da numerosi autori essere difficilmente raggiungibile con qualsiasi altro tipo di biomateriale. Pertanto, il sostituto osseo ideale rimane l’osso autologo prelevato dallo stesso paziente da sito-donatore. Questa pratica tuttavia non è esente da rischi per il paziente che molto spesso si traducono in riassorbimento dell’impianto osseo stesso e frequente comparsa di sintomatologia dolorosa nel sito dove l’innesto osseo è stato prelevato.

Studi recenti hanno dimostrato che l’impiego di osso allogenico da banca dei tessuti di derivazione umana, processato e reso inerte attraverso processi chimico-fisici, può rappresentare un'alternativa all’impiego dell’osso autologo. Tuttavia, anche in questa pratica, possono sussistere rischi legati alla contrazione di malattie infettive o reazioni di tipo immunitario.

Nuovi biomateriali con funzioni di sostituti dell’osso sono stati studiati e proposti per uso clinico, alcuni hanno evidenziato esiti positivi in seguito ad indagini cliniche sull’uomo. Tali materiali non presentano semplicemente elevate proprietà di biocompatibilità (biomateriali inerti), ma posseggono caratteristiche biomimetiche, cioè proprietà chimico e chimico-fisiche simili all’osso umano in grado di attivare meccanismi biologici (bioattività) con i tessuti ossei riceventi e le componenti cellulari in essi contenuti, promuovendo i processi di neo-formazione e consolidamento osseo. Una volta ultimata la loro funzione di stimolo della neo-formazione ossea. Questi materiali in alcuni casi vanno incontro a completo riassorbimento lasciando spazio esclusivamente all’osso neoformato.

La cinetica di formazione dell’osso ed il suo consolidamento richiedono tempi piuttosto prolungati e nell’immediato ed intermedio postoperatorio, in particolare nella ricostruzione di alcune strutture ossee come le ossa lunghe, non è possibile accedere al carico immediato in mancanza di sostegno meccanico.

Per questa ragione vengono spesso impiegati mezzi complementari di stabilizzazione e fissazione meccanica di origine metallica che assicurano un carico immediato. L’impiego di strutture complementari metalliche nelle procedure di ricostruzione ossea non si limita esclusivamente alle ricostruzioni in assenza di un carico meccanico immediato, ma molto spesso costituiscono parte integrante della rigenerazione ossea come ad esempio in campo odontoiatrico/maxillo facciale dove il posizionamento di viti di titanio diventa nel tempo corpo unico con l’osso ricevente dando origine ad un sistema anatomico in grado di alloggiare elementi dentali artificiali per il ripristino di perdita di elementi dentali.

L’uso di dispositivi metallici a base di leghe di cromo-cobalto o più diffusamente di leghe di titanio, ha consentito di ottenere risultati buoni in termini di osteointegrazione, dove per osteointegrazione (concetto introdotto da Branemark fin dagli anni '60 e successivamente approfondito negli anni '80 con l’avvento di nuove tecniche istologiche) si intende la congiunzione diretta strutturale e funzionale tra l’osso vitale ricevente e la superficie di un dispositivo protesico sottoposto al carico. La realizzazione ed il mantenimento dell'osteointegrazione dipendono dalla capacità di guarigione, riparazione e rimodellamento dell'osso.

È evidente quanto sia importante la completa osteointegrazione del metallo con l’osso del ricevente, in quanto da essa dipendono i risultati anatomici e morfofunzionali di molti interventi di ricostruzione ossea. Ad esempio in campo odontoiatrico se non si ottiene una perfetta osteointegrazione con l’osso sano vi è il rischio di mobilizzazione di impianti protesici.

Le leghe di titanio (prevalentemente leghe di TiéAUV e leghe di Ti6Al7Nb) vengono preferite ad altre leghe metalliche non solo per la facilità di lavorazione, ma specialmente per l’elevata biocompatibilità, per l’elevata resistenza meccanica, per la resistenza alla corrosione, per la ridotta propensione ad indurre un riassorbimento osseo e per le proprietà elastiche che, rispetto alle altre leghe metalliche, si avvicinano di più a quelle dell’osso umano (modulo elastico relativamente contenuto corrispondente a 100 GPa rispetto agli oltre 200 GPa dei materiali alternativi, gli acciai inossidabili e le leghe di cobalto). Vi sono numerosi fattori che risultano determinanti nell’ ottenimento di una buona osteointegrazione di dispositivi impiantabili in campo chirurgico ortopedico, neurochirurgico e maxillo-facciale: oltre a fattori biomeccanici legati alla geometria ed alla forma dell’impianto, è importante la natura topografica e chimica della superficie dell’impianto stesso che si interfaccia con il tessuto osseo sano ed i suoi componenti costitutivi il connettivo, primo tra tutti la componente cellulare. Il meccanismo di formazione ossea sulla superficie dell’impianto inizia con una chemiotassi cellulare verso l’interfaccia osso impianto e migrazioni di altri fattori (macromolecole, mediatori chimici, proteine, nutrienti ecc.) con formazione inizialmente di un coagulo e successivamente di tessuto di granulazione in grado di preparare un letto ideale per la trasformazione di cellule progenitrici indifferenziate (cellule mesenchimali presenti nel midollo osseo) in cellule mature in grado di sintetizzare nello stadio finale di neossificazione la matrice ossea minerale. Infine, il risultato di una buona osteointegrazione passa inevitabilmente attraverso una perfetta qualità dell’osso ricevente. Sovente infatti si notano fallimenti di impianti metallici alloggiati in pazienti affetti da forma osteoporotica sia senile che secondaria o da altre malattie degenerative a carico del sistema scheletrico.

Ad oggi, si dispone di tecniche e trattamenti particolari in grado di implementare le proprietà di osteointegrazione quindi di stabilità duratura degli impianti metallici, attraverso la modifica delle caratteristiche di superficie (es. modifica della rugosità) grazie a processi chimici o fisici che permettono la deposizione, sulle superfici di contatto con l’osso, di sottili film ceramici. Tali trattamenti, oltre a conferire una maggiore osteointegrazione ed una stabilità prolungata, possono conferire anche maggiore biocompatibilità della protesi limitando il fenomeno del rilascio di ioni metallici dovuto allo stress meccanico ed agli attriti. Particolare attenzione è stata riservata al trattamento superficiale di protesi di ginocchio e di anca dove i sistemi di fissazione devono possedere una macro rugosità e delle geometrie particolari, mentre per ridurre lo "stress shielding" le superfici delle protesi stesse devono essere trattate con speciali coating compresi riporti di titanio nitruro (TiN) o TiNbNi ceramizzato. Tali particolari trattamenti superficiali nel primo caso si ottengono mediante sabbiatura o lavorazioni meccaniche, oppure mediante deposizione di microparticelle di materiale ceramico o metallico grazie a specifici processi di rivestimento (Ti-plasma spray, deposizione di microsfere sinterizzate di HA, fiber mesh metalliche). Nel caso di rivestimenti esterni di superfici metalliche che si interfacciano con altre superfici articolari, essi vengono ottenuti grazie a processi chimico-fisici come il CVD (Chemical Vapor Deposition) ed il PVD (Physical Vapor Deposition) che consentono rivestimenti ultrasottili (ordine di grandezza qualche decina di nm) e resistenti, in grado di ammortizzare le sollecitazioni meccaniche dovute allo sfregamento di superfici articolari adiacenti eludendo il rilascio di ioni che possono indurre reazioni infiammatorie sui tessuti adiacenti.

Se da un lato queste tecniche possono garantire un’osteointegrazione primaria in tempi più rapidi (ad es. in ambito chirurgico maxillo-facciale 3-6 mesi), a lungo termine possono essere intrinsecamente soggette a rischi di "debridement" che possono alterare le proprietà meccaniche e superficiali del dispositivo metallico, pregiudicandone la biocompatibilità, la stabilità e l’osteointegrazione (infiammazione all 'interfaccia protesi connettivo, con formazione di lacune superficiali e osteolisi).

Altri sistemi, terapie e tecniche complementari possono essere impiegate per favorire l’osteointegrazione (laser terapia, ultrasuoni ecc.) attraverso una stimolazione ossea in grado di far proliferare e differenziare le cellule progenitrici in cellule competenti alla sintesi di matrice ossea.

E noto che la nucleazione diretta in soluzione acquosa di nanocristalli di idrossiapatite (HA) all’intemo di fibre collageniche consente di ottenere un composito biomimetico con caratteristiche analoghe a quelle dell’osso umano. La nucleazione dell’HA aH’intemo di fibre di collagene induce la carbonatazione di nanocristalli di HA in posizione B con sostituzione dello ione P04con lo ione C03in maniera simile a come avviene nel processo di deposizione dell’apatite umana prevenendo la carbonatazione in posizione A dove lo ione C03<2->sostituirebbe il gruppo OH come avviene nella carbonato apatite sintetica. La stretta analogia in termini di microstruttura e composizione chimica del nanocomposito collagene-apatite con l’osso umano può portare alla realizzazione di una struttura bioattiva che depositata su una superficie metallica è in grado di modulare la cinetica di neoformazione e rimodellamento osseo. I compositi nano-strutturati calcio-fosfati/collagene si prestano ad essere depositati su superfici metalliche. Tuttavia, le metodologie di rivestimento tradizionali come il plasma spray, il CVD (Chemical Vapour Deposition) ed il PVD (Physical Vapour Deposition) non sono applicabili per questa tipologia di materiale particolarmente a causa della forma fibrosa del collagene.

Come descritto in letteratura, numerose difficoltà sono state riscontrate nel rendere uniformi ed omogenei rivestimenti di composito calciofosfato/collagene su superfici e supporti metallici mediante deposizione elettrolitica.

Ad esempio, nell'articolo di H. Schliephake et al, "Biological performance of biomimetic calcium phosphate coating of titanium implants in thè dog mandible" pubblicato in J Biomedi. Mater. Res., (2003) 64, pag. 225-234., viene riportato uno studio sugli effetti in vivo di impianti in titanio rivestiti con vari materiali. In particolare sono stati utilizzati impianti protesici in titanio rivestiti con un multistrato di calcio-fosfato/collagene bioattivo, ottenuto mediante elettro-cristallizzazione di una soluzione di fosfato di calcio su un elettrodo di titanio sulla cui superficie in precedenza era stato depositato collagene tramite integrazione parziale di quest'ultimo all'intemo di uno strato di ossidi ottenuti per elettrodeposizione anodica. L'integrazione del collagene è stata ottenuta in condizioni galvanostatiche utilizzando un elettrolita contenente collagene in condizioni quasi fisiologiche (pH 7,4 a 37°C), e successiva immersione in una soluzione di collagene per 10 min, così da ottenere uno strato di collagene avente spessore di circa 40 nm. Come riportato dagli autori stessi, lo spessore complessivo del multistrato (circa 500 nm) ed il grado di mineralizzazione del collagene erano molto bassi.

Nell'articolo di Y. Fan et al "A composite coating by electrolysis-induced collagen self-assembly and calcium phosphate mineralization", pubblicato in Biomaterials, (2004) 26, pag. 1623-1632, vengono descritti altri tentativi di deposizione elettrochimica di rivestimenti multistrato di collagene e calcio fosfato. In particolare, viene descritta la deposizione elettrolitica su un substrato di silicio di un primo strato di spessore di circa 100 pm di fosfato di calcio ed un secondo strato in forma di gel di spessore di circa 100 pm costituito da un composito di fibrille di collagene con fosfato ottacalcico (OCP). La deposizione elettrolitica è stata condotta in una soluzione di Ca(N03)2e NH4H2P04addizionata con una soluzione di NaOH 1 M così da ottenere un pH di 4, 8-5.3, a cui è stato successivamente aggiunto collagene di tipo I in soluzione acida, seguito da un riaggiustamento del pH ai valori indicati sopra. La deposizione elettrolitica è stata condotta ad un potenziale costante al catodo di -1, -2 o -3V rispetto al catodo di riferimento (elettrodo saturo di calomelano, SCE).

La Richiedente si è posta il problema di aumentare la capacità di osteointegrazione di dispositivi protesici che includono almeno un elemento metallico tramite un processo di rivestimento della superficie di quest'ultimo con almeno uno strato di un materiale ad elevata biocompatibilità, tale da ottenere un'interfaccia con la struttura ossea che consenta una più rapida neoformazione ossea ed un'osteointegrazione che si consolida nel tempo.

La Richiedente ha trovato che tale problema può essere risolto tramite un processo secondo le rivendicazioni che seguono, in cui sulla superficie dell'elemento metallico destinata a venire a contatto con la struttura ossea viene depositato per via elettrochimica un composito di collagene con un calciofosfato in condizioni di processo tali per cui le fibre di collagene si autoassemblano con la componente inorganica calcio-fosfatica in prossimità della superficie metallica, precipitando su quest'ultima in un'unica fase minerale a base di HA, senza l'aggiunta nel bagno elettrolitico di composti alcalini.

Secondo un primo aspetto, la presente invenzione riguarda pertanto un processo per rivestire una superficie di un elemento metallico, che comprende: predisporre un bagno elettrolitico comprendente almeno un collagene, ioni calcio e ioni fosfato;

immergere in detto bagno elettrolitico almeno un catodo ed almeno un anodo, detto almeno un catodo comprendendo l'elemento metallico da rivestire; far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere su detta superficie una co -deposizione elettrolitica del collagene con un composto calcio-fosfato comprendente idrossiapatite.

Secondo un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda un dispositivo protesico comprendente almeno un elemento metallico, detto elemento metallico avendo almeno una superficie rivestita con almeno uno strato ottenibile per codeposizione elettrolitica di un collagene con un composto calcio-fosfato comprendente idrossiapatite.

Secondo una forma preferita di realizzazione, all'inizio della co-deposizione il bagno elettrolitico ha un pH compreso tra 3,0 e 4,5, preferibilmente tra 3,5 e 4,0, detto pH innalzandosi in prossimità del catodo ad un valore superiore a 8, generalmente compreso tra 10 e 12, durante il processo di co-deposizione senza aggiunta di composti alcalini. Al termine del processo di co-deposizione elettrolitica, il bagno elettrolitico ha un pH generalmente compreso tra 4,0 e 6,0, preferibilmente tra 4,5 e 5,5.

Secondo una forma preferita di realizzazione, la co-deposizione elettrolitica viene condotta con una corrente continua sostanzialmente costante. Preferibilmente la corrente continua viene mantenuta a valori relativamente bassi onde evitare distacchi del materiale depositato causati da un eccessivo sviluppo di idrogeno gassoso al catodo. Generalmente la corrente continua ha un valore compreso tra 10 e 60 mA, più preferibilmente tra 30 e 40 mA.

Preferibilmente, il collagene è di tipo I. Preferibilmente, il collagene viene preventivamente sottoposto ad una fase di digestione enzimatica allo scopo di rimuovere i telopeptidi presenti sulle molecole di collagene che possono ostacolare l'autoassemblaggio della proteina sulla superficie metallica.

Preferibilmente, il collagene nel bagno elettrolitico è presente in forma di sospensione ed ha in genere una concentrazione iniziale compresa tra 0,005 e 0,05% peso/volume, preferibilmente tra 0,01 e 0,02% peso/volume.

Preferibilmente, gli ioni calcio vengono aggiunti al bagno elettrolitico sottoforma di un sale solubile nelle condizioni di reazione, ad esempio calcio nitrato. La concentrazione iniziale degli ioni calcio nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,01 e 0,1 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,06 moli/litro.

Preferibilmente, gli ioni fosfato vengono aggiunti al bagno elettrolitico sottoforma di un sale solubile nelle condizioni di reazione, ad esempio ammonio diidrogeno fosfato .

La concentrazione iniziale degli ioni fosfato nel bagno elettrolitico è generalmente compresa tra 0,01 e 0,10 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,04 moli/litro. Nell'ambito della presente invenzione, il termine "ioni fosfato" include sia gli ioni fosfato P04<3->, sia gli ioni idrogeno- ed diidrogeno-fosfato HP04e H2P04eventualmente presenti in equilibrio con gli ioni P04in quantità variabili in funzione del pH.

Preferibilmente, l'elemento metallico comprende titanio od una sua lega, ad esempio leghe Ti6Al4V oppure leghe Ti6Al7Nb.

Attuando il processo secondo la presente invenzione è possibile variare lo spessore dello strato di collagene ed idrossiapatite entro ampi margini, passando da uno spessore di pochi nm, ad esempio da 10 nm a 500 nm, fino a spessori più consistenti, generalmente compresi tra 50 pm e 500 pm, preferibilmente tra 100 pm e 200 pm. Lo spessore dello strato di collagene ed idrossiapatite è preferibilmente non superiore a 500 pm, in quanto spessori più elevati possono provocare fenomeni di delaminazione che causerebbero irregolarità superficiali inficiando la capacità di osteointegrazione della superficie trattata, Preferibilmente, il composto calcio-fosfato comprende almeno il 90% in peso, più preferibilmente almeno il 95% in peso, di idrossiapatite. Preferibilmente, l'idrossiapatite è presente sottoforma di cristalli aventi morfologia lanceolata appiattita (morfologia biomimetica), aventi dimensioni medie del lato più lungo inferiori a 300 nm, più preferibilmente comprese tra 100 e 200 nm.

Lo strato ottenuto per co-deposizione elettrolitica secondo la presente invenzione generalmente comprende: dal 10 a 90% in peso di idrossiapatite e dal 10 al 90% in peso di collagene. Più preferibilmente detto strato comprende: dal 60 a 70% in peso di idrossiapatite e dal 30 al 40% in peso di collagene.

La presente invenzione verrà ora illustrata tramite alcuni esempi di realizzazione, i quali vengono fomiti a puro titolo esemplificativo ma non limitativo della portata dell'invenzione stessa.

Le figure allegate alle presente descrizione illustrano:

Fig. 1: una rappresentazione schematica di un dispositivo per realizzare la codeposizione elettrolitica secondo l’invenzione;

Fig. 2: immagine SEM del rivestimento ottenuto per co-deposizione di collagene ed idrossiapatite secondo l'invenzione dopo 5 min. di elettrodeposizione;

Fig. 3: immagini TEM del rivestimento ottenuto per co-deposizione di collagene ed idrossiapatite secondo l'invenzione: (a) e (b) dopo 5 min. di elettrodeposizione, (c) e (d) dopo 30 min. di elettrodeposizione;

Fig. 4: spettro FTIR del rivestimento ottenuto per co-deposizione di collagene ed idrossiapatite secondo l'invenzione dopo 30 min. di elettrodeposizione (spettro A), a confronto con lo spettro FTIR di un tessuto osseo (spettro B); Fig. 5: diffrattogramma a raggi-X del rivestimento ottenuto per co-deposizione di collagene ed idrossiapatite secondo l'invenzione dopo 30 min. di elettrodeposizione; nell'inserto viene riportata per confronto una porzione di un diffrattogramma a raggi-X di un tessuto osseo;

Fig. 6: immagini SEM delle fibre di collagene auto-assemblate secondo l'invenzione, dopo decalcificazione con EDTA/aldeide glutarica.

ESEMPIO 1.

Materiali impiegati.

Tutti i reagenti erano Chemical grade.

Il collagene di tipo I utilizzato negli esperimenti è stato estratto da tendine equino utilizzando un metodo di produzione standard dove i tessuti animali ed il tessuto grezzo derivato venivano sottoposto a rigorosi controlli medicoveterinari. Dopo aver rimosso completamente la membrana sinoviale il tessuto veniva sminuzzato finemente e sospeso in soluzione acquosa di HC1 a pH 2.5 e quindi digerito con pepsina per 24h. Dopo digestione enzimatica il collagene veniva precipitato innalzando il pH a 5.5 per aggiunta di soluzione di NaOH e successivamente sottoposto a lavaggi con acqua distillata e successivamente trattato con NaOH 1M per Ih in modo da rimuovere qualsiasi residuo glicosidico ed assicurare la completa inattivazione virale. Al termine della procedura veniva trattato in ambiente a pH 5.5 per aggiunta di HC1. Poco prima del processo di deposizione le fibre collagene venivano omogeneamente risospese ( 1% w/w) in acido acetico 0.3% (w/v).

Le lamine di titanio al 99,7% sono state ottenute da Sigma (cod. 267503-25.2G) e successivamente tagliate in strisele di dimensioni 15 mm x 25 mm.

Condizioni di processo.

I processi di deposizione elettrolitica di seguito descritti venivano condotti con un sistema elettrochimico a due elettrodi illustrato schematicamente in Figura 1, che comprende un bagno elettrolitico (1) in cui sono presenti ioni calcio, ioni fosfato e collagene in forma di sospensione nel mezzo acquoso; nel bagno elettrolitico (1) sono immersi un catodo (2) ed un anodo (3), tra i quali passa corrente elettrica continua controllata attraverso un potenziostato (4), utilizzato come galvanostato (Amel model 552-Potenziostat/Amel model 721-Integrator). II catodo era costituito da una lamina di titanio delle dimensioni di 15mm x 25 mm. Prima della deposizione elettrolitica, la lamina di titanio veniva pulita mediante trattamento ad ultrasuoni in bagno di acetone e successivamente in acqua distillata al fine di rimuovere ogni residuo.

II bagno elettrolitico è stato preparato sciogliendo in acqua distillata Ca(N03)2e NH4H2P04fino ad ottenere una concentrazione 42 mM di [Ca ] e 25 mM di P04<3->. Una sospensione di collagene di tipo I preparata come descritto sopra veniva addizionata al bagno elettrolitico alla concentrazione di 0.012% w/v. Il pH iniziale del bagno elettrolitico era di circa 4,0. Al termine della codeposizione il pH del bagno elettrolitico era di circa 5, 0-5, 5.

Durante la deposizione elettrolitica, la cella elettrochimica con all’interno il bagno elettrolitico veniva mantenuta a temperatura ambiente applicando una corrente sostanzialmente costante di 34 mA. Le prove di durata del processo di deposizione del rivestimento composito collagene/ΉΑ veniva stabilita in 5 secondi, 30 secondi, 5 minuti, 30 minuti.

In considerazione degli elettroliti presenti in soluzione, le principali reazioni che si generano al catodo di titanio al passaggio della corrente attraverso gli elettrodi sono le seguenti::

1)

2)

3)

4)

5)

Si ritiene che tali reazioni siano in grado di aumentare il valore di pH nella zona catodica così da creare le condizioni adatte alla co-deposizione del collagene con l'idrossiapatite senza aggiunta di composti alcalini. Si può pertanto supporre che il collagene inizi ad auto-assemblarsi solo in vicinanza del catodo, dove si ottiene un innalzamento locale del pH per effetto del processo elettrochimico, e non in tutta la massa del bagno per effetto di ioni OH<->aggiunti.

Il pH iniziale del bagno elettrolitico viene aggiustato ad un valore inferiore al punto isoelettrico del collagene in modo da consentire la migrazione al catodo della molecola caricata positivamente. Le reazioni al catodo illustrate sopra, producendo ioni OH-, portano al superamento del punto isoelettrico del collagene ed allo stesso tempo generano le condizioni adatte alla deposizione del calcio fosfato, con conseguente simultaneo auto-assemblaggio del collagene ed associazione dello stesso con la fase minerale, così da deporre sulla superficie del catodo il composito desiderato.

Caratterizzazione dei rivestimenti.

Vari campioni ottenuti secondo l'Esempio 1 sono stati caratterizzati come segue. Gli spettri a microscopia ad infrarosso (FTIR) sono stati ottenuti mediante spettrofotometro infrarosso Perkin-Elmer mod. Spectrum One FT-IR con annesso microscopio Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Autoimage microscope). La risoluzione degli spettri era di 4 cm<"1>, la risoluzione spaziale era di 100x100 pm mentre lo spettro era il risultato di 32 scansioni. La linea base dello spettro era ottenuta da una regione in assenza di campione. Le aree specifiche da sottoporre ad analisi venivano identificate mediante visione con telecamera posizionata sul microscopio.

Le immagini al microscopio a scansione (SEM) sono state ottenute mediante microscopio Philips 515. La lamina di titanio sottoposta al rivestimento elettrochimico veniva opportunamente posizionata e trattata con coating di oro colloidale in un range temporale compreso tra 30 e 180 secondi ad un voltaggio di 30 mV.

L’analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) veniva eseguita con un microscopio Philips 420T. Un campione del rivestimento polverizzato veniva sospeso in acqua bi-distillata ed una goccia di sospensione così ottenuta veniva depositata su una lamina forata di carbonio supportata da una micro-griglia di rame.

La difrattometria a raggi X è stata impiegata per la determinazione del grado di cristallinità usando un difrattometro Analytical X’Pert Pro impiegando una radiazione a CuK generata a 40 kV e 40 mA. Lo strumento veniva configurato 1° di divergenza e 0.2 mm di fessura ricevente. Il grado di cristallinità è stato valutato applicando la formula:

La dimensione del singolo cristallo è stata determinata applicando la formula di Scherrer’s:

dove 0 rappresenta l’angolo di diffrazione, ΔΓ e Δ0l’ampiezza in radianti dell’angolo di riflessione a metà altezza rispettivamente per il picco di riferimento del prodotto finale e dell’idrossiapatite, a λ=1.5405 À.

Commenti ai risultati ottenuti.

L’osservazione al SEM del rivestimento ottenuto dopo una elettrodeposizione della durata di 5 minuti (vedi Fig. 2) mostra la presenza di una fase minerale intimamente associata alle fibrille di collagene. DaH'immagine si può intuire il ruolo importante di consolidamento della componente inorganica da parte del network fibroso collagenico.

Aumentando il tempo di elettrodeposizione a 30 minuti, all’immagine SEM le fibre collagene si presentano come completamente immerse nella fase inorganica nano-cristallina.

L’analisi dello spettro FTIR dello stesso rivestimento (vedi Fig. 4) mostra i picchi di massimo assorbimento del collagene e dell’idrossiapatite. Da notare la presenza nello spettro A di un picco a 1422 cm<_1>del tutto simile a quello presente nel tessuto osseo (spettro B), tipicamente presente nell'idrossiapatite di tessuti mineralizzati come conseguenza di una carbonatazione di tipo B.

La deposizione delle fibrille collageniche a differente grado di mineralizzazione riscontrata dalle immagini TEM (vedi Fig. 3), evidenzia come vi siano nanocristalli di idrossiapatite associati alla struttura fibrillare collageneica, le dimensioni dei quali cambiano in funzione del tempo di deposizione. I nanocristalli nella fase iniziale di deposizione (tempo di deposizione 5 sec., immagini (a) e (b)) risultano di dimensione 40±10 nm e presentano una forma irregolare. Dopo un tempo di deposizione di 30 minuti i cristalli di idrossiapatite assumono un aspetto aghiforme di lunghezza 160±20 nm e di larghezza e 60±10 nm (immagini (c) e (d)). Durante la prima fase di deposizione del coating, i cristalli sembrano localizzati all’interno delle fibrille collageniche nella zona meno mineralizzata del campione mentre nell’area più mineralizzata si verifica il fenomeno inverso cioè la mineralizzazione avviene all’esterno delle fibrille collageniche. Questo fenomeno lascia supporre che la fase di auto-assemblaggio delle molecole di collagene I private dei telopeptidi, per precipitare poi in forma fibrillare avviene contemporaneamente alla fase di nano-cristallizzazione della carbonato-idrossiapatite. Durante questo processo, la nucleazione dei nanocristalli di idrossiapatite e la loro deposizione all’interno della fibrille di collagene (processo di calcificazione) avviene solamente nel corso della prima fase, mentre la nucleazione dell’apatite sulla superficie delle fibrille avviene in una fase successiva. Questi due differenti processi di mineralizzazione delle fibre di collagene riproducono sostanzialmente il processo osservato durante la preparazione di fibre collagene/nanocristalli di idrossiapatite auto-assemblate in soluzione acquosa. Tuttavia, impiegando il processo di elettrodeposizione è possibile non solo controllare il processo ma anche modulare e localizzare la deposizione sulla superficie del substrato.

L’analisi diffrattometrica a raggi X (vedi Fig. 5) del rivestimento ottenuto secondo la presente invenzione dopo 30 min. di elettrodeposizione mostra i picchi caratteristici della fase minerale HA in corrispondenza dei valori 2 Theta = 32 e 26. In Fig. 5, nell'inserto è riportata una porzione del dififattogramma di un tessuto osseo ad evidenziare un andamento del tutto simile ai campioni ottenuti secondo l'invenzione.

Al fine di verificare la morfologia delle fibrille collageniche depositate all’elettrodo di titanio dopo 30 minuti, alcuni campioni venivano decalcificati in soluzione di EDTA al 10% per 24 ore. Questo processo consente la completa rimozione della fase minerale che avvolge le fibre permettendo una migliore caratterizzazione e quantificazione delle stesse. Le immagini SEM relative al rivestimento sulla lamina di titanio sottoposte a processo di decalcificazione sono rappresentate in Figura 6. Le fibre di collagene si presentano depositate in maniera omogenea sulla superficie di titanio senza alcun orientamento preferenziale; questo lascia intendere che il processo di mineralizzazione non modifichi sostanzialmente la morfologia tipica di questa molecola.

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per rivestire una superficie di un elemento metallico, che comprende: predisporre un bagno elettrolitico comprendente almeno un collagene, ioni calcio e ioni fosfato; immergere in detto bagno elettrolitico almeno un catodo ed almeno un anodo, detto almeno un catodo comprendendo l'elemento metallico da rivestire; far passare corrente elettrica continua attraverso detto bagno elettrolitico così da ottenere su detta superficie una co-deposizione elettrolitica del collagene con un composto calcio-fosfato comprendente idrossiapatite.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui all'inizio della codeposizione il bagno elettrolitico ha un pH compreso tra 3,0 e 4,5, preferibilmente tra 3,5 e 4,0, detto pH innalzandosi in prossimità del catodo ad un valore superiore a 8, preferibilmente compreso tra 10 e 12 durante il processo di co-deposizione senza aggiunta di composti alcalini.
3. 3. Processo secondo la rivendicazione 2, in cui al termine del processo di co-deposizione il bagno elettrolitico ha un pH compreso tra 4,0 e 6,0, preferibilmente tra 4,5 e 5,5.
4. 4. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la co-deposizione elettrolitica viene condotta con una corrente continua sostanzialmente costante.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui la corrente continua ha un valore compreso tra 10 e 60 mA, preferibilmente tra 30 e 40 mA.
6. 6. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un collagene è un collagene di tipo I.
7. 7. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un collagene viene preventivamente sottoposto ad una fase di digestione enzimatica.
8. 8. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto almeno un collagene è presente nel bagno elettrolitico con una concentrazione iniziale compresa tra 0,005 e 0,05% peso/volume, preferibilmente tra 0,01 e 0,02% peso/volume.
9. 9. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui gli ioni calcio sono presenti nel bagno elettrolitico con una concentrazione iniziale compresa compresa tra 0,01 e 0,1 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,06 moli/litro.
10. 10. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui gli ioni fosfato sono presenti nel bagno elettrolitico con una concentrazione iniziale compresa tra 0,01 e 0,10 moli/litro, preferibilmente tra 0,02 e 0,04 moli/litro.
11. 11. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l'elemento metallico comprende titanio od una sua lega.
12. 12. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dalla co-deposizione del collagene e del composto calcio-fosfato si ottiene uno strato avente uno spessore compreso tra 10 nm e 500 nm.
13. 13. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui dalla co-deposizione del collagene e del composto calcio-fosfato si ottiene uno strato avente uno spessore compreso 50 pm e 500 pm, preferibilmente tra 100 pm e 200 pm.
14. 14. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il composto calcio-fosfato comprende almeno il 90% in peso, preferibilmente almeno il 95% in peso, di idrossiapatite.
15. 15. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l'idrossiapatite è presente sottoforma di cristalli aventi morfologia lanceolata appiattita, aventi dimensioni medie del lato più lungo inferiori a 300 nm, preferibilmente comprese tra 100 e 200 nm.
16. 16. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui lo strato ottenuto per co-deposizione elettrolitica comprende: dal 10 a 90% in peso, preferibilmente dal 60 a 70% in peso, di idrossiapatite, e dal 10 al 90% in peso, preferibilmente dal 30 a 40% in peso, di collagene.
17. 17. Dispositivo protesico comprendente almeno un elemento metallico, detto elemento metallico avendo almeno una superficie rivestita con almeno uno strato ottenibile per co-deposizione elettrolitica di un collagene con un composto calcio-fosfato comprendente idrossiapatite.
18. 18. Dispositivo secondo la rivendicazione 17, in cui la co-deposizione elettrolitica è definita secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16.