ITMI20090548A1

ITMI20090548A1 - Processo di rimozione di pesticidi da estratti di ginkgo biloba e estratti ottenibili da detto processo

Info

Publication number: ITMI20090548A1
Application number: IT000548A
Authority: IT
Inventors: Mario Acerbi; Sabrina Arpini; Andrea Giori; Giacomo Mombelli
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2009-04-06
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2010-10-07
Also published as: EP2427662A2; CN102368911A; ES2402235T3; WO2010115566A2; HRP20130151T1; WO2010115566A3; US9504270B2; BRPI1016023A8; RU2011140482A; IL215546A; RU2514673C2; KR101350433B1; SG175065A1; WO2010115566A8; JP5745499B2; EP2554054A1; CA2757925C; IL215546A0; BRPI1016023A2; AU2010234008A1

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“PROCESSO DI RIMOZIONE DI PESTICIDI DA ESTRATTI DI GINKGO BILOBA E ESTRATTI OTTENIBILI DA DETTO PROCESSO”

La presente invenzione ha per oggetto un processo di rimozione di pesticidi da estratti di Ginkgo biloba e estratti ottenibili da detto processo.

Stato della tecnica

Gli estratti di foglie di Ginkgo biloba sono da tempo usati nella medicina tradizionale Cinese e in numerosi Paesi occidentali grazie alle molteplici proprietà farmacologiche attribuite ai componenti di detti estratti (vasodilatatori, immunostimolanti, antiossidanti, antiaggreganti).

Processi di preparazione di estratti di foglie di Ginkgo biloba sono descritti in US 5700468, EP 360 556, EP 431 535 e JP 09110713.

Nella coltivazione delle piante impiegate per la produzione di detti estratti si è fatto ricorso, in particolar modo nel passato, all’uso di pesticidi quali organofosforici, la cui tossicità è ampiamente documentata. Sebbene molte Autorità Sanitarie e Agriculturali abbiano bandito o limitato l’uso di tali pesticidi, non è sempre agevole controllare la provenienza del materiale vegetale e, anche nei Paesi dove l’uso dei pesticidi è stato regolamentato, non è possibile escludere usi illeciti o impropri di sostanze ad azione pesticida la cui presenza nell’estratto di grado farmaceutico o nutrizionale è assolutamente indesiderata. Un fenomeno tra l’altro particolarmente insidioso è quello della possibilità contaminazione incrociata da pesticidi provenienti da coltivazioni vicine di altre colture.

Il problema della contaminazione in generale è discusso in Journal of AOAC International, Vol. 88(3), 2005,729-735, dove è anche descritto un metodo per la determinazione per via gas cromatografica del contenuto di pesticidi organofosforici in foglie di Ginkgo.

US 5,660,832 descrive un processo generale di purificazione di estratti vegetali da pesticidi che comprende l’estrazione con un solvente polare in uno specifico intervallo di pH seguita da assorbimento e de-assorbimento su resine. Nel caso delle foglie di Ginkgo biloba l’estrazione viene effettuata con una miscela di etanolo e acqua.

I pesticidi non sono gli unici contaminanti indesiderabili negli estratti di Ginkgo biloba: EP 1 968 625 descrive ad esempio un metodo di preparazione multi-stadio di un estratto di Ginkgo biloba avente un ridotto contenuto di 4’-O-metil piridossina, nota anche come ginkgo-tossina, e/o biflavoni. In questo caso, tuttavia, i componenti indesiderati sono naturalmente presenti nella pianta.

EP 1 868 626 descrive infine un metodo di preparazione di estratti di Ginkgo biloba aventi un ridotto contenuto di idrocarburi policiclici aromatici derivanti dall’uso di combustibili fossili in prossimità delle coltivazioni di Ginkgo. Il procedimento descritto è molto complesso, comprendendo undici stadi, tempi lunghi e l’uso di reagenti costosi quali poliammidi o tossici quali sali di piombo.

Praticamente tutti i processi noti prevedono una o più fasi di rimozione dei componenti lipofili dell’estratto di Ginkgo (in particolare biflavoni e ginkgoli). Tale estrazione riduce anche il contenuto di pesticidi liofili eventualmente presenti mentre pesticidi a maggiore polarità rimangono comunque nell’estratto, avendo un comportamento più simile a quello dei componenti idrofili (come flavonglucosidi e terpeni).

Esiste pertanto la necessità di un metodo di purificazione conveniente che consenta di ridurre o eliminare i pesticidi o altri agenti inquinanti dagli estratti di foglie di Ginkgo biloba, allo scopo di rispettare tra l’altro i limiti previsti dalle normative vigenti, in particolare negli Stati Uniti, sul contenuto residuo di pesticidi di qualsiasi tipo in prodotti di origine vegetale per uso farmaceutico, nutrizionale e cosmetico.

Descrizione dell’invenzione

Si è ora trovato che è possibile ridurre il contenuto di pesticidi in estratti di Ginkgo biloba attraverso un processo che comprende:

a) Estrazione liquido-liquido dell’estratto per ottenere una frazione a media polarità comprendente ginkgoterpeni e pesticidi non rimuovibili con esano e una frazione ad alta polarità contenente i ginkgoflavonglucosidi;

b) cristallizzazione dalla frazione a media polarità ottenuta nella fase a) a dare un intermedio con un contenuto di ginkgolidi non inferiore al 50%;

c) cristallizzazione dalla soluzione residua ottenuta nella fase b) a dare un intermedio con un contenuto di bilobalide non inferiore al 50%;

d) miscelazione della frazione ad alta polarità ottenuta nella fase a) con l’intermedio di ginkgoterpeni e l’intermedio di bilobalide ottenuti negli stadi b) e c).

Il processo dell’invenzione, oltre all’eliminazione o sostanziale riduzione nel contenuto di pesticidi residui, consente anche di controllare il contenuto di ginkgoterpeni e il loro rapporto relativo.

L’invenzione riguarda pertanto anche gli estratti ottenibili dal processo sopra definito, a rapporto pre-determinato di ginkgoterpeni.

Secondo l’invenzione, nella fase a) si ottiene una frazione arricchita in ginkgoterpeni e una arricchita in ginkgo flavon glucosidi per estrazione con un solvente immiscibile con acqua scelto tra esteri, idrocarburi clorurati, miscele di idrocarburi e alcoli, chetoni e misceli di chetoni e alcoli, preferibilmente un estere C2-C8, quale acetato di etile e t-butil acetato o una miscela toluene-butanolo.

La cristallizzazione dei ginkgoterpeni viene effettuata in miscele acqua e alcoli C1-C5 mentre la cristallizzazione dalla frazione ricca in terpeni della fase c) è effettuata in acqua o in miscela acqua ed alcoli C1-C3.

Il procedimento dell’invenzione consente di eliminare i pesticidi a media polarità che non vengono rimossi con i ginkgoli.

L’invenzione è illustrata in maggior dettaglio nei seguenti esempi.

Esempio 1: Purificazione dell’estratto prodotto secondo l’esempio I di US 5700468, EP 0 360 556 (Indena)

1) 100 kg di foglie macinate sono estratti 4 volte con 400 l di Acetone 60% p/p ad una temperatura di ca. 50°C.

2) I percolati riuniti sono estratti in controcorrente con 500 l di Esano.

3) La soluzione sgrassata viene concentrata sotto vuoto fino al volume di 200 l, lasciata a 2°C per una notte, quindi centrifugata per separare la frazione dei biflavoni.

4) La soluzione acquosa è estratta in controcorrente con 400 l di una miscela di n-butanolo/toluene 8/2 v/v.

5) La soluzione organica viene concentrata sotto vuoto a piccolo volume, sostituendo con acqua. Si riprende con acqua in modo da ottenere una soluzione con residuo secco del 30% ca.

6) Si estrae in controcorrente con ca. 65 l di Etile acetato. Si concentra a molle la fase acquosa e si essicca sotto vuoto, ottenendo un intermedio ricco in ginkgo flavon glucosidi e privo di terpeni (1,95 kg).

7) Si concentra la fase etilacetica a molle sotto vuoto, quindi si riprende il residuo con 3 l di etanolo acquoso al 75%.

8) Si estrae in controcorrente con 20 l di esano, eliminando le fasi organiche riunite.

9) Si concentra la soluzione idroalcolica a molle sotto vuoto, quindi si aggiungono 0,9 l di etanolo acquoso al 50%.

Si riscalda a ricadere sotto agitazione, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 4 giorni.

10) Si filtra e si lava il solido con EtOH 50%, quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 95 g di ginkgolidi purificati.

11) Si concentrano s.v. le acque madri per eliminare l’etanolo, quindi si riprende il residuo con 1,9 l di acqua e si riscalda a 90°C sotto agitazione per 30 minuti. Si separa la soluzione acquosa, quindi il residuo viene ripreso altre 3 volte con 1,9 l di acqua a 90°C recuperando ogni volta la soluzione acquosa.

12) Si riuniscono le soluzioni acquose e si estrae in controcorrente con 14 l di esano.

13) Si concentra la soluzione acquosa fino al volume di 0,3 l e si aggiungono 0,1 l di EtOH 95°, si riscalda a 50°C, sotto agitazione, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 3 giorni.

14) Si filtra, si lava il solido con EtOH 20%, e quindi si essicca sotto vuoto, ottenendo 103 g di bilobalide purificato.

15) Si miscelano i prodotti dei punti 6, 10 e 14 a dare 2,15 kg di Ginkgo biloba estratto con le seguenti caratteristiche: - Ginkgoflavonglucosidi 26,0% - Bilobalide 3,2% - Ginkgolidi 3,5% - Acidi Ginkgolici < 5,0 ppm -Ogni pesticida < 10 ppb.

Esempio 2: Purificazione dell’estratto prodotto secondo l’esempio II di US 5700468, EP 0 360 556 (Indena)

1) 100 kg di foglie macinate sono estratti 4 volte con 400 l di Metanolo 50% p/p ad una temperatura di 35°C.

2) I percolati riuniti sono concentrati a 100 l sotto vuoto a 40°C, il concentrato è ripreso con 100 l di metanolo e la sospensione ottenuta è filtrata.

3) La soluzione filtrata è estratta 3 volte con 100 l di miscela toluene/n-butanolo 9:2.

4) Le fasi organiche riunite sono controlavate con 50 l di metanolo 50%.

5) Le soluzioni idrometanoliche sono concentrate sotto vuoto ad acqua e, dopo filtrazione, sono estratte con una miscela n-butanolo/toluene 8:2.

6) La soluzione organica è contro lavata con acqua e concentrata sotto vuoto a piccolo volume, sostituendo con acqua. Si riprende con acqua in modo da ottenere una soluzione con residuo secco del 20%.

7) Si estrae in controcorrente con 90 l di miscela n-butanolo/toluene 1:1. Si concentra a molle la fase acquosa e si essicca sotto vuoto, ottenendo un intermedio ricco in ginkgo flavon glucosidi e privo di terpeni (2,05 kg).

8) Si concentra la miscela n-butanolo/toluene a molle sotto vuoto, quindi si riprende il residuo con 3,5 l di etanolo acquoso al 60%.

9) Si estrae in controcorrente con 20 l di esano, eliminando le fasi organiche riunite.

10) Si concentra la soluzione idroalcolica a molle sotto vuoto, quindi si aggiungono 1,2 l di etanolo acquoso al 40%.

Si riscalda a ricadere sotto agitazione per 45 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 3 - 4 giorni.

11) Si filtra e si lava il solido con EtOH 40%, quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 97 g di ginkgolidi purificati.

12) Si concentrano s.v. le acque madri per eliminare l’etanolo, quindi si riprende il residuo con 2 l di acqua e si riscalda a 90°C sotto agitazione per 30 minuti. Si separa la soluzione acquosa, quindi il residuo viene ripreso altre 3 volte con 2 l di acqua a 90°C recuperando ogni volta la soluzione acquosa.

13) Si riuniscono le soluzioni acquose e si estrae in controcorrente con 17 l di esano.

14) Si concentra la soluzione acquosa fino al volume di 0,4 l e si aggiungono 0,15 l di EtOH 95°, si riscalda a 50 - 55°C, sotto agitazione, per 30 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 3 - 4 giorni.

15) Si filtra, si lava il solido con EtOH 20%, e quindi si essicca a 60°C sotto vuoto, ottenendo 110 g di bilobalide purificato.

16) Si miscelano i prodotti dei punti 7, 11 e 15 a dare 2,26 kg di Ginkgo biloba estratto analogo a quello dell’esempio 1.

Esempio 3: Purificazione dell’estratto prodotto secondo l’esempio I di EP 431 535 (Schwabe)

1) 100 kg di foglie macinate sono estratti 2 volte con 750 kg di acetone 60% p/p per 30 minuti ad una temperatura di 57-59°C.

2) Gli estratti riuniti sono concentrati ad acqua fino ad un residuo secco del 30-40%, quindi si aggiunge un pari volume di acqua e la miscela si lascia sotto agitazione per un’ora a 12°C.

3) Si separa per centrifugazione il precipitato ricco di alchilfenoli, che si elimina.

4) La soluzione chiarificata è addizionata del 30% di ammonio solfato sotto agitazione, quindi la soluzione è estratta due volte con mezzo volume di miscela metiletilchetone/acetone 6:4.

5) Le soluzioni riunite di metiletilchetone/acetone sono concentrate sotto vuoto fino ad un residuo secco del 50-70%, quindi si diluiscono con acqua ed etanolo 95% per ottenere una soluzione di etanolo 50% con residuo secco del 10%.

6) Si aggiunge sotto agitazione una soluzione acquosa di piombo idrossido acetato fino a viraggio del colore da marrone a marrone chiaro. Il precipitato ottenuto è eliminato per centrifugazione.

7) La soluzione centrifugata è estratta 3 volte con 1/3 di volume di esano.

8) La soluzione sgrassata viene concentrata ad acqua sotto vuoto, quindi viene addizionata del 20% di ammonio solfato ed estratta due volte con mezzo volume di miscela metiletilchetone/etanolo 6:4. Le fasi organiche riunite sono lavate con il 20% di ammonio solfato, rimuovendo l’acqua ed il solido eventualmente formati.

9) La soluzione limpida viene quindi concentrata sotto vuoto a piccolo volume, sostituendo con acqua.

Si riprende con acqua in modo da ottenere una soluzione con residuo secco del 10% ca.

10) Si estrae in controcorrente con ca. 100 l di t-butile acetato. Si concentra a molle la fase acquosa e si essicca sotto vuoto, ottenendo un intermedio ricco in ginkgo flavon glucosidi e privo di terpeni (1,88 kg).

11) Si concentra la fase butilacetica a molle sotto vuoto quindi si aggiungono 0,8 l di etanolo acquoso al 60%.

Si riscalda a ricadere sotto agitazione per 25 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 2 giorni.

12) Si filtra e si lava il solido con EtOH 60%, quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 98 g di ginkgolidi purificati.

13) Si concentrano s.v. le acque madri per eliminare l’etanolo, quindi si riprende il residuo con 1,9 l di acqua e si riscalda a 90°C sotto agitazione per 30 minuti. Si separa la soluzione acquosa, quindi il residuo viene ripreso altre 3 volte con 1,9 l di acqua a 90°C recuperando ogni volta la soluzione acquosa.

14) Si concentrano le soluzioni acquose riunite fino al volume di 0,6 l e si riscalda a 70°C, sotto agitazione, per 60 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 1 giorno.

15) Si filtra, si lava il solido con acqua, e quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 99 g di bilobalide purificato.

16) Si miscelano i prodotti dei punti 10, 12 e 15 a dare 2,08 kg di Ginkgo biloba estratto analogo a quello dell’esempio 1.

Esempio 4: Purificazione dell’estratto prodotto secondo JP 09110713 (Nippon Green wave)

1) 100 kg di foglie di ginkgo macinate sono estratti 3 volte con 500 l di etanolo 70% a 50°C per 30 ore.

2) I percolati riuniti sono concentrati a 100 l sotto vuoto e il concentrato è ripreso con 100 l di acqua.

La sospensione ottenuta è filtrata.

3) La soluzione filtrata viene caricata su una colonna cromatografica contenente 100 l di resina HP20 (Mitsubishi) per adsorbire l’estratto. La colonna è quindi lavata con 200 l di acqua e l’estratto è recuperato eluendo con 200 l di etanolo 70%.

4) La soluzione idroetanolica è concentrata sotto vuoto a piccolo volume, sostituendo con acqua. Si riprende con etanolo al 20% in modo da ottenere una soluzione con residuo secco del 20%.

5) Si estrae in controcorrente con 70 l di cloruro di metilene. Si concentra a molle la fase idroetanolica e si essicca sotto vuoto, ottenendo un intermedio ricco in ginkgo flavon glucosidi e privo di terpeni (2,4 kg).

6) Si concentra la fase clorometilenica a molle sotto vuoto, quindi si riprende il residuo con 4 l di metanolo acquoso al 75%.

7) Si estrae 10 volte con 2 l di esano, eliminando le fasi esaniche riunite.

8) Si concentra la soluzione idroalcolica a molle sotto vuoto, quindi si aggiunge 1 l di metanolo acquoso al 50%.

Si riscalda a ricadere sotto agitazione per 30 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 5 giorni.

9) Si filtra e si lava il solido con MeOH 50%, quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 105 g di ginkgolidi purificati.

10) Si concentrano s.v. le acque madri per eliminare il metanolo, quindi si riprende il residuo con 2 l di acqua e si riscalda a 90°C sotto agitazione per 30 minuti. Si separa la soluzione acquosa, quindi il residuo viene ripreso altre 3 volte con 2 l di acqua a 90°C recuperando ogni volta la soluzione acquosa.

11) Si concentrano le soluzioni acquose riunite fino al volume di 0,4 l e si aggiungono 0,1 l di MeOH, si riscalda a 50°C, sotto agitazione, per 30 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 3 giorni.

12) Si filtra, si lava il solido con MeOH 20%, e quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 102 g di bilobalide purificato.

13) Si miscelano i prodotti dei punti 5, 9 e 12 a dare 2,6 kg di Ginkgo biloba estratto analogo a quello dell’esempio 1.

Esempio 5: Purificazione di un estratto purificato contenente pesticidi e ad alto contenuto di terpeni

1) 1 kg di estratto di ginkgo biloba foglie contenente il 24% di ginkgoflavonglusidi, il 12% di ginkgo terpeni, 2 ppm di acidi ginkgolici e 315 ppb di chlorpyriphos e triciclazolo viene sospeso sotto agitazione in 5 l di acqua.

2) Si estrae 12 volte con 5 l di Etile acetato a temperatura ambiente. Si concentra a molle la fase acquosa e si essicca sotto vuoto, ottenendo un intermedio ricco in ginkgo flavon glucosidi e privo di terpeni (810 g).

3) Si concentrano le fasi etilacetiche riunite a molle sotto vuoto, quindi si riprende il residuo con 2 l di etanolo acquoso al 50%.

Si riscalda a ricadere sotto agitazione per 1 ora, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 2 giorni.

4) Si filtra e si lava il solido con EtOH 50%, quindi si essicca sotto vuoto ottenendo 82 g di ginkgolidi purificati.

5) Si concentrano s.v. le acque madri per eliminare l’etanolo, quindi si riprende il residuo con 2 l di acqua e si riscalda a 90°C sotto agitazione per 15 minuti. Si separa la soluzione acquosa, quindi il residuo viene ripreso una seconda volta con 2 l di acqua a 90°C, recuperando la soluzione acquosa.

6) Si riuniscono le soluzioni acquose e si concentrano a molle sotto vuoto, riprendendo poi il residuo con 400 ml di EtOH 10%. Si riscalda a 50°C, sotto agitazione, per 60 minuti, quindi si raffredda a temperatura ambiente e si lascia in cristallizzazione per 2 giorni.

7) Si filtra, si lava il solido con EtOH 10% e quindi si essicca sotto vuoto, ottenendo 70 g di bilobalide purificato.

8) Al prodotto ottenuto al punto 2 si miscelano 41 g di ginkgolidi purificati e 35 g di bilobalide purificato a dare 885 g di Ginkgo biloba estratto con le seguenti caratteristiche: a. Ginkgoflavonglucosidi 27% b. Ginkgoterpeni 6,8% c. Acidi Ginkgolici 1,0 ppm d. Ogni pesticida < 10 ppb.

È da sottolineare che il processo descritto permette sia di rimuovere i pesticidi sia di controllare il contenuto di terpeni negli estratti di ginkgo biloba, modulandolo a piacere in fase di miscelazione degli intermedi purificati. Il rapporto 24/6 (GFG/GT) considerato ottimale negli estratti è infatti spesso diverso dal rapporto naturale che si riscontra nelle droghe. Le foglie cinesi, ad esempio, hanno spesso un contenuto di terpeni più elevato e per poter ottenere estratti conformi è indispensabile un passaggio di riduzione del titolo dei ginkgoterpeni.

Nella tabella si riportano i contenuti dei pesticidi negli estratti ottenuti secondo le procedure descritte sopra. Per ogni esempio sono state eseguite due prove, la prima seguendo esattamente la procedura del brevetto, la seconda inserendo il trattamento della frazione terpenica.

Tutti gli estratti sono stati ottenuti dalla stessa droga.

Esempio 1 – Rif. brevetti Esempio 2 – Rif. brevetti Esempio 3 – Rif. brevetto Esempio 4 – Rif. brevetto Indena US 5700468, Indena US 5700468, Schwabe EP 0431535 B1; Nippon green Wave J09110713 EP 03600556 B1; EP 03600556 B1; example I

example I example II Non on

depestificatoDepestificato Non

depestificatoDepestificato N

depestificatoDepestificato Tricyclazole

(ppb) 85 < 10 55 < 10 63 < 10 212 < 10 Acetamiprid

(ppb) 24 < 10 16 < 10 27 < 10 92 < 10 Imidaclopri

d (ppb) 48 < 10 37 < 10 45 < 10 175 < 10 Phorate

(ppb) 33 < 10 28 < 10 26 < 10 84 < 10

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Processo per la rimozione di pesticidi da estratti di Ginkgo biloba che comprende il sottoporre un estratto ottenuto con metodi convenzionali ai seguenti stadi: a. Estrazione liquido-liquido dell’estratto per ottenere una frazione a media polarità comprendente ginkgoterpeni e pesticidi non rimuovibili con esano e una frazione ad alta polarità contenente i ginkgoflavonglucosidi; b. cristallizzazione dalla frazione a media polarità ottenuta nella fase a) a dare un intermedio con un contenuto di ginkgolidi non inferiore al 50%; c. cristallizzazione dalla soluzione residua ottenuta nella fase b) a dare un intermedio con un contenuto di bilobalide non inferiore al 50%; d. miscelazione della frazione ad alta polarità ottenuta nella fase a) con l’intermedio di ginkgoterpeni e l’intermedio di bilobalide ottenuti negli stadi b) e c).
2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui l’estrazione della fase a) è effettuata con un solvente immiscibile con acqua scelto tra esteri, idrocarburi clorurati, miscele di idrocarburi e alcoli, chetoni e misceli di chetoni e alcoli.
3. Processo secondo la rivendicazione 2 in cui il solvente è un estere avente da 2 a 8 atomi di carbonio.
4. Processo secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui la cristallizzazione dei ginkgoterpeni viene effettuata in miscele acqua e alcoli
5. Processo secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui la cristallizzazione dalla frazione ricca in terpeni della fase c) è effettuata in acqua o in miscela acqua ed alcoli C1-C3.
6. Estratti ottenibili dal processo delle rivendicazioni da 1 a 5, a rapporto pre-determinato di ginkgoterpeni.