ITMI20102007A1 - Metodo e kit per la diagnosi della iga nefropatia - Google Patents

Metodo e kit per la diagnosi della iga nefropatia Download PDF

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ITMI20102007A1
ITMI20102007A1 IT002007A ITMI20102007A ITMI20102007A1 IT MI20102007 A1 ITMI20102007 A1 IT MI20102007A1 IT 002007 A IT002007 A IT 002007A IT MI20102007 A ITMI20102007 A IT MI20102007A IT MI20102007 A1 ITMI20102007 A1 IT MI20102007A1
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IT
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rna
mir
iga nephropathy
rnas
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Fabio Sallustio
Francesco Paolo Schena
Grazia Serino
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Univ Bari
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Description

DESCRIZIONE
Riassunto dell’invenzione
La presente invenzione ha per oggetto un nuovo metodo per la diagnosi della glomerulonefrite a depositi mesangiali di IgA (IgA nefropatia) basato sulla rilevazione di un aumento dei livelli di espressione di alcuni microRNA (mi-RNA). L’invenzione concerne anche l’uso dei mi-RNA per la diagnosi della malattia, un kit diagnostico e l’uso dei mi-RNA antisenso per il trattamento e/o la prevenzione della malattia.
Contesto Tecnico
L’IgA nefropatia, la malattia renale primitiva più frequente, si verifica a qualsiasi età, ma in particolar modo nei bambini e nei giovani adulti. E’ sei volte più frequente nei maschi rispetto alle donne. La sua prevalenza, confrontata con quella di tutte le altre glomerulopatie primitive, à ̈ del 5% negli USA, del 10-20% nell'Europa meridionale e in Australia e del 30-40% in Asia. In circa il 50% dei pazienti con ematuria ricorrente si dimostrano depositi mesangiali di IgA e in circa la metà di questi pazienti vi à ̈ un aumento delle IgA sieriche. Sono state documentate alterazioni delle sottopopolazioni linfocitarie. I dati suggeriscono che la IgA nefropatia à ̈ causata da aumentata produzione e/o ridotta clearance dei complessi polimerici IgA-antigene che si depositano nel mesangio dei glomeruli. Probabilmente le IgA polimeriche derivano dalle superfici delle mucose e dal midollo osseo.
Il meccanismo patogenetico di questa malattia à ̈ ancora del tutto sconosciuto, tuttavia fattori genetici sembrano giocare un ruolo chiave nella suscettibilità alla malattia. I depositi mesangiali di IgA1 deglicosilate a livello glomerulare e gli episodi ricorrenti di ematuria macroscopica in concomitanza di infezioni delle alte vie respiratorie o microematuria persistente con o senza proteinuria costituiscono gli elementi per la diagnosi.
A tutt’oggi, la diagnosi certa di IgA nefropatia viene effettuata solo con la biopsia renale, procedura invasiva e per questo non facilmente applicabile come analisi routinaria a fini diagnostici. In pazienti o familiari di pazienti con sola microematuria persistente non à ̈ facile eseguire la biopsia renale perchà ̈ viene spesso rifiutata dal soggetto.
Pertanto, esiste l’esigenza di nuovi marcatori biologici che possano consentire di migliorare le possibilità diagnostiche con l’identificazione di malattie in fase precoce senza eseguire la biopsia renale.
Negli ultimi anni, nella ricerca medica particolare interesse hanno destato piccole molecole di RNA chiamate microRNA (mi-RNA) che regolano l’espressione di geni inibendo la trascrizione di RNA messaggero in proteine o favorendo la degradazione dell’RNA messaggero di specifici geni. E’ stato dimostrato che esiste un profilo unico di espressione dei mi-RNA per ogni malattia e che l’espressione alterata di uno o più mi-RNA à ̈ specifico di ogni patologia. E’ stato ad esempio suggerito che profili di espressione genica, in particolare “microRNA profiling†, siano utili sia nella diagnosi e nella prognosi del cancro.
Scopi dell’invenzione
Scopo della presente invenzione à ̈ fornire un metodo diagnostico per la IgA nefropatia che non sia invasivo, che possa pertanto essere impiegato in modo routinario e che sia accettato di buon grado dal paziente, superando così gli svantaggi dei metodi della tecnica anteriore.
Un altro scopo dell’invenzione à ̈ fornire un kit per la messa in opera del metodo dell’invenzione.
Un ulteriore scopo dell’invenzione à ̈ fornire un medicamento per la cura e la prevenzione della IgA nefropatia.
Descrizione dell’invenzione
Questi ed altri scopi sono raggiunti dall’invenzione che, secondo uno dei suoi aspetti, ha per oggetto un mi-RNA che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 per l’uso nella diagnosi della glomerulonefrite a depositi mesangiali di IgA, qui di seguito anche solo “IgA nefropatia†.
I mi-RNA usati secondo l’invenzione sono scelti tra i seguenti:
†hsa-miR-148b : UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU (SEQ. ID No.1) †hsa-let-7b : UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEQ. ID No.2)
†hsa-let7d : AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU (SEQ. ID No.3)
†hsa-miR-361-3p : UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU (SEQ. ID No.4) †hsa-miR-886-3p : CGCGGGUGCUUACUGACCCUU (SEQ. ID No.5) †hsa-miR-188-5p : CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG (SEQ. ID No.6) Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un mi-RNA che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 per il suo uso come marcatore della IgA nefropatia.
Con i termini “diagnosi†o “diagnosticare†si intende qui indicare la verifica sia della malattia IgA conclamata sia la predisposizione a sviluppare la malattia.
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, il mi-RNA à ̈ miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No 1.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un metodo per la diagnosi di IgA nefropatia che comprende valutare l’espressione di almeno un mi-RNA scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 in un campione biologico di un soggetto, in cui un aumento dell’espressione di detti mi-RNA indica la presenza di IgA nefropatia o la predisposizione a sviluppare la IgA nefropatia.
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, il metodo à ̈ caratterizzato dal fatto che detto almeno un mi-RNA à ̈ miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No.1.
Secondo un aspetto particolarmente preferito dell’invenzione, il metodo à ̈ caratterizzato dal fatto che comprende valutare l’espressione di miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No. 1 e di almeno un altro mi-RNA scelto tra le sequenze SEQ. ID No. 2-6, oppure l’espressione di miR-148b e di almeno altri due, tre, quattro o cinque mi-RNA delle sequenze SEQ. ID No.2-6 o in alternativa di tutti e sei i mi-RNA come sopra definiti. Il termine “espressione†come qui usato si riferisce alla quantità di una particolare sequenza di mi-RNA che viene trascritta dal suo locus genico, in altre parole alla concentrazione del mi-RNA nel campione analizzato.
Secondo la presente invenzione, si considera che ci sia un “aumento dell’espressione†di mi-RNA se i livelli di espressione di detto mi-RNA nel campione, rispetto a un campione controllo, sono superiori di almeno il 5%, preferibilmente 10%, preferibilmente di almeno il 20-30% e più preferibilmente del 35-50%.
Per “campione biologico†si intende qui indicare qualsiasi elemento isolato dal corpo del soggetto su cui si possa applicare il metodo dell’invenzione, cioà ̈ un campione biologico che contenga i mi-RNA sopra definiti. Tale campione biologico può essere ad esempio il sangue intero, ad esempio sangue periferico, i linfomonociti periferici, il siero, il plasma, o campioni derivati dalla mucosa buccale. Nel metodo dell’invenzione, il livello di espressione di ciascun mi-RNA può essere determinato normalizzando il suo livello di espressione rispetto ad un controllo interno nello stesso soggetto in modo tale da avere un valore di espressione normalizzato detto ï „Ct. Questo rappresenterà un valore soglia di tipo predittivo.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un kit diagnostico per la diagnosi di IgA nefropatia che comprende almeno un mi-RNA antisenso rispetto ai miRNA delle SEQ. ID No.: 1-6.
Secondo la presente invenzione, due molecole di acido nucleico (cioà ̈ la molecola “senso†e la molecola “antisenso†) possono essere perfettamente complementari, a significare che non contengono nessuna base “mismatched†e/o nucleotidi addizionali. Secondo questa forma di realizzazione dell’invenzione pertanto, i mi-RNA antisenso sono costituiti dalle sequenze SEQ.ID.No. 7-18, perfettamente complementari rispetto alle sequenze dei mi-RNA aventi le sequenze SEQ.ID.No. 1-6. In alternativa, le molecole antisenso possono avere qualche base “mismatched†(cioà ̈ alcune basi che non si appaiano con le corrispondenti basi del mi-RNA senso) o possono essere differenti nel numero di nucleotidi totali (per addizioni o delezioni).
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, le molecole antisenso sono perfettamente complementari con le molecole di mi-RNA aventi le sequenze SEQ.ID.No.1-6.
In particolare, i mi-RNA antisenso per l’uso secondo l’invenzione hanno una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 7-18 seguenti:
†anti-miR-148b: ACAAAGTTCTGTGATGCACTGA (SEQ. ID No. 7) , ACAAAGTTCTGTGATGCAC (SEQ. ID No.8)
†anti-let-7b: AACCACACAACCTACTACCTCA (SEQ. ID No. 9), AACCACACAACCTACTACC (SEQ. ID No.10)
†anti-let-7d: AACTATGCAACCTACTACCTCT (SEQ. ID No. 11), AACTATGCAACCTACTACC SEQ. ID No.12)
†anti-miR-361-3p: AAATCAGAATCACACCTGGGGGA (SEQ. ID No. 13), AAATCAGAATCACACCTGG (SEQ. ID No.14)
†anti-miR-886-3p: AAGGGTCAGTAAGCACCCGCG (SEQ. ID No. 15), AAGGGTCAGTAAGCACCCG (SEQ. ID No.16)
†anti-miR-188-5p: CCCTCCACCATGCAAGGGATG (SEQ. ID No. 17), CTCCACCATGCAAGGGATG (SEQ. ID No.18).
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, il kit dell’invenzione à ̈ caratterizzato dal fatto che detto almeno un mi-RNA antisenso à ̈ miR-148b-antisenso scelto tra le sequenze SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No.8.
Secondo un aspetto particolarmente preferito dell’invenzione, il kit diagnostico secondo l’invenzione à ̈ caratterizzato dal fatto che comprende miR-148b-antisenso avente la sequenza SEQ. ID No 7 o SEQ. ID No. 8 e almeno un altro mi-RNA antisenso scelto tra le sequenze SEQ. ID No. 9-18, oppure che comprende miR-148b senso e almeno altri due o più mi-RNa antisenso delle sequenze SEQ. ID No.9-18 o in alternativa tutti e dodici i mi-RNA antisenso come sopra definiti.
I mi-RNA antisenso per il kit secondo l’invenzione possono essere variamente marcati, ad esempio con molecole fuorescenti. I mi-RNA antisenso marcati per il kit secondo l’invenzione costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione.
Il kit dell’invenzione deputato alla rilevazione dei mi-RNA può ad esempio utilizzare la Real-Time PCR e può pertanto comprendere, oltre ad una piastra per Real-Time, i primer (sonde) marcati con molecole fluorescenti che vanno a determinare in maniera specifica l’espressione di ciascun mi-RNA, i reagenti per l’estrazione dei mi-RNA, i reagenti per la retrotrascrizione e quelli necessari per la reazione di amplificazione, come ben noto all’esperto del ramo.
Con il termine “primer†o “sonda†si intende qui riferirsi alle sequenze di mi-RNA antisenso come sopra definite.
Secondo una forma di realizzazione, il kit dell’invenzione deputato alla rilevazione dei mi-RNA aventi le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 può ad esempio utilizzare un saggio di ibridazione in soluzione basato sulla acquisizione in chemiluminescenza. Il kit può comprendere un pool di sonde, preferibilmente dei mi-RNA antisenso scelti nelle sequenze SEQ. ID No.7-18, una piastra rivestita da anticorpi (Ab) primari (ad esempio piastra multi pozzetto per test ELISA) in grado di riconoscere e legare sequenze a doppio filamento, anticorpi secondari marcati con un enzima in grado di riconoscere l’avvenuto legame Ab primario-sequenza a doppio filamento, i reagenti necessari al riconoscimento Ab primario-sequenza doppio filamento e Ab secondario-complesso Ab primario-sequenza doppio filamento, come ben noto all’esperto del ramo. In particolare l’enzima impiegato à ̈ in grado di trasformare substrati incolori e solubili, in prodotti colorati che precipitano nel punto stesso in cui à ̈ avvenuto il riconoscimento (ad esempio può essere utilizzata fosfatasi alcalina o perossidasi). L’avvenuta reazione può essere rilevata e quantificata mediante un luminometro.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un mi-RNA antisenso che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 7-18 per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione di IgA nefropatia.
Secondo un aspetto vantaggioso dell’invenzione, detto mi-RNA antisenso à ̈ caratterizzato dal fatto che à ̈ miR-148b antisenso avente sequenza scelta tra SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No. 8 con o senza modificazioni chimiche che permettono la somministrazione in vivo (ad esempio con fosforotioato o con per trasformazione in LNA (“Locked Nucleic Acid†)).
Secondo un aspetto particolarmente preferito dell’invenzione, per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione di IgA nefropatia si utilizza un miR-148b-antisenso, vantaggiosamente scelto tra le sequenze SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No 8 e almeno un altro mi-RNA antisenso scelto tra le sequenze SEQ. ID No. 9-18, oppure che comprende miR-148b senso e almeno altri due, tre o più mi-RNa antisenso delle sequenze SEQ. ID No. 7-18 o in alternativa tutti i mi-RNA antisenso come sopra definiti
Per l’uso nel trattamento secondo l’invenzione, le molecole di mi-RNA antisenso come sopra definite, sono formulate in composizioni farmaceutiche preparate secondo le tecniche ben note all’esperto del ramo somministrate mediante infusione intravenosa. I target dei mi-RNA evidenziati dall’analisi bioinformatica sono stati studiati utilizzando vari database.
E’ stato così trovato che i mi-RNA sopra definiti (hsa-miR-148b, hsa-let-7b, hsa-let-7d, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-188-5p) sono coinvolti nella patogenesi della IgA nefropatia. Tra questi, il miR-148b presenta come target computazionale l’enzima core 1,β-1,3-Galactosiltransferasi (c1GALT1), notoriamente coinvolto nella IgA nefropatia, in quanto responsabile della alterata glicosilazione delle IgA1.
Sono stati validati poi i risultati di espressione dei mi-RNA ottenuti con i microarray su un gruppo indipendente di soggetti mediante Real-Time PCR effettuata su mi-RNA estratti dai linfomonociti periferici dal sangue di 20 soggetti (10 pazienti con IgA nefropatia e 10 soggetti sani). I risultati della Real-Time PCR hanno confermato quelli dei microarray. Anche in questo caso i mi-RNA in questione risultavano significativamente e maggiormente espressi nei soggetti con IgA nefropatia rispetto a quelli sani.
Allo stesso modo, si à ̈ valutato se l’espressione dei 6 mi-RNA come sopra definiti fosse specifica della IgA nefropatia o comune ad altre patologie renali. A questo scopo, sono stati valutati i livelli di espressione dei 6 mi-RNA nei linfomonociti periferici isolati dal sangue intero di 5 pazienti con glomerulosclerosi focale segmentale (GSFS), mediante Real-Time PCR, comparandoli con i valori di espressione ottenuti dai pazienti con IgA nefropatia e dai soggetti normali. I risultati ottenuti mostrano che l’aumentata espressione dei 6 mi-RNA à ̈ specifica della IgA nefropatia.
Sono stati poi validati sperimentalmente i geni target regolati dai mi-RNA che erano stati precedentemente individuati attraverso l’analisi bioinformatica. Per fare ciò, sono stati aumentati o ridotti i livelli di mi-RNA nei linfomonociti in coltura, derivati da controlli e da pazienti, rispettivamente, mediante la transfezione transiente con mi-RNA sintetici.
La transfezione dei mi-RNA nei linfomonociti in coltura à ̈ stata effettuata mediante l’utilizzo di un reagente a base di liposomi cationici. I liposomi cationici sono delle vescicole lipidiche artificiali, dotati di carica elettrica positiva, in grado di incorporare il mi-RNA a carica negativa e di trasportarlo all’interno delle cellule mediante fusione con le membrane cellulari o mediante endocitosi mediata dal recettore. Il mi-RNA, racchiuso nel liposoma, viene successivamente rilasciato nel citoplasma dove va ad aumentare (mimic) oppure a ridurre (inibitore) i livelli di mi-RNA preesistente.
Per validare biologicamente l’effettivo coinvolgimento del miR-148b nella IgA nefropatia, si sono aumentati i livelli di miR-148b nei linfomonociti in coltura, derivanti dal sangue intero di soggetti sani, mediante la transfezione transiente utilizzando mi-RNA sintetici detti “mimic†. I mi-RNA mimic sono mi-RNA sintetici disegnati per inserirsi nelle pathway dei mi-RNA a livello di mi-RNA maturi. Le successive analisi del gene c1GALT1, mediante Real-Time PCR e Western-Blot, hanno messo in evidenza l’effettivo coinvolgimento del miR-148b nella regolazione del c1GALT1. Infatti, i livelli di espressione sia a livello trascrizionale sia a livello proteico risultavano significativamente ridotti nei linfomonociti transfettati.
Sorprendentemente, i livelli del gene c1GALT1 nei linfomonociti isolati da soggetti normali dopo la transfezione erano paragonabili ai livelli basali del gene nei pazienti con IgA nefropatia.
Per validare ulteriormente i risultati ottenuti dalla transfezione con mi-RNA mimic, abbiamo transfettato i linfomonociti isolati da pazienti con IgA nefropatia con molecole di mi-RNA antisenso, aventi funzione di “inibitori†che vanno a silenziare i mi-RNA endogeni cellulari. Questi mi-RNA antisenso sono complementari alla sequenza del mi-RNA e una volta entrati nella cellula determinano un’efficace alterazione funzionale del mi-RNA complementare. Nel studio condotto, i livelli del gene c1GALT1, dopo transfezione, risultavano significativamente aumentati e simili a quelli basali dei soggetti normali.
I risultati degli studi condotti sono qui di seguito esposti con riferimento alle figure allegate.
La fig.1 rappresenta lo stato dell’arte e mostra la maturazione del mi-RNA e l’inibizione del processo di traduzione dell’mRNA.
La fig.2 mostra lo hierarchical clustering dei mi-RNA deregolati nelle 2 classi analizzate: pazienti con IgA nefropatia (n=7) e soggetti sani (n=6). Da questa analisi si può notare la netta distinzione tra 2 principali gruppi di mi-RNA che differenziano perfettamente le 2 classi analizzate (pazienti con IgA nefropatia e soggetti sani).
La fig.3 mostra i valori di False Discovery Rate (FDR) dei mi-RNA trovati nel profilo di espressione; questa analisi e stata effettuata per determinare sia i mi-RNA che correlano maggiormente con l’IgA nefropatia sia la significatività di questa correlazione.
Di solito, i geni vengono scelti sulla base di un valore massimo di FDR di 0.05, che indica la possibilità che il gene identificato abbia il 5% di possibilità di essere un falso positivo.
Sono stati valutati i mi-RNA con un valore di FDR inferiore allo 0.01 e solo su questi sono state condotte ulteriori analisi e introdotti ulteriori filtri, come il calcolo del fold change che fornisce un valore quantitativo della variazione dell’espressione.
La fig.4 mostra i valori di fold change dei mi-RNA differentemente espressi tra pazienti con IgA nefropatia e soggetti sani che hanno un valore di FDR maggiore di 0.01. E’ stato applicato un filtro di fold change di 2. Applicando entrambi i parametri (FDR e fold change) sono stati selezionati i 35 mi-RNA maggiormente espressi nei soggetti con IgA nefropatia. A questo punto, sono stati valuati i target computazionali di ciascuno di questi mi-RNA mediante programmi bioinformatici attualmente disponibili come miRanda (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml), TargetScan (http://www.targetscan.org), Argonaute (http://www.ma.uni-heidelberg.de), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu) e DianamicroT 3.0 (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/). I geni target regolati dai mi-RNA sono stati analizzati mediante i database Gene Ontology (GO) (www.geneontology.org), KEGG (www.kegg.com) e il software Ingenuity (IPA, Ingenuity System; www.ingenuity.com). L’analisi ha messo in evidenza che 6 mi-RNA (hsa-miR-148b, hsa-let-7b, hsa-let-7d, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-188-5p) sono coinvolti nella patogenesi della IgA nefropatia poiché avevano come target dei geni che potevano essere implicati nell’insorgenza e/o progressione della malattia. Uno tra questi à ̈ il miR-148b che presenta come target computazionale l’enzima core1,β-1,3-Galactosiltransferasi (c1GALT1), notoriamente coinvolto nella IgA nefropatia in quanto responsabile dell’alterata glicosilazione delle IgA1.
Nella fig.5 sono mostrati i valori di espressione dei 6 mi-RNA (hsa-miR-361-3p, hsamiR-148b, hsa-let-7b, hsa-let-7d, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-188-5p) determinati mediante Real-Time PCR su un gruppo indipendente di 10 pazienti con IgA nefropatia(IgAN) e 10 soggetti sani (NORM). Ciascun valore di espressione à ̈ stato normalizzato sul valore di espressione del miR-27a (un mi-RNA ugualmente espresso nei campioni IgAN e NORM).
I risultati sono mostrati come medie dei valori di espressione di ciascun campione ± SEM. Come mostrato in figura, l’espressione dei mi-RNA é significativamente più alta nei pazienti con IgA nefropatia rispetto ai soggetti sani.
Nella fig.6 sono mostrati i valori di espressione dei 6 mi-RNA (hsa-miR-361-3p, hsamiR-148b, hsa-let-7b, hsa-let-7d, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-188-5p) determinati mediante Real-Time PCR su un gruppo indipendente di 10 pazienti con IgA nefropatia(IgAN), 10 soggetti sani (NORM) e 5 pazienti con glomerulosclerosi focale segmentale (GSFS). Ciascun valore di espressione à ̈ stato normalizzato sul valore di espressione del miR-27a (un mi-RNA ugualmente espresso nei campioni IgAN e NORM) e U6 (per quanto riguarda i pazienti con GSFS).
I risultati sono mostrati come medie dei valori di espressione di ciascun campione  SEM. Come mostrato in figura, la sovraespressione dei mi-RNA à ̈ specifica della IgA nefropatia, infatti i livelli di espressione dei 6 mi-RNA nei pazienti con glomerulosclerosi focale segmentale à ̈ significativamente ridotta rispetto ai pazienti con IgA nefropatia.
La fig.7 mostra i valori di espressione del gene core1, β-1,3-Galactosiltransferasi (c1GALT1) in 10 pazienti con IgA nefropatia, 10 soggetti sani e 5 pazienti con glomerulosclerosi focale e segmentaria (GSFS), gli stessi in cui à ̈ stata valutata l’espressione dei 6 mi-RNA. Ciascun valore di espressione à ̈ stato normalizzato con il valore di espressione del gene housekeeping β-actina.
I risultati sono mostrati come medie dei valori di espressione di ciascun campione  SEM.
Come mostrato nella figura, i livelli di espressione del gene c1GALT1 nei pazienti con IgA nefropatia sono significativamente ridotti rispetto ai soggetti normali e ai pazienti con GSFS. Questa riduzione, secondo quanto predetto dall’analisi in silico, potrebbe essere dovuto all’aumento dell’espressione del miR-148b.
Per validare l’effettivo coinvolgimento del miR-148b nella regolazione dell’espressione del gene c1GALT1, sono stati trasfettati sia i linfomonociti periferici isolati da pazienti con IgA nefropatia sia quelli di soggetti sani, rispettivamente con molecole di mi-RNA “inhibitor†e “mimic†e successivamente sono stati valutati i livelli del gene c1GALT1 mediante Real-Time PCR e Western blot.
La fig.8 mostra i valori di espressione del gene core1,β-1,3-Galactosiltransferasi (c1GALT1) nei linfomonociti periferici isolati da 3 pazienti con IgA nefropatia e 3 soggetti sani dopo transfezione, rispettivamente, con molecole di mi-RNA “inhibitor†(A) e “mimic†(B). Ciascun valore di espressione à ̈ stato normalizzato con il valore di espressione del gene housekeeping β-actina.
Come mostrato in figura 8A, l’espressione del gene c1GALT1 nei linfomonociti isolati da pazienti con IgA nefropatia dopo transfezione con molecole di miR-148b inhibitor à ̈ notevolmente aumentata di 3.5 volte. Ciò a dimostrazione dell’effettivo coinvolgimento del miR-148b nell’espressione del gene c1GALT1.
Per un’ulteriore conferma, i linfomonociti isolati da soggetti sani sono stati transfettati con molecole di miR-148b “mimic†, delle molecole che vanno ad aumentare i livelli di mi-RNA endogeno. Come mostrato in figura 8B, i livelli del gene c1GALT1 sono significativamente ridotti dopo la transfezione.
La fig.9 mostra i livelli della proteina core1,β-1,3-Galactosiltransferasi (c1GALT1), valutati mediante Western Blot, nei linfomonociti periferici isolati da 4 pazienti con IgA nefropatia e 3 soggetti sani dopo transfezione, rispettivamente, con molecole di mi-RNA “inhibitor†(mi-RNA antisenso) (A) e “mimic†(B). Ciascun valore di espressione della proteina c1GALT1 con il segnale corrispondente alla proteina β-actina.
In accordo con i valori di espressione dell’mRNA mostrati in figura 8 (A-B), il miR-148b regola effettivamente la sintesi di c1GALT1 e di conseguenza la glicosilazione delle IgA1.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. mi-RNA che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 per l’uso nella diagnosi della IgA nefropatia.
  2. 2. mi-RNA per l’uso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che à ̈ miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No 1.
  3. 3. Metodo per la diagnosi di IgA nefropatia, che comprende valutare l’espressione di almeno un mi-RNA scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 1-6 in un campione biologico di un soggetto, in cui un aumento dell’espressione di detti mi-RNA indica la presenza di IgA nefropatia o la predisposizione a sviluppare la IgA nefropatia.
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto almeno un mi-RNA Ã ̈ miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No.1.
  5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che comprende valutare l’espressione di miR-148b avente la sequenza SEQ. ID No.1 e di almeno un altro mi-RNA scelto tra le sequenze SEQ. ID No.2-6.
  6. 6. Kit diagnostico per la diagnosi di IgA nefropatia che comprende almeno un mi-RNA antisenso che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 7-18.
  7. 7. Kit secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto almeno un mi-RNA antisenso à ̈ miR-148b-antisenso scelto tra SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No 8.
  8. 8. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che comprende miR-148b-antisenso scelto tra SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No 8 e almeno un altro mi-RNA antisenso scelto tra le sequenze SEQ. ID No.9-18. 9. mi-RNA antisenso che ha una sequenza scelta tra le sequenze SEQ. ID No.: 7-18 per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione di IgA nefropatia. 10. mi-RNA antisenso per l’uso secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che à ̈ miR-148b antisenso scelto tra SEQ. ID No 7 e SEQ. ID No 8.
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