ITMI20110312A1 - Impianto dentale con superficie nanostrutturata e procedimento per il suo ottenimento - Google Patents

Description

TITOLO: IMPIANTO DENTALE CON SUPERFICIE NANOSTRUTTURATA E PROCEDIMENTO PER IL SUO OTTENIMENTO RICHIEDENTE: DENTAL TECH

Descrizione

Campo dell’invenzione

La presente invenzione mette a disposizione materiali e metodi per la preparazione di nanotubi a base di biossido di titanio come rivestimento per protesi biomedicali osteointegrate, in particolare per impianti dentali. Tali rivestimenti, realizzati con metodiche elettrochimiche e chimiche, hanno lo scopo di favorire l’osteointegrazione degli impianti endossei.

Stato dell’arte

Il titanio e le sue leghe sono materiali largamente impiegati in implantologia grazie alle loro caratteristiche meccaniche e di biocompatibilità.

Quando esposto all’ossigeno, il titanio tende ad ossidarsi incrementando le sue caratteristiche che ne favoriscono l’osteointegrazione. Tra le forme allotropiche di biossido di titanio particolarmente utilizzate in implantologia, vi à ̈ l’anatase, che viene generalmente preparato come sospensione colloidale utilizzata per ricoprire viti e impianti. Tale rivestimento à ̈ infatti in grado di modulare l’espressione genica e i processi traslazionali degli osteoblasti ed ha un bassissimo potenziale di colonizzazione batterica.

L’osteointegrazione à ̈ un processo per il quale il materiale innestato determina un’attivazione del tessuto osseo nel quale à ̈ stato inserito, tale da determinare un’adesione del tessuto osseo all’innesto. Il processo di osteointegrazione à ̈ estremamente complesso e non completamente chiarito. In esso intervengono meccanismi di controllo immunogenico (riconoscimento del self) tipico di tutti i processi che prevedono l’utilizzo di trapianti, meccanismi di osteoconduzione (processo per il quale il materiale innestato rappresenta un supporto alla neoproduzione di osso) e di osteoinduzione (processo per il quale il materiale innestato determina uno o più segnali molecolari che inducono la neosintesi di osso). Il processo di osteointegrazione può essere considerato ultimato in circa 60 giorni, corrispondenti al tempo di consolidamento delle fratture.

Per quanto riguarda gli impianti endoossei, un ruolo importante viene rivestito dall’effetto del materiale di cui sono composti e dal design dell’impianto stesso. Entrambi i fattori infatti influiscono in vario grado sul processo di osteointegrazione.

Il titanio rappresenta ad oggi il materiale di prima scelta per le protesi dentali ed ortopediche in quanto unisce alle eccellenti proprietà meccaniche anche una elevata osteointegrazione.

Per quanto attiene il design dell’impianto, viene normalmente preso in considerazione: (1) un macrodesign, (2) un minidesign, (3) un microdesign e (4) un nanodesign.

Il primo à ̈ il disegno macroscopico dell’impianto. Volendo fare riferimento agli impianti dentali, esistono impianti di varia forma, per esempio cilindrici o conici.

Il secondo à ̈ dato dalle caratteristiche del disegno delle spire, dalla forma degli angoli delle spire (che possono essere smussati o taglienti) ed à ̈ dell’ordine dei millimetri.

Il terzo à ̈ dato dalle caratteristiche della superficie che per esempio può essere levigata o irruvidita. A questo fine esistono varie metodiche che determinano differenze nella dimensione dei micropori che vengono creati alla superficie dell’impianto.

Infine possiamo parlare di nanodesign: questo corrisponde all’organizzazione molecolare sulla superficie dell’impianto. Attualmente gli impianti sono composti di titanio che all’aria si ossida in biossido di titanio con una distribuzione stocastica delle due forme cristalline, rutile ed anatase. Studi preliminari reperibili in letteratura dimostrano la possibilità di produrre superfici completamente rivestite di anatase, cosa che esalta la proprietà osteointegrativa propria del titanio.

Diversi autori concordano che la nano-rugosità prodotta sulla superficie degli impianti abbia un ruolo fondamentale nel determinarne la loro osteointegrazione. Una review sull’argomento à ̈ stata pubblicata da A. Wennerberg, T. Abrektsson, The Int. Journal of Oral & Maxillofacial Implants p. 63-74 Vol. 25, N.1, 2010, dove l’analisi della nanorugosità degli impianti più largamente utilizzati (TiUnite, SLActive, Nanotite e Ossospeed) rivela in tutti i casi l’assenza di strutture nanometriche regolari e la presenza di superfici con rugosità variabili.

Oltre a queste caratteristiche superficiali ve ne sono altre estremamente importanti per l’osteointegrazione. Alcuni studi, infatti, hanno dimostrato che rivestendo le superfici degli impianti con dei “nanotubi di titanio†se ne incrementa notevolmente la biocompatibilità e che tale affinità cellulare à ̈ strettamente correlata al diametro delle nanostrutture, specialmente nella proliferazione degli osteoblasti e nei processi di mineralizzazione. In questi studi le strutture nano-tubolari vengono realizzate attraverso processi di ossidazione elettrochimica in soluzione acquosa, in presenza di acido acetico o fosforico e acido fluoridrico con un sistema a tre elettrodi che opera con controllo potenziostatico.

Sommario dell’invenzione

Un oggetto à ̈ quello di mettere a disposizione dispositivi implantari in titanio che associno alle proprietà osteointegrative un’attività antimicrobica, contribuendo così a prevenire fenomeni infettivi spesso causa di rigetto dell’impianto.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono impianti dentali, tipicamente viti per impianto, dotati di elevata osteointegrazione e preferibilmente di attività anti microbica.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ quello di mettere a disposizione un procedimento per realizzare nanotubi di titanio diossido caricati con una molecola ad attività antimicrobica su un dispositivo implantare.

Il problema che sta alla base della presente invenzione à ̈ quindi quello di ottenere i suddetti oggetti.

Tale problema à ̈ risolto da dispositivi implantari e da un procedimento per la loro produzione, come delineati nelle annesse rivendicazioni, le cui definizioni formano parte integrante della presente descrizione.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno maggiormente dalla descrizione di alcuni esempi di realizzazione, fatta qui di seguito a titolo indicativo e non limitativo.

Breve descrizione delle figure

Figura 1 rappresenta schematicamente un dispositivo di anodizzazione per la formazione di nanotubi su titanio;

Figura 2 mostra l’andamento tipico delle correnti elettriche registrate durante i processi di anodizzazione nei diversi solventi DMSO, NMF o H2O; Figura 3 rappresenta un’immagine SEM di una superficie di titanio che presenta nano tubi di TiO2realizzati via anodizzazione in acqua;

Figura 4 rappresenta un’immagine SEM di una superficie di titanio che presenta nanotubi di TiO2realizzati via anodizzazione in DMSO;

Figura 5 riporta un grafico con la comparazione fra geni espressi a 15 giorni dalle cellule coltivate sulle superfici con nanotubi e gli stessi geni derivati da cellule coltivate su titanio levigato;

Figura 6 riporta un grafico con la comparazione fra geni espressi a 30 giorni dalle cellule coltivate sulle superfici con nanotubi e gli stessi geni derivati da cellule coltivate su titanio levigato.

Descrizione dettagliata dell’invenzione L’invenzione consiste nella realizzazione di strutture nanotubolari di diossido di titanio su impianti endoossei in titanio o in leghe metalliche contenenti titanio attraverso processi di anodizzazione con un semplice alimentatore che opera con due sistemi elettrodici in solventi di tipo organico o acquoso, in particolare in dimetil solfossido (DMSO), N-metilformammide (NMF) e in acqua (H2O) e nella produzione di strutture superficiali che favoriscono il processo di osteointegrazione.

All’interno della struttura nanotubolare vengono poi inserite specie ioniche ad attività antimicrobica come gli ioni argento monovalente (Ag<+>), preferibilmente adsorbite su nanoparticelle di biossido di titanio delle dimensioni di 2-20 nm che esplicano attività antimicrobica.

Le nano-strutture porose nano-tubolari dotate di elevata superficie attiva sono state ottenute su dispositivi implantari in titanio utilizzando la tecnica della dissoluzione anodica per via elettrochimica, un procedimento in grado di produrre strutture nanotubolari, costituite da biossido di titanio, di lunghezza variabile da 100 nanometri a 3 micron.

L'utilizzo di questa tecnica fa si che le strutture nano-tubolari siano parte integrante del metallo consentendo così una elevata resistenza dovuta alla diretta interconnessione col metallo sottostante. Le anodizzazioni possono essere effettuate in diversi solventi di natura organica come ad esempio DMSO (Dimetilsolfossido) o NMF (N-Metil Formammide) oppure in solvente acquoso, utilizzando specifiche composizioni elettrolitiche a seguito specificate.

In base al solvente scelto e al tempo di anodizzazione si possono ottenere nanotubi caratterizzati da diverso diametro e lunghezza.

L'anodizzazione viene effettuata imponendo una differenza di potenziale tra l’impianto endoosseo (anodo) e un controelettrodo (catodo) costituito da titanio o platino. In questa invenzione le procedure di anodizzazione sono state condotte impiegando una configurazione a due elettrodi e impiegando un alimentatore regolabile in tensione in corrente continua disponibile commercialmente a basso costo. I potenziali applicati nei processi di anodizzazione possono variare dai 20 ai 50 V in base al solvente utilizzato e in base allo spessore del substrato anodizzato desiderato.

La scelta del solvente risulta importante nel determinare i tempi di anodizzazione necessari ad ottenere la desiderata nanostruttura. In particolare, operando con solventi acquosi si può ottenere la formazione di nanotubi in tempi dell’ordine di 6-12 ore, mentre nei solventi organici utilizzati (DMSO o NMF) tali tempi risultano almeno raddoppiati (12-24 h). In generale, si potrà operare con tempi di anodizzazione variabili tra 6 e 48 ore, a seconda del solvente utilizzato e della lunghezza dei nanotubi che si vuole ottenere. L'utilizzo di tempi di anodizzazione più lunghi comporta la formazione di nanotubi di lunghezze più elevate che possono raggiungere 3 micron e diametri nell’intervallo 50-100 nm.

Si deve notare che la presenza di acqua nei solventi organici utilizzati à ̈ fondamentale per la formazione del biossido di titanio costituente la struttura nanotubolare. Pertanto, quando il processo di anodizzazione à ̈ condotto in soluzione di un solvente organico, in particolare DMSO o NMF, tale soluzione conterrà acqua nell’intervallo dal 5% al 20% in volume.

L’applicazione di una differenza di potenziale fra l’impianto endosseo e il controelettrodo produce nella fase iniziale uno strato di ossido compatto che porta alla passivazione dell'impianto. Tale passivazione risulta in una diminuzione della corrente elettrica che passa attraverso la cella elettrolitica. E’ fondamentale la presenza di fluoruri nella soluzione elettrolitica in modo da ottenere la dissoluzione dello strato di ossido precedentemente formato e la conseguente formazione di strutture nanotubolari.

Il processo di dissoluzione dello strato di ossido che porta alla formazione della struttura nano-tubolare à ̈ indicato dalla seguente equazione: TiO<- 2->2+ 6F 4H = [TiF6] 2H2O

dove lo ione esafluoruro di titanio risulta solubile nel solvente che compone la soluzione elettrolitica. Come sorgente di fluoruri possono essere impiegati diversi sali a diversi livelli di concentrazione, quali ad esempio KF (0.1 M), NH4F (0.5% p/p) o HF (2% v/v).

La velocità di anodizzazione à ̈ un parametro importante al fine di ottenere nanotubi delle dimensioni volute. Preferibilmente, si utilizzerà una densità di corrente elettrica compresa tra 10 e 100 mA/cm<2>.

Dopo il processo di anodizzazione, il dispositivo implantare viene sottoposto a riscaldamento a temperature superiori a 450°C, tipicamente superiori a 500°C, ad esempio circa 550°C, per un tempo sufficiente a convertire i nanotubi di biossido di titanio nella forma allotropica cristallina di anatase, compattarne la superficie ed eliminare eventuali impurezze organiche presenti sul dispositivo. Preferibilmente il riscaldamento viene protratto per un tempo compreso tra 30 minuti e 2 ore, ad esempio circa 1 ora.

Dopo la trasformazione del diossido di titanio in anatase, il dispositivo implantare viene caricato con specie ioniche ad attività antimicrobica.

A tal fine, il dispositivo implantare dell’invenzione viene immerso in una sospensione di nanoparticelle di biossido di titanio di dimensione nell’intervallo 2-30 nm in una soluzione al 50% in volume di alcol etilico in acqua, contenente ioni argento con concentrazioni nell’intervallo 10<-4>-10<-1>M.

Tali soluzioni possono esse preparate utilizzando diversi sali o ioni complessi d’argento quali ad esempio argento nitrato, argento acetato, argento citrato, argento lattato, argento sulfadiazina, etc..

Le nanoparticelle di biossido di titanio sono in grado di adsorbire gli ioni Ag<+>alla loro superficie ed hanno dimensioni tali da consentire la loro inserzione all’interno delle strutture nanotubolari con diametri nell’intervallo 30-50 nm. Il dispositivo implantare viene immerso in tali soluzioni e sottoposto a sonicazione per tempi dell’ordine di 5-15 minuti.

Un oggetto della presente invenzione à ̈ quindi un metodo per la preparazione di un dispositivo implantare che comprende i seguenti passaggi:

a) sottoporre detto dispositivo implantare in titanio o sue leghe ad un processo di anodizzazione come sopra descritto, in acqua o in un solvente organico contenente una quantità di acqua inferiore a 25% in volume, detto solvente organico essendo preferibilmente DMSO o NMF, in modo da formare su detto dispositivo implantare uno strato di nanotubi di titanio diossido;

b) trattare detto dispositivo implantare ad una temperatura superiore a 450°C o superiore a 500°C per un tempo sufficiente a trasformare detto diossido di titanio nella sua forma allotropica cristallina di anatase;

c) caricare detti nanotubi di diossido di titanio in forma allotropica cristallina di anatase con ioni di una specie ad attività antimicrobica, preferibilmente ioni Ag<+>, in cui detti ioni sono preventivamente adsorbiti su nanoparticelle di diossido di titanio di dimensioni tali da inserirsi in detti nanotubi.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ costituito da un dispositivo implantare in titanio o sue leghe comprendente uno strato esterno di nanotubi di diossido di titanio nella forma allotropica cristallina di anatase, caratterizzato dal fatto che detti nanotubi di diossido di titanio sono caricati con nanoparticelle di diossido di titanio su cui à ̈ assorbita una specie ionica ad attività antimicrobica.

Preferibilmente detta specie ionica à ̈ costituita da ioni Ag<+>.

Ancora un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ costituito da un impianto dentale, tipicamente una vite, in titanio o sue leghe, caratterizzato dal fatto di comprendere sulla sua superficie uno strato di nanotubi di diossido di titanio nella forma allotropica cristallina di anatase.

Preferibilmente, detti nanotubi sono caricati con una specie ionica ad attività antimicrobica, quale ioni Ag<+>. In una forma di realizzazione particolarmente preferita, detti nanotubi sono caricati con nanoparticelle di diossido di titanio su cui à ̈ assorbita detta specie ionica ad attività antimicrobica.

METODI PREPARATIVI

Le metodologie preparative a seguito descritte si applicano sia ad impianti dentali in forma di viti sia più in generale ad impianti endossei di diversa forma e dimensione. Le metodiche sono state messe a punto utilizzando lamine di titanio o di leghe di titanio dello spessore di alcune centinaia di micron e di area di 2,5x5cm, pretrattate mediante un processo di sabbiatura per ottenere superfici macroporose analoghe a quelle utilizzate per gli impianti endossei. La scelta di operare con lamine di titanio à ̈ legata alla necessità di condurre le analisi biologiche a seguito descritte che richiedono una particolare geometria per i campioni investigati.

Prima di operare la dissoluzione anodica, che porta alla formazione delle strutture nano-tubolari, le lamine in Titanio sono state preventivamente pulite con lavaggi in acqua e acetone e sonicate con ultrasuoni in una soluzione acquosa di detergente (Alconox) per un tempo di circa 10 minuti.

Le anodizzazioni sono state effettuate ponendo frontalmente due lamine di Titanio in una soluzione elettrolitica ad una distanza di circa 6 mm (Fig.1). la soluzione elettrolitica veniva mantenuta sotto agitazione tramite agitatore magnetico. L’area dell’elettrodo immersa nella soluzione elettrolitica era di circa 2,5 x 2,5 cm. La restante superficie non immersa veniva utilizzata per il contatto elettrico e per evitare che la risalita di soluzione elettrolitica per capillarità portasse a cortocircuiti della cella.

Le anodizzazioni sono state effettuate in tre solventi: H2O, DMSO ed NMF ottenendo per i solventi organici DMSO ed NMF analoghi risultati.

Nel caso del solvente acquoso, le anodizzazioni sono state eseguite applicando, alle due lamine di Titanio, una differenza di potenziale di 24V per un tempo tra le 6 e le 12h (Fig. 2) in una soluzione contenente come donatore di fluoruri KF (0.1 M) e come elettrolita di supporto K2SO4(0.5 M). L’andamento non lineare della corrente registrato durante le anodizzazioni, come mostrato in Fig. 2, à ̈ dovuto alla competizione fra i processi di formazione e dissoluzione dell’ossido. Se la velocità di formazione dell’ossido à ̈ più elevata della sua dissoluzione si ottiene la passivazione dell’elettrodo con una conseguente diminuzione della corrente registrata. Viceversa, quando la dissoluzione à ̈ più veloce del processo di ossidazione del Titanio si ha una più ampia superficie del metallo esposta alla soluzione, che comporta un aumento della corrente registrata. La formazione di strutture ordinate di nanotubi à ̈ dovuta alla dissoluzione dell’ossido attraverso “corsie preferenziali†dettate dal rafforzamento del campo elettrico nelle zone in cui l’iniziale dissoluzione ha reso lo strato di ossido più sottile, velocizzando così la crescita e la relativa dissoluzione dell’ossido in quella particolare zona. La velocità con cui avviene la dissoluzione à ̈ fondamentale, dissoluzioni troppo veloci o troppo lente non portano alla formazione dell’ossido.

Per quanto riguarda la dissoluzione anodica effettuata in DMSO o NMF, contenente HF 2% in volume o NH4F allo 0.5% in peso, Ã ̈ stata applicata una differenza di potenziale di 40V per un tempo fra l2 e 24h. Le anodizzazioni sono state effettuate a temperatura ambiente (circa 20°C).

La presenza dei fluoruri à ̈ fondamentale per scavare le superfici di ossido formatosi a seguito del processo di anodizzazione della lamina di Titanio. In Figura 2 à ̈ possibile osservare che durante l’anodizzazione si verifica un aumento della corrente dovuto ad una più veloce dissoluzione dello strato di ossido rispetto alla sua formazione, mentre la diminuzione della corrente à ̈ dovuta ad una passivazione dell’elettrodo causata dalla formazione di uno strato di ossido spesso. La scelta del tempo di anodizzazione à ̈ determinante ai fini di ottenere una particolare morfologia alla superficie di un impianto endoosseo. Tempi di anodizzazione elevati portano in generale alla formazione di strutture di nano-tubi che possono raggiungere lunghezze dell’ordine di 3 micron, mentre tempi di anodizzazione troppo brevi non portano alla formazione di strutture nano-tubolari.

Una volta concluso il processo di anodizzazione, le lamine sono state trattate con acqua e acetone e sonicate con ultrasuoni per circa 10 minuti in acqua distillata per eliminare eventuali residui di biossido di titanio non legati stabilmente alla loro superficie. Infine le lamine in Titanio anodizzate sono state sottoposte a riscaldamento a 550°C per 1h, allo scopo di convertire i nanotubi di biossido di titanio nella forma allotropica di anatase, compattarne la superficie ed eliminare eventuali impurezze organiche presenti sulle lamine.

La corrente prodotta durante l’anodizzazione à ̈ stata registrata, ad intervalli di tempo di un minuto, da un multimetro digitale Velleman DVM 1200 interfacciato ad un PC oppure ogni trenta secondi con un multimetro digitale Tenma 72-7730 anch’esso interfacciato al PC. Le anodizzazioni sono state effettuate grazie ad una alimentatore Thurlby Thandar Instruments EX752M.

I campioni in titanio anodizzato secondo le procedure precedentemente descritte sono stati immersi in una sospensione di nanoparticelle di biossido di titanio di dimensione nell’intervallo 2-30 nm in una soluzione al 50% in volume di alcol etilico in acqua contenenti ioni argento con concentrazioni nell’intervallo 10<-4>-10<-1>M.

Tali soluzioni possono esse preparate utilizzando diversi sali o ioni complessi d’argento quali ad esempio argento nitrato, argento acetato, argento citrato, argento lattato, argento sulfadiazina, etc.

Le nanoparticelle di biossido di titanio sono in grado di adsorbire gli ioni Ag<+>alla loro superficie e le loro dimensioni ne consentono l’inserzione all’interno delle strutture nanotubolari con diametri nell’intervallo 30-50 nm. I campioni in titanio anodizzato sono stati immersi nelle sospensioni contenenti ioni argento e sottoposti a sonicazione per tempi dell’ordine di 5-15 minuti. I campioni sono stati poi lavati con etanolo ed essicati a 60 °C.

CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA

Le lamine di titanio trattate sono state caratterizzate mediante microscopia elettronica SEM mostrando come, sia per le dissoluzioni anodiche effettuate in acqua (Fig.3) che per quelle effettuate in DMSO o NMF (Fig. 4), si abbia la formazione di strutture nano-tubolari, presenti in modo omogeneo su tutto l’elettrodo, sia sulla faccia posta frontalmente al controelettrodo che sulla faccia opposta. Dalle immagini SEM à ̈ possibile notare come i nanotubi prodotti per anodizzazione in acqua siano lunghi circa 300-400 nm mentre quelli realizzati in DMSO o NMF raggiungano lunghezze di un micron.

ATTIVITA’ ANTIMICROBICA

E’stata verificata l’attività antimicrobica delle lamine in titanio, preparate secondo le procedure precedentemente descritte che prevedono il processo di anodizzazione e la successiva inserzione di ioni argento, effettuando test con i seguenti ceppi batterici: Escherichia coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans.

PROCEDURA SPERIMENTALE

Microrganismi

Sono stati utilizzati i seguenti ceppi test:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 10536

Candida albicans ATCC 10231

I ceppi provengono dal Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di Microbiologia, dell’Università di Ferrara e sono stati acquistati dalle ditte Diagnostic International Distribution SpA e VWR International Srl.

Mantenimento

I ceppi batterici sono stati mantenuti congelati in brodo di coltura e glicerolo al 50% (v/v); prima dell’utilizzo sono stati trapiantati su slant di TSA e conservati in frigorifero a 4°C ± 2°C.

Candida albicans à ̈ stata mantenuta congelata in brodo di coltura e glicerolo al 50% (v/v); prima dell’utilizzo à ̈ stata trapiantata su slant di Malt Extract Agar e conservata in frigorifero a 4°C ± 2°C.

TERRENI COLTURALI E REAGENTI

Terreni

Tryptone Soya Agar (TSA) per i ceppi batterici e Malt Estract Agar (MEA) per Candida albicans.

Diluente

Triptone, digestione

pancreatica di caseina 1.0 g OXOID NaCl 8.5 g MERCK Acqua distillata q.b. 1000 ml

APPARECCHIATURE

- Stufa per la sterilizzazione a secco KW - Autoclave a vapore COLUSSI - Termostato MEMMERT - Agitatore Vortex VELP - Cronometro ARBORE - Micropipette GILSON Preparazione delle sospensioni di prova

I ceppi batterici e il ceppo di Candida albicans, una volta scongelati, sono stati trapiantati per 2 volte di seguito su slant di TSA (MAE per Candida albicans) e incubati a 37°C ± 1°C per 18 ore, ottenendo la coltura di lavoro. Entro 2 ore dall’inizio del test la coltura di lavoro à ̈ stata sospesa in diluente usando palline di vetro e la sospensione à ̈ stata diluita fino ad ottenere una conta da 1.5 x 10<7>a 5.0 x 10<7>ufc/ml (sospensione di prova).

Conteggio delle sospensioni di prova

Sono state effettuate diluizioni seriali in diluente fino a 10<-6>- 10<-7>delle sospensioni di prova aven<7 7>ti concentrazione da 1.5 x 10 a 5.0 x 10 ufc/ml. E’ stato effettuato un conteggio in doppio per inclusione in Agar. E’ stato determinato il numero di ufc/ml della sospensione dopo un periodo di incubazione di 24 ore a 37°C ± 1°C.

Esecuzione del saggio

Per ogni ceppo dei microrganismi à ̈ stata allestita una provetta contenente 5 ml di sospensione di prova avente una concentrazione tra 1.5 x 10<7>e 5.0 x 10<7>ufc/ml.

Le lamine in titanio trattate secondo le procedure di anodizzazione ed inserzione di ioni argento e non trattate (Controllo) sono state immerse nelle sospensioni di prova contenenti le diverse specie microbiche ed estratti dopo 10 secondi. I campioni sono stati lasciati sotto cappa sterile a contatto con l’aria per un tempo pari a 5 minuti. Al termine di questo tempo, le lamine di titanio sono state poste in piastre Petri e ricoperte con terreno di coltura liquido, mantenuto alla temperatura di 45°C. Le piastre Petri sono state poste in agitazione per 1 minuto, al fine di favorire la diffusione omogenea in tutta la piastra dei microrganismi adesi alla superficie delle lamine in titanio e il terreno à ̈ stato poi lasciato solidificare. Le piastre Petri sono state infine poste in cella di incubazione a 37°C per 24 ore.

Trascorso questo tempo le piastre sono state esaminate valutando lo sviluppo delle colonie batteriche e fungine.

RISULTATI

L’analisi delle piastre relative ai campioni di controllo ha evidenziato la crescita di un elevatissimo numero di colonie microbiche mentre le piastre relative alle lamine trattate con le procedure descritte in questo brevetto hanno dimostrato attività antimicrobica, inducendo la totale mortalità delle cellule microbiche venute a contatto con la sua superficie. A fronte di un numero non contabile di colonie (superiore alla decina di migliaia) formatesi nelle piastre Petri relative ai controlli, nelle piastre Petri includenti le lamine trattate non vi à ̈ stata crescita di colonie.

CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA RELATIVA AI PROCESSI DI OSTEOINDUZIONE

Principio dell’indagine

Lo scopo di questa indagine à ̈ di verificare gli effetti biologici di una lega di titanio la cui superficie à ̈ stata rivestita con nanotubi.

A tale scopo sono state allestite delle colture di cellule staminali derivate da polpa dentaria selezionate come clone CD105 positive, CD90 positive, CD73 positive e CD 34 negative, che poste in coltura con appropriato terreno si differenziano in osteoblasti [Pittenger MF et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.

Science 1999;284:143-147.]. Tali cellule sono state coltivate su dischetti di titanio rivestiti di nanotubi e su dischetti di titanio macchinato (cioà ̈ non rivestito da nanotubi) ed utilizzato come controllo. Dopo 15 e 30 giorni le cellule sono state staccate, à ̈ stato estratto il RNA messaggero ed à ̈ stata misurata, mediante PCR Real Time, l’espressione di specifici geni la cui funzione à ̈ correlata all’osteo-differenziamento. Tutto questo per verificare le potenzialità osteodifferenziative della superficie di nanotubi. Infatti, quando le protesi metalliche vengono inserite nelle ossa dei pazienti non stimolano solo una attività osteoblastica, ma anche una attività delle cellule staminali che à ̈ rilevante al fine del processo osteointegrativo.

Materiali e Metodi

Isolamento di cellule staminali da polpa dentaria

La polpa dentaria da cui ricavare le cellule staminali à ̈ stata estratta da denti terzi molari di individui sani di età compresa tra i 20 -25 anni in seguito a consenso informato.

La polpa à ̈ stata poi immersa in una soluzione di digestione (3 mg/ml di collagenasi tipo I e 4 mg/ml di dispasi disciolti in 4 ml di una soluzione salina 0,1 M di tampone fosfato (PBS) integrata con 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina, e 500 mg/ml di claritromicina) e incubata per 1 ora a 37 ° C. Una volta digerita, la soluzione à ̈ stata filtrata con filtri cellulari Falcon da 70 micron (Sigma Aldrich).

Dopo la filtrazione, le cellule sono state poste in fiasche T75, contenenti terreno di coltura α-MEM integrato con il 20% di FBS, 100 µM di acidoascorbico, 2 mM L-glutammina, 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina e incubate a 37 ° C e 5% di CO2. Il terreno à ̈ stato cambiato due volta a settimana. Poco prima che le cellule diventassero confluenti, sono state suddivise in nuove fiasche.

Per il saggio, le cellule staminali al secondo passaggio sono state staccate mediante tripsina e seminate su piastre la cui superficie à ̈ stata ricoperta da nanotubi di titanio.

Un'altra serie di pozzetti contenenti le cellule seminate su piastre di titanio macchinato sono stati utilizzati come controllo.

Le cellule sono state raccolte a 15 e 30 giorni di trattamento per l'estrazione dell'RNA.

Estrazione dell’RNA

La trascrizione inversa a cDNA à ̈ stata effettuata direttamente dal lisato delle cellule poste in coltura mediante il Kit “TaqMan Gene Expression Celle-to-Ct†(Ambion Inc., Austin, TX, USA), seguendo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state lisate con un buffer di lisi e l’RNA liberato in questa soluzione à ̈ stato retrotrascritto a cDNA utilizzando una specifica retrotrascrittasi e relativo buffer.

Il cDNA così ottenuto à ̈ stato amplificato mediante Real Time PCR utilizzando una miscela di amplificazione, la TaqMan Gene Expression Master Mix in dotazione con il kit e saggi di amplificazione (primers e sonde) specifici per i geni da indagare.

PCR Real Time

L’espressione dei geni indagati à ̈ stata quantificata mediante PCR Real Time.

I livelli di espressione genica sono stati normalizzati mediante un gene di riferimento housekeeping RPL13A. Successivamente l’espressione delle cellule trattate con i nanotubi à ̈ stata comparata con quella delle cellule non trattate, attraverso il metodo statistico del ΔΔCt [Livak e Schmittgen, 2001].

I primers forward e reverse e le sonde per i geni selezionati sono stati progettati utilizzando il programma Primer Software Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Per questo esperimento sono state utilizzate sonde Taq Man (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) di geni la cui espressione à ̈ legata all’osteoinduzione e osteodifferenziamento.

Tutte le reazioni di PCR sono state eseguite in un volume di 20 microlitri utilizzando lo strumento ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), seguendo un protocollo di PCR che prevede una denaturazione iniziale del DNA a 95°C seguita da due step, una denaturazione a 95°C per 15 sec e un annealing dei primer e sonde a 60°C per 1 minuto, per 40 cicli.

RISULTATI

Al fine di testare l’effetto osteoinducente dei nanotubi di titanio, sono stati misurati i livelli di espressione di quei geni la cui funzione à ̈ correlata alla mineralizzazione e alla deposizione della matrice ossea, in cellule staminali sottoposte a trattamento per 15 e 30 giorni, il lasso di tempo più rilevante al fine del processo osteo-integrativo.

Mediante PCR Real Time sono stati analizzati due fattori di trascrizione fondamentali nel differenziamento osteoblastico (RUNX2 e FOSL1), alcuni geni legati al differenziamento dell’osso SPP1 (Osteopontina), BGLAP (osteocalcina) e ALPL (fosfatasi alcalina), i geni del collagene (COL1A1 e COL3A1) e un gene caratteristico delle cellule staminali la cui espressione varia durante il differenziamento cellulare (ENG).

Dopo 15 giorni di trattamento nelle cellule staminali coltivate sui nanotubi di titanio rispetto al controllo si osserva una marcata sovra-espressione dei geni RUNX2, FOSL1, ALPL, BGLAP, COL1A1 e una moderata sovra-regolazione dei geni ENG e COL3A1. Al contrario i geni SP7 e SPP1 risultano sotto-espressi (Fig. 5)

I risultati della PCR real-time hanno dimostrato che dopo 30 giorni di trattamento, rispetto alle cellule di controllo, gli osteogeni SP7, FOSL1, COL1A1 e BGLAP sono sovra-espressi mentre RUNX2, ENG, ALPL e COL3A1 sono sotto-regolati (Fig. 6). L'espressione di SPP1 sostanzialmente non cambia.

Analizzando più nel dettaglio i risultati possiamo osservare che il fattore di trascrizione RUNX2 risulta sovra-espresso nelle cellule trattate rispetto alle cellule di controllo dopo 15 giorni e sotto-espresso dopo 30 giorni. RUNX2 à ̈ un importante modulatore della differenziazione degli osteoblasti che viene attivato nelle prime fasi di differenziazione e svolge un ruolo fondamentale nella maturazione degli osteoblasti e nell'omeostasi. Si evince che i nanotubi di titanio quindi promuovono l’osteodifferenziazione delle cellule staminali nelle prime fasi di trattamento. Un effetto inverso à ̈ stato osservato per un altro fattore trascrizionale, SP7, che regola la formazione delle ossa e la differenziazione degli osteoblasti e che à ̈ a valle di RUNX2.

Nelle cellule staminali trattate SP7 Ã ̈ sottoespresso nei primi giorni di trattamento ma tende poi ad aumentare nei successivi 30 giorni.

I nanotubi di titanio sono in grado di modulare anche l'espressione dei geni che codificano per le proteine collagene della matrice extracellulare come il collagene di tipo 1α1 (COL1A1) e collagene di tipo 3α1 (COL3A1).

Dopo 15 giorni di trattamento à ̈ stata osservata una marcata sovra-espressione di COL1A1 e una più modesta sovra-regolazione di COL3A1.

A 30 giorni di trattamento l'espressione di COL3A1 cala, perché i nanotubi di titanio inducono la sintesi della matrice nei primi stadi di differenziazione e proliferazione degli osteoblasti.

È stato dimostrato che la sintesi di collagene di tipo I à ̈ associata alla differenziazione degli osteoblasti nella fase iniziale, seguita dalla sintesi di ALP e osteocalcina (BGLAP).

In tale studio ALPL à ̈ significativamente sovraespresso dopo 15 giorni di trattamento. L'aumento d’espressione di ALPL à ̈ stato largamente associato alla differenziazione degli osteoblasti.

Anche l’osteocalcina (BGLAP), una proteina coinvolta nella mineralizzazione e il riassorbimento osseo, viene sovra-espressa a 15 e 30 giorni di trattamento.

L’osteocalcina à ̈ attivata immediatamente prima della mineralizzazione e la sua espressione continua ad aumentare nelle fasi successive.

I nanotubi di titanio determinano poi la significativa sovra-espressione del gene FOSL1. Tale gene codifica per un componente del fattore di trascrizione AP-1 i cui siti sono presenti nei promotori di osteogeni, tra cui la fosfatasi alcalina, collagene I, osteocalcina.

Infine l’espressione di endoglin (ENG), un marker di superficie utilizzato per caratterizzare le cellule staminali mesenchimali, rimane inalterata nei primi 15 giorni di trattamento con i nanotubi di titanio. Successivamente la sua espressione cala sensibilmente nelle cellule staminali trattate, indicando l'effetto osteoinducente di questo biomateriale sulle cellule staminali. E’ stato dimostrato infatti che la scomparsa dell'antigene ENG durante l’osteogenesi suggerisce che questa proteina à ̈ coinvolta nella regolazione dell’osteogenesi.

CONCLUSIONI

Il trattamento delle dispositivi implantari in titanio o sue leghe attraverso processi di anodizzazione e successiva inserzione di ioni argento ha dimostrato che le nanostrutture nanotubolari in titanio esplicano attività antimicrobica e influenzano fortemente il comportamento delle cellule staminali in vitro, aumentandone la proliferazione, la differenziazione in osteoblasti e la deposizione della matrice ossea.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di un dispositivo implantare in titanio o sue leghe che comprende i seguenti passaggi: a) sottoporre detto dispositivo implantare in titanio o sue leghe ad un processo di anodizzazione, in acqua o in un solvente organico contenente una quantità di acqua inferiore a 25% in volume, in modo da formare su detto dispositivo implantare uno strato di nanotubi di titanio diossido; b) trattare detto dispositivo implantare ad una temperatura superiore a 450°C o superiore a 500°C per un tempo sufficiente a trasformare detto titanio diossido nella sua forma allotropica cristallina di anatase; c) caricare detti nanotubi di titanio diossido in forma allotropica cristallina di anatase con ioni di una specie ad attività antimicrobica.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detti ioni di una specie ad attività antimicrobica sono ioni Ag<+.>
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detti ioni di una specie ad attività antimicrobica sono preventivamente adsorbiti su nanoparticelle di diossido di titanio di dimensioni tali da inserirsi in detti nanotubi.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui dette particelle di diossido di titanio hanno dimensioni comprese tra 2 e 20 nm.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto solvente organico à ̈ scelto tra dimetilsolfossido e N-metilformamide.
6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto passaggio a) di anodizzazione viene condotto impiegando una configurazione a due elettrodi e un alimentatore regolabile in tensione in corrente, operando con differenze di potenziale dai 20 ai 50 V.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui i tempi di anodizzazione sono variabili tra 6 e 48 ore.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui i tempi di anodizzazione in solvente acquoso sono compresi nell’intervallo 6-12 ore, mentre in solventi organici sono compresi nell’intervallo 12-24 ore.
9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui, quando l’anodizzazione viene condotta in solvente organico, detto solvente organico contiene una quantità d’acqua compresa tra 5 e 20% in volume.
10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, in cui detto passaggio a) di anodizzazione à ̈ condotto in presenza di sali fluoruro.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detti Sali fluoruro sono scelti tra KF 0.1 M, NH4F 0.5% p/p e HF 2% v/v.
12. 12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detto passaggio a) di anodizzazione viene condotto con una densità di corrente elettrica compresa tra 10 e 100 mA/cm<2>.
13. 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detto passaggio b) viene condotto per un tempo compreso tra 30 minuti e 2 ore.
14. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, in cui detto passaggio b) viene condotto ad una temperatura di circa 550°C e per un tempo di circa 1 ora.
15. 15. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14, in cui detto passaggio c) viene condotto immergendo detto dispositivo impiantare in una sospensione di nanoparticelle di biossido di titanio di dimensione nell’intervallo 2-30 nm in una soluzione al 50% in volume di alcol etilico in acqua, contenente ioni argento con concentrazioni nell’intervallo 10<-4>-10<-1>M, in cui gli ioni argento sono preferibilmente derivati da un sale scelto tra argento nitrato, argento acetato, argento citrato, argento lattato, argento sulfadiazina, e sottoponendo il dispositivo impiantare in detta soluzione a sonicazione per tempi dell’ordine di 5-15 minuti.
16. 16. Dispositivo implantare in titanio o sue leghe comprendente uno strato esterno di nanotubi di diossido di titanio nella forma allotropica cristallina di anatase, caratterizzato dal fatto che detti nanotubi di diossido di titanio sono caricati con nanoparticelle di diossido di titanio su cui à ̈ assorbita una specie ionica ad attività antimicrobica.
17. 17. Dispositivo implantare secondo la rivendicazione 16, in cui detta specie ionica ad attività antimicrobica à ̈ costituita da ioni Ag<+>.
18. 18. Dispositivo implantare secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui detta specie ionica à ̈ adsorbita su particelle di titanio diossido di dimensioni tali da inserirsi all’interno di detti nanotubi.
19. 19. Dispositivo implantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 18, in cui detti nanotubi hanno una lunghezza compresa tra 100 nm e 3 micron e diametri compresi tra 30 e 50 nm ed in cui dette particelle di titanio diossido inseribili in detti nano tubi hanno dimensioni comprese tra 2 e 30 nm.
20. 20. Dispositivo implantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 19, in cui detto dispositivo à ̈ una vite per impianto dentale.