ITMI20110678A1 - Composizione e metodo per la crioconservazione di cellule - Google Patents

Composizione e metodo per la crioconservazione di cellule Download PDF

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ITMI20110678A1
ITMI20110678A1 IT000678A ITMI20110678A ITMI20110678A1 IT MI20110678 A1 ITMI20110678 A1 IT MI20110678A1 IT 000678 A IT000678 A IT 000678A IT MI20110678 A ITMI20110678 A IT MI20110678A IT MI20110678 A1 ITMI20110678 A1 IT MI20110678A1
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IT
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cells
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composition
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IT000678A
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Ida Biunno
Sara Simona Dessi
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Consiglio Nazionale Ricerche
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Description

Titolo: “Composizione e metodo per la crioconservazione di celluleâ€
Descrizione
La presente invenzione ha per oggetto una composizione adatta alla crio-conservazione a breve e a lungo termine di cellule di mammifero per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa.
Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per la crio-conservazione di cellule che comprende i) l’internalizzazione di uno zucchero; ii) l’esposizione delle cellule alla composizione di crio-conservazione; iii) il congelamento delle cellule in detta composizione di crio-conservazione. La composizione di crio-conservazione e la metodica oggetto della presente invenzione sono applicabili su cellule conservate in sospensione così come su cellule congelate in adesione.
Stato dell’arte
La medicina rigenerativa rappresenta un approccio terapeutico finalizzato alla rigenerazione biologica del tessuto/organo deteriorato, anziché alla sua sostituzione con una protesi o un trapianto.
Le terapie cellulari rientrano in questo ambito. Inizialmente dirette verso situazioni per le quali non erano presenti alternative terapeutiche, le terapie cellulari si sono in seguito sviluppate in maniera tale da prevedere un loro impiego esteso al trattamento di patologie degenerative largamente diffuse.
Le capacità di proliferazione e differenziamento che caratterizzano le cellule staminali ha certamente contribuito a questo sviluppo. Infatti, la possibilità di disporre di popolazioni di cellule staminali totipotenti, in grado cioà ̈ di dare origine a qualsiasi tipo di cellula matura, amplia in maniera considerevole le possibili ricadute della terapia cellulare nella medicina rigenerativa.
E’ pertanto fortemente avvertita la necessità di poter conservare per utilizzi futuri cellule di mammifero, comprese cellule umane, non solo per applicazioni nell’ambito della ricerca ma anche per applicazioni di medicina rigenerativa. A titolo di esempio, ad oggi sono state impiegate con successo cellule staminali nella medicina rigenerativa veterinaria, in particolare in patologie cutanee, osteocondrali e tendinee del cavallo. Il vantaggio di poter disporre di cellule staminali crio-conservate adatte a tali applicazioni à ̈ evidente. Un altro ambito dove vi à ̈ necessità di disporre di metodiche di conservazione adatte riguarda le cellule del cordone ombelicale, cellule dalle enormi potenzialità che vengono conservate per possibili utilizzi futuri in trapianti autologhi e/o eterologhi.
Dallo stato dell’arte sono noti metodi di conservazione di cellule di mammifero che prevedono il congelamento delle stesse in presenza di proteine come stabilizzanti e di un agente in grado di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio che andrebbero a distruggere in maniera irreversibile la struttura della cellula stessa. E’ consolidato l’utilizzo per il congelamento di una composizione che comprende siero fetale bovino che apporta le proteine necessarie e dimetilsolfossido (DMSO) in concentrazioni generalmente pari al 10% quale crioprotettore. Il DMSO viene utilizzato in quanto à ̈ un solvente particolarmente igroscopico in grado di attraversare la membrana cellulare. Laddove à ̈ necessario conservare le cellule per applicazioni nell’ambito della medicina rigenerativa, la conservazione deve avvenire secondo criteri ben definiti che implicano il superamento di alcuni limiti intrinseci alla metodica di congelamento oggi in uso. In particolare, va escluso il contatto delle cellule con proteine di specie diversa da quella del soggetto ricevente, di conseguenza non à ̈ ammesso l’utilizzo del siero fetale bovino. Va anche escluso il contatto con sostanze dotate di tossicità, tra le quali figura appunto il DMSO. Inoltre il DMSO, per meccanismi ancora non del tutto chiariti, agisce da induttore del differenziamento cellulare, pertanto il suo utilizzo nella conservazione di cellule totipotenti da mantenere nello stato indifferenziato à ̈ fortemente sconsigliato.
Con l’obiettivo di individuare sostanze alternative a quelle di norma utilizzate per il congelamento di cellule, l’attenzione si à ̈ rivolta verso gli zuccheri. E’ infatti noto che zuccheri, tra i quali il trealosio, esercitano un’attività stabilizzante sulle cellule. L’alta concentrazione di trealosio nei tessuti di alcuni organismi detti criptobionti consente loro di sopravvivere in condizioni di mancanza di acqua ed a temperature molto elevate. Questi organismi, una volta reidratati, riprendono il loro normale ciclo vitale, senza presentare alcun danno. Grazie a tali proprietà stabilizzanti, soluzioni contenenti trealosio vengono utilizzate per prolungare la conservazione di tessuti e di organi. Ai fini di poter utilizzare le proprietà del trealosio per la conservazione di cellule, à ̈ necessario internalizzarlo nelle stesse cellule. Infatti la membrana cellulare non à ̈ permeabile agli zuccheri. Diverse metodiche sono state sviluppate per favorire l’internalizzazione cellulare di sostanze esogene, tra le quali l’uso di proteine batteriche (α- emolisina) per la formazione di pori transienti, la lipofezione, l’elettroporazione e la stimolazione dei recettori P2x7 mediante l’impiego dei rispettivi agonisti Adenosina 5-trifosfato (ATP) e/o suoi analoghi come 2’-3'-O-(4-Benzoilbenzoil)adenosina-5'-trifosfato (BzATP). Tuttavia queste metodiche, efficaci e largamente utilizzate in molteplici ambiti, risultano essere troppo invasive e non applicabili in maniera propedeutica alla conservazione delle cellule.
US 7,314,755 descrive l’utilizzo di ATP per la permeabilizzazione della membrana cellulare, permeabilizzazione ottenuta mediante l’azione esercitata dall’ATP sui recettori P2X7. I recettori P2X7 appartengono alla famiglia dei purinocettori per l’ATP e funzionano da canali-ionici ligando operati, responsabili della formazione di pori di membrana permeabili a molecole anche di grandi dimensioni. US 7,314,755 descrive un metodo che prevede l’ingresso ATP-mediato di trealosio nella cellula, suggerendo che cellule così trattate sono adatte alla conservazione come cellule disidratate o congelate. Non viene però suggerita alcuna formulazione di crioconservazione, ed é noto che pellet di cellule, indipendentemente da eventuali trattamenti ai quali le cellule stesse siano state preventivamente esposte, non sono adatti alla crio-conservazione se non risospesi in un solvente opportuno.
E’ scopo della presente invenzione quello di mettere a disposizione una composizione e un metodo adatti alla crio-conservazione a lungo termine di cellule di mammifero per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa.
Descrizione dell’invenzione
La presente invenzione descrive una composizione adatta alla crio-conservazione a breve e a lungo termine di cellule di mammifero preventivamente trattate con zuccheri, preferibilmente con trealosio, per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa. E’ inoltre descritto un metodo per la crio-conservazione che comprende i) l’internalizzazione di uno zucchero, preferibilmente di trealosio, mediata da esposizione a shock osmotici e/o a shock termici; ii) l’esposizione di dette cellule alla composizione di crio-conservazione; iii) il congelamento di dette cellule in detta composizione di crio-conservazione. La composizione di crio-conservazione e la metodica oggetto della presente invenzione sono applicabili su cellule da conservarsi in sospensione così come su cellule da conservarsi in adesione.
La descrizione à ̈ integrata dagli esempi che seguono e che formano parte integrante della stessa.
Descrizione delle figure
Figura 1: rappresentazione grafica del congelamento programmato tramite Rate Freezer.
Figura 2: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule neurali staminali fetali umane derivate dal midollo spinale, linea CB660sp. In A e B sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, ottenuti congelando con una metodica che non comprende, in A, o comprende, in B, l’utilizzo di ATP. In C à ̈ riportata un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento.
Figura 3: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule staminali neurali murine di origine embrionale . In A sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, in B un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento.
Figura 4: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule di glioma umano, G179. In A e B sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, ottenuti congelando con una metodica che non comprende, in A, o comprende, in B, l’utilizzo di ATP.
Figura 5: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule staminali neurali umane AF22. In A sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, in B un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento.
Descrizione dettagliata dell’invenzione:
E’ oggetto della presente invenzione una composizione adatta alla crio-conservazione di cellule di mammifero, comprese cellule umane, somatiche o germinali. Detta composizione di crioconservazione comprende uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule di mammifero e opzionalmente DMSO in quantità minore o uguale al 2% v/v. Detta soluzione di crio-conservazione non contiene proteine di origine animale. Detta composizione di crio-conservazione comprende: NaCl da 50 a 150 mM, preferibilmente circa 145 mM; KCl 1-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; gluconato sale sodico 0.5-6 mM, preferibilmente circa 3 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 25 mM; mioinositolo 100-1000 µM, preferibilmente circa 500 µM, un inibitore delle caspasi, preferibilmente Z-VAD-FMK 100-1000 nM, preferibilmente circa 500 nm, GIBCO MEM Amino Acids 100X, GIBCO MEM Vitamin Solution 100X; uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule 100-1000 mM, preferibilmente trealosio circa 500 mM. Opzionalmente, detta composizione di crioconservazione potrà contenere DMSO in quantità minore o uguale al 2% v/v. Detta composizione di crio-conservazione avrà un’osmolarità compresa tra 1100 e 1400 mOsm, preferibilmente detta osmolarità sarà di circa 1278 mOsm
Il metodo di crio-conservazione comprende l’esposizione di cellule che abbiano preventivamente internalizzato uno zucchero a detta composizione di crio-conservazione. In una forma di realizzazione, detta composizione di crio-conservazione viene mantenuta in ghiaccio prima dell’utilizzo.
I migliori risultati in termini di efficacia della procedura di crio-conservazione sono stati ottenuti utilizzando detta composizione di crioconservazione secondo la metodica che viene qui di seguito descritta e che à ̈ parte integrante della presente invenzione.
Il metodo di crio-conservazione comprende:
1) l’internalizzazione nelle cellule di uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule, laddove l’internalizzazione à ̈ mediata da esposizione a shock osmotico e/o shock termico ed, opzionalmente, ad esposizione ad ATP o analoghi dell’ATP;
2) l’esposizione di dette cellule alla composizione di crio-conservazione;
3) il congelamento di dette cellule.
Detto processo 1) di internalizzazione dello zucchero comprende due fasi: a) modifica delle conduttanze ioniche di membrana con conseguente aumento della fluidità e trasporto passivo delle molecole presenti nell’ambiente extracellulare; b) ingresso dello zucchero.
In detta fase a) le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii)opzionalmente, lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, preferibilmente ad una T compresa tra 0°C e 4°C; iii)opzionalmente, rapido lavaggio con soluzione di distacco, preferibilmente comprendente tripsina EDTA o Accutase<TM>; iv)opzionalmente, aggiunta di una soluzione salina, detta soluzione B che, in una forma di realizzazione, può contenere un agente porante, preferibilmente ATP o suoi analoghi. Detta soluzione B verrà mantenuta sulle cellule per un tempo compreso tra i 5 e i 30 minuti, preferibilmente per 15 minuti, ad una T compresa tra i 4 e i 50°C, preferibilmente a circa 37°C.
Laddove le cellule vengono conservate in adesione, detta fase a) comprende detti passaggi i), ii) e, in detto passaggio iv) si aggiunge detta soluzione B che, in una forma di realizzazione, può contenere un agente porante, preferibilmente ATP o suoi analoghi.
Si passa quindi a detta fase b), dove dette cellule vengono esposte a una soluzione di internalizzazione, detta soluzione C, che comprende uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule di mammifero, preferibilmente trealosio. Detta soluzione C viene preferibilmente mantenuta a T compresa tra 0°C e 4°C e dette cellule vengono incubate in detta soluzione di internalizzazione per un tempo compreso tra 5 e 60 minuti, preferibilmente per circa 15 minuti a una T compresa tra i 4 e i 50°C, preferibilmente a circa 37°C. Per favorire l’internalizzazione dello zucchero si interviene meccanicamente, ad esempio con leggeri urti sulle pareti della piastra o della flask nella quale le cellule sono adese.
Laddove le cellule vengono conservate in adesione, in detta fase b), mantenendo dette cellule in detta soluzione B, viene aggiunta detta soluzione di internalizzazione C; il volume di soluzione C sarà superiore a quello di soluzione B, preferibilmente detta soluzione C e detta soluzione B saranno in rapporto 2:1.
Nella successiva fase 2), laddove le cellule vengono congelate in sospensione, dette cellule vengono risospese nella composizione di crioconservazione dopo aver ottenuto per sedimentazione un pellet cellulare, anche mediante l’utilizzo di una centrifuga, centrifugando circa 5 minuti a circa 1500 rpm a circa 25°C. Detto pellet cellulare à ̈ preferibilmente costituito da un numero di cellule compreso tra 3*10^6 e 5*10^6, preferibilmente circa 4*10^6. laddove le cellule vengono congelate in adesione, la composizione di crio-conservazione viene aggiunta direttamente sulle cellule, private della soluzione B e della soluzione di internalizzazione.
Nella fase 3), dette cellule in composizione di crio-conservazione vengono congelate, preferibilmente mediante Rate Freezer, ovvero in un sistema di abbassamento controllato della temperatura. In una forma preferita di realizzazione, la temperature viene abbassata di ~1ËšC/min. Per controllare la nucleazione ed il rilascio del calore latente durante il congelamento il Rate Freezer viene preferibilmente programmato con la rampa rappresentata in Figura 1 e che comprende: (1) mantenimento della temperatura per 3 min a 4.0ËšC, (2) -1.0ËšC/min a -4.0ËšC, (3) -35.0ËšC/min a -35.0°C, (4) 25.0ËšC/min a -16.0ËšC, (5) 2.0ËšC/min a -12.0ËšC, (6)-1.0ËšC/min a -40.0ËšC, (7) -5.0ËšC/min a -60.0ËšC, (8) -10.0Ëš/min a -90.0ËšC.
Le cellule vengono quindi mantenute in azoto liquido, in vapori di azoto o a – 80°C.
Detta soluzione A à ̈ preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, e comprende: NaCl da 50 a 200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-20 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; EDTA 5-30 mM, preferibilmente circa 10 mM. Detta soluzione A ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327 mOsm.
Detta soluzione B à ̈ preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, e comprende: NaCl da 5 a 20 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM, opzionalmente potrà essere impiegato ATP 1-15 mM, preferibilmente circa 5 mM. In alternativa all’ATP, la soluzione B potrà contenere analoghi dell’ATP, quali il BzATP [2’, 3’-O-(benzoil-4-benzoil) ATP] in concentrazioni ricomprese tra 5 e 30 µM, preferibilmente circa 15 µM. In un’ulteriore forma di realizzazione, ATP e BzATP potranno essere co-presenti in detta soluzione B. Detta soluzione B ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327mOsm.
Detta soluzione di internalizzazione C comprende: NaCl da 5 a 20 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Detta soluzione C ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.219 mOsm.
In una forma di realizzazione, laddove si proceda con detta fase iv) e con l’esposizione a detta soluzione B, nella successiva fase b) la soluzione di internalizzazione C usata comprenderà NaCl da 50 a 200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-20 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Detta soluzione C ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.219 mOsm.
In una forma di realizzazione, la temperatura di utilizzo delle soluzioni A, B, C e della composizione di crio-conservazione à ̈ pari alla temperatura di incubazione delle cellule, preferibilmente circa 37°C. In un’ulteriore forma di realizzazione, laddove si volesse aggiungere allo shock osmotico anche uno shock termico, dette soluzioni vengono utilizzate fredde.
La composizione di crio-conservazione e la metodica qui rivendicate trovano applicazione per la crio-conservazione di linee cellulari immortalizzate, così come di cellule staminali totipotenti o pluripotenti, anche umane. In particolare, detta composizione di crio-conservazione e detta metodica trovano impiego con successo nella crio-conservazione di cellule staminali neurali murine, ad esempio le NS46C. Un impiego di successo si à ̈ anche osservato nella crio-conservazione di cellule staminali neurali umane, ad esempio nella crio-conservazione di cellule staminali neurali umane derivate dal midollo spinale fetale, quali le CB660sp oppure delle cellule staminali neurali umane AF22, ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS).
Cellule crio-conservate nella composizione di crio-conservazione e secondo la metodica della presente invenzione potranno trovare impiego nella ricerca e nella medicina rigenerativa. Dette cellule, non essendo entrate in contatto con siero fetale bovino, non contengono antigeni eventualmente responsabili di una risposta immunitaria non desiderata. Inoltre, l’assenza di DMSO fa sì che le stesse non vadano incontro ad un differenziamento indesiderato, ma sia possibile indirizzarne il differenziamento quando scongelate. Infine, utilizzando la composizione e la metodica qui rivendicate, le cellule risultano stabilizzate e non vanno incontro alle alterazioni cromosomiche che tipicamente si riscontrano seguendo metodiche di crio-conservazione tradizionali.
ESEMPI:
Esempio 1: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule staminali neurali umane.
Cellule staminali neurali umane derivate dal midollo spinale fetale CB660sp la cui derivazione à ̈ descritta in WO2005/121318 vengono congelate utilizzando una composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, MEM Vitamin 100X, MEM Aminoacid 100X, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM. Vengono utilizzate due diverse metodiche. La metodica a comprende:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente Tripsina EDTA e/o Accutase<TM>; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione precedentemente mantenuta a 4°C, incubando per circa 15 minuti a 37°C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione sopra descritta;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido.
La metodica b comprende gli stessi passaggi descritti in a, ma detto passaggio 1) comprende in aggiunta uno step iv) dove viene aggiunta una soluzione B per 15’ a 37°C che opzionalmente comprende ATP.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Quando viene seguito il metodo b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica.
La figura 2 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento (t=0h) e 24 ore dopo lo scongelamento (t=24h). Con entrambe le metodiche di conta cellulare, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 50% ed una vitalità pari a 40% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti.
Esempio 2: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule neurali staminali fetali murine.
Cellule staminali neurali murine NS46C, derivate secondo la procedura descritta in WO2005/121318, vengono congelate utilizzando la composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM, DMSO 2% seguendo una metodica che comprende:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente Accutase<TM>; iv) aggiunta di una soluzione B che comprende ATP; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata preferibilmente MilliQ.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata preferibilmente MilliQ.
Detta soluzione C comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica.
La figura 3 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento.
Con entrambi i metodi, utilizzando la composizione di crio-conservazione qui descritta, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 47% ed una vitalità pari a 41% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti.
Esempio 3: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule di glioma umano.
Cellule di glioma umano G179 vengono congelate utilizzando una composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM. Le cellule vengono conservate in azoto liquido. Si utilizzano due metodiche di conservazione. la metodica a comprende:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente accutase; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C; 2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido.
La metodica b comprende gli stessi passaggi descritti in a, ma detto passaggio 1 comprende uno step iv) di aggiunta di una soluzione B che comprende ATP.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Seguendo la metodica b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypab blue e mediante analisi citometrica.
La figura 4 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento. Con entrambi i metodi, utilizzando la composizione di crio-conservazione qui descritta, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 40% ed una vitalità pari a 30% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti.
Esempio 4: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule staminali neurali umane.
Cellule staminali neurali umane AF22, ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), sono congelate utilizzando una composizione di crioconservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM, MEM Amino Acids 100X, MEM Vitamin Solution 100X; trealosio 500 mM secondo una metodica che comprende:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente accutase; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Seguendo la metodica b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.500 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica.
La figura 5 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento. Le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 58% ed una vitalità pari a 91% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti.

Claims (24)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione di crio-conservazione di cellule di mammifero che comprende uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule di mammifero e non contiene proteine di origine animale.
  2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 che comprende: NaCl da 50 a 150 mM; KCl 1-20 mM; glucosio 2-20 mM; gluconato sale sodico 0.5-6 mM; Hepes 5-50 mM; uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule di mammifero 100-1000 mM.
  3. 3. Composizione secondo una delle rivendicazioni 1 o 2 che comprende anche: mioinositolo 100-1000 µM e un inibitore delle caspasi, preferibilmente Z-VAD-FMK 100-1000 nM.
  4. 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 che comprende: NaCl circa 145 mM; KCl circa 5 mM; glucosio circa 5 mM; gluconato sale sodico circa 3 mM; Hepes circa 25 mM; uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule di mammifero circa 500mM; mioinositolo circa 500 µM, Z-VAD-FMK circa 500 nM, GIBCO MEM Amino Acids 100X, GIBCO MEM Vitamin Solution 100X.
  5. 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, avente un’osmolarità compresa tra 1100 e 1400 mOsm, preferibilmente pari a circa 1278 mOsm.
  6. 6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, dove detto zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule di mammifero à ̈ trealosio.
  7. 7. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6 che comprende anche DMSO in quantità minore o uguale al 2% v/v.
  8. 8. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per l’uso nella crioconservazione di cellule di mammifero, comprese cellule staminali e/o germinali.
  9. 9. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per l’uso nella crioconservazione di cellule staminali neurali murine, preferibilmente di cellule NS46C.
  10. 10. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per l’uso nella crioconservazione di cellule staminali neurali umane, derivate dal midollo spinale fetale o ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte, preferibilmente dette cellule sono cellule CB660sp o cellule AF22.
  11. 11. Un metodo per la crio-conservazione di cellule di mammifero, comprese cellule staminali e/o germinali, che comprende: i) l’internalizzazione in dette cellule di uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule; ii) l’esposizione di dette cellule ottenute nel passaggio i) ad una composizione di crioconservazione che comprende uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule e non contiene proteine di origine animale; iii) il congelamento di dette cellule.
  12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, dove dette cellule vengono crio-conservate in sospensione o in adesione.
  13. 13. Metodo secondo le rivendicazioni 11 o 12, dove detta internalizzazione di detto zucchero à ̈ ottenuta mediante shock osmotico e/o shock termico e, opzionalmente, esposizione ad ATP o suoi analoghi.
  14. 14. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 13, dove detta internalizzazione di detto zucchero avviene privando le cellule del terreno di coltura ed esponendole ad un ciclo di lavaggi seguito dall’esposizione di dette cellule ad una soluzione di internalizzazione che comprende uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule.
  15. 15. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 14, dove detto ciclo di lavaggi comprende: i)lavaggio con PBS, soluzione salina fosfato; ii)opzionalmente, lavaggio rapido con soluzione salina A, che comprende EDTA, preferibilmente ad una T compresa tra 0°C e 4°C; iii)opzionalmente, rapido lavaggio con soluzione di distacco, preferibilmente comprendente tripsina EDTA o Accutase<TM>; iv)opzionalmente, aggiunta di una soluzione salina B che, opzionalmente, contiene un agente porante, preferibilmente ATP o suoi analoghi.
  16. 16. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 15, dove dette cellule vengono conservate in adesione e, mantenendo dette cellule in detta soluzione B, viene aggiunta sulle stesse detta soluzione di internalizzazione in volume superiore a quello di detta soluzione B, preferibilmente detta soluzione di internalizzazione e detta soluzione B saranno in rapporto di circa 2:1.
  17. 17. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 16, dove detta soluzione di internalizzazione viene mantenuta a T compresa tra 0°C e 4°C e dette cellule vengono incubate in detta soluzione per un tempo compreso tra 5 e 60 minuti, preferibilmente per circa 15 minuti a una T compresa tra i 4 e i 50°C, preferibilmente a circa 37°C.
  18. 18. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 17, dove: - detta soluzione A, preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, comprende: NaCl da 50 a 200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-20 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; EDTA 5-30 mM, preferibilmente circa 10 mM; detta soluzione A ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327mOsm; - detta soluzione B, preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, comprende: NaCl da 5 a 20 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM, opzionalmente potrà essere impiegato ATP 1-15 mM, preferibilmente circa 5 mM o, in alternativa o in aggiunta a detto ATP, BzATP [2’, 3’-O-(4benzoilbenzoil) ATP] in concentrazioni comprese tra 5 e 30 µM, preferibilmente circa 15 µM; detta soluzione B ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327mOsm; - detta soluzione di internalizzazione C, preparata in PBS, comprende: NaCl da 5 a 200 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS; detta soluzione ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.219 mOsm.
  19. 19. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 18, dove, laddove in detto ciclo di lavaggi si espongano dette cellule a detta soluzione B che comprende ATP, detta soluzione di internalizzazione C, preparata in PBS, comprende: NaCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-200 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM; detta soluzione di internalizzazione ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.278 mOsm.
  20. 20. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 19, dove al termine di detta internalizzazione dette cellule vengono risospese in una composizione di crio-conservazione dopo aver ottenuto per sedimentazione un pellet cellulare, anche mediante l’utilizzo di una centrifuga.
  21. 21. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 20, dove al termine di detta internalizzazione a dette cellule in adesione la composizione di crioconservazione viene aggiunta su dette cellule private della soluzione B e della soluzione di internalizzazione.
  22. 22. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 20, dove dette cellule esposte a detta composizione di crio-conservazione vengono congelate, preferibilmente mediante Rate Freezer.
  23. 23. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 11 a 22, dove detta composizione di crio-conservazione à ̈ la composizione di crio-conservazione rivendicata in una delle rivendicazioni da 1 a 7.
  24. 24. Cellule di mammifero, comprese cellule umane, somatiche e/o germinali, crio-conservate secondo il metodo rivendicato in una delle rivendicazioni da 11 a 23 per l’uso nella medicina rigenerativa.
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