ITMI20111283A1 - Composizione comprendente microorganismi del genere enterococcus thailandicus ed equolo, metodo di preparazione ed uso della stessa come agente prebiotico - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:

COMPOSIZIONE COMPRENDENTE MICROORGANISMI DEL GENERE ENTEROCOCCUS THAILANDICUS ED EQUOLO, METODO DI PREPARAZIONE ED USO DELLA STESSA COME AGENTE PREBIOTICO

Campo dell’invenzione

L’invenzione è relativa a microorganismi del genere Enterococcus thailandicus in grado di produrre elevate quantità di equolo e ad una composizione comprendente tali microorganismi del genere Enterococcus thailandicus ed equolo. L’invenzione è relativa inoltre al metodo di preparazione della composizione stessa ed al suo uso come agente prebiotico.

Stato della tecnica

Gli isoflavonoidi, composti difenolici di origine vegetale, con struttura simile al 17-beta-estradiolo, sono in grado di legarsi ai recettori estrogenici in diversi tessuti agendo come degli agonisti o antagonisti (G. Kuiper et al., Endocrinology, 1997, 138, 863-870; I.R. Pantry et al., Progr. in din. Biol. Res., 1988, 280, 57-60, A.R. Liss Ed. NY; L.S. Stare et al., Progr. in din. Biol. Res., 1986, 213, 253-256, A.R. Liss Ed. NY). Per tali caratteristiche sono in grado di sviluppare dei benefici effetti per la salute dell’uomo: ad esempio, diversi autori riportano il loro potenziale ruolo nella prevenzione e terapia delle malattie ormono-correlate quali il tumore della mammella e l’osteoporosi (L. Coward et al., J. Agr. Food Chem ., 1993, 41 , 1961-1967; M.J. Messina et al., Nutr. Cancer, 1994, 21 , 113-131 ; H. Adlercreutz, Env. Health Perspect, 1995, 103, 103-112).

Altre proprietà descritte per la stessa famiglia di bioflavonoidi sono, ad esempio, l’inibizione dell’aldosoreduttasi (S.D. Varma et al., Progr. in din. Biol. Res., 1986, 213, 343-358, A.R. Liss Ed. NY) con influenza su una possibile attenuazione delle complicanze diabetiche; l'inibizione delle fosfodiesterasi (A. Beretz et al., Progr. in din. Biol., Res., 1986, 213, 281-296, A.R. Liss Ed. NY).

Gli isoflavonoidi sono presenti in molte specie vegetali e sono particolarmente abbondanti nella soia (M. Axelson et al., J. Endocrinol., 1984, 102, 49-56; N.K. Peters et al., Science, 1986, 233, 977-980; D. Phillips, Ann. Rev. Phytochem., 1992, 26, 201-231 ).

La daidzeina (4’,7-diidrossiisoflavone) è uno dei principali isoflavonoidi (rappresenta più dell’uno per cento del peso secco del germe di soia) (P.A. Murphy et al., J. Chromatogr., 2002, B 777, 129-138). Nella soia e relativi prodotti non fermentati essa è presente solo in piccole quantità come aglicone (meno del cinque per cento del totale), mentre è principalmente presente nella forma non assorbibile e biologicamente inattiva di glucoside, acetilglicoside o malonilglicoside (H.J. Wang et al., J. Agr. Food Chem., 1994, 42, 1666-1673).

Questi ultimi, dopo ingestione, sono in piccola quantità idrolizzati ad aglicone a livello del piccolo intestino e, quindi, assorbiti attraverso l’epitelio intestinale stesso (A.J. Day et al., FEBS Lett., 2000, 468, 166-170). Una considerevole frazione non idrolizzata raggiunge il colon dove le forme glicosilata, solfatata e glucoronidata vengono deconiugate dagli enzimi prodotti dai microrganismi (A.J. Day et al., 2000, ref. cit.\ M. Richelle et al., J. Nutr., 2002, 132, 2587-2592; J. Chen et al., J. Pharmacol., Exp. Ther., 2003, 304, 1228-1235; K.D.R. Setchell et al., Am. J. Clin. Nutr., 2003, 77, 411-419). Gli agliconi vengono quindi assorbiti o soggetti ad una ulteriore metabolizzazione da parte dei batteri intestinali (H. Wiseman, Proc. Nutr. Soc., 1999, 58, 139-146).

Il destino metabolico dopo ingestione degli isoflavonoidi, in particolare la loro trasformazione da parte dei microbi intestinali riveste un importante aspetto per quanto attiene la loro biodisponibilità e bioattività (M.S. Kurzer et al., Ann. Rev. Nutr., 1997, 17, 353-381).

E’ stato supposto che, nelle condizioni riduttrici presenti nel colon, la daidzeina venga prima trasformata in diidrodaidzeina e successivamente, da questa, in O-desmetilangolensina ed in equolo (Y.C. Chang et al., J. Nat. Prod., 1995, 58, 1892-1896; S. Heinonen et al., Anal. Biochem., 1999, 274, 211-219). L’equolo, metabolita intestinale della daidzeina, in particolare è stato oggetto di molte attenzioni per i suoi potenziali benefici effetti sulla salute (K.D.R. Satchell et al., J. Nutr., 2002, 132, 3577-3584). Questi viene esclusivamente prodotto dai batteri intestinali (E. Bowey et al., Food Chem. Toxicol., 2003, 41 , 631-636).

La composizione della microflora intestinale è un fattore determinante per la natura dei metaboliti che si formano ed è variabile da individuo ad individuo (X. Xu et al., J. Nutr., 1995, 125, 2307-2315; F. Rafii et al., Arch. Microbiol., 2003, 180, 11-16; C. Atkinson et al., J. Nutr., 2004, 134, 596-599).

E’ stato calcolato che, approssimativamente, solo un terzo degli uomini ospitano una microflora intestinale in grado di trasformare la daidzeina in equolo (equolo produttori); la produzione di O-desmetilangolensina è maggiormente diffusa e non è direttamente correiabile all’equolo (G.E. Kelly et al., Proc. Soc. exp. Biol. Med., 1995, 208, 40-43; I. Rowland et al., Nutr. Cancer, 2000, 36, 27-32; J.W. Lampe et al., J. Nutr., 2001, 131, 740-744; K.D.R. Setchell et al., 2002, ref. cit.).

L’equolo ha una affinità di legame nei confronti dei recettori umani alfa e beta estrogenici molto superiore rispetto alla daidzeina (da dieci a ottanta volte) ed induce la trascrizione molto più fortemente di qualsiasi altro isoflavonoide (N. Sathyamoorthy et al., Eur. J. Cancer, 1977, 33, 2384-2389; G. Kuiper et al., Endocrinology, 1998, 139, 4252-4263; K. Morito et al., Biol. Phatm. Bull., 2001, 24, 351-356; D. Kostenac et al., J. Agr. Food Chem., 2003, 51, 7632-7635; R.S. Muthyala et al., Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 1559-1567).

E’ stato anche riportato che lo stesso ha, sempre rispetto agli altri isoflavonoidi, un potere antiossidante significativamente più forte (J.H. Mitchell et al., Arch. Biochem. Biophys., 1998, 360, 142-148) e, recentemente, ne è stata evidenziata l’attività anti-androgenica, con conseguenti possibili effetti inibitori sullo sviluppo del cancro della prostata (T.D. Lund et al., Biol. Reprod., 2004, 70, 1188-1195).

L’equolo è assorbito attraverso il colon meglio del precursore daidzeina, ha una più bassa clearance piasmatica ed è metabolicamente inerte (K.D.R. Setchell et al., 2002, ref. cit.).

Le proprietà biologiche di questo fitoestrogeno suggeriscono che l’efficacia di una dieta contenente soia può essere dipendente dallo stato individuale del soggetto di essere “equolo-produttore”.

Recenti studi supportano questa deduzione (H. Akaza et al., Jpn. J. CHn. Oncol., 2004, 34, 86-89; B.J. Meyer et al., Ann. Nutr. Metabol., 2004, 48, 67-78).

L’equolo, in clinica, risulta efficace a dosaggi nell’ordine di 10 - 30 mg/dose (N. Ishiwata et al., Menopause, 2009, 16(1), 141; T. Aso, J. Nutr., 2010, 140, 1386S).

Recentemente si è riscontrato anche un crescente interesse allo studio e caratterizzazione delle specie batteriche in grado di modulare specificatamente la produzione di equolo a livello del colon.

Studi "in vitro” con impiego di materiale fecale umano hanno consentito di isolare alcune specie microorganiche coinvolte nel metabolismo di questo prodotto: queste sono rappresentate da Lactobacillus mucosae, Enterococcus faecium , Finegolda magna e Veillonella sp. (K. Decroos et al., Arch. Microbiol. 2005, 183, 45-55).

Di particolare interesse si sono rivelati gli studi condotti da Uchiyama, in un primo tempo a partire da streptococchi intestinali (S. Uchiyama et al., WO99/07392) e, successivamente, a partire da batteri lattici del genere Lactococcus garvieae (S. Uchiyama et al., EP 1 649 760).

Nel primo caso, che contempla l’impiego di streptococchi, viene rivendicata essenzialmente una composizione comprendente una sostanza contenente daidzeina ed un ceppo di microorganismo vitale metabolizzante la daidzeina in equolo oltre a sostanze in grado di favorire il mantenimento e la ricrescita del ceppo.

In un secondo aspetto viene rivendicata invece una composizione dove è già presente equolo previamente prodotto dal microorganismo per fermentazione con rese neH’ordine del 55% rispetto al substrato isoflavonoico.

In successivi studi, gli stessi autori confermano che ceppi del genere bacterioide ovatus, ruminococco e streptococco intermedius da loro isolati (T. Ueno et al., J. Nutr., 2002, 132, 594S) non erano da considerarsi sicuri né di facile assunzione per l’uomo (S. Uchiyama et al., J. Invest. Microbiol., 2007, 21 , 217).

Da qui la necessità di proseguire gli studi per ricercare lattobacilli considerati altamente sicuri per l’impiego come probiotici; questo ha portato all’isolamento del Lactobacillo garvieae.

Questi viene impiegato nella forma vitale, ma non limitatamente a questa, in composizioni di diversa natura contenenti isoflavonoìdi del tipo della daidzeina con la finalità di fornire equolo all’organismo; la concentrazione di equolo contenuta nelle composizioni e mediamente compresa tra 2 e 5 mg per 100 gr di composizione totale.

Da questi studi deriva la rivendicazione prevalente dell’impiego dei microorganismi come probiotici per la produzione a livello intestinale di equolo e ciò, probabilmente, come conseguenza del fatto che le rese nella produzione fermentativa dello stesso non sono di per sé sufficienti per realizzare forme farmaceutiche industrialmente convenienti con dosaggi di equolo terapeuticamente validi.

D’altra parte è noto che l’impiego di composti probiotici, in assenza di fattori di crescita specifici, è aleatorio in considerazione della sperequazione tra tempi utili per l'impianto del microorganismo e i tempi di transito intestinale del composto (M. Raynaud et al., Ann. Nutr. Alim., 1971 , 25, A209).

Uno scopo della presente invenzione è quindi di identificare altri microorganismi in grado di metabolizzare in modo efficiente gli isoflavoni della soia in equolo e nel contempo sicuri sotto il profilo di un loro uso umano.

È ancora uno scopo della presente invenzione la messa a punto di composizioni ricche in equolo impiegabili nella prevenzione e/o correzione di disturbi funzionali ed ormonali connessi alla menopausa, compreso l’irsutismo femminile.

Sommario

Per gli scopi dell’Invenzione gli inventori hanno isolato e caratterizzato microorganismi intestinali, del genere Enterococcus thailandicus, selezionati da materiale fecale di soggetti sani produttori di equolo. Tali microorganismi sono stati selezionati in base alla loro capacità di metabolizzare gli isoflavoni di soia, principalmente la daidzeina, in equolo e per migliorare ulteriormente tali loro proprietà metabolizzanti sono stati successivamente condizionati. Il processo di condizionamento prevede la riproduzione dei microorganismi in brodi di coltura arricchiti in concentrazioni crescenti di miscele di isoflavoni titolati nella stessa daidzeina. La riproduzione fermentativa di tali microrganismi, in terreni di coltura opportunamente definiti per aumentare la quantità prodotta degli stessi, consente di ottenere, in modo industrialmente conveniente, una massa ricca in equolo, in intermedi di metabolizzazione ed in enzimi metabolizzanti la daidzeina.

L’impiego, come prebiotico, della composizione costituita dalla massa ottenuta dal condizionamento e dalla riproduzione fermentativa degli enterococci selezionati è in grado di fornire aH’organismo una quantità di fitoestrogeno equolo sufficiente per avere evidenti riscontri terapeutici in disordini legati al dismetabolismo estrogenico quali, ad esempio, la menopausa, i disturbi della fertilità e l’irsutismo femminile.

In un primo aspetto sono quindi oggetto della presente invenzione microorganismi appartenenti al genere Enterococcus thailandicus caratterizzati dal fatto di produrre equolo nel surnatante della brodo-coltura in una concentrazione superiore a 20 mg/Lt con impiego di un inoculo consistente in 20mL/Lt di una coltura fresca del microorganismo prelevato in fase logaritmica di crescita e di D.O. a 620 nm, al momento del prelievo, nell’ordine pari a 1,300-1,400 coltivata in brodi di coltura a base di tioglicolato arricchiti in daidzeina del 0,1%.

In un secondo aspetto è oggetto dell’invenzione un metodo di preparazione di una composizione consistente in una massa secca comprendente tali microorganismi del genere Enterococcus thailandicus condizionati ad una maggiore metabolizzazione della daidzeina in equolo, riprodotti per fermentazione in opportuni brodi di coltura, inattivati, lisati e seccati.

Tale metodo comprende almeno le fasi di:

- condizionamento di tali microorganismi del genere Enterococcus thailandicus alla maggiore metabolizzazione della daidzeina condotto mediante colture successive in terreni liquidi per anaerobiosi, cui vengono aggiunte concentrazioni scalarmente crescenti di daizdeina sino al plateau di metabolizzazione;

- riproduzione fermentativa a 37 °C e pH 7,2 per 48 ore in condizioni di anaerobiosi in brodo di coltura a base di estratti di fegato e peptone di soia ed arricchito di un substrato solubilizzato di isoflavonoidi titolati in daidzeina e di equolo e di diidrodaidzeina aggiunti come catalizzatori della reazione di metabolizzazione;

- inattivazione dei microorganismi per riscaldamento a temperature non denaturanti la struttura e successiva lisi enzimatica per aumentare la permeabilità della membrana cellulare e rendere maggiormente biodisponibile la relativa endomassa;

- essicamento della massa.

In un altro aspetto è oggetto dell’invenzione una composizione consistente in una massa secca ottenuta con il metodo sopramenzionato e comprendente i microorganismi del genere Enterococcus thailandicus condizionati alla maggior metabolizzazione della daidzeina, inattivati e lisati, isoflavonoidi totali e titolati in daidzeina ed equolo.

In un ulteriore aspetto l’invenzione ha per oggetto l’uso della composizione come agente prebiotico per la preparazione di integratori nutraceutici per la prevenzione e/o correzione di disturbi funzionali e ormonali connessi alla menopausa e dell’irsutismo femminile.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Partendo da materiale fecale di soggetti sani produttori di equolo sono stati isolati ceppi anaerobi appartenenti al genere Enterococcus thailandicus e tra questi sono stati selezionati ceppi di Enterococcus thailandicus in grado di metabolizzare la daidzeina ed isoflavoni similari in equolo. La selezione è necessaria in quanto non tutti i ceppi di Enterococcus thailandicus si sono dimostrati in grado di metabolizzare gli isoflavoni di soia in equolo.

Tali ceppi produttori di equolo, al fine di ottimizzarne le proprietà metabolizzanti, sono stati sottoposti “in vitro” ad una fase di condizionamento metabolico mediante un procedimento che prevede la loro riproduzione seriale su terreno di coltura standard per anaerobi cui vengono associate concentrazioni scalarmene crescenti di miscele di isoflavonoidi titolate in daidzeina ed in daidzina. Si sono cosi ottenuti dei microorganismi deputati specificatamente alla metabolizzazione degli isoflavonoidi, daidzeina e daidzina in particolare.

La loro riproduzione, in un processo fermentativo che prevede anche l’impiego di catalizzatori della metabolizzazione, quali diidrodaidzeina e lo stesso equolo, in aggiunta al terreno di coltura, consente l’ottenimento, dal processo, di equolo in concentrazioni industrialmente convenienti che consentono il suo utilizzo in dosi terapeuticamente adatte.

La quantità di enzimi e di metaboliti prodotta è sorprendentemente superiore a quella ottenibile con i microrganismi e le tecniche descritte allo stato deH’arte.

Oltre a ciò sono stati messi a punto dei particolari terreni nutrienti, che una volta arricchiti con gli opportuni substrati metabolici e catalizzatori della metabolizzazione stessa, sono in grado di incrementare notevolmente la quantità in massa microorganica prodotta durante il processo fermentativo stesso.

Si è cosi ottenuto un significativo miglioramento delle rese in massa microorganica ed in equolo prodotto, cosa che ha permesso, impiegando la massa microorganica inattivata, la realizzazione di prebiotici contenenti concentrazioni di equolo terapeuticamente utili a costi industrialmente convenienti.

In dettaglio, da soggetti sani risultati equolo-produttori sono stati isolati e selezionati microorganismi aventi la capacità di produrre equolo nel surnatante della brodo-coltura dei microorganismi in una concentrazione superiore a 20 mg/Lt a partire da una coltura fresca con D.O. a 620 nm pari a 1 ,300 - 1 ,400 coltivati in brodi di coltura a base di tioglicolato arricchiti in daidzeina del 0,1%.

La caratterizzazione tassonomica eseguita su questi microorganismi (sigla di riferimento P11/7n; P11/10η, P11/1 Ob) ha portato alla loro identificazione sulla base deH’analisi del profilo genetico come microorganismi appartenenti al genere Enterococcus thailandicus.

Dalla caratterizzazione tassonomica si è inoltre verificato che questi microorganismi hanno le seguenti caratteristiche:

- gram , anaerobi facoltativi, non sporigeni;

- positivi per idrolisi di arginina ed esculina e debolmente positivi per l’emolisi;

- negativi per la catalasi, idrolisi di gelatina, riduzione dei nitrati e produzione di gas da glucosio, gluconato e citrato;

- crescita a pH tra 5,0 e 9,6, 15 - 45 °C e in 2 - 6,5 % di sodio cloruro; - produzione di acido da cellobiosio, fruttosio, galattosio, glucosio, maltosio, mannitolo, sucrosio ma non da arabinosio, eritriolo, fucosio. I ceppi preferiti di Enterococcus thailandicus selezionati per gli scopi dell’invenzione hanno la capacità di produrre equolo, prima del condizionamento, in una concentrazione compresa tra 20 mg/Lt e 30 mg/Lt (corrispondenti al 2% ed al 3% del substrato daidzeina).

Per migliorare le proprietà metabolizzanti gli isoflavoni in equolo di questi microorganismi, questi vengono sottoposti ad una fase di condizionamento metabolico consistente in una serie di riproduzioni e crescite successive a partire da un inoculo fresco prelevato in fase logaritmica (D.O. a 620 nm della coltura pari a 1,400) su brodo di coltura per anaerobiosi a base di tioglicolato ed arricchito, in ogni crescita successiva, di una concentrazione in scala geometrica crescente per due di daidzeina sino al plateau della sua metabolizzazione in equolo (intervallo di concentrazioni di daidzeina aggiunte alle varie colture successive da 10 mg/Lt a 1.000 mg/Lt).

Dopo questa fase di condizionamento i microorganismi si sono dimostrarti in grado di produrre equolo nel surnatante della brodo-coltura in concentrazioni superiori a 212.0 - 250,0 mg/Lt (corrispondenti al 21 - 25% del substrato).

Questi microorganismi condizionati vengono poi sottoposti a riproduzione fermentativa, fase che prevede l'impiego di un substrato solubile di metabolizzazione ricco in isoflavonoidi. Questo substrato è ottenuto da un idrolisato secco di soia avente un titolo in isoflavoni totali almeno del 40% p/p, di cui daidzeina almeno il 10% p/p, per estrazione a 60 °C con una miscela etano!o:acqua 50:50. II surnatante ottenuto dall’estrazione portato a secco costituisce il substrato solubile di metabolizzazione ricco in isoflavonoidi ed ha preferibilmente un titolo in isoflavonoidi almeno del 90%, di cui la diadzeina rappresenta almeno il 20%.

La riproduzione fermentativa dei microorganismi prevede inoltre l’impiego di un terreno di crescita in grado di aumentare la resa in microorganismi.

Tale terreno consiste in una composizione comprendente:

estratto di fegato 20.0 gr/Lt

peptone di soia 5.0 gr/Lt

sodio cloruro 5,0 gr/Lt

acqua q.b. a 1,0 Lt.

Questo terreno viene addizionato con il substrato solubile di metabolizzazione ricco in isoflavonoidi sopra descritto in una quantità compresa tra 5,0 e 50,0 gr/Lt (preferibilmente 20 gr/lt corrispondenti ad un contenuto in daidzeina di 4,84 gr/Lt). In funzione di catalizzatori sono inoltre aggiunti al brodo di coltura equolo in una quantità compresa tra 0,1 e 0,5 gr/Lt (preferibilmente 0,2 gr/Lt) e diidrodaizdeina in una quantità compresa tra 0,2 e 1,0 gr/Lt (preferibilmente 0,5 gr/Lt).

In questo terreno vengono coltivati i microorganismi selezionati in base alla loro capacità di produrre equolo in condizioni di anaerobiosi, a 37°C per 48-72 ore. Le curve di crescita sono seguite per determinazione spettrofotometrica misurando la densità ottica. La coltura viene prelevata al momento della massima crescita logaritmica, trasferita e mantenuta in un bagno maria a 60 °C sino a completa inattivazione (tipicamente 2-3 ore). Con questo processo fermentativo si sono ottenute rese in massa secca fermentata comprendente i microorganismi, isoflavonoidi residui ed equolo, superiori sino a 4 volte rispetto alle condizioni di crescita in terreni per anaerobiosi (tioglicolato) di uso comune. In particolare, la resa in massa secca fermentata è superiore a 5 gr/Lt e compresa tra 5 e 6 gr/Lt. Inoltre, tale massa secca ha un contenuto in equolo superiore a 170mg/gr massa secca e compresa tra 170 e 230 mg/gr di massa secca.

Dopo inattivazione i microorganismi ottenuti sono sottoposti a blandi trattamenti di lisi con lisozima per ridurre la consistenza della parete cellulare aumentandone la permeabiltà. Quindi la massa ottenuta viene trattata ulteriormente con lipasi e glucosidasi. Tali enzimi sono quindi inattivati a 60 °C ed eliminati per dialisi. Al termine di questo trattamento la massa così ottenuta viene essicata ed in tal modo si ottiene la composizione utilizzabile come agente prebiotico (marchio depositato Equoloxil™) secondo l’invenzione. Il contenuto in equolo di questo prebiotico è superiore a 200mg/gr massa secca e compreso tra 200 e 300 mg/gr massa di prebiotico.

La massa secca così ottenuta può essere impiegata come agente prebiotico per la preparazione di integratori sotto forma di formulazioni per uso orale, quali ad esempio compresse, polveri, liquidi edibili, in combinazione con eccipienti e diluenti accettabili sotto il profilo farmaceutico e/o alimentare. Preferibilmente per questo scopo la composizione prebiotica oggetto dell’invenzione è somministrata in dosi giornaliere corrispondenti a 10-20 mg/dose di equolo per un periodo di tre mesi. Il trattamento può essere ripetuto a cicli successivi.

E' stato visto che la loro somministrazione è in grado di rìequilibrare l’assetto ormonale estrogenico, ad esempio nella menopausa dove la somma di estrogeni naturali e di equolo escreti raggiunge i livelli tipici dell’età proliferativa correggendo di fatto il dismetabolismo ormonale legato alla patologia.

PARTE SPERIMENTALE

Parte sperimentale microbiologica

Esempio 1 - Isolamento, selezione dei microrganismi produttori di equolo.

Un gruppo di soggetti volontari di sesso ed età diversi sono stati inseriti in un regime alimentare arricchito in soia per a verificarne lo stato funzionale di “equolo produttori" mediante determinazione quantitativa del tassi plasmatici del fitoestrogeno. A dieci soggetti risultati equolo-produttori sono state prelevate le feci e su queste si è proceduto, con impiego delle tradizionali tecniche, all’isolamento dei microorganismi presenti.

I diversi microorganismi sono stati fatti riprodurre in condizioni standard di temperatura e di anaerobiosi con impiego di brodi di coltura specifici a base di tiogiicolato ed arricchiti in daidzeina (Sigma D 7802 - Mr 254,2) in ragione dello 0,1 % (1 ,0 gr/Lt di brodo coltura). La crescita del microorganismo è stata seguita per determinazione spettrofotometrica dell’opalescenza della coltura a 620 nm. Nella fase logaritmica di massima crescita sono stati prelevati campioni di surnatante delle colture e su questi si è proceduto alla determinazione della presenza di equolo con analisi in HPLC (D.K. Vanhemmens et al., Arch. Microbiol., 2005, 183(1), 45-55).

Sono stati selezionati, per le successive fasi di studio e caratterizzazione, i ceppi (sigla di riferimento P11/7n, P11/10n, P11/1 Ob) per i quali si è rilevata nel surnatante della coltura una concentrazione di equolo superiore a 20 mg/Lt.

Esempio 2 - Condizionamento dei microorganismi produttori di equolo

I microorganismi selezionati come produttori di equolo all’esempio 1 sono stati quindi sottoposti ad una fase di condizionamento per ottimizzare le proprietà metabolizzanti l’equolo stesso. A tale scopo, gli stessi sono stati fatti riprodurre in condizioni di anaerobiosi a 37 °C per 48 ore su terreno di coltura “Brewer thioglycollate medium” (pH 7,2) arricchito in concentrazioni scalarmene crescenti di daidzeina (Sigma D 7802), a partire da 10 mg/Lt fino a 1.000 mg/Lt.

Al termine della fase di condizionamento veniva eseguita una coltura pilota in terreno contenente gr 1/Lt di substrato daidzeinico finalizzata alla definizione della quantità di equolo prodotta mediante analisi in HPLC del surnatante della coltura stessa.

Ceppo Equolo prodotto

Prima del condizionamento Dopo il condizionamento

Esempio 3- Riproduzione fermentativa dei microorganismi condizionati.

3.1. Preparazione del substrato solubile di metabolizzazione ricco in isoflavonoidi Si parte da un idrolisato secco di soia reperibile sul mercato (EVS 40 I 20 CK -Naturai srl - MI ) titolato in isoflavoni totali, pari al 40,9%, di cui daidzeina 10,59%. L’idrolisato viene sottoposto ad estrazione a 60 °C con una miscela 50/50 di etanolo - acqua. La parte insolubile viene eliminata per filtrazione ed il surnatante, recuperato, viene portato a secco per essiccamento a 80 °C. Si ottiene una polvere bianca solubile con un contenuto totale in isoflavonoidi pari al 93,5 % di cui la daidzeina rappresenta il 24,2 %.

3.2. Studio e preparazione del terreno di crescita dei microorganismi

E’ stato definito un terreno di coltura in grado di aumentare significativamente la riproduzione dei microorganismi. La sua composizione è: fegato estratto Oxoid gr 20,0/Lt - peptone di soia Oxoid gr 5,0/Lt - sodio cloruro 5,0 gr/Lt - acqua q.b. a Lt 1. I valori delle rese in massa secca di produzione fermentativa, nell'ordine di quattro volte rispetto a quelle ottenibili con impiego dei normali terreni per anaerobiosi, sono riportati in tabella successiva.

Microrganismo Rese in massa secca gr/Lt

3.3. Produzione fermentativa

I microrganismi vengono riprodotti, seguendo i normali processi, in fermentatore in condizioni di anaerobiosi a 37 °C, sotto agitazione, per un periodo da 48 a 120 ore, preferibilmente 48 - 72 ore, pH nell’ordine di 7,2, sul terreno di coltura descritto nell’esempio 3.2. Questi viene arricchito della miscela di flavonoidi descritta nell’esempio 3.1., in quantità variabili da 5 - a 50 gr/Lt, preferibilmente 20 gr/Lt, corrispondenti ad un contenuto in daidzeina pari a 4,84 gr/Lt. Con funzione di catalizzatori vengono aggiunta al brodo di coltura una quantità di equolo, nell’ordine compreso tra 0,1 e 0,5 gr/Lt, preferibilmente 0,2 gr/Lt, ed una quantità di diidrodaidzeina nell’ordine compreso tra 0,2 e 1 gr/Lt, preferibilmente 0,5 gr/Lt. Le curve di crescita vengono seguite per determinazione spettrofotometrica dell’opalescenza della coltura a 640 nm. La coltura viene prelevata al momento di massima crescita logaritmica e quindi viene trasferita in un bagno maria a 60 °C ed ivi mantenuta, mediamente per due - tre ore, fino a completa inattivazione dei microrganismi.

Esempio 4 - Preparazione del prebiotico ricco in equolo.

La massa ottenuta dal processo fermentativo, di cui all’esempio 3, viene successivamente sottoposta a blando trattamento con lisozima (50.000 U.l./mg), prima, e con una miscela di lipasi da pancreas suino (400 U.l./mg) e di glucosidasi da lieviti (10 Ul/mg), dopo, al fine di frammentare i grassi e zuccheri in essa contenuti e fornire alla parete cellulare dei microrganismi inattivati presente il giusto livello di permeabilità per ottimizzare la biodisponibilità intestinale dei componenti intracellulari in essa contenuti. Successivamente si procede alla inattivazione degli enzimi per riscaldamento a 60 °C e, quindi, a dialisi su tubo con “cut off’ 1.000 Daltons. Si procede, quindi, all’essiccamento per sprayzzazione della massa. Resa in prebiotico 84,3 %.

Parte sperimentale analitica

Esempio 5 - Caratteristiche tassonomiche dei microorganismi

Ceppi classificati come Enterococcus thailandicus sulla base dell’analisi del profilo genetico.

Gram , anaerobi facoltativi, non sporigeni.

Positivi per idrolisi di arginina ed esculina e debolmente positivi per l’emolisi.

Negativi per la catalasi, idrolisi di gelatina, riduzione dei nitrati e produzione di gas da glucosio, gluconato e citrato.

Crescita a pH tra 5,0 e 9,6, 15 - 45 °C e in 2 - 6,5 % di sodio cloruro.

Produzione di acido da cellobiosio, fruttosio, galattosio, glucosio, maltosio, mannitolo, sucrosio ma non da arabinosio, eritriolo, fucosio.

Esempio 6 - Determinazione delle curve di crescita e riproduzione dei microorganismi condizionati

10 mL di una coltura fresca vengono centrifugati; il sedimento viene lavato per centrifugazione e, quindi, rimesso in sospensione in acido ascorbico 0,1 M pH 7,0 sterile (13 mL). Sul sedimento risospeso si determina la D.O. a 640 nm (D.O. = 1 ,060). 10 mL di questa sospensione servono per seminare 80 mL di terreno di coltura.

La D.O. di partenza è pari a 0,209. Si ottengono le seguenti curve di crescita.

Parte sperimentale tossicologica

Esempio 7 - Caratteristiche di tollerabilità dei microorganismi

Le prove di tossicità acuta sono state eseguite nel topo Swiss del peso di 20 gr. circa suddivisi in gruppi da dieci animali. I microrganismi, provenienti da colture fresche, sono stati risospesi in soluzione fisiologica sterile e diluiti fino ad una concentrazione di dieci alla tredicesima microorganismi/mL.

Di tale sospensione è stata somministrata agli animali, digiuni da 12 ore, una dose pari a 0,3 mL/animale per via intraperitoneale ed una dose di 0,6 mL/animale con sondino gastrico. Gli animali cosi trattati sono stati mantenuti in stabulazione, per 15 gg. con libero accesso a cibo ed acqua, controllando la eventuale mortalità ed il periodo di sopravvenienza.

Parte sperimentale farmacoloqico-clinica

Esempio 8 - Effetto correttivo della somministrazione della composizione prebiotica sul dismetabolismo ormonale in menopausa

Sono state selezionate venti pazienti volontarie in fase di menopausa. Dopo attenta valutazione della sintomatologia relativamente a: attività vasomotoria, ansietà, depressione e disturbi somatici, quantificati in una scala da 1 a 4 a seconda della severità riscontrata, le pazienti sono state sottoposte a trattamento con la composizione prebiotica (Equoloxil™) preparata come descritto in precedenza ad una dose giornaliera corrispondente a 10 mg/dose di equolo per un periodo di tre mesi. Periodicamente ed al termine del trattamento veniva controllato lo stato della sintomatologia sempre riferita ad una scala da 1 a 4. Al termine del trattamento si riscontrava un significativo miglioramento dei sintomi patologici nella quasi totalità delle pazienti.

Esempio 9 - Effetto correttivo della somministrazione della composizione prebiotica sul’irsutismo femminile

Sono state selezionate dieci pazienti affette da irsutismo post-menopausa. Dopo un controllo della severità della malattia, entità delle zone interessate e consistenza della peluria, le pazienti sono state sottoposte a trattamento con la composizione prebiotica (Equoloxil™) preparata come descritto in precedenza ad una dose giornaliera corrispondente a 20 mg/dose di equolo per un periodo di tre mesi.

Il controllo eseguito al termine del trattamento ha evidenziato, nell’ottanta per cento dei soggetti, una significativa riduzione delle aree e della massa dei peli.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Microorganismi appartenenti al genere Enterococcus thailandicus caratterizzati dal fatto di produrre in brodi di coltura a base di tioglicolato arricchiti in daidzeina del 0,1% equolo nel surnatante di tale brodo-coltura in una concentrazione superiore a 20 mg/Lt.
2. 2. Microorganismi appartenenti ai genere Enterococcus thailandicus secondo la rivendicazione 1 aventi le ulteriori seguenti caratteristiche: - gram , anaerobi facoltativi, non sporigeni; - positivi per idrolisi di arginina ed esculina e debolmente positivi per l’emolisi; - negativi per la catalasi, idrolisi di gelatina, riduzione dei nitrati e produzione di gas da glucosio, gluconato e citrato; - crescita a pH tra 5,0 e 9,6, 15 - 45 °C e in 2 - 6,5 % di sodio cloruro; - produzione di acido da cellobiosio, fruttosio, galattosio, glucosio, maltosio, mannitolo, sucrosio ma non da arabinosio, eritriolo, fucosio.
3. 3. Metodo di preparazione di una composizione consistente in una massa secca comprendente i microorganismi del genere Enterococcus thailandicus come definiti alla rivendicazione 1 , condizionati ad una maggiore metabolizzazione della daidzeina in equolo, riprodotti per fermentazione, inattivati, lisati e seccati.
4. 4. Metodo di preparazione di una composizione secondo la rivendicazione 3 comprendente almeno le fasi di: - condizionamento di microorganismi del genere Enterococcus thailandicus alla maggiore metabolizzazione della daidzeina condotto attraverso colture successive in terreni liquidi per anaerobiosi cui vengono aggiunte concentrazioni scalarmente crescenti di daizdeina sino al plateau di metabolizzazione; - riproduzione fermentativa a 37 °C per 48 ore in condizioni di anaerobiosi su brodo di coltura a base di estratti di fegato e peptone di soia ed arricchito di un substrato soiubilizzato di isoflavonoidi titolati in daidzeina e di equolo e di diidrodaidzeina aggiunti come catalizzatori della reazione di metabolizzazione; - inattivazione dei microorganismi per riscaldamento a temperature non denaturanti la struttura e successiva lisi enzimatica per aumentare la permeabilità della membrana cellulare e rendere maggiormente biodisponibile la relativa endomassa; - essicamento della massa.
5. 5. Metodo di preparazione di una composizione secondo la rivendicazione 4, in cui per il condizionamento il brodo di coltura per anaerobiosi è arricchito, in ogni crescita successiva, di una concentrazione in scala geometrica crescente per due di daidzeina in un intervallo di concentrazioni da 10mg/Lt a 1.000mg/Lt.
6. 6. Metodo di preparazione di una composizione secondo la rivendicazione 4, in cui per la riproduzione fermentativa il brodo di coltura è una composizione comprendente: estratto di fegato 20 gr/Lt; peptone di soia 5,0 gr/Lt; sodio cloruro 5,0 gr/Lt; acqua q.b. a 1,0 Lt, addizionata con: un substrato solubile di metabolizzazione ricco in isoflavonoidi in una quantità compresa tra 5,0 e 50,0 gr/Lt; equolo in una quantità compresa tra 0,1 e 0,5 gr/Lt; e diidrodaizeina in una quantità compresa tra 0,2 e 1 ,0 gr/Lt.
7. 7. Metodo di preparazione di una composizione secondo la rivendicazione 4, in cui la lisi enzimatica è condotta con lisozima, lipasi e glucosidasi.
8. 8. Composizione consistente in una massa secca ottenibile con il metodo di preparazione secondo le rivendicazioni da 3 a 7 comprendente microorganismi del genere Enterococcus thailandicus condizionati ad una maggiore metabolizzazione della daidzeina in equolo, inattivati, lisati, isoflavoni totali e titolati in daidzeina, ed equolo.
9. 9. Composizione secondo la rivendicazione 8, in cui l'equolo è in una quantità superiore a 200 mg/gr di massa secca.
10. 10. Composizione secondo la rivendicazione 9, in cui l'equolo è in una quantità compresa tra 200 e 300 mg/gr di massa secca.
11. 11. Uso della composizione secondo le rivendicazioni da 8 a 10 come agente prebiotico per la preparazione di integratori nutraceutici per la prevenzione e/o correzione di disturbi funzionali ed ormonali nella donna. (SL/Pa)