ITMI20120008A1 - Composizioni ad attività anti-neurodegenerativa - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“COMPOSIZIONI AD ATTIVITÀ ANTI-NEURODEGENERATIVA”
Campo tecnico dell’invenzione
La presente invenzione è relativa all’uso di composizioni comprendenti una miscela di estratti ottenibili da embrioni ovipari, come ingrediente attivo, per la prevenzione e/o il trattamento di malattie degenerative.
Stato dell’arte
Estratti di embrioni da impiegare come sostanze anti-tumorali o ad attività anti-psoriasica sono stati descritti in precedenti brevetti.
Ad esempio nel brevetto francese n. 2451193 viene descritto l’impiego di un omogenato in soluzione idroalcolica ottenuto da embrioni di mucca, pecora o suino per il trattamento di tumori.
Nella domanda di brevetto n. WO 98/11905 viene descritta una composizione adatta al trattamento di tumori contenente un estratto di embrioni o di utero gravido, in cui gli embrioni sono prelevati da animali ovipari od ovovivipari e l’utero gravido è prelevato da topo, coniglio, pecora, suino.
Nel brevetto europeo n. 0929308 viene descritto che estratti di embrioni prelevati a specifici stadi del differenziamento embrionale sono efficaci nel trattamento di malattie tumorali e di altre patologie controllate dall’anti-oncogene p53 e che detti stadi specifici dipendono dalle specie animali da cui si prelevano gli estratti.
Inoltre, nella domanda di brevetto europeo n. 03013959.6 viene descritto che gli estratti di embrioni animali non umani in specifici stadi del differenziamento cellulare sono efficaci come sostanze nutritive sia per via generale con effetti sistemici sullo stato di validità generale (performance status) di pazienti oncologici e defedati sia per via topica per il nutrimento della cute e degli annessi cutanei.
Infine, il brevetto europeo n. 1570853 descrive l’uso di un estratto di embrioni di ovipari e di mucosa di utero gravido o di placenta di mammiferi non umani per la preparazione di un prodotto ad attività anti-psoriasica.
Sommario dell’invenzione
La presente invenzione è relativa a composizioni comprendenti una miscela di estratti ottenibili da embrioni di ovipari prelevati in specifici stadi dello sviluppo embrionale o in momenti compresi fra uno stadio e l’altro dello sviluppo embrionale per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento riparazione di patologie degenerative del sistema nervoso e/o di altri organi o apparati.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
È stato sorprendentemente trovato che estratti di embrioni di ovipari, costituiti prevalentemente da proteine con diversi pesi molecolari e da una frazione di acidi nucleici, sono molto efficaci nella prevenzione e/o nel trattamento di lesioni degenerative del sistema nervoso e di altri organi o apparati.
La presente invenzione è relativa a composizioni comprendenti una miscela di estratti ottenibili da embrioni ovipari prelevati ad uno stadio specifico dello sviluppo embrionale o in momenti compresi fra uno stadio e l’altro dello sviluppo embrionale per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di malattie degenerative del sistema nervoso e/o di altri organi o apparati, quali ad esempio l’organo della vista, il fegato, l’apparato cardiovascolare.
Gli embrioni utilizzabili per gli usi di cui alla presente invenzione sono preferibilmente prelevati da pesci, uccelli, anfibi.
Secondo un aspetto preferito, tra i pesci gli embrioni sono prelevati dal Brachidanio Rerio (Zebrafish), dalla trota, dal salmone; tra gli anfibi dalle rane e tra gli uccelli dal pollo e dalle quaglie.
Preferibilmente, gli embrioni sono prelevati nei seguenti stadi dello sviluppo embrionale: medio-blastula-gastrula, tail budd, 5 somiti, 20 somiti e nello stadio corrispondente a 24 ore dopo la fecondazione. Gli embrioni possono essere prelevati in altri momenti dello sviluppo embrionale, ad esempio in momenti compresi fra uno stadio e l’altro fra quelli sopra descritti (ovvero tra medio-blastula-gastrula e tail budd, tra tail budd e 5 somiti, tra 5 somiti e 20 somiti) ed in momenti dello sviluppo che vanno oltre le 24 ore dopo la fecondazione.
Secondo un ulteriore aspetto, gli embrioni possono essere prelevati in stadi diversi dello sviluppo embrionale.
Gli estratti possono essere ottenuti utilizzando il metodo descritto di seguito.
Gli embrioni prelevati nei diversi stadi sopra-descritti vengono lavati abbondantemente in acqua distillata e quindi sospesi in soluzione costituita dall’85% di glicerolo e dal 15% di alcool etilico al 98%. La sospensione viene trattata con un ciclo di sonicazione di 10 secondi e quindi con due cicli di turboemulsione della durata di 3 minuti.
Il contenuto di proteine totali in dette sospensioni può essere compreso fra 0,1 e 0,3 milligrammi per millilitro. Negli estratti l’analisi dei pesi molecolari delle diverse frazioni proteiche cambia in rapporto ai diversi stadi di sviluppo embrionale degli embrioni impiegati per ottenere gli estratti: ad esempio nel periodo di medio-blastula-gastrula si rileva usualmente una frazione di proteine che rappresenta circa il 15% del totale con un peso molecolare intorno ai 15 kDaltons, una frazione pari circa al 20% del totale con pesi molecolari compresi fra 20 e 30 kDaltons, una frazione pari circa al 20% del totale con pesi molecolari compresi fra 40 e 50 kDaltons ed una frazione intorno al 45% del totale con pesi molecolari compresi fra i 50 ed i 100 kDaltons.
In stadi successivi dello sviluppo embrionale le diverse frazioni proteiche cambiano in percentuale fra loro, circa il 70% delle proteine presente nel periodo di medio-blastula-gastrula è presente fino a 18 ore dopo la fecondazione.
Invece, da 18 a 24 ore dopo la fecondazione, il rapporto tra le diverse frazioni proteiche cambia in modo molto evidente, con un aumento notevole della percentuale di proteine con peso molecolare inferiore a 25 kDaltons e con una diminuzione della frazione con peso molecolare sopra i 50 kDaltons.
Le sospensioni ottenute utilizzando i diversi stadi di differenziazione cellulare ed usualmente in periodo di medio-blastula-gastrula, 5 somiti e 20 somiti, ma anche a 24 ore ed oltre, diluite, come si è detto, in soluzione glicero-alcolica, vengono ulteriormente diluite con acqua depurata in un rapporto di volume 1:10 e quindi filtrate sotto vuoto con membrane Millipore di 90 micron e successivamente con membrane di 10 micron. Le soluzioni così ottenute hanno una concentrazione di proteine totali che può essere compresa fra 10 e 30 microgrammi per millilitro.
Gli estratti possono essere utilizzati come ingredienti attivi per la preparazione di composizioni utili per la prevenzione e/o il trattamento di malattie degenerative, in particolare del sistema nervoso e/o di altri organi o apparati.
Le composizioni possono inoltre comprendere, quali ingredienti attivi, anti-ossidanti, vitamine o altre sostanze utilizzate come integratori alimentari.
Nella preparazione di tali composizioni, gli ingredienti attivi possono essere miscelati con almeno un eccipiente o veicolo farmaceuticamente accettabile.
Le composizioni possono essere somministrate preferibilmente per via sublinguale o nasale.
Le composizioni possono essere sotto forma di soluzioni o spray.
Gli estratti possono anche essere liofilizzati e utilizzati per preparare composizioni in forma di compresse, capsule, ovuli, granuli, ecc.
Gli estratti possono essere somministrati giornalmente in quantità variabile fra 10 e 40 microgrammi/die in relazione alle diverse patologie degenerative da trattare.
Gli esempi di seguito riportati illustrano ulteriormente l' invenzione.
ESEMPI
Esempio di composizione
Una composizione secondo la presente invenzione può contenere:
un estratto A ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di sviluppo di medio-blastula-gastrula,
un estratto B ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di 5 somiti, un estratto C ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di 20 somiti, in parti uguali.
Gli estratti sono stati preparati come descritto nella descrizione dettagliata dell’invenzione.
Esempio sperimentale
L’efficacia degli estratti ottenuti da embrioni di ovipari prelevati in precisi momenti del differenziamento cellulare è stata testata utilizzando i modelli di indagine usualmente impiegati per lo studio di patologie neurodegenerative.
Tra tali modelli, l’ippocampo prelevato da ratti con tutte le sue cellule e posto in vitro è uno dei più studiati. Le cellule dell’ippocampo possono essere trattate con sostanze che ne provocano facilmente la degenerazione e su tali cellule possono essere studiati gli effetti di varie altre sostanze che prevengono o riparano la degenerazione provocata da agenti neurotossici.
Materiali e metodi
Fettine organotipiche ippocampali sono state preparate come descritto in letteratura (Gardoni et al., 2002) utilizzando ratti di 7-8 giorni; tutti i trattamenti farmacologici sono stati effettuati in fettine organotipiche al 14esimo giorno in coltura ( DIV14 ).
Per testare l’effetto dell’estratto di zebrafish, fettine organotipiche sono state esposte a NMDA (N-Metil-D-Aspartato) 50 μΜ o a NMDA 300 μΜ in Serum Free medium, in presenza o assenza degli estratti.
Negli esperimenti le fettine sono state incubate per un’ora in serum free medium in presenza o assenza degli estratti.
Dopo un’ora, le fettine sono state lavate con Serum-Free medium e poi incubate con il loro medium in presenza o assenza dell’estratto di zebrafish per 24 ore.
Per ogni tipo di trattamento, è stata valutata l’attività neuroprotettiva sia della miscela degli estratti (A+B+C) sia dei singoli estratti (A o B o C): l’estratto A è stato ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di sviluppo di medio-blastula-gastrula, l’estratto B è stato ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di 5 somiti, l’estratto C è stato ottenuto da embrioni prelevati allo stadio di 20 somiti e preparato come già descritto nella descrizione dettagliata dell’invenzione.
Per valutare il danno cellulare indotto dai differenti trattamenti è stata utilizzata la fluorescenza associata all’uso del propidio ioduro (PI) (5 mg/ml) come descritto in letteratura (Pellegrini-G. et al., 1999). L’analisi quantitativa della mortalità cellulare è stata effettuata nell’area CA1 dell’ippocampo utilizzando come termine di paragone il massimo danno cellulare ottenuto esponendo le fettine organotipiche al trattamento con NMDA.
Le immagini sono state acquisite con un microscopio a epifluorescenza Zeiss Axiovert 200M (obiettivo 10x) e CoolSnap CCD camera. Per l’analisi quantitativa, le immagini sono state acquisite con gli stessi setting e tempi di esposizione. L’intensità media di fluorescenza è stata determinata dopo aver tracciato l’area corrispondente all’area CA1 e la mortalità analizzata in funzione dell’intensità di fluorescenza e dell’area espressa come pixel.
Esperimenti
Una prima serie di esperimenti è stata condotta al fine di stabilire le condizioni sperimentali ottimali per la valutazione di una possibile attività di tipo neuroprotettivo degli estratti di zebrafish.
A questo scopo, è stato verificato che il trattamento per 1h con NMDA 50 μΜ e 300 μΜ inducesse una mortalità significativa nelle condizioni sperimentali studiate. Fettine ippocampali organotipiche ( DIV14 ) sono state trattate per un’ora con NMDA 50 μΜ, o con NMDA 300 μΜ, per avere una condizione che determini mortalità certa, e 24 ore dopo è stata condotta la colorazione con PI. Dopo fissazione, è stata acquisita l’area CA1 ed è stata analizzata la mortalità come descritto nei materiali e metodi.
Il trattamento con NMDA 50 μΜ determina un aumento di mortalità del 47% (NMDA 50 μΜ vs controlli) mentre NMDA 300 μΜ causa un aumento di mortalità del 99% (NMDA 300 μΜ vs controlli) nell’area CA1 dell’ippocampo 24 ore dopo il trattamento per 1 ora con NMDA (50 μΜ) o con NMDA (300 μΜ).
Sono state quindi valutate le proprietà neuroprotettive degli estratti in seguito ad esposizione di fettine organotipiche ippocampali a tre differenti stimoli tossici, di diversa intensità (deprivazione siero, NMDA 50 μΜ, NMDA 300 μΜ per 1 ora). In una prima serie di esperimenti è stato analizzato il possibile effetto neuroprotettivo della miscela di estratti A+B+C. La miscela degli estratti è stata aggiunta (con un ulteriore diluizione 1:100) contemporaneamente al trattamento con NMDA o alla semplice deprivazione da siero e le analisi sono state condotte dopo 24 h. Il trattamento con la miscela A+B+C determina una significativa riduzione della mortalità neuronaie (-31,6 ± 6,2%, *p=0,005) indotta da 1 ora di deprivazione da siero. ;Come già indicato il trattamento con NMDA (50 μΜ) causa un significativo aumento della mortalità nell’area CAI (*p=0,002, NMDA 50 μΜ vs controlli); il co-trattamento con la miscela A+B+C determina una riduzione significativa della mortalità indotta da NMDA (50 μΜ) (p=0,01, NMDA 50 μΜ con A+B+C vs NMDA 50 μΜ).
In un’ultima serie di esperimenti è stata analizzata la capacità della miscela A+B+C di indurre neuroprotezione anche a seguito di trattamento di fettine ippocampali con concentrazioni ancora più elevate di NMDA (300 μΜ). Anche in queste condizioni sperimentali, il co-trattamento con la miscela A+B+C determina una riduzione significativa della mortalità indotta da NMDA (300 μΜ) (p=0,009 NMDA 300 μΜ con A+B+C vs NMDA 300 μΜ).
L’uso di una miscela di estratti ottenuti da embrioni di ovipari prelevati in specifici momenti dello sviluppo embrionale ha dimostrato di avere effetti benefici sulla qualità della vita ed il performance status nell’uomo, in particolare quando le dosi somministrate di proteine totali contenute negli estratti è compresa fra 10 e 40 micro grammi/die, a seconda delle patologie trattata.
In conclusione, la miscela degli estratti A+B+C ha dimostrato invece una significativa attività neuroprotettiva nei confronti della morte neuronaie indotta da ih di deprivazione di siero o indotta dal trattamento con NMDA (sia 50 μΜ che 300 μΜ). In tutti i casi, l’attività neuroprotettiva è stata misurata 24h dopo l’insulto tossico.
Detti risultati sono sorprendenti e dimostrano l’effetto anti-degenerativo legato all’ utilizzo di una miscela di diversi estratti, soprattutto alla luce dei risultati ottenuti somministrando separatamente gli estratti.
Successivamente, sono state infatti valutate le eventuali proprietà neuroprotettive degli estratti somministrati singolarmente (A, B o C). Anche in questo caso, la mortalità neuronaie tramite il saggio con propidio ioduro è stata valutata in seguito ad esposizione delle fettine organotipiche ippocampali a deprivazione di siero o a NMDA, in presenza dei diversi estratti di zebrafish. I singoli estratti hanno dimostrato una certa capacità neuroprotettiva, soprattutto l’estratto A, al limite della significatività, ma non diversa statisticamente rispetto ai controlli, nè in seguito a deprivazione di siero nè in seguito a trattamento con NMDA (50 μΜ)
I composti B o C utilizzati singolarmente non hanno mai dimostrato attività di tipo neuroprotettivo. L’estratto A ha invece mostrato una certa tendenza verso una possibile attività neuroprotettiva, che è possibile definire al limite della significatività, soprattutto nei confronti della morte cellulare indotta da deprivazione di siero.
REFERENZE
Gardoni F., Bellone C., Viviani B., Marinovich M., Meli E., Pellegrini- Giampietro D.E., Cattabeni F., Di Luca M.; Lack of PSD-95 drives hippocampal neuronal celi death through activation of an alpha CaMKII transduction pathway, Eur. J. Neurosci. 2002 Sep.; 16(5):777-86.
Pellegrini- Giampietro D.E., Cozzi A., Peruginelli F., Leonardi P., Meli E., Pellicciari R., Moroni F.; 1-Aminoindan-1,5-dicarboxylic acid and (S)-(+)-2-(3’-carboxybicyclo[1.1.1] pentyl)-glycine, two mGlul receptorpreferring antagonists, reduce neuronal death in vitro and in vivo models of cerebral ischaemia; Eur. J. Neurosci. 1999 Oct.; 11(10):3637-47.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizioni comprendenti una miscela di estratti ottenibili da embrioni di ovipari prelevati in specifici stadi dello sviluppo embrionale o in momenti compresi fra uno stadio e l’altro dello sviluppo embrionale per l’uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie degenerative del sistema nervoso e/o di altri organi o apparati.
- 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1, in cui gli altri organi o apparati sono scelti tra l’organo della vista, fegato, apparato cardiovascolare.
- 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1, in cui gli specifici stadi dello sviluppo embrionale sono scelti tra medio-blastula-gastrula, tail budd, 5 somiti, 20 somiti e 24 ore dopo la fecondazione.
- 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1, in cui gli embrioni sono prelevati in momenti dello sviluppo compresi tra medio-blastula-gastrula e tail budd, tra tail budd e 5 somiti, tra 5 somiti e 20 somiti o in momenti dello sviluppo embrionale che vanno oltre le 24 ore dopo la fecondazione.
- 5. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-4, in cui gli embrioni sono isolati da pesci, anfibi, uccelli.
- 6. Composizioni secondo la rivendicazione 5, in cui gli embrioni sono isolati da Brachidanio Rerio (Zebrafish), trota, carpa, salmone, rana, pollo, quaglia.
- 7. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-6, in cui la miscela di estratti ha una concentrazione di proteine totali compresa fra 10 e 30 microgrammi per millilitro.
- 8. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-7, in cui gli estratti sono liofilizzati.
- 9. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-8, comprendenti inoltre anti-ossidanti, vitamine ed altre sostanze naturali.
- 10. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-9, in forma di soluzioni, spray, compresse, capsule, ovuli, granuli.
- 11. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-9, somministrate per via sublinguale o nasale.
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2005030246A1 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-07 | As-Faktor Ab | Novel use of antisecretory factor |
| US20070087437A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Jifan Hu | Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo |
| WO2009115429A1 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Joan Cunill Aixela | Food preparation and pharmaceutical composition containing an embryonic extract |
| US20090274770A1 (en) * | 2006-05-11 | 2009-11-05 | Regenics As | Cellular extracts |
-
2012
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030246A1 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-07 | As-Faktor Ab | Novel use of antisecretory factor |
| US20070087437A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Jifan Hu | Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo |
| US20090274770A1 (en) * | 2006-05-11 | 2009-11-05 | Regenics As | Cellular extracts |
| WO2009115429A1 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Joan Cunill Aixela | Food preparation and pharmaceutical composition containing an embryonic extract |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "DOGtorX Scientific Research Humanofort Formula", 10 August 2005 (2005-08-10), XP002681054, Retrieved from the Internet <URL:http://www.petequinox.com.au/sci.html> [retrieved on 20120730] * |
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