ITMI20120732A1 - Polisaccaridi reticolati a memoria di forma - Google Patents

Description

“POLISACCARIDI RETICOLATI A MEMORIA DI FORMAâ€

La presente invenzione riguarda un processo per la preparazione di polisaccaridi reticolati a memoria di forma, che comprende la reticolazione del polisaccaride in un sistema non solvente per il polisaccaride.

Stato dell’arte

L’acido ialuronico (HA) à ̈ il polisaccaride di tipo glicosamminoglicanico che attualmente riveste il maggiore interesse applicativo nel settore bio-medico. L’HA à ̈ un polisaccaride a catena lineare, carico negativamente, composto dalla ripetizione di n unità disaccaridiche (-4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-), in cui l’acido D-glucuronico (GlcUA) e la N-acetil-D-glucosammina (GlcNAc), sono legati con legami glicosidici alternati β-1,3 e β-1,4.

L’HA à ̈ un polisaccaride altamente solubile in acqua e soluzioni di HA mostrano un comportamento visco-elastico di tipo non-newtoniano.

L’HA à ̈ uno dei componenti essenziali della matrice extracellulare (ECM). Nei vertebrati, l’HA ha un’ampia varietà di funzioni: nella pelle garantisce l’idratazione del tessuto; nella cartilagine l’HA si lega a proteoglicani per regolare il contenuto di acqua e ioni, per stabilizzare le proprietà fisiche (viscoelastiche) del tessuto e le interazioni cellula-substrato. Il peso molecolare medio dell’HA del fluido sinoviale e del cordone ombelicale à ̈ 3.000-4.000 KDa. Le risposte biologiche elicitate dall’HA per interazione con recettori presenti sulle membrane cellulari dipendono fortemente dal peso molecolare delle catene polisaccaridiche, in particolare l’accumulo di HA a basso peso molecolare rappresenta un segnale precoce di alterazione dell’ECM, che attiva risposte di riparo a livello tissutale, mentre la preponderanza di HA ad alto peso molecolare codifica per una situazione di buona omeostasi.

Per la sua naturale presenza a livello tissutale l’HA, quando impiantato nell’organismo, non elicita risposte immunitarie; per questo e per le uniche proprietà reologiche e lubrificanti, di seguito riportate, l’HA à ̈ uno dei biomateriali più versatili e interessanti oggi disponibile per applicazioni in campo bio-medico.

Idrofilicità e proprietà reologiche - In soluzione acquosa le molecole di HA intrappolano grandi quantità d’acqua (circa 1000 volte il peso dell’HA) assumendo la forma di spirali estese stabilizzate dai legami idrogeno tra i gruppi idrossilici lungo la catena. Queste catene si inviluppano tra loro anche a concentrazioni molto basse, per questo, anche soluzioni molto diluite di HA hanno viscosità elevate, ma dipendenti dalla velocità di scorrimento.

Proprietà lubrificanti - Le straordinarie proprietà reologiche delle soluzioni di HA rendono questo composto un candidato ideale come lubrificante in ambito biologico. Questa à ̈, infatti, una delle azioni a cui l’HA assolve negli organismi, dove separa le superfici di differenti tessuti che, grazie alla sua presenza, scivolano le une sulle altre. Le articolazioni del nostro corpo sono un esempio di questo tipo di comportamento.

Azione di signaling e proprietà biorivitalizzanti -– L’HA, quando impiantato nell’organismo elicita a livello cellulare e tissutale risposte biologiche differenziate, che dipendono dal peso molecolare del materiale e si traducono complessivamente in un’azione di rivitalizzazione delle strutture biologiche.

La naturale presenza di HA nell’organismo e la sua capacità di trattenere l'acqua hanno portato al suo utilizzo in varie applicazioni terapeutiche, ad esempio, nel trattamento delle patologie artritiche, l'utilizzo come sostituto del vitreo, la prevenzione di aderenze dopo interventi chirurgici, la protezione delle durante la guarigione, i trattamenti di viscosupplementazione nelle articolazioni e l’impiego nella medicina estetica per correggere gli inestetismi legati alla senescenza della pelle.

Uno dei limiti più importanti in tutte queste applicazioni terapeutiche dell’HA à ̈ la sua rapida degradazione dovuta all’azione di enzimi diversi, ad esempio, ialuronidasi, glucoronidasi e glucosidasi o a processi radicalici che ne alterano le proprietà reologiche e ne riducono i tempi di permanenza in vivo.

Un approccio efficace per ritardare la degradazione dell’HA in vivo à ̈ quello di modificarne la struttura con un agente reticolante che, ancorando tra loro catene polisaccaridiche differenti o creando loop su una stessa catena, consente di limitare i processi degradativi responsabili della ridotta emivita di questo polisaccaride in vivo.

In particolare la reticolazione dell’HA consiste nella formazione di legami covalenti inter o intra catena che avvengono per reazione del polisaccaride con molecole polifunzionali in grado di dare legami covalenti con le funzioni ossidriliche e carbossiliche presenti sull’HA. In base alla natura chimica dell’agente reticolante, alla stechiometria e alle condizioni di reazione si possono generare processi di reticolazione dell’HA differenti, ottenendo una grande varietà di prodotti con proprietà chimiche, biologiche e reologiche differenziate.

Una delle tecniche di reticolazione più utilizzata, in particolare nel caso dell’HA, consiste nella reazione con di-epossidi in ambiente basico con formazione di legami eterei. Tra questi il di-epossido maggiormente impiegato à ̈ l’1,4-butanediol diglicidil etere (BDDE). Questo tipo di reticolazione offre il vantaggio della grande stabilità dei legami eterei formati e dell’assenza di tossicità del prodotto reticolato, che mantiene tutte le caratteristiche di biocompatibilità proprie dell’HA.

L’impiego di di-epossidi nella reticolazione di polisaccaridi, in particolare dell’HA, à ̈ ampiamente riportato nella letteratura brevettuale. Nella generalità dei casi (US 4,963,666, US 5,827,937, KR 10-2005-0059521, US 6,921,819, US 2005/0281880, US 20060105022, US 2007/0026070, US 2007/0196426, US 6,630,167) la reazione di reticolazione prevede la solubilizzazione dell’HA in NaOH e successivamente la sua reticolazione in fase omogenea impiegando BDDE.

Come si può rilevare dalla tabella 1, in cui sono confrontate le varie metodiche alla base dei documenti brevettuali in precedenza citati, tutti i metodi di reticolazione basati sull’impiego di BDDE in ambiente basico, a oggi sviluppati, lasciano insoluto il problema di un processo di reticolazione che garantisca il mantenimento della forma originaria del materiale. In tutti i casi riportati nella letteratura scientifica e brevettuale, infatti, la reazione di reticolazione con BDDE in ambiente basico utilizza sistemi solventi per l’HA che pregiudicano il mantenimento della forma originaria del materiale da

reticolare.

Il mantenimento della struttura 3D del materiale durante il processo di

reticolazione à ̈ di fondamentale importanza quando, ad esempio, si vogliono

reticolare particolati, membrane, strutture spugnose o scaffold per ingegneria

tissutale a base di HA.

È evidente quindi, alla luce di quanto sopra riportato, l’importanza di

sviluppare una strategia di reticolazione che consenta di mantenere la struttura

tridimensionale dell’HA durante il processo di reticolazione, per questo detta

a “memoria di forma†.

Reazione su 10 g di HA con BDDE/ H2O h (°C) RIFERIMENTO BDDE come agente reticolante HA (% (mL)

p/p)

L’HA si scioglie in 0,5%NaOH, si 1 300 12 25 US 4,963,666 reticola con BDDE (epoxyactivation), si allontana l’eccesso di

BDDE con 24h di dialisi, si reticola

nella fase di essiccamento per 48h a

25°C.

Si ottiene un film che si scioglie in

48h.

Metodo di reazione che porta 0,20 100 4 40 US 5,827,937 inizialmente a un HA attivato,

bloccando con un processo di

diluizione la reticolazione prima

della gelazione dell’HA, e

successivamente completa il

processo di reticolazione

concentrando la miscela di

reazione. L’HA si scioglie in 1%

NaOH, poi si aggiunge BDDE.

Dopo la prima reazione a 40°C si

diluisce 10 volte, si neutralizza e

poi si concentra al rotavapor.

Si ottiene un gel continuo.

(continua) Il metodo prevede che alla 2,4 400 24 25- KR 10-2005-soluzione basica contenente l’HA e 50 0059521 il BDDE si addizioni un grande

volume di etanolo o acetone che

precipita l’HA, il quale continua a

reticolarsi anche dopo la

precipitazione. L’HA (5-15% p/p) à ̈

sciolto in 4-19% NaOH a cui si

aggiunge BDDE, successivamente

si versa la miscela in etanolo o

acetone ottenendo un precipitato.

Si neutralizza e si lava con H2O,

ottenendo un materiale granulare o

fibroso.

Il metodo rivendica che il processo 6,8 67 3 50 US 6,921,819 di reticolazione avviene durante

l’idratazione dell’HA. L’HA si

idrata con 68 g di 1%NaOH

contenenti il BDDE.

Si ottiene un gel continuo che si

neutralizza con tampone fosfato e si

omogeneizza.

Il metodo prevede che la reazione 60-100 100 4 50 US 2005/0281880 sia realizzata in un reattore in cui si

effettuano tutte le fasi del processo,

che dura 3 giorni. L’HA si scioglie

in 1% NaOH e si aggiunge BDDE.

Si ottiene un gel continuo.

Metodo di reazione ad alta 0,5 22,5 24 25 US 20060105022 concentrazione di HA (>20%)

impastando per rotazionerivoluzione.

L’HA si idrata con 22,5mL di

NaOH 0,2N contenenti il BDDE, si

mescola per rotazione–rivoluzione

per 5min e si lascia a temperatura

ambiente per 24h. Si ottiene un gel

continuo.

(continua) Il metodo prevede una prima fase di 2,5 250 2 45 US 2007/0026070

reticolazione nella soluzione basica

e una fase successiva concomitante

all’essiccamento sotto vuoto della

miscela di reazione. L’HA si

scioglie in 1% NaOH a cui si

aggiunge BDDE. Dopo 2h a 45°C

si essicca sotto vuoto a 40°C 1,5h.

Successivamente si lava tre volte

con 500mL di alcol isopropilico

(IPA)-H2O 6:4 per 22h; si allontana

il solvente e si lava con 500mL di

CH3COOH 1,3% in H2O 35min, 1L

IPA, 500mL IPA-H2O 6:4; 2L IPA,

2L IPA- H2O 8:2, 1L IPA.

Il metodo prevede una doppia 0,85 100 9 25 US 2007/0196426

reazione di reticolazione, nella prima 6 25

l’HA si scioglie in 1% NaOH e si

aggiunge BDDE, nella seconda. Si

aggiungono altri 200mL di HA 0,5%

a pH 11. Si ottiene un gel continuo.

Si descrive un metodo per preparare US 6,630,167

spugne di HA reticolato ottenute

per liofilizzazione di soluzioni

acquose di HA e reticolazione del

liofilizzato. Nella spugna reticolata

successivamente si introduce una

soluzione acquosa di HA per

ottenere un materiale barriera anti

adesione per uso chirurgico. Il

brevetto rivendica genericamente

tutti i tipi di reticolazione ma non

riporta esempi con BDDE o altri diepossidi.

Tabella 1 - Descrizione delle metodiche di reticolazione dell’HA con

di-epossidi (BDDE) riportate in US 4,963,666, US 5,827,937, KR 10-2005-

0059521, US 6,921,819, US 2005/0281880, US 20060105022,

US 2007/0026070, US 2007/0196426, US 6,630,167. Tutti i dati sono

normalizzati per un processo di reticolazione di 10g di HA.

Descrizione dell’invenzione

Si à ̈ ora trovato che à ̈ possibile effettuare la reazione di reticolazione

dell’HA e di altri polisaccaridi come la condroitina, la condroitina solfato, il chitosano o il polidestrano con epossidi polifunzionali, operando direttamente in un sistema non solvente per il polisaccaride in maniera da ottenere un polisaccaride reticolata che mantiene le caratteristiche 3D del polisaccaride di partenza (“memoria di forma†).

Il processo dell’invenzione à ̈ vantaggioso rispetto alla prior art, comportando volumi di reazione ridotti, tempi per la sintesi e la purificazione del materiale reticolato più brevi, costi sintetici meno onerosi, oltre alla possibilità unica di ottenere il mantenimento della forma 3D del materiale durante la sua reticolazione.

Come discusso sopra, la reazione di reticolazione in ambiente basico di polisaccaridi, in particolare di HA, con reattivi epossidici polifunzionali rappresenta oggi la strategia di elezione nella produzione di HA reticolato, per la grande stabilità chimica e biologica del legame etereo e la totale biocompatibilità di questo tipo di materiale una volta impiantato.

Il problema fondamentale della reazione di reticolazione dell’HA con epossidi polifunzionali à ̈ la necessità di operare in un ambiente fortemente basico, pH > 12, per tempi dell’ordine delle ore a temperature variabili tra 20 e 70°C. Queste condizioni determinano, parallelamente al processo intra- e inter-molecolare di reticolazione, anche l’idrolisi dei legami glicosidici presenti sulla catena polisaccaridica, con conseguente riduzione del suo peso molecolare. La competizione tra questi due processi determina le caratteristiche strutturali della matrice polisaccaridica reticolata formata, che sostanzialmente à ̈ caratterizzata dalla presenza nel sistema reticolato di segmenti polimerici lineari significativamente più corti di quelli originariamente impiegati. Pertanto, à ̈ di particolare importanza l’individuazione di condizioni di reazione che minimizzino il processo idrolitico rispetto a quello di reticolazione.

Nei metodi finora noti la reticolazione dell’HA à ̈ sempre stata effettuata in sistemi solventi per l’HA, in genere soluzioni acquose di NaOH, originando soluzioni vere e proprie o paste idratate che, una volta completata la reazione, si presentano come gel continui che, per trattamento meccanico, possono essere ridotti a particelle di piccole dimensioni, in genere tra 50 e 500µm. In particolare nel caso della reazione in soluzione (US 4,963,666, US 5,827,937, US 6,921,819, US 2005/0281880, US 2007/0026070, US 2007/0196426, US 6,630,167), per l’elevata viscosità delle soluzioni di acido ialuronico occorrono volumi di reazione elevati, che complicano e rendono notevolmente costoso il processo sintetico.

L’impiego di paste di acido ialuronico idratato (US 20060105022) crea invece problemi legati alla forte consistenza di queste masse, difficilmente mescolabili in maniera omogenea, in particolare su scala industriale.

Il processo dell’invenzione comprende la reticolazione del polisaccaride in un sistema non solvente per il polisaccaride, in presenza di basi ammoniche quaternarie e di un epossido polifunzionale.

Il processo può essere usato per la reticolazione di acido ialuronico, condroitina, condroitina solfato, chitosano o loro miscele, preferibilmente di acido ialuronico.

Il sistema non solvente à ̈ costituito da miscele di solventi organici e acqua con un rapporto in volume tra solvente organico e acqua ≥ 2.

Esempi di solventi organici adatti sono chetoni, alcoli o eteri miscibili con acqua. L’acetone à ̈ particolarmente preferito.

La reazione deve avvenire a valori di pH > 12 che possono essere raggiunti con basi ammoniche quaternarie e non con idrossidi inorganici come gli idrossidi dei metalli alcalini e alcalino-terrosi.

Esempi di basi ammoniche quaternarie sono idrossido di tetrabutil ammonio, idrossido di tetrapropil ammonio, idrossido di tetraetil ammonio, idrossido di tetrametil ammonio, idrossido di benzil tributil ammonio, idrossido di benzil tripropil ammonio, idrossido di benzil trietil ammonio, idrossido di benzil trimetil ammonio, idrossido di metil tributil ammonio, idrossido di metil tripropil ammonio, idrossido di metil trietil ammonio, idrossido di fenil tributil ammonio, idrossido di fenil tripropil ammonio, idrossido di fenil trietil ammonio, idrossido di fenil trimetil ammonio, idrossido di dodecil trimetil ammonio, idrossido di tetradecil trimetil ammonio, idrossido di esadecil trimetil ammonio, idrossido di octadecil trimetil ammonio, colina idrossido. Dette basi sono preferibilmente usate alla concentrazione compresa tra 0,025 e 1,3M. L’idrossido di benzil trimetil ammonio à ̈ particolarmente preferito.

L’agente reticolante epossidico polifunzionale à ̈ scelto fra 1,3-butadiene diepossido, 1,2,7,8-diepossiottano, 1,5-esadiene di epossido, etilene glicol diglicidil etere, 1,4-butanediol diglicidil etere, 1,6-esanediol diglicidil etere, polietileneglicol diglicidil etere, polipropileneglicol diglicidil etere, bisfenolo A diglicidil etere. Sono preferiti 1,4-butanediol diglicidil etere, polietileneglicol o polipropileneglicol diglicidil etere.

Il rapporto molare tra reticolante e gruppi reattivi del polisaccaride condiziona le rese di reazione e le caratteristiche dell’HA reticolato. Più elevato à ̈ questo rapporto, maggiori sono il grado di reticolazione, la resa percentuale in HA reticolato insolubile e la sua stabilità all’attacco delle ialuronidasi e dei radicali liberi.

Il rapporto molare tra i gruppi epossidici presenti nell’agente crosslincante e i gruppi funzionali del polisaccaride in grado di reagire con i gruppi epossidici à ̈ ≤1.

La reazione può essere effettuata a temperature comprese tra 0 e 150°C, preferibilmente tra 40 e 80 °C, per tempi di reazione tra 0,01 e 100h, preferibilmente tra 0,1 e 10h. Le rese in HA reticolato aumentano linearmente all’aumentare della temperatura di reazione fino a T = 60°C. A temperature più elevate la resa di reazione diminuisce per il prevalere di processi idrolitici legati all’ambiente basico di reazione. Tempi di reazione crescenti (0,5 - 16h) determinano un incremento delle rese in HA reticolato insolubile; tale incremento à ̈ particolarmente marcato nelle prime 3h, in cui si ha la formazione di circa il 70% dell’HA reticolato, dando a 100% la quantità formata a 16h. Pertanto sono preferiti tempi di reazione di 3 - 8h, poiché rappresentano il miglior compromesso tra resa di reazione e tempi di processo.

Il down stream di purificazione dell’HA reticolato prevede inizialmente l’arresto della reazione di reticolazione, portando il pH della miscela di reazione a 7,4 mediante aggiunta di H3PO4concentrato. La fase successiva prevede la purificazione dell’HA reticolato con allontanamento della fase liquida contenente reagenti e sottoprodotti di reazione e successivi lavaggi con soluzioni acquoso-organiche. Come solventi organici in miscela con l’acqua possono essere adoperati etanolo, acetone, tetraidrofurano, dimetilformammide, preferibilmente etanolo e acetone. La percentuale di acqua presente nella soluzione di lavaggio condiziona il grado di swelling del polisaccaride reticolato; si impiega preferibilmente una soluzione circa 1:1 (v/v). La saturazione della soluzione di lavaggio con sali inorganici, principalmente cloruri di metalli alcalini o alcalino-terrosi quali NaCl, KCl, CaCl2ecc., nelle prime fasi del processo di purificazione consente lo spostamento dello ione ammonico quaternario derivante dalla base organica utilizzata nella reazione, in modo da ottenere il sale di interesse (ialuronato reticolato di sodio, di potassio, di calcio, ecc.). L’allontanamento dello ione ammonico quaternario à ̈ monitorato spettrofotometricamente. Le ultime fasi di lavaggio sono effettuate con soluzioni acqua/solvente organico non saturate con il sale. Quando la conducibilità raggiunge valori di poche decine di µS/cm, si recupera la fase solida reticolata, il cui essiccamento può essere effettuato per liofilizzazione o in alternativa per trattamento con acetone o etanolo anidri e successivo essiccamento a caldo (40-45°C) sotto vuoto. La frazione di HA reticolato insolubile in acqua nel prodotto recuperato à ̈ determinata mediante lavaggi in acqua del prodotto seguiti dalla misura gravimetrica della frazione insolubile. Il rapporto percentuale tra la massa di campione insolubile recuperato e la massa di HA sottoposta a reazione rappresenta la resa di reazione.

I vantaggi rispetto alla prior art del metodo rivendicato sono: a) l’ottenimento di un prodotto reticolato a “memoria di forma†, che presenta dopo idratazione la stessa geometria della matrice polisaccaridica messa a reagire; b) il mantenimento di una maggiore integrità strutturale della catena polisaccaridica, perché sono più contenuti i processi idrolitici imputabili all’ambiente basico di reazione; c) la possibilità di operare con volumi di reazione molto ridotti; d) la possibilità di modulare in maniera semplice il processo di reticolazione; e) l’ottenimento di matrici reticolate altamente biocompatibili e con una maggiore stabilità chimica nei siti di impianto, non ottenibili con i protocolli attualmente sviluppati per la reticolazione con epossidi polifunzionali in ambiente basico.

Di seguito si riportano esempi che descrivono l’invenzione in maggio dettaglio.

ESEMPI ESEMPIO 1 - Effetto della quantità di acqua sulla reazione di reticolazione

A 10g di HA in polvere (particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80µm) si addizionano 100mL di miscela di reazione, contenenti quantità differenti di acqua e acetone (6,35, 16,35 e 33,05% v/v di acqua), che rappresentano sistemi non solvente per l’HA) in cui sono disciolti la base organica TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10mL (25mmoli) e l’agente reticolante, BDDE 0,68 mL (rapporto molare BDDE/gruppi OH dell’HA = 3,5%; tenendo conto della natura bi-funzionale del BDDE vi à ̈ la possibilità teorica di impegnare nel legame etereo il 7% delle funzioni ossidriliche disponibili sull’HA, quindi rapporto in equivalenti 7%). La miscela di reazione da aggiungere all’HA in polvere si presenta come un sistema omogeneo con percentuali di acqua del 16,35 e 33,05% (v/v), invece con una percentuale di acqua del 6,35% (corrispondente alla quantità di acqua che si introduce con la base organica) la miscela à ̈ bifasica. Dopo aggiunta dell’HA la miscela di reazione, che presenta una consistenza pastosa, à ̈ fatta reagire per 3h a 50°C sotto energico mescolamento. La reazione à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO4concentrato (14,8M) fino a neutralizzazione. La miscela di reazione à ̈ purificata come di seguito riportato: a) si allontana la fase liquida contenente i contaminanti solubili; b) si effettuano 4 lavaggi con 200mL di una soluzione etanolo/acqua 53,5/46,5 v/v saturata con NaCl; c) si effettua 1 lavaggio con 200mL di una soluzione di etanolo/acqua 50/50; d) si aggiunge etanolo puro fino ad arrivare a un rapporto etanolo/acqua 80/20 v/v e si allontana la fase liquida; e) si effettuano 10 lavaggi con 100mL di una soluzione di etanolo/acqua 80/20); f) la polvere di HA reticolato à ̈ trattata con etanolo anidro (4 lavaggi con 100 mL di etanolo anidro) ed essiccata sotto vuoto a 40°C. L’allontanamento della fase liquida à ̈ realizzato in tutta la procedura mediante filtrazione su membrana in ceramica porosa (dimensione pori: 20µm). In Tabella 2 à ̈ riportata la composizione delle differenti miscele di reazione e le rese di reazione in HA reticolato insolubile.

Nella reazione si ottiene un particolato con gli stessi rapporti dimensionali dell’HA impiegato, con rese percentuali rispetto all’HA di 0,00 a 6,35v/v di acqua, 43,4 ± 5,5 a 16,35 v/v di acqua e 79.4 ± 4,9(%) a 33,05% v/v di acqua. L’HA ottenuto impiegando una percentuale di acqua del 33,05% v/v, una volta idratato, si presenta come un gel continuo, mentre l’HA reticolato impiegando una percentuale di acqua del 16,35% v/v, una volta idratato, si presenta come un particolato gelificato con un fattore di rigonfiamento in acqua di circa 235mL/g e di 90mL/g in fisiologica. Dal paragone della Tabella 2 con la Tabella 1 relativa ai metodi noti appaiono evidenti le differenze nelle condizioni sperimentali, in particolare per quanto riguarda la quantità di acqua impiegata.

Campione HA Acetone H2O TMBAH** BDDE Insolubile° (% H2O)* (g) (mL) (mL) (mL (mL) (%) soluzione/mmol

TMBAH/mLH2O

)

1 6,35% 10 89,32 0,010/25/6,350,68 0,0°°

2 16,35% 10 79,32 10,0 10/25/6,35 0,68 43,4 ± 5,5

3 33,05% 10 62,62 26,7 10/25/6,35 0,68 79,4 ± 4,9

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di

quella presente nel TMBAH; ** soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M; ° % di

HA reticolato a memoria di forma; °° la resa à ̈ 0 perché il prodotto eventualmente

reticolato si scioglie nelle soluzioni di lavaggio durante la purificazione.

Tabella 2 - Miscela di reazione con quantità variabili di acqua (si tiene

conto anche dell’acqua presente nel TMBAH) e rese di reazione come % di

HA reticolato insolubile in acqua a memoria di forma.

ESEMPIO 2 - Effetto del tempo sulla reazione di reticolazione

Si preparano sei miscele di reazione, ciascuna formata da 10 g di HA in

polvere (particelle con dimensioni comprese tra 0,2 – 80 µm) a cui si

addizionano 100 mL di miscela di reazione, formata da: acqua 10 mL, acetone

79,32 mL, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa

al 40% w/w ≡ 2,5M) 10mL (25mmoli) e BDDE 0,68 mL (rapporto in

equivalenti BDDE/HA = 7%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈

solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni

sono fatti reagire a 50°C sotto energico mescolamento per tempi che variano

nell’intervallo 0,5-6h; la reazione di volta in volta à ̈ bloccata per aggiunta di

H3PO414,8 M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono

purificate come di seguito riportato: a) si allontana la fase liquida contenente i

contaminanti solubili; b) si effettuano 4 lavaggi con 200 mL di una soluzione acetone/acqua 53,5/46,5 v/v saturata con NaCl; c) si effettua 1 lavaggio con 200 mL di una soluzione di acetone/acqua 50/50; d) si aggiunge acetone puro fino ad arrivare a un rapporto acetone/acqua 80/20 v/v e si allontana la fase liquida; e) si effettuano 10 lavaggi con 100 mL di una soluzione di acetone/acqua 80/20); f) la polvere di HA reticolato à ̈ trattata con acetone anidro (4 lavaggi con 100mL di acetone anidro) ed essiccata sotto vuoto a 40°C. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato a memoria di forma insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione, sono 0,00 a 0,5h, 7,01 ± 1,2 a 1,5h, 43,44 ± 5,5 a 3h, 53,6 ± 6,6 a 5h, 58,9 ± 5,9 a 7h e 62,3 ± 4,4 a 16h. In tutti i casi si ottiene un particolato con le stesse caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione, che in acqua si rigonfia dando origine a particelle di gel di consistenza elastica.

ESEMPIO 3 - Effetto della temperatura sulla reazione di reticolazione Si preparano 5 miscele di reazione, ciascuna formata da 10g di HA in polvere (particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80 µm) a cui si addizionano 100 mL di miscela di reazione, formata da: acqua 10 mL, acetone 79,32 mL, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e BDDE 0,68 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA = 7%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni sono fatti reagire per 3h sotto energico mescolamento a differenti temperature (30, 40, 50, 60 e 70°C). La reazione di volta in volta à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono purificate come descritto nell’esempio 1. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione, sono 1,0 a 30°C, 28,0 ± 4,1 a 40°C, 43,4 ± 5,5 a 50°C, 66,0 ± 6,2 a

60°C e 47,3 ± 7,3 70°C). In tutti i casi si ottiene un particolato con le stesse

caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione, che in acqua si

rigonfia dando origine a particelle di gel di consistenza elastica.

ESEMPIO 4 - Effetto della concentrazione della base sulla reazione di

reticolazione

Si preparano 6 miscele di reazione, come riportato in tabella 3, ciascuna

formata da 10g di HA in polvere (particelle con dimensioni comprese tra

0,2 - 80 µm) a cui si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da:

acetone, acqua, BDDE 0,68 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA = 7%) e

differenti quantità di TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio,

soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) da 0,025 a 0,64M, la quantità di acqua

a 16,35% à ̈ calcolata tenendo conto dell’acqua presente nel TMBAH. Per

concentrazioni di TMBAH superiori a 0,3M (30 mmol TMBAH nel volume di

reazione) la miscela di reazione à ̈ bifasica.

TMBAH*

Campione HA Acetone H2O (mL aggiunti/mmol BDDE Insolubile° (H2O %)* (g) (mL) (mL) TMBAH nella reazione/mL (mL) (%) H2O nella base)

1 16,35 10 82,61 15,71 1,0 2,5 0,64 0,68 0,0°° 2 16,35 10 81,15 13,17 5,0 12,5 3,18 0,68 18,2±1,0 3 16,35 10 79,32 10,00 10,0 25,0 6,35 0,68 43,4±5,5 4 16,35 10 78,60 8,72 12,0 30,0 7,63 0,68 54,8±1,8 5 16,35 10 75,69 3,63 20,0 50,0 12,72 0,68 66,9±1,2 6 16,35 10 73,65 0,07 25,6 64,0 16,28 0,68 64,6±3,2

* % complessivo di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; ** soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M; °

% di HA reticolato a memoria di forma; °° la resa à ̈ 0 perché il prodotto anche se reticolato si scioglie nelle soluzioni di lavaggio durante la purificazione. Tabella 3 - Miscela di reazione con quantità variabili di TMBAH e rese di reazione come % di HA reticolato a memoria di forma insolubile in acqua.

Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni sono fatti reagire a 50°C per 3h sotto energico mescolamento. La reazione à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono purificate come descritto nell’esempio 1. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione, sono 0,00 con 0,025M TMBAH, 18,2 ± 2,8 con 0,125M TMBAH, 43,4 ± 5,5 con 0,250M TMBAH, 54,8 ± 1,8 con 0,300M TMBAH, 66,9 ± 1,2 con 0,500M TMBAH, 64,6 ± 3,2 con 0,640M TMBAH. In tutti i casi si ottiene un particolato con le stesse caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione, che in acqua si rigonfia dando origine a particelle di gel di consistenza elastica.

ESEMPIO 5 - Effetto della quantità di BDDE sulla reazione di reticolazione

Si preparano 4 miscele di reazione come riportato in tabella 4, ciascuna formata da 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80 µm, a cui si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e differenti quantità di BDDE rispettivamente 0,34, 0,68, 1,36 e 2,91 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA nell’ordine 3,5, 7, 14 e 30%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni sono fatti reagire a 50°C per 3h sotto energico mescolamento.

Campione HA Acetone H2O (mL) TMBAH** BDDE Insolubile°° (% H2O)* (g) (mL) (mLsol./mL (mL - %°) (%)

H2O°)

1 16,35% 10 79,66 10,0 10/6,35 0,34 3,5 0,0^

2 16,35% 10 79,32 10,0 10/6,35 0,68 7,0 43,4 ± 5,5

3 16,35% 10 78,63 10,0 10/6,35 1,36 14,0 60,8 ± 7,2

4 16,35% 10 77,09 10,0 10/6,35 2,91 30,0 74,5 ± 3,4

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; **soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M; ° quantità

di acqua contenuta in 10mL di TMBAH; °rapporto in equivalenti BDDE/HA; °° %

di HA reticolato a memoria di forma; ^la resa à ̈ 0 perché il prodotto anche se

reticolato si scioglie nelle soluzioni di lavaggio durante la purificazione.

Tabella 4 - Miscela di reazione con quantità variabili di BDDE e rese di

reazione come % di HA reticolato a memoria di forma insolubile in acqua

La reazione di volta in volta à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono purificate come

descritto nell’esempio 1. Le rese di reazione, definite come % di HA

reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella

reazione, sono 0,0 con 0,34 mL di BDDE, 43,4 ± 5,5 con 0,68 mL di BDDE,

60,8 ± 7.2 con 1,36 mL di BDDE, 74,5 ± 3,4 con 2,91 mL di BDDE. In tutti i

casi si ottiene un particolato con gli stessi rapporti dimensionali dell’HA

impiegato nella reazione, che in acqua si rigonfia, dando origine a particelle

di gel di consistenza elastica.

ESEMPIO 6 - Swelling in differenti tipi di sistemi acquosi di materiali

a memoria di forma basati su HA a differente grado di reticolazione

Il grado di swelling in acqua e in soluzione fisiologica in condizioni di equilibrio alla temperatura di 37°C Ã ̈ determinato per campioni di HA reticolati con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 7%, 11% e 14%.

Si preparano 3 miscele di reazione come riportato in tabella 5, ciascuna formata da 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80 µm, a cui si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e differenti quantità di BDDE rispettivamente 0,68, 1,07 e 1,36 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA nell’ordine 7, 11 e 14%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni sono fatti reagire a 60°C per 3h sotto energico mescolamento.

La reazione di volta in volta à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono purificate come descritto nell’esempio 1. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione, sono 65,7 ± 5,2 con 0,68 mL di BDDE, 70,8 ± 4,2 con 1,07 mL di BDDE, 74,5 ± 5,3 con 1,36 mL di BDDE. In tutti i casi si ottiene un particolato con le stesse caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione.

I campioni preparati sono risospesi in acqua bidistillata o in fisiologica alla concentrazione di 5 mg/mL. Le sospensioni sono autoclavate (12’, 120°C) in cilindro graduato e lasciate rigonfiare per 12h. Il grado di rigonfiamento à ̈ determinato misurando il volume del gel nel cilindro ed espresso come mL di gel/g HA reticolato insolubile, Tutte le misure sono effettuate in triplicato.

Il rigonfiamento in acqua per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 7% Ã ̈ 264 ± 13 mL/g, per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/11% Ã ̈ 160 ± 11 mL/g e per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 14% Ã ̈ 115 ± 13 mL/g.

Campione BDDE

Acetone Insolubile° Swelling degree (mL/g) (24%

H2O)* (mL) (%)

%** mL acqua fisiologica

1 71,67 7,0 0,68 65,7 ± 5,2 264 ± 13 110 ± 5

2 71,28 11,0 1,07 70,8 ± 4,2 160 ± 11 81 ± 5

3 70,99 14,0 1,36 74,5 ± 5,3 115 ± 13 75 ± 2

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; **rapporto in equivalenti BDDE/HA; ° % di HA reticolato a memoria di forma.

Tabella 5 - Valori di swelling degree di campioni di HA a memoria di forma reticolati con differenti quantità di BDDE. A 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80 µm, si addizionano 100 mL di una miscela di reazione formata da: H2O (17,65 mL), TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL, corrispondenti a 25 mmoli di TMBAH e 6,35 mL di H2O, in addizione a BDDE e acetone come riportato in tabella.

Il % di swelling in fisiologica per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 7% à ̈ 110 ± 5 mL/g, per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 11% à ̈ 81 ± 5 mL/g e per il campione con un rapporto in equivalenti BDDE/HA del 14% à ̈ 75 ± 2 mL/g. Come atteso il grado di swelling in acqua à ̈ maggiore che in fisiologica e all’aumentare della percentuale di agente reticolante diminuisce la quantità di acqua assorbita per grammo di campione, perché l’aumentato grado di reticolazione comporta una minore deformabilità del materiale e quindi una minore porosità.

ESEMPIO 7 - Preparazione di HA reticolato con polietileneglicol diglicidil etere (PEGDGE)

Si preparano 2 miscele di reazione come riportato in tabella 6, ciascuna formata da 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80 µm, a cui si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e differenti quantità di PEGDGE (Sigma Aldrich, Milano, Italia; product N. 475696, average Mn= 526Da, d=1,14 g/mL), rispettivamente 2,0 e 3,1 mL (rapporto in equivalenti PEGDGE/HA nell’ordine 9 e 14%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. I vari campioni sono fatti reagire a 60°C per 3h sotto energico mescolamento.

Campione HA Acetone H2O TMBAH** PEGDGE Insolubile°° (% H2O)* (g) (mL) (mL) (mLsol./mLH (mL - %°) (%)

2O°)

1 24% 10 70,35 17,65 10/6,35 2,0 9 61,0 ± 3,5

2 24% 10 69,25 17,65 10/6,35 3,1 14 74,0 ± 4,5

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; **soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M; ° quantità di acqua contenuta in 10mL di TMBAH; °rapporto in equivalenti PEGDGE/HA; °° % di HA reticolato a memoria di forma.

Tabella 6 - Miscela di reazione con quantità variabili di PEGDGE e rese di reazione come % di HA reticolato a memoria di forma insolubile in acqua La reazione di volta in volta à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le varie miscele di reazione sono purificate come descritto nell’esempio 1. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione, sono 61,0 ± 3,5 con 0,20 mL di PEGDGE, 74,5 ± 4,5 con 0,31 mL di PEGDGE. In tutti i casi si ottiene un particolato con le stesse caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione.

ESEMPIO 8 - Valutazione della stabilità alle ialuronidasi di materiali a memoria di forma basati su HA a differente grado di reticolazione

È stata determinata la stabilità dei materiali a memoria di forma basati su HA a differente grado di reticolazione, descritti nell’esempio 6, all’azione degradativa della ialuronidasi testicolare bovina (BTH). La BHT à ̈ un’endo-glucano idrolasi, il cui pH ottimale per l’attività idrolasica à ̈ di circa 4 - 5. Lo studio à ̈ stato fatto in paragone con Restylane® un prodotto a base di HA reticolato con BDDE largamente utilizzato come filler intradermico per trattamenti di medicina estetica. I campioni sono sospesi alla concentrazione di 4 mg/mL in tampone fosfato pH 7,4, autoclavati (12’ a 120°C) e incubati a 37°C sotto agitazione (1.000 rpm) con 50U/mL di BTH (nel caso di Restylane il prodotto à ̈ direttamente diluito in tampone fosfato e incubato con BTH). Ai tempi stabiliti, i campioni sono portati a 100°C per 10’, per bloccare l’attività enzimatica. I campioni sono quindi filtrati su 0,45 µm e il filtrato (contenente la frazione solubile del campione) à ̈ testato per il contenuto di HA mediante il test del carbazolo (T. Bitter, H.M. Muir, Anal. Biochem. 1962, 330-334).

La degradazione à ̈ monitorata seguendo l’incremento di frazione solubile nel tempo.

massa HA nel permeato (g)

% HA solubile = x 100

massa HA incubata (g)

In tabella 7 sono riportati i dati ottenuti. I prodotti analizzati presentano differenze sostanziali nei tempi di degradazione. In particolare, la velocità di degradazione dei prodotti descritti nell’esempio 6 diminuisce all’aumentare del grado di reticolazione: il campione reticolato con BDDE 7% si solubilizza completamente a tempi di incubazione tra 6 e 24h; il prodotto reticolato con BDDE 11% raggiunge la completa solubilizzazione dopo tempi di incubazione 10 volte maggiori; in corrispondenza della completa solubilizzazione del prodotto reticolato con BDDE 11%, la frazione solubile per il prodotto reticolato con BDDE 14% ammonta a circa il 50% del totale. Nelle stesse condizioni sperimentali, il prodotto commerciale Restylane à ̈ completamente solubilizzato in meno di 3h.

Campione

(% % solubile dopo incubazione con BTH 50U/mL

BDDE)*

0h 1h 3h 6h 24h 3gg 10gg 17gg 1 (7) 3,7 ± 0.5 53,8 ± 83,7 ±

5.3 92,80,7 ±1.8 100

2 (11) 4.0 ± 0,1 25,0 ± 69,0 ±

1,0 77 ± 7 97,0 ±

0,30,5

3 (14) 0,1 ± 0,0 10,2 ± 18,4 ± 29,8 ±4,1 51,8 ± 61,0 ±

1,10,81,8 4,0 Restylane<®>33.0 ±

5.0 100

*rapporto in equivalenti BDDE/HA;

Tabella 7 - Stabilità in vitro a 37°C all’idrolisi catalizzata da ialuronidasi bovina (BTH 50 U/mL) di campioni di HA a memoria di forma reticolati con differenti quantità di BDDE, preparati secondo l’esempio 6, e di un campione commerciale di Restylane<®>.

ESEMPIO 9 - Estrudibilità di particolati a memoria di forma basati su HA reticolato

In considerazione del possibile impiego nel campo della medicina estetica di particolati a base di HA reticolato a memoria di forma come filler da micro-iniettare sotto cute si à ̈ valutata l’estrudibilità di sospensioni in soluzione fisiologica (NaCl 0,9% p/v) di campioni di HA reticolati con un rapporto in equivalenti BDDE/HA di 7%, 11% e 14%, preparati come descritto nell’esempio 6. I campioni reticolati sono messi a rigonfiare in soluzione fisiologica alla concentrazione di 20, 25 e 30 mg/mL. Le sospensioni sono state tenute in agitazione (1.000rpm) per 2-3h, Tutti i campioni si sono rigonfiati fino a diventare gel di elasticità decrescente all’aumentare della concentrazione delle sospensioni e del grado di reticolazione. Con le sospensioni idratate si sono riempite siringhe in vetro da 2mL, sottoposte successivamente a un ciclo di sterilizzazione per 12’ a 120°C. I gel sterilizzati sono estrusi dalle siringhe attraverso aghi gauge 27 e 30, corrispondenti rispettivamente a diametri interi pari a 0,45 e 0,30 mm (tali dimensioni corrispondono a quelle degli aghi utilizzati per le iniezioni dei filler a base di HA attualmente sul mercato). Il campione di HA reticolato con rapporto in equivalenti BDDE/HA del 7% ha prodotto sospensioni estrudibili attraverso gauge 30 a tutte le concentrazioni testate. Per i campioni reticolati con rapporto in equivalenti BDDE/HA pari a 11% e 14%, le sospensioni più concentrate (30mg/mL) sono risultate estrudibili attraverso aghi gauge 27, quelle a concentrazione inferiore attraverso aghi gauge 30. I campioni sono giudicati estrudibili applicando pressioni compatibili con l’applicazione clinica. L’estrudibilità dei gel dipende sia dalla dimensione delle particelle allo stato idratato che dalla loro elasticità. In particolare l’estrudibilità migliora al diminuire della concentrazione e delle dimensioni delle particelle idratate e all’aumentare della loro elasticità. I campioni di HA reticolato descritti nell’esempio 6 presentano (allo stato secco) le stesse caratteristiche di forma e dimensioni (0,2-80 µm) dell’HA impiegato nella reazione di reticolazione. Considerando i dati di swelling degree in soluzione fisiologica riportati in tabella 5 (110 ± 5 mL/g per il campione reticolato al 7% in equivalenti BDDE/HA, 81 ± 5 mL/g per il campione reticolato al 11% in equivalenti BDDE/HA, e 75 ± 2 mL/g per il campione reticolato al 14% in equivalenti BDDE/HA), dopo idratazione la dimensione delle particelle aumenta mediamente di 110-75 volte rispetto allo stato secco, passando dal prodotto meno reticolato a quello più reticolato, e raggiungono dimensioni comprese nell’intervallo 15 µm-8.8 mm. Pertanto la facile estrudibilità attraverso aghi gauge 27-30 (diametro interno 0,45-0,30 mm) dimostra la grande elasticità dopo idratazione dei particolati di HA reticolato a memoria di forma, una caratteristica importante non solo per la iniettabilità del prodotto ma anche per un buon successo sotto il profilo estetico del filler nella sede di impianto.

ESEMPIO 10 - Preparazione di una spugna di HA reticolato a memoria di forma

Si preparano spugne di HA reticolato a partire da HA ad alto peso molecolare (HHA, Mw 1.5kDa) e a basso peso molecolare (LHA, Mw 220kDa).

Soluzioni acquose di HA al 4% p/p nel caso dell’HHA e al 12,5% p/p nel caso dell’LHA sono versate in capsule di petri fino ad avere uno spessore del liquido di 0,5cm e successivamente liofilizzate. In entrambi i casi si ottiene un materiale che, osservato al microscopio elettronico a scansione si presenta come una struttura porosa con elevato grado di interconnessione dei pori. Il materiale cosi ottenuto, se posto in acqua, si solubilizza istantaneamente. Per ottenere un materiale che mantiene la sua forma originaria in acqua, la spugna liofilizzata à ̈ sottoposta a processi di reticolazione con BDDE in un sistema non solvente. In particolare, per entrambe i materiali a base di HHA e LHA si preparano 3 miscele di reazione, ciascuna formata da 10g di spugna di HA a cui si addizionano 100mL di miscela di reazione, formata da: acqua 10mL, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e quantità di BDDE e acetone variabili secondo quanto indicato in tabella 8. In particolare le quantità di BDDE impiegate corrispondono a rapporti in equivalenti BDDE/HA di 7, 14 e 30%. Il materiale, imbibito e interamente ricoperto dalla miscela di reazione, à ̈ fatto reagire a 60°C per 3h sotto agitazione; la reazione à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Il prodotto reticolato à ̈ purificato come descritto nell’esempio 1. Tutti i materiali ottenuti conservano la loro forma tridimensionale originaria, ma in acqua con l’aumentare del grado di reticolazione presentano una resistenza crescente e si rigonfiano in maniera decrescente.

Campione HA** Acetone<H2O (mL)>TMBAH°BDDE

(% H2O)* (g) (mL) (mL/mLH2O °°) (mL - %^)

1 16,35% 10 79,32 10,0 10/6,35 0,68 7,0

2 16,35% 10 78,63 10,0 10/6,35 1,36 14,0

3 16,35% 10 77,09 10,0 10/6,35 2,91 30,0

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; ** Spugna a base di HHA o LHA; °soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M; °° quantità di acqua contenuta in 10mL di TMBAH; ^ rapporto in equivalenti BDDE/HA;

Tabella 8 - Miscela di reazione con quantità variabili di BDDE ESEMPIO 11 - Preparazione di chitosano reticolato

A 10g di chitosano in polvere (Chitosan low molecular weight, Sigma Aldrich, Milano, Italia; product N. 448869, deacetilazione ≥ 75%, viscosità 20-300 cps c = 1%p/v in acido acetico 1%v/v in acqua) si addizionano 100mL di miscela di reazione, contenente acqua in acetone 24% v/v, che rappresenta un sistema non solvente per il chitosano, in cui sono disciolti la base organica TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e l’agente reticolante, BDDE 2,26 mL (rapporto in equivalenti BDDE/gruppi OH/NH2del chitosano = 14%). Come sistema di controllo si utilizza una miscela di reazione in cui non si addiziona l’agente reticolante.

Nella miscela di reazione il chitosano non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. Si fa reagire a 60°C per 3h sotto energico mescolamento.

La reazione à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le due miscele di reazione, con e senza agente reticolante, sono purificate come riportato nell’esempio 1. Si ottiene un particolato con le stesse caratteristiche dimensionali del chitosano impiegato nella reazione, con rese percentuali rispetto al chitosano impiegato di 95 e 93% p/p rispettivamente per la miscela di reazione con e senza agente reticolante. Per valutare la resa in prodotto reticolato insolubile le due polveri sono sospese in una soluzione acquosa di acido acetico all’1% v/v che à ̈ un sistema solvente per il chitosano, si lascia in agitazione per 5h e si centrifuga. Il sedimento à ̈ lavato due volte con acqua ed essiccato per liofilizzazione. Il liofilizzato rappresenta l’80% del prodotto di reazione per la miscela con BDDE, mentre la polvere della miscela di reazione senza BDDE si solubilizza completamente in acqua/acido acetico 1%v/v.

ESEMPIO 12 - HA reticolato funzionalizzato con colina Sono stati prodotti reticolati di HA a memoria di forma contenenti residui di colina cloruro.

La reazione in presenza di colina cloruro à ̈ stata condotta secondo due procedure. Per la prima, a 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 – 80 µm, si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli), una quantità di BDDE pari a 1,36 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA nell’ordine 14%) e colina cloruro (C7017, Sigma Aldrich, Italia) 1,94 g (rapporto in equivalenti colina/HA nell’ordine 14%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. Il campione à ̈ fatto reagire a 60°C per 3h sotto energico mescolamento.

Per la seconda, a 10g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80µm, si addizionano 100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli) e una quantità di BDDE pari a 1,36 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA nell’ordine 14%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. Il campione à ̈ fatto reagire a 60°C per 3h sotto energico mescolamento. A 3h, si aggiungono ulteriori

100 mL di miscela di reazione formata da: acqua, acetone, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL (25 mmoli), BDDE 1,36 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA nell’ordine 14%) e colina cloruro (C7017, Sigma Aldrich, Italia) 1,94 g (rapporto in equivalenti colina/HA nell’ordine 14%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il sistema si presenta di consistenza pastosa. Il campione à ̈ fatto reagire a 60°C per ulteriori 1,5h sotto energico mescolamento.

La reazione à ̈ in entrambi i casi bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Le miscele di reazione sono purificate come descritto nell’esempio 1. Si ottengono particolati con le stesse caratteristiche dimensionali dell’HA impiegato nella reazione. Le rese di reazione, definite come % di HA reticolato insolubile in acqua ottenuto rispetto all’HA impiegato nella reazione sono pari a 29 ± 2 e 71 ± 3, rispettivamente.

Per entrambi i prodotti à ̈ stato valutato lo swelling degree secondo quanto descritto nell’esempio 6. Lo swelling degree per il campione ottenuto con la prima procedura à ̈ 270 ± 16 mL/g in acqua e 94 ± 8 mL/g in fisiologica. Lo swelling degree per il campione ottenuto con la seconda procedura à ̈ 139 ± 11 mL/g in acqua e 81 ± 4 mL/g in fisiologica

BDDE Colina cloruro Insolubile Swelling degree Campione Acetone °(mL/g)(24% H2O)* (mL)

%** mL *** g<(%)>Acqua Fisiologica

1 70,99 14,0 1,36 100 1,94 29 ± 2 270 ± 16 94 ± 8

<70,99>14,0 1,36 0 0

2

+70,99+14,0 1,36 68 ± 3 139 ± 11 81 ± 4

100+1,94

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; **rapporto in equivalenti BDDE/HA; ***rapporto in equivalenti colina /BDDE° % di HA reticolato a memoria di forma.

Tabella 9 - Valori di resa e di swelling degree di campioni di HA a memoria di forma reticolati con BDDE in presenza di colina cloruro. Per il campione 1, a 10 g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 – 80 µm, si addizionano 100mL di una miscela di reazione formata da: H2O (17,65 mL), TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10mL, corrispondenti a 25mmoli di TMBAH e 6,35 mL di H2O, in addizione a BDDE, acetone e colina cloruro come riportato in tabella. Per il campione 2, a 10g di HA in polvere, particelle con dimensioni comprese tra 0,2 - 80µm si addizionano 100 mL 100 mL di miscela di rex contenenti H2O (17,65 mL), TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 10 mL, corrispondenti a 25mmoli di TMBAH e 6,35 mL di H2O, in addizione a BDDE, acetone e colina cloruro come riportato in tabella.

Come atteso sulla base della competizione tra HA e colina nella reazione con BDDE, la reazione 1 porta ad un prodotto meno reticolato di quello ottenuto in assenza di colina (esempio 6): minore resa e valori maggiori di swelling degree. Per la reazione 2, il valore di resa à ̈ paragonabile a quello del prodotto ottenuto solo con BDDE 14% descritto nell’esempio 6, tuttavia i valori di swelling degree risultano maggiori evidentemente per l’introduzione di residui di colina nel network.

I prodotti descritti sono stati testati per la stabilità all’azione degradativa della ialuronidasi testicolare bovina seguendo la procedura indicata nell’esempio 7. In tabella 10 sono riportati i risultati ottenuti.

I prodotti analizzati differiscono, come atteso, nei tempi di degradazione. In particolare, il campione 1 risulta completamente solubilizzato a 5 gg di incubazione. Nelle stesse condizioni, il campione 2 risulta solubile solo per il 44 ± 3%. Entrambi i campioni sono risultati meno resistenti all’azione enzimatica del prodotto reticolato con BDDE 14% in assenza di colina ottenuto secondo quanto descritto nell’esempio 6. Tali risultati sono coerenti con il minor grado di reticolazione e il maggior grado di swelling (maggiore esposizione all’azione enzimatica) del campione 1 e il maggior grado di swelling del campione 2 rispetto al campione reticolato con BDDE 14% in assenza di colina.

Colina % solubile dopo

BDDE

Campione Acetone cloruro incubazione con BTH (24% H2O)* (mL) 50U/mL

%** mL *** g 3gg 5gg

1 70,99 14,0 1,36 100 1,94 44 ± 1 0

<70,99>0 0

2 14,0 1,36 1,36 57 ± 5 44 ± 3

+70,99 14,0+100+1,94

* % complessiva di H2O nella miscela di reazione tenendo conto anche di quella presente nel TMBAH; **rapporto in equivalenti BDDE/HA; ***rapporto in equivalenti colina/BDDE

Tabella 10 - Stabilità in vitro a 37°C all’idrolisi catalizzata da ialuronidasi bovina (BTH 50U/mL) di campioni di HA a memoria di forma reticolati con BDDE in presenza di colina cloruro

ESEMPIO 13 - Valutazione della citotossicità di materiali a memoria di forma basati su HA reticolato

I test di citotossicità in vitro sono condotti secondo le norme ISO 10993-5 (test indiretto). In particolare, una coltura cellulare di fibroblasti murini NIH3T3 à ̈ incubata con mezzo di coltura condizionato con i campioni da analizzare. Le prove sono eseguite in triplicato.

La valutazione à ̈ eseguita sui prodotti a base di HA reticolato preparati secondo quanto descritto nell’esempio 5 (HA in polvere reticolato usando un rapporto in equivalenti BDDE/HA di 7, 14 e 30%) e sui prodotti a base di HA reticolato preparati secondo quanto descritto nell’esempio 9 (spugne di HHA e LHA reticolati con un rapporto in equivalenti BDDE/HA di 30%).

Operando in condizioni sterili, i mezzi condizionati sono ottenuti ponendo i materiali in esame in DMEM completo senza rosso fenolo (il volume di mezzo aggiunto à ̈ tale che, raggiunto l’equilibrio di swelling, i materiali risultino sospesi in una quantità di mezzo pari a 1mL di mezzo/0,2 g di materiale) e incubandoli a 37°C per 24h. Il mezzo di coltura adoperato à ̈ terreno di Dulbecco modificato (DMEM) contenente glucosio (4,5 g/L), piruvato di sodio (1 mM), glutammina (2 mM) e addizionato con siero fetale bovino (FBS) al 10% v/v, penicillina (100U/mL), streptomicina (100 µg/mL), fungizone (2,5 µg/mL) e aminoacidi non essenziali (1% v/v).

Al termine dell’incubazione si centrifuga e il surnatante rappresenta il mezzo condizionato. Contemporaneamente, fibroblasti murini NIH3T3 sono seminati a una densità di 8,5x10<4>cell/cm<2>in multiwell per colture cellulari da 12 pozzetti e incubati in terreno DMEM completo senza rosso fenolo a 37°C per 24h. A 24h dalla semina, il terreno di coltura à ̈ sostituito con 1mL del mezzo condizionato con i materiali in esame e le piastre sono incubate a 37°C per 48h. Nei pozzetti di controllo, il mezzo à ̈ sostituito con DMEM completo non condizionato.

A 24 e 48h di incubazione con mezzo condizionato, la vitalità cellulare à ̈ valutata qualitativamente, mediante osservazione al microscopio ottico, e quantitativamente, mediante il test del MTT (3-[4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazolio bromuro) (Slater TF, Sawyer B, Strauli U., Biochim Biophys Acta 1963; 77, 383-393). In particolare, la vitalità delle cellule incubate con mezzo condizionato à ̈ stata quantificata in termini percentuali rispetto a quella delle cellule incubate con mezzo non condizionato (controllo).

All’osservazione al microscopio ottico, le cellule incubate con tutti i mezzi condizionati presentano la loro morfologia ottimale, indicando l’assenza di rilascio di sostanze tossiche dai materiali.

Analogamente l’analisi quantitativa con test MTT conferma la non citotossicità dei materiali testati, perché le cellule incubate con mezzo condizionato con tutti i campioni di HA reticolato mostrano una vitalità confrontabile con quella del controllo (80-100%).

ESEMPIO 14 - Valutazione in vivo di HA reticolato a memoria di forma

La citocompatibilità di spugne di HA reticolato a memoria di forma à ̈ valutata in vivo utilizzando come sistema modello il topo.

Una soluzione di LHA al 12,5% p/p in acqua à ̈ versata in una capsula di petri fino ad avere uno spessore del liquido di 0,5cm, successivamente la soluzione à ̈ liofilizzata. Il materiale liofilizzato, che osservato al microscopio elettronico a scansione, presenta una struttura porosa con elevato grado di interconnessione dei pori, à ̈ sottoposto a reticolazione. In particolare, a 10 g di LHA liofilizzato si addizionano 194 mL di miscela di reazione, formata da: acqua 19,4 mL, acetone 149,6 mL, TMBAH (idrossido di benzil trimetil ammonio, soluzione acquosa al 40% w/w ≡ 2,5M) 19,4mL (48,5 mmoli) e BDDE 5,64 mL (rapporto in equivalenti BDDE/HA = 58,2%). Nella miscela di reazione l’HA non à ̈ solubilizzato e il materiale à ̈ imbibito e interamente ricoperto dalla fase liquida. Il campione à ̈ fatto reagire a 60°C sotto energico mescolamento per 3h; la reazione à ̈ bloccata per aggiunta di H3PO414,8M fino a neutralizzazione. Il prodotto à ̈ purificato secondo il protocollo descritto nell’esempio 1. Il materiale ottenuto, insolubile in mezzo acquoso, si presenta come un idrogelo di consistenza elastica che, sulla base delle osservazioni al microscopio elettronico a scansione e al microscopio ottico, mantiene la struttura porosa del materiale messo a reticolare.

Si procede con la preparazione del costrutto, scaffold caricato con condrociti umani, da impiantare sotto cute in topi immonocompromessi.

I condrociti umani sono ottenuti da cartilagine umana prelevata durante interventi chirurgici di rinoplastica. Il pezzo di cartilagine, conservato in condizioni sterili, à ̈ diviso, sempre in condizioni sterili, in piccoli pezzi, che sono disgregati enzimaticamente incubando sotto agitazione per 12h a 37°C il materiale in una soluzione di PBS contenente collagenasi di tipo I (3 mg/mL), dispasi (4 mg/mL) e 5 µl/mL di una soluzione di gentamicina (80 mg/mL). Successivamente si filtra la sospensione su un filtro da 0,2 µm e si lava il residuo di cellule con mezzo DMEM 10%FBS. Si centrifuga a 1.500 rpm per 7’, si elimina il surnatante e si risospende il pellet in DMEM 10%FBS. I condrociti così ottenuti sono seminati su piastra in DMEM 10%FBS contenente DIFLUCAN alla concentrazione di 5 µL/mL e gentamicina 5 µl/mL.

Per la preparazione dello scaffold, la spugna di HA reticolato a memoria di forma à ̈ tagliata a formare dischetti che, raggiunto l’equilibrio di swelling, presentino un diametro di circa 10 mm. Questi dischetti, ancora allo stato secco, sono sterilizzati in autoclave (12’ a 120°C) e successivamente sono caricati con condrociti umani, lasciando rigonfiare in vitro l’idrogelo con una sospensione cellulare contenente 2x10<5>cellule fino a completo assorbimento. Costrutti di Hyalofill<TM>(Fidia Advanced Biopolymers) e condrociti sono preparati allo stesso modo e usati nella sperimentazione in vivo come controllo. I costrutti ottenuti sono incubati per 48h a 37°C e 5%CO2per consentire l’adesione delle cellule allo scaffold e, quindi, impiantati in vivo sottocute nella zona dorsale di topi immunocompromessi.

Nella sperimentazione si utilizzano 10 animali, in precedenza stabulati, impiantando sulla zona dorsale di cinque ratti sul lato destro due dischetti di HA crosslincato a memoria di forma e su quello sinistro due dischetti dello stessa materiale, che invece sono stati caricati con condrociti umani; sugli altri cinque animali si procede analogamente impiantando Hyalofill e Hyalofil caricato con condrociti umani. A 30 giorni dall’impianto si effettua il prelievo dei costrutti, ove ancora presenti, e di campioni di tessuto dell’area perimplantare. Questo materiale à ̈ sottoposto ad analisi immunoistochimica e istologica. Hyalofill, sia impiantato senza condrociti che combinato con condrociti, à ̈ risultato completamente riassorbito, invece, nel caso della spugna di HA reticolato a memoria di forma, sia il controllo che lo scaffold caricato con condrociti umani si ritrovano ancora in situ e appaiono estesamente vascolarizzati. L’analisi istologica del costrutto di HA reticolato caricato con condrociti umani mostra la presenza di tessuto cartilagineo bene organizzato strutturalmente.

Claims (26)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di polisaccaridi reticolati a memoria di forma, che comprende la reticolazione del polisaccaride in un sistema non solvente per il polisaccaride, in presenza di basi ammoniche quaternarie e di un epossido polifunzionale.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il polisaccaride à ̈ acido ialuronico, condroitina, condroitina solfato, chitosano o loro miscele.
3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il polisaccaride à ̈ acido ialuronico.
4. 4. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-3 in cui il sistema non solvente à ̈ costituito da miscele di solventi organici e acqua.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 4 in cui il sistema non solvente à ̈ costituito da miscele in cui il rapporto in volume tra solvente organico e acqua à ̈ ≥ 2.
6. 6. Processo secondo la rivendicazione 4 o 5 in cui i solventi organici sono chetoni, alcoli o eteri miscibili con acqua.
7. 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui il solvente à ̈ acetone.
8. 8. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-7 in cui la concentrazione della base à ̈ compresa tra 0,025 e 1,3M.
9. 9. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-8 in cui le basi ammoniche quaternarie sono scelte fra idrossido di tetrabutil ammonio, idrossido di tetrapropil ammonio, idrossido di tetraetil ammonio, idrossido di tetrametil ammonio, idrossido di benzil tributil ammonio, idrossido di benzil tripropil ammonio, idrossido di benzil trietil ammonio, idrossido di benzil trimetil ammonio, idrossido di metil tributil ammonio, idrossido di metil tripropil ammonio, idrossido di metil trietil ammonio, idrossido di fenil tributil ammonio, idrossido di fenil tripropil ammonio, idrossido di fenil trietil ammonio, idrossido di fenil trimetil ammonio, idrossido di dodecil trimetil ammonio, idrossido di tetradecil trimetil ammonio, idrossido di esadecil trimetil ammonio, idrossido di octadecil trimetil ammonio, colina idrossido.
10. 10. Processo secondo la rivendicazione 9 in cui la base ammonica quaternaria à ̈ idrossido di benzil trimetil ammonio.
11. 11. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-10 in cui la temperatura di reazione varia tra 0 e 150°C.
12. 12. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-10 in cui l’epossido polifunzionale à ̈ scelto fra 1,3-butadiene diepossido, 1,2,7,8-diepossiottano, 1,5-esadiene di epossido, etilene glicol diglicidil etere, 1,4-butanediol diglicidil etere, 1,6-esanediol diglicidil etere, polietileneglicol diglicidil etere, polipropileneglicol diglicidil etere, bisfenolo A diglicidil etere.
13. 13. Processo secondo la rivendicazione 12 in cui l’epossido polifunzionale à ̈ 1,4-butanediol diglicidil etere.
14. 14. Processo secondo la rivendicazione 12 in cui l’epossido à ̈ polietilene glicol diglicidil etere o polipropileneglicol diglicidil etere.
15. 15. Processo secondo la rivendicazione 12, 13 o 14 in cui il rapporto molare tra i gruppi epossidici presenti nell’epossido e i gruppi funzionali del polisaccaride in grado di reagire con i gruppi epossidici à ̈ ≤1.
16. 16. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui la reazione à ̈ interrotta portando a neutralità per aggiunta di un acido concentrato.
17. 17. Processo secondo la rivendicazione 16 in cui l’acido concentrato à ̈ acido fosforico.
18. 18. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-17 in cui il prodotto cross-lincato à ̈ purificato allontanando la fase liquida e lavando fino a scomparsa dei contaminanti con una miscela omogenea acqua-solvente organico, che non determina lo swelling della fase solida.
19. 19. Processo secondo la rivendicazione 18 in cui nei primi lavaggi la miscela solvente organico-acqua à ̈ saturata con cloruro di sodio.
20. 20. Processo secondo le rivendicazioni 18 e 19 in cui il solvente organico presente nella miscela di lavaggio à ̈ etanolo o acetone.
21. 21. Processo secondo la rivendicazione 20 in cui il rapporto tra solvente organico e acqua à ̈ ≥2.
22. 22. Processo secondo una o più delle rivendicazioni 1-21 in cui il prodotto cross-lincato a memoria di forma à ̈ ottenuto per essiccamento del materiale dopo il lavaggio.
23. 23. Processo secondo la rivendicazione 22 in cui l’essiccamento à ̈ ottenuto con un lavaggio esauriente con un solvente organico anidro in cui l’acqua sia miscibile e successivo essiccamento sotto vuoto a caldo.
24. 24. Processo secondo la rivendicazione 23 in cui il solvente organico anidro à ̈ etanolo o acetone.
25. 25. Processo secondo la rivendicazione 22 in cui l’essiccamento à ̈ ottenuto per liofilizzazione.
26. 26. Materiali a memoria di forma ottenuti dai processi delle rivendicazioni da 1 a 25.