ITMI20121636A1 - Metodo per la determinazione dell'attivita' di alfa-amilasi - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“METODO PER LA DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITÀ DI ALFA-AMILASIâ€

La presente invenzione riguarda un metodo per determinare l’attività di alfa-amilasi in un campione di fluido biologico mediante saggio colorimetrico. Il metodo dell’invenzione consente un’accurata valutazione dell’attività catalitica dell’enzima alfa-amilasi in presenza di emoglobina nel campione di fluido biologico. L’invenzione riguarda inoltre un kit e reagenti per l’esecuzione del saggio.

Introduzione

Nella diagnostica di laboratorio campioni di sangue venoso ed arterioso emolizzati sono causa di rilevanti inconvenienti clinici, analitici e organizzativi a causa dell'interferenza biologica, spettrofotometrica e chimica causata dall’emoglobina libera plasmatica (1,2). Per quanto riguarda gli ultimi due tipi di interferenza, l'aumento di assorbanza ottica o il cambiamento del valore della linea di base nella misura a lunghezze d'onda in cui l'emoglobina assorbe più intensamente la luce, o attribuibili all'attività pseudoperossidasica e alla sovrapposizione spettrale con reazioni chimiche, spesso causa l’alterazione dei risultati di molteplici test. L'enzima α-amilasi à ̈ principalmente sintetizzata nel pancreas e nelle ghiandole salivari, ma può anche essere rilasciata in misura minore da altri tessuti come intestino (duodeno e ileo), ovaio e testicoli. Sebbene tre isoenzimi specifici dell'amilasi siano presenti in natura (α, β e γ), l’α-amilasi à ̈ presente solo negli esseri umani, il cui pancreas e ghiandole salivari sintetizzano isoforme specifiche caratterizzate da diversa mobilità durante focalizzazione isoelettrica. Le principali cause di siero o plasma - iperamilasemia oltre che macroamilasemia - comprendono pancreatite acuta e altri disturbi pancreatici come il cancro, l'ostruzione del pancreas e la fibrosi cistica, neoplasie della mammella, del colon, del polmone e dell'ovaio, traumi, ustioni, disturbi salivari e gastrointestinali (vale a dire ulcere, ischemia intestinale e perforazione, appendicite), disfunzione epatica a causa di epatite e cirrosi, varie patologie ginecologiche tra cui gravidanze ectopiche e salpingite, colecistite, peritonite, la presenza di calcoli biliari e l'alcolismo cronico. Nella maggior parte di queste condizioni, la valutazione dell’amilasi nel siero, nel plasma o anche nelle urine rappresenta una parte essenziale della pratica diagnostica. Il significato di quantificare l’amilasi in fluidi biologici diversi da sangue e urina à ̈ stato proposto per la diagnosi differenziale nel fluido cistico delle lesioni pancreatiche o per la previsione precoce della gravità della pancreatite acuta, così come nei fluidi pleurici e peritoneali per la diagnosi differenziale della peritonite, e una varietà di altri disturbi, tra cui rottura esofagea, versamento pleurico pancreatico, gravidanza ectopica, tumori ovarici, sindrome di Meigs, cirrosi alcolica, tumori del polmone, della mammella o del rene.

Diversi studi hanno dimostrato che l'attività catalitica dell’amilasi -misurata con una varietà di reagenti e test - può risultare sostanzialmente diminuita in presenza di emoglobina libera nel campione (3-9), riducendo così l'utilità clinica della valutazione dell’ alfa-amilasi nel siero o nel plasma emolizzato, così come in urina o altri fluidi biologici che spesso contengono un gran numero di globuli rossi intatti o danneggiati. Ciò vale anche per le forme di pancreatite acuta con complicazioni da shock emorragico, in cui la concentrazione di emoglobina libera plasmatica può essere frequentemente aumentata a causa dell’emolisi in vivo (10,11).

Gli approcci più idonei per superare l'interferenza spettrofotometrica e chimica da emoglobina libera nel plasma nella chimica clinica tradizionale comprendono il cambio di reagente/i, la misura del bianco e la modifica della lunghezza d'onda di misura o dei tempi di misura (12). Tutti questi metodi portano svantaggi e limitazioni specifiche, quali costi sproporzionati o prolungamento eccessivo del tempo misura, l’applicabilità o meno a seconda delle strumentazioni e valori di assorbanza che superano le capacità di lettura dello spettrofotometro.

Descrizione dell’invenzione

Si à ̈ ora trovato un metodo per la determinazione dell’attività di alfaamilasi che risente in misura significativamente inferiore rispetto ai test convenzionali dell’interferenza prodotta dall’emoglobina eventualmente presente nel campione biologico. Questo risultato à ̈ stato ottenuto sottoponendo il campione biologico a un passaggio preliminare di ossidazione dell’ossiemoglobina a met-emoglobina o in alternativa attraverso la formazione di un complesso con il monossido di carbonio, prevenendone così l’interferenza con lo spettro di assorbimento durante l’esecuzione del saggio colorimetrico.

Specificamente l’invenzione riguarda un metodo per la determinazione dell’attività di alfa-amilasi in un campione di fluido biologico contenente emoglobina, mediante saggio colorimetrico comprendente:

i) aggiunta al campione di fluido biologico di un agente ossidante in grado di ossidare l’ossiemoglobina a met-emoglobina;

o in alternativa

ii) aggiunta di monossido di carbonio in modo da formare il complesso carbomonossiemoglobina;

e

iii) successiva aggiunta al campione di un substrato di alfa amilasi recante un gruppo cromoforo che viene liberato dall’attività enzimatica dell’alfa amilasi stessa, generando una variazione di assorbanza in un intervallo di tempo prestabilito, ovvero un intervallo di tempo in cui la reazione produca una variazione di assorbanza lineare;

iv) determinazione dell’assorbanza generata dal campione nell’intervallo di tempo prestabilito e quindi del valore di attività di alfa amilasi mediante interpolazione di una curva standard di riferimento precedentemente ottenuta con quantità note di alfa amilasi.

L’emoglobina presente nel campione biologico può essere in forma libera, eventualmente coniugata con polietilenglicole o trattata con agenti che formano complessi polimerici, oppure à ̈ contenuta all’interno degli eritrociti.

Per migliorare l'attività dell’amilasi, il tiocianato di potassio à ̈ aggiunto alla miscela del saggio come agente caotropico per aumentare la solubilità di molecole apolari e, quindi, la velocità di reazione.

L’agente ossidante à ̈ preferibilmente scelto tra sodio nitrito e ferricianuro di potassio. Il primo, maggiormente preferito, à ̈ generalmente aggiunto a una concentrazione di 10 mM e a pH 6. La concentrazione di sodio nitrito o di ferricianuro di potassio o altro reagente ossidante necessario dipende dal tempo di incubazione prima del mescolamento con il substrato cromoforico dell’alfa amilasi. Il pH della soluzione può essere variato rispetto a pH 6, considerando che la diminuzione del pH aumenta la velocità di ossidazione, e che la reazione di ossidazione sia completata prima del mescolamento con il substrato cromoforico dell’alfa amilasi. Analogamente, la concentrazione di ossidante può variare a seconda del tempo di incubazione, considerando che un aumento di concentrazione del reagente ossidante aumenta la velocità di reazione.

Il nitrito di sodio à ̈ noto reagire con ossiemoglobina per dare metemoglobina e nitrato come prodotti finali. In questo modo si sfrutta l’attività nitrito diossigenasica della ossiemoglobina per ottenere met-emoglobina. Con questo approccio, i reagenti ossidanti che sono presenti nei saggi commerciali non convertono ossiemoglobina in met-emoglobina durante la misura cinetica e non causano i cambiamenti di assorbanza concomitanti, che sono la fonte dell’interferenza da emoglobina libera.

Il campione à ̈ generalmente siero o plasma emolizzati, urina o un qualunque fluido biologico contaminato dalla presenza di eritrociti intatti o danneggiati.

I substrati di alfa-amilasi recanti un gruppo cromoforo che viene liberato dall’attività enzimatica dell’enzima includono 2-cloro-4-nitrofenilalfa-D-maltotrioside (CNPG3); 4,6-etilidene (G7)-p-nitrofenil (G1)-a,D-maltoeptaoside (EPS) o p-nitrofenil fosfato (PNP).

Un altro aspetto dell’invenzione si riferisce a un kit per l’esecuzione del metodo qui descritto, comprendente, in contenitori separati, l’agente ossidante e il substrato di alfa-amilasi recante il gruppo cromoforo ed eventualmente soluzioni tampone.

Lo spettro delle potenziali applicazioni cliniche del metodo dell’invenzione à ̈ ampio. In primo luogo, può essere utilizzato per valutare l’α-amilasi nella maggioranza dei campioni in vivo o in campioni emolizzati, con importanti ricadute cliniche, economiche ed organizzative. Inoltre, grazie alla sua robustezza contro l’emolisi (fino a 75 g / L di emoglobina), nonché l’eccellente prestazione analitica, può essere efficacemente utilizzato per misurare l'attività catalitica dell'amilasi nelle urine e molti altri fluidi biologici che sono spesso contaminati dalla presenza di eritrociti intatti o danneggiati, senza la necessità di trattare il campione con centrifugazione o altre procedure complicate per limitare l'interferenza dell'emoglobina. Un'altra applicazione del metodo dell’invenzione riguarda la determinazione di alfaamilasi in pazienti sottoposti a somministrazione di sostituti del sangue basati su emoglobina, in particolare emoglobine coniugate con polietilene glicole (PEG) o trattate con agenti che formano complessi polimerici di emoglobina: questi composti sono infatti noti per produrre un’interferenza negativa sul saggio similmente all’emolisi. Infine, il metodo dell’invenzione finalizzato ad ossidare l’emoglobina a met-emoglobina o a produrre un derivato stabile dell’emoglobina come carbomonossiemoglobina può essere applicato in altri saggi di chimica clinica o immunochimica per limitare o anche diminuire l'interferenza dell'emoglobina per le prove in cui l'origine dell’interferenza non à ̈ biologica, ma piuttosto chimica o spettrofotometrica (ad esempio, nei saggi per la troponina cardiospecifica, acido urico, azoto ureico, calcio, creatinina, bilirubina, lipasi).

L’invenzione verrà ulteriormente illustrata nella parte sperimentale riportata nel seguito e nelle figure qui accluse.

Breve descrizione delle Figure

Figura 1: Grafico di Bland-Altman del nuovo saggio messo a punto per l’α-amilasi rispetto al saggio commerciale Beckman Coulter per α-amilasi. La linea continua tracciata corrisponde alla differenza media, mentre le linee tratteggiate designano il 95% dell’intervallo di confidenza (95% CI).

Figura 2: Rapporto di concentrazione di α-amilasi in campioni emolizzati e non emolizzati, determinati con il nuovo saggio messo a punto con nitrito come ossidante (z) e con il saggio commerciale Beckman-Coulter ({). Le linee sottili designano l’errore totale permesso.

Figura 3: Risultato dello studio con il reattivo messo a punto con nitrito, a confronto con lo stesso saggio condotto con una pre-ossidazione con 1.5 mM di ferricianuro di potassio.

Figura 4: Il legame del monossido di carbonio porta ad un cambiamento dello spettro di assorbimento dell’emoglobina, con diminuzione dell’assorbanza a 405-410 nm, lunghezza d’onda a cui una serie di saggi colorimetrici vengono condotti, rispetto all’ossiemoglobina. Questa diminuzione dell’assorbanza diminuisce anche il contributo di fondo dell’emoglobina ad una data concentrazione, per le misure a 405-410 nm.

Figura 5: Misura a 405 nm della variazione dell’assorbanza nel tempo di un campione contenente emoglobina messo a reagire con il reattivo commerciale Beckman Coulter ( ) a confronto con lo stesso reattivo previamente equilibrato in atmosfera di monossido di carbonio (z) (concentrazione del monossido di carbonio nella soluzione 1 mM).

Parte sperimentale

Descrizione del metodo

Le prestazioni analitiche sia del saggio α-amilasi commerciale che del nuovo saggio sviluppato, sono state valutate sulla piattaforma per chimica clinica AU5822 (Beckman Coulter Inc., Brea CA, USA), una strumentazione completamente automatizzata progettata per l'analisi di chimica generale, il monitoraggio terapeutico, l’abuso di droga, l’analisi delle urine, particolari proteine e saggi sierologici. Una descrizione completa dello strumento e le sue prestazioni sono disponibili (13). Il saggio dell’α-amilasi Beckman Coulter à ̈ un test cinetico colorimetrico che impiega 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotrioside (CNPG3) come substrato. Il substrato reagisce direttamente con l’alfa-amilasi e non richiede la presenza di enzimi ausiliari. Il rilascio di 2-cloro-4-nitrofenolo (CNP) dal substrato e l'aumento di assorbanza a 410 nm risultante à ̈ direttamente proporzionale all'attività enzimatica nel campione. Secondo il produttore, il test à ̈ lineare all'interno di una gamma di attività enzimatica tra 10 e-2000 U/L per il siero e il plasma, e presenta una imprecisione compresa tra 0,8 e 2,0%.

Il test à ̈ un metodo sperimentale colorimetrico in cinetica per la determinazione quantitativa di α- amilasi impiegando 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-maltotrioside (CNPG3) come substrato, con la formulazione identica a quella del reattivo analogo Beckman Coulter. Rispetto a questo saggio, il saggio dell’invenzione comporta un passaggio di pre-incubazione del campione biologico, in cui l’emoglobina acellulare viene completamente ossidata. Il meccanismo per eliminare l'interferenza da emoglobina libera plasmatica nel campione viene attribuita a questa fase di pre-ossidazione in cui la molecola viene convertita a met-emoglobina da 10 mM sodio nitrito, tamponato in 50 mM MES, pH 6, prima di reagire con il substrato cromoforo. Il nitrito di sodio à ̈ noto reagire con ossiemoglobina per dare met-emoglobina e nitrato come prodotti finali. In questo modo si sfrutta l’attività nitrito diossigenasica della ossiemoglobina per ottenere met-emoglobina. Con questo approccio, i reagenti ossidanti che sono presenti nei saggi commerciali non convertono ossiemoglobina in met-emoglobina durante la misura cinetica e non causano i cambiamenti di assorbanza concomitanti, che sono la fonte dell’interferenza da emoglobina libera.

Più specificamente, nel saggio commerciale dell’amilasi, l’analogo di substrato CNGP3 (in 50 mM MES pH 6) à ̈ idrolizzato dall’enzima stesso, generando così un prodotto cromoforico che assorbe a 405-410 nm. Per migliorare l'attività dell’amilasi, il tiocianato di potassio à ̈ presente nella miscela del saggio come agente caotropico per aumentare la solubilità di molecole apolari e, quindi, la velocità di reazione. È noto che, in condizioni acide, il tiocianato viene ossidato a cianuro in presenza di ossiemoglobina, ma non in presenza di met-emoglobina. Queste reazioni sono accompagnate da cambiamenti significativi nello spettro di assorbimento dell’emoglobina nell’intervallo 400-450 nm, così come fino a circa 700 nm. Poiché l’analogo di substrato dell’amilasi CNGP3 viene idrolizzato per generare un cromoforo prodotto che assorbe a 405 nm, l’intervallo spettrale e le cinetiche delle due reazioni (ossidazione dell’emoglobina da parte del tiocianato e formazione del composto idrolizzato) si sovrappongono e sono origine dell'interferenza osservata. Per verificare questa ipotesi, l’ossiemoglobina à ̈ stato aggiunta al reattivo commerciale per l’alfa-amilasi, in assenza di alfa-amilasi, e i cambiamenti spettrali sono stati monitorati con uno spettrofotometro. Lo spettro finale della miscela di reazione risulta essere molto simile a quello della cianomet-emoglobina. Come riportato, il passaggio di pre-ossidazione dell’emoglobina presente nei fluidi biologici la converte ad una forma stabile che non interferisce con il rilevamento del cambiamento di colore sviluppato nel saggio dell’amilasi.

L’interferenza causata dall’ossidazione dell’emoglobina ad opera della soluzione dei saggi commerciali viene similmente rimossa o significativamente ridotta attraverso l’aggiunta di monossido di carbonio alla soluzione del saggio, che da’ immediatamente luogo alla formazione del complesso stabile con l’emoglobina (carbomonossiemoglobina), che risulta essere molto più stabile all’ossidazione rispetto alla ossiemoglobina, e inoltre mostra un minore assorbimento a 405-410 nm, diminuendo il contributo al segnale di fondo.

Studi di imprecisione

Gli studi imprecisione con i test sono stati eseguiti utilizzando tre campioni di siero con differenti concentrazioni di α-amilasi, bassa (45 U / L), intermedia (143 U / L) e alta (270 U / L). L’imprecisione intra-test à ̈ stata valutata in 20 set di misure sequenziali e i risultati sono stati espressi come coefficiente di variazione (CV%).

Linearità

Un campione di siero di routine con α-amilasi a concentrazione di 282 U / L à ̈ stato diluito in serie in rapporti fissi (ad esempio, 1:9, 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 07:03, 8:2; 9:1) con un altro campione di routine siero con alfa-amilasi concentrazione di 45 U / L. Le diluizioni sono state poi valutate con il nuovo saggio messo a punto, in duplice copia, e i valori teorici sono stati calcolati a partire dai risultati della misura sui campioni non diluiti. La linearità à ̈ stata calcolata mediante analisi di regressione lineare e coefficiente di correlazione di Spearman (r).

Studio di confronto

Lo studio di confronto à ̈ stato effettuato su 40 campioni consecutivi di siero di routine casualmente scelti tra quelli indicati per stat test e la visualizzazione di una vasta gamma di valori di α-amilasi. Tutti i campioni sono stati analizzati entro 2 ore dall'arrivo in laboratorio. I risultati del nuovo saggio messo a punto per l’alfa-amilasi sono stati confrontati con quelli ottenuti utilizzando il test Beckman Coulter convenzionale. Il bias à ̈ stato valutato mediante regressione lineare, coefficiente di correlazione di Spearman (r) e analisi di Bland e Altman.

Studio di emolisi

L'interferenza da emoglobina libera plasmatica sul test dell’alfa-amilasi à ̈ stata valutata sia sul nuovo saggio che su quello commerciale. Lo studio à ̈ stato eseguito su 20 campioni prelevati da volontari sani (10 femmine e 10 maschi, età media 45 anni, intervallo 26-57 anni). Il sangue venoso à ̈ stato prelevato da un unico flebotomista esperto nelle prime ore del mattino in tubi sotto vuoto da 6,0 ml, siliconati, senza gel separatore e contenenti 18 U / L di litio eparina (Vacuette, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania), utilizzando un ago con calibro 20, 0.80x19 mm (Greiner Bio-One GmbH). Il sangue coagulato à ̈ stato subito diviso in due aliquote di ~ 3 ml ciascuno. La prima aliquota à ̈ stata immediatamente centrifugata a 1200 x g per 15 min a temperatura ambiente, mentre la seconda à ̈ stata sottoposto a emolisi meccanica secondo un metodo convalidato che à ̈ stato accuratamente descritto altrove (14). Brevemente, il sangue non coagulato à ̈ stato passato 3 volte attraverso un ago di piccolo calibro (30 gauge, 0.3x8 mm), una procedura che à ̈ nota produrre lesioni meccaniche ai globuli rossi così come ai leucociti e alle piastrine (15), e quindi mima in modo molto preciso i campioni emolizzati presenti nei laboratori clinici, piuttosto che la semplice aggiunta ai campioni di preparazioni di emoglobina purificata (16). Dopo questo trattamento, il campione à ̈ stato centrifugato a 1200 x g per 15 min a temperatura ambiente. La concentrazione di emoglobina libera plasmatica à ̈ stata valutata su tutti i campioni emolizzati e non emolizzati per spettrofotometria diretta su un Beckman Coulter DxC (Beckman Coulter, Inc.). La correlazione altamente significativa tra questo metodo e il dosaggio di riferimento della cianomet-emoglobina à ̈ già stata valutata in uno studio precedente (17). La significatività statistica delle differenze tra aliquote à ̈ stata valutata mediante regressione lineare, coefficiente di correlazione di Spearman (r), e il bias à ̈ stato correlato con l'errore totale ammissibile derivato dalla variazione biologica intra e inter-individuale (18).

Statistica

La valutazione statistica à ̈ stata effettuata con Analyse-it per Microsoft Excel (Analyse-it Software Ltd, Leeds, UK). Lo studio à ̈ stato effettuato in accordo con la Dichiarazione di Helsinki e secondo i termini della legislazione locale pertinente.

Risultati

L'imprecisione intra-analisi del nuovo test messo a punto risulta essere tra 1,3 e 2,2% (Tabella), e quindi paragonabile a quella dichiarata dal costruttore per il reagente commerciale. Anche la linearità à ̈ eccellente, come si evince dall'equazione della regressione lineare rilevata in concentrazioni teoriche (y = 1.01x - 5.6, r = 0,998, p <0,001). Un accordo molto significativo à ̈ stata osservato tra le prove (nuovo saggio α-amilasi = 1.06; Beckman Coulter α-amilasi -1; r = 1.00, p <0.001), essendo il bias medio -3,8% (95% CI, -4,7% a - 3,0%) (Figura 1). I risultati dello studio di emolisi sono mostrati nella figura 2. Le concentrazioni di emoglobina libera plasmatica e α-amilasi nei campioni emolizzati sono comprese tra 7,5-75,0 g / L e 50-1150 U / L, rispettivamente. Sebbene una correlazione significativa tra valori nei campioni non emolizzati ed emolizzati sia stata osservata con entrambi i saggi (commerciale e nuovo saggio) (p <0,001), à ̈ stato trovato un accordo maggiore con il nuovo saggio (r = 0,997 contro 0,818). Da notare che rispetto all’errore totale ammissibile derivato dalla variazione biologica intra- ed inter-individuale (cioà ̈, ± 14,6%), nessuna misura supera questa soglia con il nuovo saggio, mentre il limite à ̈ stato superato nella maggior parte dei campioni utilizzando il metodo commerciale (17/20, vale a dire, 85%).

Tabella

Imprecisione intra-saggio sul nuovo saggio messo a punto testato su Beckman Coulter AU5822. I risultati sono espressi come coefficiente di variazione (CV, %).

<Valore>

(U/L)CV

Siero basso 45±1 1.3%

Siero intermedio 143±3 1.7%

Siero alto 270±6 2.2% Bibliografia

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Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione dell’attività di alfa-amilasi in un campione di fluido biologico contenente emoglobina, mediante saggio colorimetrico comprendente: i) aggiunta al campione biologico di un agente ossidante in grado di ossidare l’ossiemoglobina a met-emoglobina; o in alternativa ii) aggiunta di monossido di carbonio in modo da formare il complesso carbomonossiemoglobina; e iii) successiva aggiunta al campione di un substrato di alfa amilasi recante un gruppo cromoforo che viene liberato dall’attività enzimatica dell’alfa amilasi stessa, generando una variazione di assorbanza in un intervallo di tempo prestabilito; iv) determinazione dell’assorbanza generata dal campione nell’intervallo di tempo prestabilito, e quindi dell’attività di alfa amilasi mediante interpolazione di una curva standard di riferimento precedentemente ottenuta con quantità note di alfa amilasi.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui l’emoglobina à ̈ in forma libera, eritrocitaria, coniugata con polietilenglicole o in forma di polimero di emoglobina.
3. 3. Metodo secondo le rivendicazioni 1-2, comprendente inoltre l’aggiunta di tiocianato di potassio nel passaggio iii).
4. 4. Metodo secondo le rivendicazioni 1-3, in cui detto agente ossidante à ̈ scelto tra sodio nitrito e ferricianuro di potassio.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui il sodio nitrito à ̈ presente nel campione di fluido biologico a una concentrazione di 10 mM e a pH 6.
6. 6. Metodo secondo le rivendicazioni 1-5, in cui detto campione di fluido biologico à ̈ scelto tra siero o plasma emolizzati e urina.
7. 7. Metodo secondo le rivendicazioni 1-6, in cui detto substrato di alfa amilasi recante un gruppo cromoforo à ̈ scelto tra 2-cloro-4-nitrofenil-alfa-D-maltotrioside (CNPG3); 4,6-etilidene (G7)-p-nitrofenil (G1)-a,D-maltoeptaoside (EPS) o p-nitrofenil fosfato (PNP).
8. 8. Kit per l’esecuzione del metodo secondo le rivendicazioni precedenti, comprendente, in contenitori separati, l’agente ossidante e il substrato di alfa-amilasi recante il gruppo cromoforo ed eventualmente soluzioni tampone.
9. 9. Uso di (i) un agente ossidante in grado di ossidare ossiemoglobina a met-emoglobina o di (ii) monossido di carbonio in grado di formare con emoglobina il complesso carbomonossiemoglobina, in un saggio colorimetrico dell’attività di alfa amilasi.
10. 10. Uso secondo la rivendicazione 9, dove detto agente ossidante à ̈ scelto tra sodio nitrito e ferricianuro di potassio. Milano, 1° ottobre 2012