ITMI20121676A1 - Metodo per la determinazione del potere ossidante degli idroperossidi plasmatici - Google Patents

Metodo per la determinazione del potere ossidante degli idroperossidi plasmatici Download PDF

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ITMI20121676A1
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Description

“METODO PER LA DETERMINAZIONE DEL POTERE OSSIDANTE DEGLI IDROPEROSSIDI PLASMATICIâ€
Campo dell’invenzione
La presente invenzione concerne un metodo per la determinazione degli idroperossidi plasmatici che rappresentano le principali molecole ossidate dell' e quindi l'espressione indiretta più efficiente dello stress ossidativo (SO) rispetto a tutti gli altri indici in uso, vantaggiosamente offrendo rapidità di valutazione ed un ridotto coefficiente di variazione (CV).
Stato della tecnica
Negli organismi aerobi l'impiego di ossigeno (O2) à ̈ una necessità fondamentale ai fini della normale funzionalità cellulare, la quale si svolge in un'alternanza continua e vitale di processi di ossidazione e riduzione. Il processo di ossidazione à ̈ possibile, come noto, anche senza la presenza di O2 in quanto si basa sulla sottrazione di uno o più elettroni (e<">) a qualsiasi elemento o composto dell'organismo. Comunque provocato, con o senza O2, tale evento determina una modificazione della corteccia elettronica del composto o elemento tale da tradursi essenzialmente in una sua diversa reattività o funzione.
Lo SO può essere generato anche da specie reattive (0 RS) che non sono "centrate" sull'02, ma su altri elementi, quali prevalentemente l'azoto (N), il carbonio (C) e Io zolfo (S). Anche queste specie hanno la capacità di ossidare dei substrati con efficienza simile a quella dei ROS (specie reattive all’ossigeno). Una particolare menzione si deve fare per il monossido di azoto (NO<'>) il quale à ̈ attivamente sintetizzato da diversi sistemi cellulari (in particolare dalle cellule endoteliali) denominati NO-sintetasi o NOS per svolgere una funzione vasodilatatrice, antiaggregante ed anche di trasduzione. Si può notare come esso contenga ossigeno e quindi potrebbe configurarsi come una ROS. La pericolosità potenziale di NO<’>risiede nella sua capacità di reagire con 02<'>a formare ONOO<">, il quale, oltre ad essere un più potente ossidante, tende a trasformarsi in OH<'>, che à ̈ in assoluto l'ossidante più reattivo dell'organismo. Ogni molecola biologica (proteine, lipidi, acidi nucleici, vitamine antiossidanti, etc.), una volta ossidata, ha la capacità di ossidare a sua volta dei substrati comportandosi come RS. Tra queste RS sono di particolar importanza gli idroperossidi di natura lipidica (ma non solo) i quali, una volta ossidati, innescano il processo di propagazione ossidativa, operando da moltiplicatori dello SO.
Essenzialmente, tutte le RS si comportano in modo chimicamente similare e sostanzialmente perdono la funzionalità fisiologica e diventano ossidanti alla stessa stregua dei ROS (Tabella 1 seguente). Gli idroperossidi organici riportati nella Tabella 1 come ROOH si riferiscono a tutti i composti che sono stati combinati con una molecola di O2 e i più frequenti sono dei derivati lipidici, ma anche proteici, saccaridici o acidi nucleici. Pertanto, †̃R’ indica diverse tipologie di composti. Questi idroperossidi hanno la tendenza a reagire con i metalli di transizione (vedi di seguito "reazione di Fenton†) assumendo la forma radicalica (RO<*>oppure ROO'), pertanto hanno notevole potenzialità ossidante.
Tabella 1. Alcuni tra i principali agenti ad azione ossidante per l’organismo umano, definiti in generale come specie reattive (RS) e suddivisi a seconda dell’elemento rappresentativo
Specie reattive dell’ossigeno (ROS)
Specie di natura radicalica Formula Specie di natura non radicalica Formula Ossigeno 0-2Ossigeno singoletto Δ 0 ΣΟ2 Superossido o2- Perossido di idrogeno H202Idrossile OH’ Ozono 03Idroperossile HO2<*>Acido ipoclorico<a>HOCI Percossile RO2<*>Acido ipobromoso HOBr Alcossile RO<*>Idroperossidi organici ROOH Carbonato C03- Ione perossinitrito ONOO<'>Diossido di carbonio C02<*'>Acido perossinitroso<a>ONOOH Specie reattive del cloro (RCIS)
Cloro atomico cr Cloruro di nitrile N02CI Acido ipoclorico<3>HOCI Cloro Cl2Clorammine RNHCI
Specie reattive dell’azoto (RNS)
Ossido d’azoto 0 nitrico NO<*>Acido nitroso HN02Diossido di azoto N02· Acido perossinitroso<3>ONOOH Alchilperossinitriti ROONO Ione perossinitrito<α>ONOO<'>Cloruro di nitrile NO2CI
<a>Alcune specie reattive sono inserite in più di una categoria poiché alcuni attribuiscono il ruolo centrale a elementi diversi del composto. Il puntino in alto a destra (a volte a sinistra) indica la natura di radicale.
Una caratteristica particolare dei processi di ossidazione dei lipidi insaturi à ̈ la propagazione. In presenza di un ossidante (iniziatore), il lipide insaturo (LH) forma un alchilradicale (L<†̃>) e poi in presenza di 02si forma un perossilradicale (LOO·) che propaga la reazione ossidativa come segue:
LH→ L<’>L<’>+ 02→ LOO· LOO· LH → LOOH L<’>
Questo fenomeno comunque à ̈ possibile anche per proteine, acidi nucleici, glucidi. Tali sostanze una volta ossidate alla condizione di radicali, se entrano in contatto con altri composti simili o diversi, trasferiscono la loro condizione ossidativa nel fenomeno di propagazione per il quale si genera una cascata ossidativa, appunto †̃propagazione’, la quale può essere interrotta dagli antiossidanti liposolubili (detti "chain breakes") i cui prototipi sono la vitamina E ed i carotenoidi.
Una volta che si sono formati gli idroperossidi, il loro successivo decadimento a specie reattive a basso peso molecolare, quali malonildialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale (4-HNE), à ̈ impedito dalla barriera antiossidante, in particolare dai cosiddetti antiossidanti circolanti, dei quali l'acido ascorbico à ̈ il principale protagonista.
Il fenomeno di propagazione à ̈ ovviamente dannoso per le membrane cellulari interne ed esterne, ma in particolare per le lipoproteine che sostanzialmente sono delle membrane fosfolipidiche circolanti.
Le lipoproteine essendo circolanti possono trasferire con estrema facilità alle cellule endoteliali (ed in generale a tutti i loro recettori) la condizione ossidativa. Come accennato, anche le proteine ossidate possono il svolgere un ruolo propagativo, il quale sostanzialmente à ̈ indirizzato a ripercuotersi sui glicerofosfolipidi (PL), che appartengono sia alle strutture circolanti (cellule, piastrine, lipoproteine) sia alle strutture stanziali come le cellule endoteliali.
Pertanto, emerge ancora una volta l'importanza del ruolo degli idroperossidi come markers estremamente sensibili dello SO, precoci rispetto alle aldeidi reattive (MDA, acroleina, 4-HNE ecc.) che sono espressione della demolizione delle macromolecole biologiche (lipidi, pproteine, DNA ecc.) conseguente alla mancanza di "tamponamento antiossidante".
Da moltissimo tempo i ricercatori cercano di mettere a punto un metodo che possa consentire una valutazione della condizione di SO.
Il sistema ESR (electric spin resonance) che capta le specie reattive non à ̈ applicabile come test di routine per la complessità di determinazione.
L'uso di resine che catturano le ROS non à ̈ applicabile, in quanto queste dovrebbero essere somministrate, la qual cosa à ̈ possibile negli animali sperimentali, ma non nell'uomo a causa della loro tossicità.
Pertanto, per la valutazione dei ROS, i ricercatori si sono rivolti a sistemi di derivatizzazione che consentano la determinazione di sostanze endogene che sono state modificate dalla presenza di ROS (Tabella 2 seguente).
Tabella 2. Alcuni dei metodi principali utilizzati per la misurazione dello SO.
Tipo di metodo Derivato
DNA deossiribonucleico
SPC Proteine carbonilate
LPH Idroperossidi lipidici
TBARS reattivi all'acido tiobarbitutico LNO nitrolinoleati
MDA malonildialdeide
4-HNE 4-idrossinonenale
IsoPs F /D /E2/isoprostani
NeuroPs F /F isoprostani
H 0 Perossido di idrogeno
BH Idrocarburi respiratori
ONOO<'>* perossi nitrito
PTN* Alfa-fenil-N-tert-butiltirone
AHS* Idrossilazione aromatica del salicilato
* metodi tipo "spin trap" che implicano la somministrazione di resine o sostanze potenzialmente molto tossiche
Molti di questi tests sono basati sull'uso di sostanze "spin trap" che non sono ammesse per uso umano. Altri metodi sono estremamente lunghi e dispendiosi quindi utilizzabili esclusivamente ai fini di ricerca, ma non per valutazioni di monitoraggio che implicano tests semplici e poco costosi.
Di fatto nella letteratura medica, i metodi più utilizzati riguardano l'analisi dei TBARS, della MDA, delle 4-HNE, degli isoprotani urinari (F2), delle proteine carbonilate, del DNA ossidato ed infine degli idroperossidi.
Ogni metodo ha le sue limitazioni: ad esempio l’analisi dei TBARS, della MDA e delle 4-HNE sono indicatori che emergono quando le riserve circolanti sono esaurite e pertanto non sono indicatori precoci. In altri termini, quando sono alterati si à ̈ chiaramente in uno stato patologico e quindi non consentono di fare diagnosi precoce.
L'analisi degli isoprostani, delle proteine carbonilate, del DNA e degli idroperossidi possono invece avere valenza precoce di diagnosi di malattia e si prestano anche al monitoraggio della condizione patologica segnalando con la loro dimensione (aumentata o ridotta) eventuali miglioramenti o peggioramenti.
Di fatto à ̈ quest'ultima condizione che serve per il monitoraggio della condizione clinica di una determinata malattia. Ovvero, à ̈ importante poter disporre di un test sensibile alle variazioni dello stato patologico.
La dimensione dello SO, comunque misurata, non consente di fare diagnosi sul tipo di patologia, ma serve per dare una dimensione dello "stato di gravità" della malattia.
Per questi motivi diventa importante che un test sia caratterizzato da bassi coefficienti di variazione ovvero di limitate oscillazioni dei valori nei soggetti affetti da un grado di malattia simile.
In tali condizioni, il marker che si modifica in modo più omogeneo (ovvero con variazioni interindividuali più ridotte) si può ritenere quello più affidabile.
Questo tipo di esperienza à ̈ stata svolta mettendo a confronto i markers più utilizzati, ovvero isoprostani, proteine carbonilate, DNA ossidato e idroperossidi controllando le loro modificazioni a confronto con un indice di infiammazione, la proteina C reattiva.
Da questa esperienza [Cornelli U, Beicaro G, Fineo A. The oxidative stress balance measured with different markers, following a single orai antioxidant supplement or a diet poor of antioxidants. JCDA 2011;1:64-70], à ̈ emerso che gli idroperossidi sono i primi ad essere modificati e sono quelli con variazioni interindividuali più limitate.
In tal senso, esiste in commercio il test denominato †̃d-ROMs’, come da brevetto europeo EP0783692, che si basa sulla radicalizzazione degli idroperossidi ematici da parte del Fe<2+>attraverso la reazione di Fenton. Nella reazione di Fenton, sia il Fe<2+>sia il Fe<3+>reagiscono secondo un andamento ciclico, il Fe<2+>risulta essere però sempre la prima specie a reagire attraverso uno step più rapido rispetto al Fe<3+>, come segue:
Reazione di Fenton
(1) Fe<2+>+ ROOH → Fe<3+>+ RO· OH<'>VELOCE
(2) Fe<3+>+ ROOH → Fe<2+>+ ROO· H<+>LENTA
In tale test, i radicali che si formano attraverso la reazione di Fenton tra Fe<2+>e idroperossidi reagiscono con un cromoforo di formula:
dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>possono essere H, CH3-, C2H5- oppure alogenuro; tale cromoforo si radicalizza a sua volta ed assume colorazione in proporzione alla concentrazione di radicali, che può essere rilevata fotometricamente a 505 nm. Tale reazione impiega non meno di 5 minuti.
Lo scopo della presente invenzione à ̈ migliorare il test di cui sopra, in particolare in termini di rapidità di ottenimento dell’esito, precisione, accuratezza, ripetibilità e specificità nella determinazione del potere ossidativo e del livello degli idroperossidi nel plasma.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Tale scopo à ̈ stato raggiunto mediante un metodo per la determinazione del potere ossidante degli idroperossidi plasmatici, come riportato in rivendicazione 1.
Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un kit per l’implementazione del metodo di cui sopra come da rivendicazione 10.
DESCRIZIONE DELLA FIGURA
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata, dagli Esempi realizzativi forniti a titolo illustrativo e non limitativo ed all’annessa Figura 1 in cui à ̈ riportata la cinetica delle reazioni alla base del metodo dell'invenzione e del d-ROMs (media di 3 determinazioni su campione di plasma umano), come da Esempio 6.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
L’invenzione dunque riguarda un metodo per la determinazione del potere ossidante degli idroperossidi plasmatici comprendente le fasi di:
i) fornire una soluzione A acquosa comprendente acido solforico ed un agente cromoforo di formula (I)
R1
\ N
R2 /
(I)
o suo sale, dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>sono, indipendentemente l’uno dall’altro, H, -CH3, -C2H5oppure alogenuro;
ii) fornire una soluzione B acquosa comprendente acido acetico, idrossido di metallo alcalino o alcalino-terroso, sale di Fe(ll) ed ioduro;
iii) fornire un campione di plasma;
iv) unire la soluzione A, la soluzione B ed il campione e misurare l’assorbanza della miscela risultante a to e a ti, in cui to à ̈ da 1 a 3 secondi e ti à ̈ da 1 ,50 a 2,30 minuti dalla preparazione della miscela; e
v) sottrarre l’assorbanza a to dall’assorbanza a t-i, ottenendo il valore del potere ossidante degli idroperossidi nel campione in esame in termini di concentrazione di equivalenti di H2O2, secondo la legge di Lambert-Beer. In riferimento alla reazione di Fenton sopra citata, nel presente metodo dell’invenzione, à ̈ solo la specie Fe<2+>a reagire velocemente con gli idroperossidi (ROOH) e di conseguenza à ̈ la specie responsabile della riduzione dei tempi di reazione. Quest'ultimo obiettivo à ̈ stato raggiunto aggiungendo un opportuno agente riducente, ossia lo ioduro, alla miscela del metodo dell'invenzione. Lo ioduro, reagendo rapidamente con il Fe<3+>, porta alla formazione di Fe<2+>, senza interagire direttamente con la componente idroperossidica in soluzione. La reazione di Fenton modificata secondo il metodo dell’invenzione à ̈ riportata di seguito:
Reazione di Fenton modificata secondo il metodo dell'invenzione
(1) Fe<2+>+ ROOH → Fe<3+>+ RO· OH<'>VELOCE
(2) Fe<3+>+ RED → Fe<2+>+ ROO· H<+>VELOCE
In tali condizioni operative, la concentrazione di Fe<2+>à ̈ controllata e costante nella reazione; ciò permette di evitare la diminuzione della velocità di reazione dovuta alla riduzione della concentrazione del reagente coinvolto nella reazione limitante la velocità di reazione. Infatti, lo ioduro, reagendo rapidamente con il Fe<3+>porta alla formazione di Fe<2+>, senza interagire direttamente con la componente idroperossidica in soluzione. Questo effetto à ̈ significativo quando reagiscono grosse quantità di Fe<2+>segnatamente quindi a valori elevati di U.Carr. L’effetto ottenuto quindi à ̈ duplice: da un lato consente di ottenere un aumento della velocità di reazione proporzionale all'aumento della quantità di Fe<2+>, mentre dall’altro consente di estendere l'intervallo di linearità verso l'alto. Un altro effetto inaspettatamente riscontrato à ̈ stata la significativa diminuzione del coefficiente di variazione relativo a ai replicati analitici quando sono eseguite un numero di prove pari o superiori a 5.
L'accelerazione e la stabilizzazione di tale reazione à ̈ stata quindi soprendentemente raggiunta mediante un’opportuna combinazione di reagenti come sopra riportato. Tale combinazione consente la piena utilizzazione del Fe<2+>nella reazione con il cromoforo, che, come detto, si radicalizza a sua volta ed assume colorazione in proporzione alla concentrazione di radicali, che può essere rilevata fotometricamente a 505 nm, e consente l’eliminazione di alcuni passaggi manuali. Tale obiettivo à ̈ stato raggiunto mediante l'aggiunta di un agente stabilizzante dello stato di ossidazione del ferro, ossia lo ioduro. Tali reagenti hanno sorprendentemente consentito di ridurre i tempi di esecuzione del test, in quanto la reazione modificata si svolge nel tempo di 2 minuti invece degli almeno 5 minuti necessari per ottenere il medesimo risultato con il test noto, quindi vantaggiosamente con una riduzione percentuale di tempo del 60%.
Inoltre, il metodo dell’invenzione ha portato ad ottenere un intervallo di linearità più esteso 50 - 600 U.Carr, dove le U.Carr. rappresentano un metodo per il calcolo del potere ossidante piasmatico (concentrazione ematica di idroperossidi), dove 1 U.Carr corrisponde a 0.08 mg/dL di H2O2.
In aggiunta, l’invenzione vantaggiosamente consente di impiegare una soluzione di siero di controllo come campione “standard" per il controllo di qualità dei reagenti.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il cromoforo à ̈ fornito in forma condensata, dove per †̃condensata’ si intende che la soluzione acquosa in cui à ̈ disciolto il cromoforo à ̈ lasciata evaporare fino a secchezza. Ciò consente vantaggiosamente una maggiore stabilità e la riduzione drastica dei passaggi manuali, invece previsti dal test noto.
Preferibilmente, detto agente cromoforo à ̈ p-N,N-dietilfenilendiammina o suo sale. Adatti sali del cromoforo sono solfato, ossalato, fumarato, cloruro, fosfato, nitrato e loro miscela.
Adatti sali di Fe(ll) sono cloruro, clorato, ammonio solfato, solfato, solfuro, fosfato, nitrato, acetato, succinato, fumarato, gluconato, lattato e loro miscela. Preferibilmente, detto sale di Fe(ll) Ã ̈ solfato.
Adatto ioduro à ̈ ioduro di potassio, ioduro di sodio, ioduro di calcio e ioduro di magnesio e loro miscela. Preferibilmente, detto ioduro à ̈ ioduro di potassio.
Preferibilmente, detto idrossido di metallo alcalino 0 alcalino-terroso à ̈ idrossido di potassio, sodio, calcio, magnesio o loro miscela.
In dette soluzioni acquose, il solvente à ̈ acqua, preferibilmente demineralizzata o deionizzata.
Preferibilmente, detto cromoforo à ̈ in concentrazione da 0,19 a 0,57 mol/l nella soluzione A acquosa, più preferibilmente da 0,30 a 0,45 mol/l. Preferibilmente, detto cromoforo à ̈ in concentrazione da 0,0072 a 0,22 mol/l nella miscela risultante nella fase iv).
Preferibilmente, l’acido solforico à ̈ in concentrazione da 0,17 a 0,53 mol/l nella soluzione A acquosa, più preferibilmente da 0,20 a 0,40 mol/l. Preferibilmente, l’acido solforico à ̈ in concentrazione da 0,0064 a 0,20 mol/l nella miscela risultante nella fase iv).
Preferibilmente, il Fe(ll) à ̈ in concentrazione da 0,00035 a 0,029 mol/l nella soluzione B acquosa, più preferibilmente da 0,001 a 0,01 mol/l. Preferibilmente, il Fe(ll) à ̈ in concentrazione da 0,00033 a 0,027 mol/l nella miscela risultante nella fase iv).
Preferibilmente, lo ioduro à ̈ in concentrazione da 0,00018 a 0,027 mol/l nella soluzione B acquosa, più preferibilmente da 0,001 a 0,01 mol/l. Preferibilmente, lo ioduro à ̈ in concentrazione da 0,00017 a 0,026 mol/l nella miscela risultante nella fase iv).
Preferibilmente, l’acido acetico à ̈ in concentrazione da 0,17 a 0,35 mol/l nella soluzione B acquosa, più preferibilmente da 0,20 a 0,30 mol/l. Preferibilmente, l’acido acetico à ̈ in concentrazione da 0,16 a 0,33 mol/l nella miscela risultante nella fase iv).
Secondo una forma di realizzazione preferita, nella soluzione A acquosa detto cromoforo à ̈ in concentrazione da 0,19 a 0,57 mol/l, l’acido solforico à ̈ in concentrazione da 0,17 a 0,53 mol/l, e nella soluzione B acquosa il Fe(ll) à ̈ in concentrazione da 0,00035 a 0,029 mol/l, lo ioduro à ̈ in concentrazione da 0,00018 a 0,027 mol/l, e l’acido acetico à ̈ in concentrazione da 0,17 a 0,35 mol/l. Secondo una forma di realizzazione preferita, la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina o suo sale in concentrazione di 0,3797 mol/l, acido solforico in concentrazione di 0,3526-0,3637 mol/l sul peso della soluzione A, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in concentrazione di 0,2601 mol/l, ioduro in concentrazione di 0,0090 mol/l, acido acetico in concentrazione di 0,015 mol/l, ed idrossido di sodio in concentrazione di 0,1875 mol/l, sul peso della soluzione B.
Risulta altresì preferita la forma di realizzazione in cui la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina o suo sale in quantità di 2-6 mg, acido solforico in quantità di 0,4-1 ,2 mi, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in quantità di 0,1-8 pi, ioduro in quantità di 0,1-1, 5 pi, acido acetico in quantità di 0,01-0,02 mi, ed idrossido di sodio in quantità di 5-8 mg.
Ulteriormente preferita à ̈ la forma di realizzazione in cui la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina 0 suo sale in quantità di 4 mg, acido solforico in quantità di 0,8 mi, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in quantità di 0,5 pi, ioduro in quantità di 0,5 Î1⁄4l, acido acetico in quantità di 0,015 mi, ed idrossido di sodio in quantità di 7,5 mg.
Preferibilmente, il metodo dell’invenzione impiega 10 Î1⁄4Ι di campione di plasma, 40 Î1⁄4Ι di soluzione A acquosa, e 1000 Î1⁄4Ι di soluzione B acquosa.
Secondo un’altra forma di realizzazione, la soluzione A acquosa consiste in acqua, acido solforico ed un agente cromoforo di formula (I)
/ W
(I)
o suo sale, dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>sono, indipendentemente l’uno dall’altro, H, -CH3, -C2H5oppure alogenuro; e
la soluzione B acquosa consiste in acqua, acido acetico, idrossido di metallo alcalino o alcalino-terroso, sale di Fe(ll) ed ioduro.
Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un kit per l'implementazione del metodo di cui sopra, comprendente:
a) almeno un contenitore comprendente un agente cromoforo di formula (I)
(I)
o suo sale, dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>sono, indipendentemente l’uno dall’altro, H, -CH3, -C2H5oppure alogenuro,
b) almeno un contenitore comprendente sale di Fe(ll) ed ioduro; ed
c) un foglietto illustrativo comprendente le istruzioni per l’effettuazione della determinazione del potere ossidante degli idroperossidi.
Preferibilmente, detto cromoforo à ̈ presente nel contenitore a) del kit in forma condensata.
È da intendersi che tutti gli aspetti identificati come preferiti e vantaggiosi per il metodo dell'invenzione, sono da ritenersi analogamente preferiti e vantaggiosi anche per il kit per l'implementazione dello stesso.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo e non limitativo.
ESEMPI
Esempio 1. Metodo per la determinazione della concentrazione piasmatica di idroperossidi secondo la presente invenzione a confronto con il test d-ROMs noto I reagenti che sono stati preparati secondo il metodo della presente invenzione sono riportati di seguito:
Concentrazione
Reagenti dell’invenzione Quantità Volume [moli/l]
Campione di
plasma 10 pi p-N,N-dietilfenilendiammina
condensata 0,3797 4 mg Soluzione (1) 40 pi Acido solforico (95-98%) 0,3526-0,3637 0.8 mL Acqua demineralizzata q.b. a volume
Acido acetico 0,2601 0.015 mL NaOH 0,1875 7.5 mg Soluzione (2) Ferro (II) 0,0018 5 pL 1000 pi Ioduro 0,0090 0.05 pL Acqua demineralizzata q.b. a volume
Totale 1050 pi
La soluzione acida di ammina (1) era introdotta in una cuvetta per l’analisi spettrofotometrica UV-Vis. Tale cuvetta era già preparata con una massa pari a 40Î1⁄4Ι di p-NN-dietilfenilendiammina in precedenza condensata (parte del processo produttivo) per evaporazione. Successivamente, era aggiunto nella soluzione (2) il campione biologico con un volume pari a 10Î1⁄4Ι. La soluzione così formata era introdotta nella cuvetta contenente la soluzione (1), generando così la colorazione da trasparente a rosa, la cui intensità era proporzionale alla presenza di idroperossidi che avevano reagito con l’ammina. La lettura dell'assorbanza veniva effettuata allo spettrofotometro dopo 2 secondi e successivamente dopo 2 minuti utilizzando una lunghezza d’onda pari a 505 nm.
La differenza tra la seconda e la prima lettura di assorbanza consente, mediante la legge di Lambert-Beer, di ricavare la concentrazione in termini di U.Carr. (dove 1 U.Carr. corrisponde a 0.08 mg/dL di H202in soluzione acquosa), impiegata come standard di riferimento e quindi del potere ossidante del campione in esame secondo il seguente algoritmo:
Y= [( log S, - log S2)* - ]
dove S-i= segnale ottico 1° misura; S2= segnale ottico 2° misura
Kfj= K factor interno pari a 13000; Kf= Kfactor del kit
Per rendere il più possible significativo il confronto con il test d-ROMs noto, sono stati selezionati i seguenti reagenti, in cui il Fe(ll) à ̈ nella quantità indicata dal test d-ROMs stesso:
Reagenti secondo il test d-ROMs Quantità Volume Campione di
10 pi plasma
p-N,N-dietilfenilendiammina 4 mg
Soluzione (1) 40 Î1⁄4Ι Acido solforico (95-98%) 0.8 mL
Acido acetico 0.015 mL Soluzione (2) NaOH 7.5 mg 1000 Î1⁄4Ι Ferro (II) 0.05 Î1⁄4L
Totale 1050 Î1⁄4Ι
I campioni di plasma umano analizzati confrontando il test d-ROMs ed il metodo dell’invenzione sono riportati nella Tabella 3 seguente, utilizzando sempre lo stesso campione per 10 determinazioni in sequenza:
Tabella 3.
Prova d-ROMs Metodo dell’invenzione
1 235 238
2 245 250
3 238 246
4 267 235
5 244 245
6 245 239
7 241 245
8 242 250
9 229 242
10 242 237
M 242,8 242,7
Ds 9,86 5,33
Si può osservare come i valori medi siano identici nelle due serie di determinazioni mentre i coefficienti di variazione (CV) siano inferiori del 45 % nel metodo dell'invenzione rispetto al test d-ROMs. Si ritiene che la riduzione della varianza sia dovuta all'impiego del cromogeno condensato che riduce possibili errori di manualità nel dosaggio del cromogeno che nel metodo originale avveniva attraverso l'aggiunta manuale di una "goccia" di reattivo la cui entità poteva oscillare tre 35 e 45 Î1⁄4L.
Esempio 2. Metodo dell'invenzione su siero ricostituito
È stato anche impiegato un siero di controllo bifasico (siero in polvere e acqua demineralizzata), in ragione del suo contenuto noto in idroperossidi e soprattutto della sua stabilità a lungo termine in soluzione acquosa una volta ricostituito, si à ̈ ritenuto potesse essere lo standard di riferimento per il metodo dell'invenzione. In altri termini, il siero di controllo può essere utilizzato per testare l’esattezza della misurazione del contenuto in idroperossidi di un campione biologico.
Allo scopo erano effettuate 10 prove consecutive, utilizzando 10 pL di siero di controllo ricostituito secondo metodica standard e aggiunti alla soluzione di reazione del metodo dell'invenzione.
Il valore medio di riferimento atteso era di 150 ± 10% U.Carr. e il valore medio ottenuto con il metodo dell'infezione era di 161 ± 6% U.Carr.
Pertanto, in confronto al metodo standard si osserva che con il metodo oggetto dell'invenzione si confermava ancora una riduzione del CV. Circa la differenza media osservata (161 Vs 150), il metodo dell'invenzione à ̈ nel range di variazione del metodo standard che tuttavia, come accennato in precedenza, ha una più limitata precisione nella misura, in ragione della misura non precisa del cromogeno la cui quntità poteva oscillare tra 35 e 45 Î1⁄4L.
Esempio 3. Linearità del metodo della presente invenzione
Lo scopo dell’Esempio era dimostrare la linearità del metodo dell’invenzione tra i valori 50 e 600 U.Carr.. Le letture venivano effettuate per via fotometrica a lunghezza d’onda fissa di 505 nm, secondo la procedura del metodo dell’invenzione in precenza descritto.
Per sviluppare la curva di taratura sono stati utilizzati sia campioni di siero di controllo (plasma liofilizzato) sia campioni di plasma da pazienti sani.
L'impiego di due diversi tipi di plasma ha permesso di determinare una perfetta corrispondenza dei valori indipendentemente dal tipo di campione usato (liofilizzato o fresco).
Il siero di controllo à ̈ stato fortificato con soluzioni a concentrazione nota di t-butilidroperossido (t-BHP), usato come fonte di idroperossidi. Sono state preparate differenti soluzioni di t-BHP, ottenute diluendo (1:4; 1:5; 1:10; 1:25) con acqua demineralizzata una soluzione di t-BHP concentrata (0.039 moli/L). Sono state preparate 3 diverse soluzioni stock di t-BHP.
Le determinazioni erano svolte in numero di 3 per ciascuna diluizione di ogni soluzione di t-BHP, operando la misura con successioni diverse (concentrazioni crescenti e decrescenti) (Tabella 4). Tutte le misure erano effettuate a temperatura controllata (25°C).
Tabella 4. Linearità d-ROMs fast con siero di controllo tBHP
Campioni
mmol/L di tBHP
Siero U.Carr.
t-BHP aggiunto
controllo
5 pi 0 0 74
5 pi 10 Î1⁄4Ι dii 1:4 9,75 430
5 Î1⁄4] 10 Î1⁄4Ι dii 1:5 7,8 372
5 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:10 3,9 202
5 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:25 1,56 110
Come si può osservare dalla disamina dei dati riportati in Tabella 4, la curva di taratura à ̈ perfettamente lineare, sino a valori di 400 U.Carr. (y=38,229x+61,672; R<2>=0,9947).
Il plasma umano à ̈ stato anch’esso fortificato con soluzioni a concentrazione nota di t-butil-idroperossido (t-BHP), usato come fonte di idroperossidi. Sono state preparate differenti soluzioni di t-BHP, ottenute diluendo (1:4; 1:5; 1:10; 1:25) con acqua demineralizzata una soluzione di t-BHP concentrata (0.039 moli/L).
Sono state preparate 3 diverse soluzioni stock di t-BHP. Le determinazioni erano svolte in numero di 3 per ciascuna diluizione di ogni soluzione di t-BHP, operando la misura con successioni diverse (concentrazioni crescenti e decrescenti) (Tabella 5). Tutte le misure erano effettuate a temperatura controllata (25°C).
Come si può osservare dalla disamina dei dati riportati in Tabella 5, la curva di taratura à ̈ perfettamente lineare, sino a valori di 580 U.Carr. (y=38,855x+207,39; R<2>=0,9951).
Tabella 5. Linearità del metodo dell’invenzione con plasma umano tBHP
Campioni mmoI/L di tBHP
U.Carr.
Plasma umano t-BHP aggiunto
10 Î1⁄4Ι 0 0 222
10 pi 10 Î1⁄4Ι dii 1:4 9,75 586
10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:5 7,8 517
10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:10 3,9 352
10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:25 1,56 254
Al fine di confermare i dati di linearità del metodo dell'invenzione à ̈ stato eseguito un terzo esperimento. In tale prova, si sono modificati i volumi di siero di controllo (a concentrazione nota) aggiunti alla miscela di reazione. I volumi impiegati sono stati di 5 Î1⁄4Ι, 10 Î1⁄4i, 20 pi e 30 Î1⁄4Ι di siero di controllo ricostituito il cui valore di riferimento per 20 Î1⁄4Ι pari a 300 ± 10 % U.Carr.. Le prove sono state effettuate in numero di 5 per ogni volume impiegato (Tabella 6). Questa prova ha consentito di confermare le prestazioni del metodo sia in termini di linearità che di robustezza nei confronti del possibile effetto matrice dovuto al siero.
Tabella 6. Linearità del metodo dell’invenzione con siero di controllo aggiunto a diversi volumi (valore medio di 3 misure)
Volume di siero Valore Atteso Valore ottenuto Δ%
aggiunto U.Carr U.Carr
5 pi 75 77 3% 10 pi 150 147 4% 20 pi 300 321 1% 30 pi 450 465 2%
Come si può osservare dalla disamina dei dati riportati in Tabella 6, la curva di taratura à ̈ perfettamente lineare (y=15,939x- 5,5085; R<2>=0,9989).
I dati ottenuti evidenziano un eguale comportamento del metodo dell’invenzione nei confronti sia di campioni standard di riferimento (siero di controllo) sia di campioni biologici (plasma umano). Ne risulta che l’impiego di siero di controllo e di plasma umano in esperimenti paralleli ha permesso di determinare la linearità del metodo dell’invenzione nel range 50-600 U.Carr. in quanto le rette di taratura ottenute presentavano la medesima pendenza (rispettivamente 38,855 per la retta con il siero di controllo e 38,855 per la retta con il plasma umano).
Esempio 4. La selezione dell’agente riducente adatto
La selezione dell’adatto agente riducente à ̈ stata condotta su numerosi composti per valutare la capacità di stabilizzare la maggiore quantità di specie Fe<2+>, specie rilevante per il controllo della velocità della reazione. Infatti, l’agente riducente adatto, reagendo rapidamente con il Fe<3+>, avrebbe indotto la formazione di Fe<2+>, senza interagire direttamente con la componente idroperossidica in soluzione. Tra i composti esaminati, si riportano i seguenti agenti riducenti:
- NH2OH (idrossilammina);
- Na2S03(solfito di sodio);
- Na2S04(solfato di sodio); e
- Kl (ioduro di potassio).
Tutti gli agenti riducenti sono stati aggiunti a concentrazioni identiche.
Dalle prove effettuate à ̈ emerso che sia l'idrossilammina sia i sali di zolfo interferiscono con la determinazione degli idroperossidi. L’idrossilammina, infatti, interferisce con l’andamento della reazione del metodo dell’invenzione favorendo reazioni secondarie e producendo composti colorati (gialli) che impediscono la lettura fotometrica alla lunghezza d’onda di 505 nm, inficiando la reazione colorimetrica del metodo dell'invenzione. I sali di zolfo inducono invece una inibizione della reazione alla base del metodo dell'invenzione.
Sorprendentemente, lo ioduro si à ̈ mostrato essere l'unica tipologia di riducente che non interferiva con la successiva determinazione degli idroperossidi, ma, al contrario, riduceva i limiti di variabilità mantenendo i coefficienti di variazione tra 1% e 2% in confronto con la reazione svolta in assenza di ioduro che invece si quotava con CV 8 %. Sorprendentemente, à ̈ stata confermata l’assenza di interferenza del riducente ioduro con la reazione indipendentemente dalla quantità usata (Tabella 7).
Tabella 7. Effetto di differenti riducenti sulla reazione
Segnale
CV%
Valore atteso 150 U.Carr.
controllo 153 8% Kl
9 pmol/L 153 2% 45 pmol/L 154 1% 90 pmol/L 147 2 % NH2OH
9 pmol/L 38 12% Na2S03
9 pmol/L 0 Nv Na2S04
9 pmol/L 0 Nv Nv = non valutabile
Esempio 5. Confronto d-ROMs test e metodo dell'invenzione: valutazione su campione di siero di controllo e t-BHP a diversi tempi di reazione.
Questo esempio à ̈ stato effettuato per dimostrare che la diversa velocità di reazione del metodo dell'invenzione non modifica l'esattezza della determinazione degli idroperossidi in un campione di siero di controllo a concentrazione nota.
Il plasma umano à ̈ stato fortificato con soluzioni a concentrazione nota di t-butilidroperossido (t-BHP), usato come fonte di idroperossidi. Sono state preparate differenti soluzioni di t-BHP, ottenute diluendo (1:2; 1:5; 1:10) con acqua demineralizzata una soluzione di t-BHP concentrata (0.039 moli/L). Sono state preparate 3 diverse soluzioni stock di t-BHP.
Le determinazioni erano svolte in numero di 3 per ciascuna diluizione di ogni soluzione di t-BHP, operando la misura con successioni diverse (concentrazioni crescenti e decrescenti) (Tabella 8). Tutte le misure erano effettuate a temperatura controllata (25°C). L’esperienza ha permesso di valutare la corrispondenza dei valori ottenuti con il metodo dell'invenzione a confronto del d-ROMs test, per il quale la reazione impiega 5 minuti.
Tabella 8. Confronto d-ROMs test e metodo dell’invenzione
Campioni mmol/L Metodo
d-ROMs
Plasma tBHP dell’invenzione CV % t-BHP
umano aggiunto U.Carr.
U.Carr.
10 Î1⁄4Ι 0 0 277 280 1 10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:2 9,75 1044 967 5 10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:5 7,8 605 534 9 10 Î1⁄4Ι 10 Î1⁄4Ι dii 1:10 3,9 448 388 8
Come si poteva osservare dalla disamina dei dati riportati in Tabella 8, i valori ottenuti con i due test presentano coefficienti di variazione tra l' 1 e il 9%.
Esempio 6. Cinetica di reazione d-ROMs e metodo dell’invenzione
Al fine di confermare ulteriormente che la velocità di reazione maggiore del metodo dell'invenzione rispetto al d-ROMs test non inficia la determinazione degli idroperossidi, sono state effettuate prove di cinetica (valutazione ogni 15 secondi per 3 minuti) utilizzando un siero di controllo e in 3 diversi campioni biologici (plasma umano).
Le determinazioni erano svolte in numero di 3 per ciascun campione in esame ed hanno restituito lo stesso andamento, seppur con valori di idroperossidi ovviamenti diversi, trattandosi di campioni diversi. Tutte le misure erano effettuate a temperatura controllata (25°C). L’esperienza ha permesso di valutare la corrispondenza dei valori ottenuti con il metodo dell'invenzione a confronto del d-ROMs test, per il quale la reazione impiega 5 minuti. Il contenuto in idroperossidi ottenuto con il metodo dell’invenzione nel tempo di 2 minuti à ̈ lo stesso che viene evidenziato con il d-ROMs nel tempo di 5 minuti. La Figura 1 riporta l'andamento delle due reazioni (metodo dell'invenzione e d-ROMs) in funzione del tempo su campione di plasma umano.
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante il metodo secondo la presente invenzione. In particolare, detto metodo consente di accelerare e stabilizzare la reazione di Fenton mediante l'opportuna combinazione di reagenti come sopra riportato. Tale combinazione consente la piena utilizzazione del Fe<2+>nella reazione con il cromoforo consente di eliminare alcuni passaggi manuali. Tali reagenti hanno sorprendentemente consentito di ridurre i tempi di esecuzione del test, in quanto la reazione modificata si svolge nel tempo di 2 minuti invece degli almeno 5 minuti necessari per ottenere il medesimo risultato con il test noto. Inoltre, il metodo dell’invenzione ha portato ad ottenere un intervallo di linearità più esteso 50 - 600 U.Carr. In aggiunta, l’invenzione vantaggiosamente consente di impiegare una soluzione di siero di controllo come campione “standard" per il controllo di qualità dei reagenti.

Claims (10)

  1. Rivendicazioni 1. Metodo per la determinazione del potere ossidante degli idroperossidi plasmatici comprendente le fasi di: i) fornire una soluzione A acquosa comprendente acido solforico ed un agente cromoforo di formula (I) R1 R3 \ N V \ R2 / X R4 (I) o suo sale, dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>sono, indipendentemente l’uno dall’altro, H, -CH3, -C2H5oppure alogenuro; ii) fornire una soluzione B acquosa comprendente acido acetico, idrossido di metallo alcalino o alcalino-terroso, sale di Fe(ll) ed ioduro; iii) fornire un campione di plasma; iv) unire la soluzione A, la soluzione B ed il campione e misurare l’assorbanza della miscela risultante a t0e a t1, in cui t0à ̈ da 1 a 3 secondi e ti à ̈ da 1,50 a 2,30 minuti dalla preparazione della miscela; e v) sottrarre l’assorbanza a to dall’assorbanza a ti, ottenendo il valore del potere ossidante degli idroperossidi nel campione in esame in termini di concentrazione di equivalenti di H202, secondo la legge di Lambert-Beer.
  2. 2. Il metodo di rivendicazione 1 , in cui detto cromoforo p-N,N-dietilfenilendiammina o suo sale.
  3. 3. Il metodo di rivendicazione 1 o 2, in cui detto ioduro à ̈ ioduro di potassio, ioduro di sodio, ioduro di calcio e ioduro di magnesio o loro miscela.
  4. 4. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detto ioduro à ̈ in concentrazione da 0,00018 a 0,027 mol/l nella soluzione B acquosa, più preferibilmente da 0,001 a 0,01 mol/l.
  5. 5. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto cromoforo à ̈ in concentrazione da 0,19 a 0,57 mol/l nella soluzione A acquosa, più preferibilmente da 0,30 a 0,45 mol/l.
  6. 6. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui il Fe(ll) à ̈ in concentrazione da 0,00035 a 0,029 mol/l nella soluzione B acquosa, più preferibilmente da 0,001 a 0,01 mol/l.
  7. 7. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina 0 suo sale in concentrazione di 0,3797 mol/l, acido solforico in concentrazione di 0,3526-0,3637 mol/l sul peso della soluzione A, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in concentrazione di 0,2601 mol/l, ioduro in concentrazione di 0,0090 mol/l, acido acetico in concentrazione di 0,015 mol/l, ed idrossido di sodio in concentrazione di 0,1875 mol/l, sul peso della soluzione B.
  8. 8. Il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina 0 suo sale in quantità di 2-6 mg, acido solforico in quantità di 0,4-1 ,2 mi, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in quantità di 0,1-8 pi, ioduro in quantità di 0,1-1 ,5 pi, acido acetico in quantità di 0,01-0,02 mi, ed idrossido di sodio in quantità di 5-8 mg.
  9. 9. li metodo di rivendicazione 8, in cui la soluzione A acquosa comprende acqua, p-N,N-dietilfenilendiammina 0 suo sale in quantità di 4 mg, acido solforico in quantità di 0,8 mi, e la soluzione B acquosa comprende acqua, Fe(ll) in quantità di 0,5 pi, ioduro in quantità di 0,5 pi, acido acetico in quantità di 0,015 mi, ed idrossido di sodio in quantità di 7,5 mg.
  10. 10. Kit per l’implementazione del metodo di rivendicazione 1, comprendente: a) almeno un contenitore comprendente un agente cromoforo di formula (I) R1 \ N R2 / R4 (l) o suo sale, dove R<1>, R<2>, R<3>ed R<4>sono, indipendentemente l’uno dall’altro, H, -CH3, -C2H5oppure alogenuro, b) almeno un contenitore comprendente sale di Fe(ll) ed ioduro; ed c) un foglietto illustrativo comprendente le istruzioni per l’effettuazione della determinazione del potere ossidante degli idroperossidi.
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