ITMI20130142A1 - Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati - Google Patents
Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporatiInfo
- Publication number
- ITMI20130142A1 ITMI20130142A1 IT000142A ITMI20130142A ITMI20130142A1 IT MI20130142 A1 ITMI20130142 A1 IT MI20130142A1 IT 000142 A IT000142 A IT 000142A IT MI20130142 A ITMI20130142 A IT MI20130142A IT MI20130142 A1 ITMI20130142 A1 IT MI20130142A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- crm197
- protein
- molecular construct
- multivalent
- saccharide
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 77
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 77
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 76
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 68
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 49
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 45
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 36
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 25
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 25
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 24
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 24
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 24
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 17
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 16
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 13
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 12
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 12
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 7
- -1 MF59 Chemical compound 0.000 claims description 6
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 5
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 5
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 5
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 5
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 claims description 4
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims description 2
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 claims 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 15
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 14
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 12
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 11
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 6
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- CBOIHMRHGLHBPB-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl Chemical compound O[CH2] CBOIHMRHGLHBPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101100456571 Mus musculus Med12 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 229940124959 polyvalent pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical compound CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 2-trimethylsilylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)[Si](C)(C)C HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000798077 Poelagus marjorita Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000008273 hexosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000669 high-field nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229940124731 meningococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical compound [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000012144 step-by-step procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
- A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
Description
“Vaccini glicoconiugati comprendenti unità base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporatiâ€
La presente invenzione si riferisce a nuovi antigeni coniugati esprimenti epitopi multipli pre-determinati e a vaccini glicoconiugati polivalenti nonché a formulazioni contenenti gli stessi. Inoltre, la presente invenzione comprende l’uso di questi vaccini in particolare per la protezione della popolazione pediatrica da infezioni dovute a S.pneumoniae, N.meningitidis e H.influenzae.
I vaccini coniugati sono lo standard di riferimento per misurare il successo odierno dell’immunologia clinica. Fin dall’inizio degli anni ’90, l’avvento di vaccini coniugati per la prevenzione di S.pneumoniae, N.meningitidis e H.influenzae hanno migliorato drasticamente la qualità della vita della popolazione pediatrica nel mondo occidentale. Questo eccezionale successo à ̈ ora esteso ai Paesi del mondo in via di sviluppo grazie al Programma Esteso d’Immunizzazione sponsorizzato dall’ OMS e dai programmi nazionali implementati attraverso l’associazione AMC (Advance Market Commitment) di vari Paesi.
Per esempio, vaccini come il “Prevnar†, presente sui mercati occidentali fin dall’anno 2000 (all’inizio nella formulazione 7-valente e ora in quella 13-valente, entrambe contenenti polisaccaridi di tipospecifico e covalentemente coniugati di S.pneumoniae alla proteina-vettore CRM197) à ̈ oggi raccomandato dall’ OMS a tutti i Paesi del mondo per una campagna di immunizzazione senza precedenti per la protezione della popolazione pediatrica dalle infezioni sistemiche dovute a S.pneumoniae (Malattie Pneumococciche Invasive) che possono culminare con meningiti batteriche acute. Davvero, questa patologia à ̈ ben documentata per avere un’alta percentuale di mortalità perché l’intervallo di tempo del trattamento terapeutico à ̈ ridotto a poche ore dall’inizio dei sintomi, cosicché la strategia razionale da seguire à ̈ la prevenzione e non la terapia della patologia. Poiché la quantità di specie batteriche significativamente rappresentative per le infezioni umane da S.pneumoniae sono molte (fino a 23 specie delle oltre 90 oggi conosciute)e la strategia di usare singoli Ps tipo specifico coniugati a proteine-vettori richiede un dosaggio significativo della proteina-vettore quando la formulazione del vaccino richiede molti antigeni coniugati (es.: 13 o 15 o più se si includono i sierotipi più importanti dal punto di vista epidemiologico indicati dall’OMS per essere antibiotico-resistenti che includono , in accordo alla nomenclatura Danese, i sierotipi 1,2,3,4,5,6A,6B,6C, 7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23 F,33F) la possibilità di ridurre la quantità di proteina-vettore nelle intere formulazioni di coniugati, sta diventando una questione prioritaria.
Infatti, si deve considerare che un bambino ricevente l’immunizzazione con i vaccini coniugati di H.influenzae (un coniugato tipo-specifico del Ps tipo b), N.meningitidis (quattro coniugati Ps gruppospecifici A,C,W135 and Y) e S.pneumoniae (fino a 13 coniugati tipo-specifici dei Ps tipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F Ps) per la prevenzione di Malattie Pneumococciche Invasive (IPD), viene iniettato con diciotto antigeni coniugati che hanno il rilevante carico di ben diciotto volte la quantità di proteina-vettore contenuta in ogni singolo coniugato. Inoltre, questo dosaggio deve essere moltiplicato per tre o quattro volte, in considerazione del fatto che da tre a quattro dosi dei vaccini sono necessarie per conferire completa protezione ad un bambino nei primi 2 anni di vita. Considerando ciò,l’intero quantitativo di proteina-vettore iniettata in un bambino può facilmente raggiungere dosi di ca.
0,20 mg , con un ovvio stress del sistema immunitario che, comunque, fino ad ora sembra ben tollerare simili dosaggi di proteina-vettore per conferire Helper T-cell dipendenza all’ospite. Comunque, nel continuo aggiornamento e avanzamento della formulazione di vaccini polivalenti come quello per la prevenzione delle infezioni da S.pneumoniae, la quantità di Ps tipo-specifico, ovvero di proteina-vettore, à ̈ destinata a salire nel tempo.
In questo contesto,l’autore della presente invenzione ha prodotto una nuova categoria di antigeni coniugati che rappresentano l’espressione di multiple specificità per i carboidrati, pre-determinati ed inseriti nel costrutto molecolare, che usa una mole (o micro mole o nanomole o picomole, tutte rappresentative per una frazione della stessa)di proteina-vettore per trasportare almeno una mole (o micromole o nanomole o picomole, tutte rappresentative per una frazione della stessa) di ciascuno di almeno tre differenti carboidrati antigenici di tipo (o gruppo)-specifici, quindi un coniugato esprimente un totale di almeno quattro differenti specificità sierologiche.
In questo modo, una formulazione vaccinale comprendente anche diciotto antigeni coniugati tipo-specifici, come esempio, sarà sintetizzata usando solo un terzo (o 33 %) della quantità di proteina-vettore che si necessita oggi nelle formazioni disponibili come associazione di singoli antigeni, cosicché il carico immunogenico sul sistema immunitario dell’ospite sarà significativamente inferiore a, di conseguenza, più sicuro.
Infatti, à ̈ ben nota in immunologia, l’esistenza del fenomeno definito come “immuno-interferenza ed immunosoppressione dovuta alla proteina-vettore†spiegabile come ipo-regolazione del sistema immunitario che diventa sovraccarico dalla quantità di antigene proteico somministrato in dosi ripetute, per esempio come un’entità coniugata, specialmente quando nell’ospite trattato sono presenti specifici titoli sierologici significativi di anticorpi IgG così detti di “memoria immunologica†(Dagan R. et al., Vaccine 28 (34): 5513-5523, 2010). La riduzione significativa della quantità di proteina-vettore nel presente modello molecolare, tuttavia, garantisce la completa espressione della Helper T-dipendenza, in accordo al passato lavoro sperimentale evidenziante che, la risposta anamnestica di anticorpi IgG in un mammifero, contro un antigene glicoconiugato, à ̈ ristretta alla zona ibrida di un epitopo comprendente il legame proteina-carboidrato con la specificità del sistema immunitario confinato a pochi residui monosaccaridici della struttura del carboidrato covalentemente legato (Arndt and Porro, Immunobiology of Proteins and Peptides, Edited by M.Z. Atassi, Plenum Press, New York and London, pages 129-148, 1991). Questo lavoro pubblicato à ̈ focalizzato sulle differenti strategie chimiche a su differenti PM di Ps di S.pneumoniae coniugati alla proteina-vettore CRM197, per ottenere una struttura ottimale del coniugato quando si usano carboidrati antigenici attivati con mono - funzionalità ; inoltre, la pubblicazione si focalizza sull’area molecolare più probabilmente coinvolta in quel costrutto molecolare da essere considerata responsabile della Helper T-dipendenza nei mammiferi (attraverso l’analisi degli anticorpi policlonali isotipo IgG indotti) come evidenziato dalla mappatura molecolare dei coniugati sintetizzati.
US 4,711,779 rilasciato a nome dello stesso richiedente, riporta un modello molecolare di glicoproteina trivalente esprimente immunogenicità in mammiferi verso un batterio Gram-positivo e uno Gramnegativo. Il documento si riferisce a un costrutto molecolare che usa oligosaccaridi di basso PM, covalentemente legati alla proteina-vettore via un linker derivato introdotto al gruppo riducente terminale scoperto dopo l’idrolisi chimica a bassa temperatura; quel coniugato esprimeva un massimo di tre differenti specificità (verso la proteina CRM197, verso il Ps tipo 6A, verso il Ps gruppo C); usava oligosaccaridi mono-funzionali; il costrutto molecolare induceva specificità sierologica alla proteina-vettore e a ciascuna delle due strutture carboidratiche trasportate.
US 5,306,492, sempre a nome dello stesso richiedente, riporta vaccini coniugati oligosaccaridici e un metodo migliorato per produrre detti vaccini basati su oligosaccaridi coniugati. Il metodo coinvolgeva l’attivazione degli apteni oligosaccaridici ad alta temperatura e al gruppo riducente terminale scoperto, prima di essere covalentemente coniugato alla proteinavettore via una molecola linker; un tipico coniugato di quella generazione esprimeva specificità bivalente (alla proteina CRM197 e al Ps tipo (o gruppo)-specifico; il coniugato usava oligosaccaridi monofunzionali; il costrutto molecolare induceva specificità sierologica alla proteina-vettore e alla struttura del carboidrato trasportata singolarmente. EP 1501542 a nome dello stesso richiedente, riporta un nuovo metodo per produrre antigeni polisaccaridici coniugati di alto PM, polidispersi e cross-legati, in alta resa; un tipico coniugato di questa generazione esprimeva specificità verso la proteina-vettore Tossoide Tetanico e al Ps trasportato, tipo (o gruppo)-specifico; il coniugato usava polisaccaridi polifunzionali coniugati a proteine-vettori polifunzionali; il costrutto molecolare induceva specificità sierologica verso la proteina-vettore e verso la singola struttura di carboidrato trasportata. In aggiunta a quanto sopra, Porro M. et al. in Medecine Tropicale, 43: 129-132, 1983, inizialmente introduceva la chimica di attivazione di un oligosaccaride meningococcico di gruppo B (preliminarmente idrolizzato in condizioni di acidità controllata) al proprio gruppo riducente terminale, con ammoniaca liquida e via aminazione riduttiva a bassa temperatura (25-37 °C); tale oligosaccaride monofunzionale esibente un amino gruppo era poi attivato con il bis-succinimidil-estere dell’acido adipico e quindi coniugato ai gruppi amminici dei gruppi di Lisina presenti nella proteinavettore CRM197. L’antigene oligosaccaridico attivato era monofunzionale nel processo di coniugazione e la coniugazione avveniva senza la preliminare attivazione della proteina-vettore CRM197.
Inoltre, Porro M. et al. in Molecular Immunology, 22: 907-919 (1985) riportavano la chimica di attivazione di un oligosaccaride pneumococcico tipo 6A (preliminarmente idrolizzato in condizioni di acidità controllata) alla propria unità riducente terminale, con ammoniaca e via aminazione riduttiva nel loro articolo intitolato “Specific antibodies to diphtheria toxin and type 6A pneumococcal capsular polysaccharide induced by a model of semi-synthetic glycoconjugate antigen†. Questo oligosaccaride monofunzionale esibente un amino gruppo era poi attivato dal bis-succinimidilestere dell’acido adipico e quindi coniugato agli amino gruppi delle Lisine presenti nella struttura del CRM197. L’antigene oligosaccaridico attivato era monofunzionale nel processo di coniugazione e senza la preliminare attivazione della proteina-vettore.
In un successivo articolo in Molecular Immunology, 23: 385-391, (1986), gli stessi autori riportavano un processo di coniugazione in due passaggi alla stessa proteina-vettore CRM197, di due oligosaccaridi capsulari (derivati da un batterio Gram-negativo e da uno Gram-positivo, rispettivamente) usando la chimica di attivazione e la chimica di coniugazione riportata nel primo articolo sopra citato. Entrambi gli antigeni oligosaccaridici attivati erano monofunzionali nel processo di coniugazione e senza la preliminare attivazione della proteina-vettore.
Infine, in una pubblicazione successiva(Porro M. Edited by R. Bell and G. Torrigiani (World Health Organization), pag. 279-306; John Wiley & Sons Publishers, New York 1987) l’autore della presente invenzione sintetizza i concetti e le procedure tecniche sopra esposte per antigeni coniugati composti da proteina-vettore e un massimo di due differenti strutture di carboidrati.
Nello sviluppare il suddetto stato dell’arte, il costrutto molecolare oggetto della presente invenzione à ̈ composto da una glicoproteina di semi-sintesi quadri (tetra)-valente che contiene epitopi multipli incorporati ed esprime la propria specifica immunogenicità Helper T-dipendente “in vivo†verso la proteina CRM197 e verso ciascuna delle tre strutture veicolate dei carboidrati di S.pneumoniae tipo 3,6A,7F selezionati come un esempio.
Così, il nuovo costrutto molecolare induce specificità sierologica alla proteina-vettore e a ciascuna delle tre strutture carboidratiche veicolate.
Questo antigene semi-sintetico tetra-valente può essere considerato come il nuovo precursore di una nuova generazione di antigeni coniugati esprimenti multiple specificità per ottenere vaccini con un sempre più ampio spettro di protezione contro una varietà di batteri patogeni mentre, al contempo, si riduce la quantità di proteina-vettore in modo da ottenere un miglioramento razionale per :
A) il costo di produzione dei vaccini;
B) la loro efficienza di produzione;
C) la loro sicurezza in relazione alla minore quantità del dosaggio proteico che ha un impatto sul sistema immunitario della popolazione target e, conseguentemente
D) l’utilità pubblica di questi vaccini coniugati. La presente invenzione apre nuove strade nel campo della immunologia clinica e in vaccinologia. Infatti,la multipla antigenicità incorporata nel descritto costrutto molecolare, specifica per differenti antigeni batterici, à ̈ in stretto parallelo, nell’innovativo campo della poli-farmacologia, con la sintesi di un farmaco disegnato a priori per raggiungere simultaneamente recettori multipli di rilevanza farmacologica in modo da ridurre il numero di farmaci da essere somministrati in forma associata (Besnard J. et al., Nature, 492 : 215-220, 2012).
Pertanto, forma oggetto della presente invenzione un costrutto molecolare antigenico multivalente consistente di una unità base comprendente una proteina vettore Helper T-dipendente covalentemente legata a un minimo di tre strutture di carboidrati di differente specificità sierologica, in cui ciascuna struttura di carboidrato comprende almeno uno degli epitopi base che si ripetono e che consistono di un minimo di cinque a dodici residui monosaccaridici, preferibilmente un minimo di otto a dodici residui monosaccaridici,come valutato dalla determinazione della massa molecolare e dalla spettroscopia NMR (equivalenti a un differente numero di Unità Base Ripetenti, BRU, allorché dipendenti da sequenze omologhe o eterologhe), detti epitopi antigenici base che si ripetono essendo valutati per reattività con anticorpi policlonali o monoclonali, tipo o gruppo-specifici, attraverso la determinazione dei loro rispettivi valori di MIC50nell’inibizione del loro omologo sistema di riferimento Polisaccaride-Anticorpo. Secondo la presente invenzione, il termine strutture carboidratiche à ̈ inteso comprendere strutture oligosaccaridiche o polisaccaridi che (come i polisaccaridi capsulari).
Secondo forme preferite di realizzazione della presente invenzione, la proteina-vettore Helper T-dipendente covalentemente legata a un minimo di tre differenti strutture di carboidrati di differenti specificità sierologica, à ̈ scelta dal gruppo comprendente la proteina mutante naturale difterica CRM197 (PRF 1007216A), il Tossoide Difterico (CAE 11230.1 della omologa tossina), il Tossoide Tetanico (AAK 72964.2 della omologa tossina), la Proteina D dell’Haemophilus influenzae (AAA 24998.1), le proteine di superficie dello Streptococcus pneumoniae (PspA, EMBL CBW 33751.1; e PspC, EMBL ACF 56456.1), la tossina di Streptococcus pneumoniae (Pneumolisina, EMBL ACF 56060.1) o varianti e derivati dalle stesse. In particolare, quando ci si riferisce a derivati del Tossoide Tetanico, à ̈ preferibile l’uso del Tossoide Tetanico derivato con lo spaziatore molecolare di-idrazide dell’acido adipico (Tossoide Tetanico-ADH).
Secondo la forma più preferita di realizzazione della presente invenzione, la proteina-vettore à ̈ la proteina mutante naturale difterica CRM197.
Questa proteina fu inizialmente riportata da Uchida e Pappenheimer verso la metà degli anni Settanta (Uchida T. et al., J. Biol. Chem. 248, 3838-3844, 1973) e il suo possibile uso come nuovo agente immunogenico contro la Tossina Difterica, essendo in correlazione immunogenica con il Tossoide Difterico, à ̈ stato già riportato dal richiedente (Porro M. et al., J. Infect. Dis., 142 (5), 716-724, 1980). Fin da allora, il richiedente ha usato CRM197 come ideale proteinavettore Helper T-dipendente per antigeni carboidratici, una volta che furono comprese le ragioni alla base delle peculiari caratteristiche immunogeniche di quest’ultimo gruppo di antigeni in soggetti umani, nella specifica fascia di età comprendente la maturazione del sistema immunitario (da ca. 2 mesi a ca. 2 anni di età ).
La proteina CRM197 à ̈ composta da una sequenza di 535 amino acidi, come la tossina difterica (Giannini G. et al., Nucl. Acid Res., 12, 4063-4069, 1984) ma mostra una “mutazione puntiforme†all’amino acido in posizione 52, dove Glu sostituisce Gly. La sua antigenicità à ̈ stata riportata essere principalmente diretta a quattro aree della sequenza, con l’uso di anticorpi monoclonali, relativamente alle sequenze AA 1-156, 157-193, 293-345 e 465-535 (Zucker D. and Murphy J.R., Mol. Immunol. 21, 785-793). La proteina inoltre à ̈ caratterizzata da 39 residui Lys e un amino gruppo terminale, per un totale di 40 amino gruppi, che sono usati allo scopo per le reazioni chimiche coinvolte nelle varie strategie di coniugazione.
Secondo forme preferite di realizzazione relative al costrutto molecolare multivalente antigenico dell’invenzione, le strutture di carboidrati veicolati sono selezionati tra quelli dello Streptococcus pneumoniae (tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F) e tra quelli di Neisseria meningitidis (gruppo A, C, W135 e Y), Haemophilus influenzae (tipo b) e Klebsiella pneumonia (i.e. antigeni K), o una loro combinazione.
Sulla base delle suddette forme di realizzazione, à ̈ anche possibile preparare costrutti molecolari ibridi dove la proteina-vettore funziona come vettore Helper T-dipendente per antigeni di S.pneumoniae e N.meningitidis e altri antigeni, simultaneamente. Questi costrutti molecolari ibridi non esistono in natura giacché la superficie antigenica di batteri Gram-negativi e Gram-positivi differisce significativamente tra essi in termini di architettura molecolare della cellula batterica e dei meccanismi biologici attraverso i quali essi inducono immunità protettiva nell’ospite. Per esempio, mentre l’attività protettiva indotta contro il Ps capsulare del batterio Gram-negativo N.meningitidis coinvolge attività battericida complemento-dipendente, quella indotta dal batterio Gram-positivo S.pneumoniae coinvolge l’opsonofagocitosi, pure complemento-dipendente. Nel caso di questa categoria ibrida di antigeni sintetici, entrambe le reazioni biologiche vengono specificamente attivate (Porro M. et al., Molecular Immunol., 23 : 385-391 (1986), una differenza fondamentale esibita dalle proprietà dei singoli antigeni naturali.
Secondo una forma preferita di realizzazione dell’invenzione, le strutture dei carboidrat i veicolati scelti tra gli antigeni di S.pneumoniae selezionati sono il polisaccaride tipo 3, 6A,7F.
Il polisaccaride 3 corrisponde alla seguente struttura (Reeves R.E. and Goebels W.F., J. Biol. Chem.,139: 511 -519, 1941):
La struttura mostra una coppia di gruppi – OH / BRU , che significa esiste la possibilità di attivare a vari gradi la struttura usando il metodo riportato dal richiedente nel Brevetto EP 1501 542 sopra menzionato. Il polisaccaride tipo 6A risponde alla seguente struttura (Rebers P.A. and Heidelberger M., J. Am. Chem. Soc., 83: 3056-3059, 1961):
S. Pneumoniae Type 6A
O CH2O P
CH2OH
H O O OH O CH2OH
OH O OH O<O>H
O CH H O
*3
CH2OH
O OH OH O OH n
O
<2)-D-Galp-(1 3)-α -D-Glcp-(1 3)->α<-L-Rhap-(1 3)-D-ribitol-(5->O P O
OH
Reactive groups:
*3,4 Hydroxyls
La struttura mostra una coppia di – OH /BRU che significa c’à ̈ un’ampia possibilità di attivazione a vari gradi usando il metodo riportato dal richiedente nel brevetto EP 1501542.
Il polisaccaride tipo 7F risponde alla seguente struttura (Moreau M. et al., Carbohydrate Res., 182(1):79-99, 1988):
S. Pneumoniae Type 7F
CH2OH
OH O
O OHO<CH>2<OH>
O
CH
CH3O
2O
OHOO * OH O
OH O(Ac) OH NAc
O
*
CH2OH CH3
CH2OH O
OH OHOO * OH O
OH
* OH
NAc
* OH Ac n
2
6)-α-D-Galp-(13)-β-L-Rhap-(14)-β-D-Glcp-(13)-β-D-GalpNAc-(1-
2 4
Reactive groups:
1 1 *Various vicinal hydroxyls β-D-Galp α-D-GlcpNAc-(12)-α-L-Rhap
La struttura mostra ben cinque coppie di – OH / BRU che significa c’à ̈ una enorme possibilità di attivazione a vari gradi usando il metodo riportato nel brevetto EU No. 1501542.
Altri possibili coniugati multivalenti (in aggiunta o in alternativa a CRM197-3,6A,7F) dove la proteina CRM197 (o qualsiasi altra proteina immunogenica) serve come vettore Helper T-dipendente di polisaccaridi di S.pneumoniae sono selezionati tra i seguenti :
CRM197-4,5,9V; CRM197-1,6B,14; CRM197-18C,19A,23F; CRM197-6C,19F,22F; CRM197-12F,15B,33F.
Il costrutto molecolare antigenico multivalente dell’invenzione può essere sia in forma monomerica che polimerica. L’invenzione à ̈ anche diretta a uno o più costrutti molecolari antigenici multivalenti come definito sopra in un vaccino per la protezione di un soggetto (preferibilmente appartenente alla popolazione umana pediatrica) dalle infezioni dovute ad almeno un agente selezionato tra S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae, K. pneumonia, S. typhi ed E. coli.
Inoltre, l’invenzione si riferisce ad una formulazione di vaccino comprendente uno o più costrutti molecolari di differente specificità antigeniche secondo la presente invenzione, in un veicolo fisiologicamente accettabile, facoltativamente insieme con un adiuvante e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili. L’invenzione à ̈ inoltre diretta alla formulazione di un vaccino polivalente a largo spettro, come sopra definito, per l’uso in campo medico o veterinario per la protezione di un soggetto dalle infezioni dovute ad almeno un agente selezionato tra: S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae, K. pneumonia, S. typhi ed E. coli. Preferibilmente, detto soggetto appartiene alla popolazione pediatrica.
Inoltre, il modello molecolare descritto nella presente domanda à ̈ la base per un vaccino polivalente a largo spettro per la prevenzione delle infezioni batteriche da S.pneumoniae contenenti da un minimo di 9 e fino a 25 differenti strutture di carboidrati del tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F.
Quando si consideri il coniugato base veicolante tre moli (o frazioni delle stesse) di antigeni carboidratici strutturalmente differenti per mole (o frazioni della stessa) di proteina-vettore, la quantità di proteina-vettore può essere ridotta a circa il 30% di quella presente in qualsiasi delle formulazioni di coniugati pneumococcici oggi disponibili per la popolazione pediatrica (es.: il vaccino Prevnar oggetto del brevetto EP 1868645 e il vaccino Synflorix).
Un esempio pratico di una formulazione a largo spettro (18-valente) per la prevenzione di IPD (Invasive Pneumococcal Disease o Malattie Invasive da Pneumococco) dovute a S.pneumoniae, che à ̈ basato sul costrutto molecolare antigenico multivalente riportato in questa domanda, à ̈ l’associazione di almeno tre, quattro, cinque o preferibilmente tutti i seguenti multivalenti coniugati, dove la proteina CRM197 (o qualsiasi altra proteina immunogenica) serve come vettore proteico Helper T-dipendente:
CRM197-3,6A,7F; CRM197-4,5,9V; CRM197-1,6B,14; CRM197-18C,19A,23F ; CRM197-6C,19F,22F; CRM197-12F,15B,33F. In questo esempio, solo sei coniugati multivalenti coprono il largo spettro dei sierotipi selezionati.
In aperto contrasto, le formulazioni di vaccini oggi disponibili richiederebbero l’associazione di ben diciotto coniugati singoli. La quantità di proteinavettore iniettata à ̈ quindi ca. il 30 % (in peso) della quantità di proteina-vettore presente in quest’ultima formulazione, con una riduzione altamente significativa di almeno il 70 % (in peso).
Per fare un confronto, la quantità totale di proteinavettore oggi presente nel vaccino 13-valente “Prevnar†(formulazione composta da 13 antigeni monovalenti associati oggetto del brevetto EP 1868645) à ̈ di 32 µg, alla dose clinica di ca. 2 µg proteina /2 µg di ciascun antigene Ps coniugato, per un totale di 31 ug di antigeni Ps [rapporto medio (R) proteina /Ps (in peso) = 1.03]; a circa lo stesso rapporto Proteina /Ps tipospecifico (come mostrato dal sopra riportato coniugato multivalente CRM197-3,6A,7F), la quantità totale di proteina-vettore nella formulazione 18-valente esemplificata à ̈ appena 12 µg ovvero il 37,5 % di quella presente nella formulazione 13-valente del “Prevnar†(i dati relativi alla composizione del vaccino “Prevnar†e del vaccino “Synflorix†sono ottenuti da documenti pubblicamente disponibili rilasciati da US-FDA e EMA). Ulteriori esempi di formulazioni vaccinali sono basati sul costrutto molecolare antigenico multivalente secondo l’invenzione, per la prevenzione delle infezioni batteriche da N.meningitidis (Gruppo A, C, W135, Y).
La stessa strategia relativa al processo di coniugazione e ai controlli sopra riportati per il costrutto molecolare antigenico multivalente di S.pneumoniae tipo 3,6A,7F, può essere usato per altre strutture di carboidrati come quelli di N.meningitidis. In questo caso, giusto un antigene multivalente contenente le strutture dei carboidrati gruppospecifici (polisaccaride A,C,W135 e Y) può costituire la formulazione del vaccino.
Quindi un altro oggetto dell’invenzione à ̈ la formulazione di un vaccino a largo spettro per la prevenzione delle infezioni dovute a Neisseria meningitidis comprendente un costrutto molecolare antigenico multivalente contenente le strutture dei carboidrati gruppo-specifici A,C,W135 e Y.
Quando si consideri il costrutto del coniugato base veicolante quattro antigeni di carboidrati strutturalmente differenti, la quantità di proteinavettore può essere ridotta ad almeno il 25 % di quella presente in qualsiasi delle formulazioni di coniugati contenenti antigeni associati (es.: “Menactra†e “Menveo†) in accordo alle informazioni pubblicamente disponibili sulla loro composizione e formulazione (una quantità totale di 48 e 47 µg/dose di Tossoide Difterico e di CRM197, rispettivamente) rilasciate da US-FDA e EMA.
La dose immunogenica delle formulazioni polivalenti del costrutto molecolare riportato nella presente domanda, à ̈ riferito alla dose di ciascuna struttura di carboidrato veicolata. In questo contesto, la dose può cadere nel range da 0.1 a 10 µg, di ciascun antigene saccaridico in infanti e bambini. Coloro che sono esperti in campo clinico possono aiutare a trovare la dose ottimale nella popolazione target. Preferibilmente, dette formulazioni di vaccini comprendono anche un adiuvante minerale o chimicosintetico o biologico. Adiuvanti minerali o chimicosintetici o biologici possono essere usati con il costrutto molecolare descritto in questa domanda, in modo da poter beneficiare da qualsiasi aiuto immunologico che possa essere efficace nell’abbassare la dose immunogenica ottimale nell’uomo così da ulteriormente ridurre la quantità totale di proteinavettore. In particolare, i preferiti adiuvanti inorganici nelle formulazioni dei vaccini descritti nell’invenzione per uso umano sono selezionati tra Alluminio Fosfato (AlPO4) e Alluminio Idrossido Al(OH)3; i preferiti adiuvanti organici sono selezionati tra gli adiuvanti basati sullo squalene come MF59, QF 21, Addavax; i preferiti antigeni batterici sono selezionati tra il Monofosforil-lipide A, il Trealoso dicorinomicolato (Adiuvante di Ribi). Nelle formulazioni di vaccini per uso in campo veterinario, l’adiuvante di Freund (completo o incompleto)à ̈ preferito. La dose di adiuvante può essere tra 0.1-1.0 mg/dose, preferibilmente 0.5 mg/dose.
Più preferibilmente, detta formulazione à ̈ conveniente per somministrazione per via sottocutanea o intramuscolare o intradermica. Convenientemente, la somministrazione può essere eseguita con iniezione mediante siringa convenzionale o mediante dispositivi senza ago.
Le formulazioni di vaccini secondo l’invenzione possono essere somministrate in accordo a un protocollo che richiede singole o multiple somministrazioni, in accordo alle istruzioni in campo pediatrico.
La presente invenzione à ̈ ulteriormente diretta a un processo di coniugazione per la preparazione del costrutto molecolare antigenico multivalente che utilizza la chimica riportata nel Brevetto Europeo No.
1501542, dove ciascuna delle almeno tre strutture saccaridiche à ̈ chimicamente attivata a polifunzionalità per scoppiamento d’idrogeni da due ossidrili vicinali via ossidazione e aminazione riduttiva formante legami imina-ridotti con uno spaziatore molecolare alchildiamminico, poi derivatizzato a estere attivo, detto estere-derivato essendo infine e simultaneamente coniugato ai gruppi amminici della proteina-vettore polifunzionale attraverso la formazione di legami ammidici.
Preferibilmente, dette strutture saccaridiche sono chimicamente attivate nei loro corrispondenti derivati di-amino butirrici e gli esteri attivi sono esteri dell’acido succinico.
Come esempio, l’attivazione chimica dei polisaccaridi tipo 3, 6A, 7F di S.pneumoniae ai corrispondenti omologhi Ps-DAB derivati (di acido di-amino butirrico) à ̈ stata ottenuta in accordo alla procedura riportata dal titolare nella Rivendicazione 1 di EP 1501542 B1, sopra menzionata, dove la proteina-vettore polifunzionale era il CRM197.
Alternativamente, il processo di coniugazione per preparare il costrutto molecolare antigenico multivalente impiega la chimica coinvolgente la coniugazione simultanea degli amino gruppi della proteina-vettore polifunzionale con almeno tre differenti strutture saccaridiche, via aminazione riduttiva formante legame(i)imina-ridotti, dette strutture saccaridiche essendo previamente attivate a monofunzionalità o polifunzionalità , con o senza spaziatori molecolari, per scoppiamento di idrogeni in ossidrili vicinali via ossidazione.
Come si può inferire, il sopra riportato modello molecolare può essere ulteriormente sviluppato per contenere più che tre (per esempio quattro o cinque) differenti strutture saccaridiche per singola mole (o frazioni di essa) di proteina-vettore, questa possibilità dipendendo da tre parametri principali del costrutto molecolare:
a) le caratteristiche chimico-fisiche della proteinavettore, le quali dovrebbero esibire le più alte possibili quantità di residui di Lisina (fonte di –NH2reattivi);
b) la polidispersione di PM selezionata “ad hoc†delle differenti strutture saccaridiche esibenti una ottimale percentuale di attivazione mentre, in parallelo, limitando gli effetti negativi dei fenomeni d’ingombro sterico nella reazione di coniugazione, e c)l’efficienza della chimica usata per l’attivazione delle differenti strutture saccaridiche e per la sintesi del costrutto molecolare (la chimica preferita per un’alta efficienza nell’attivazione ottimale di strutture saccaridiche à ̈ lo scoppiamento d’idrogeni in ossidrili vicinali via ossidazione, con o senza spaziatori molecolari, mentre quella per un’alta efficienza nella reazione di coniugazione à ̈ attraverso la formazione di legame ammidico via esteri attivi tra le strutture dei carboidrati e la proteina-vettore ; à ̈ anche preferita per la reazione di coniugazione, la chimica che usa la formazione di un legame iminaridotto tra le strutture saccaridiche ossidate risultanti nello scoppiamento d’idrogeni da ossidrili vicinali, con o senza spaziatori molecolari, e la proteina-vettore, via aminazione riduttiva diretta). La presente invenzione viene ulteriormente illustrata in accordo agli esempi preferiti con particolare riferimento alle figure incluse, dove :
- Figura 1 mostra una comparazione tra lo spettro 1H-NMR del Ps 3 nativo (tratto grigio)e Ps 3-DAB attivato al 50 % Ox (tratto nero).
- Figura 2 mostra gli spettri<1>H-NMR del Ps 3-DAB al 50 % Ox, con filtri in diffusione. Lo spettro in nero à ̈ ottenuto al 60 % GRAD, lo spettro in grigio al 2 % GRAD dimostranti l’assenza del DAB in forma libera, nel derivato.
- Figura 3 mostra il derivato Ps3-DAB, 50 % Ox,il cui spettro<1>H-NMR quantifica l’attivazione DAB (2 % su basi molari).
- Figura 4 mostra una comparazione tra lo spettro<1>H-NMR del Ps 6A nativo (tratto grigio)e Ps 6A-DAB attivato al 50 % Ox (tratto nero).
- Figura 5 mostra gli spettri<1>H-NMR del Ps 6A-DAB al 50 % Ox, con filtri in diffusione. Lo spettro in nero à ̈ ottenuto al 60 % GRAD, lo spettro in grigio al 2 % GRAD dimostranti l’assenza del DAB in forma libera, nel derivato.
- Figura 6 mostra il derivato Ps6A-DAB, 50 % Ox,il cui spettro<1>H-NMR quantifica l’attivazione DAB (2.3 % su basi molari).
- Figura 7 mostra una comparazione tra lo spettro 1H-NMR del Ps 7F nativo (tratto grigio)e Ps 7F-DAB attivato al 10 % Ox (tratto nero). Il segnale a 1.92 ppm, presente solo nel Ps nativo, à ̈ dovuto allo ione acetato libero. Il segnale OAc a 2.24 ppm rimane lo stesso dopo l’attivazione DAB.
- Figura 8 mostra gli spettri<1>H-NMR del Ps 7F-DAB al 10 % Ox, con filtri in diffusione. Lo spettro in nero à ̈ ottenuto al 60 % GRAD, lo spettro in grigio al 2 % GRAD dimostranti l’assenza del DAB in forma libera, nel derivato.
- Figura 9 mostra il derivato Ps 7F-DAB, 10 % Ox,il cui spettro<1>H-NMR quantifica l’attivazione DAB (1.7 % su basi molari). La freccia indica il segnale di riferimento a 5.65 ppm (protone α del glucosio o galattosio) per la quantificazione dell’attivazione DAB.
- Figura 10 mostra l’analisi GPC del costrutto molecolare antigenico multivalente CRM197-3,6A,7F.
- Figura 11 mostra l’analisi GPC dei quattro componenti miscelati insieme (CRM197 Ps3-DAB Ps6A-DAB Ps 7F-DAB) in modo da mostrare l’assenza di qualsiasi formazione di complesso tra i singoli antigeni.
- Figura 12 mostra l’analisi SEC-HPLC dell’antigene multivalente, dopo purificazione su Sepharose 4B-CL, con specifico riferimento al profilo della proteinavettore CRM197.
- Figura 13 mostra l’analisi SEC-HPLC del CRM197 come proteina nativa, quando miscelata con Ps3-DAB, Ps6A-DAB e Ps7F-DAB.
- Figura 14 mostra l’analisi SDS-PAGE (9 % di tampone glicina)illustrante il comportamento dell’antigene multivalente CRM197-3,6A,7F. La legenda dei campioni : 1: CRM197 come riferimento ; 2: PM polidisperso dell’antigene coniugato multivalente purificato CRM197-3,6A,7F ; 3: Miscela di CRM197 Ps3-DAB Ps6A-DAB Ps7F-DAB come riferimento.
- Figura 15 mostra l’analisi Immunoblot (Western blot) dell’antigene multivalente come qualitativamente rivelato dagli anticorpi policlonali di ciascun siero tipo-specifico. Legenda dei campioni : 1: coniugato multivalente CRM197-3,6A,7F (dalla posizione 2 della Fig. 14 sopra); 2: Miscela di CRM197 Ps3-DAB Ps6A-DAB Ps7F-DAB come riferimento.
- Figura 16 mostra la comparazione tra la % d’inibizione (espressa come MIC50)del CRM197 nativo e della sua forma coniugata come CRM197-3,6A,7F.
- Figura 17 mostra la curva sigmoidale (scala log)riferita al grafico di Fig. 16.
- Figura 18 mostra la comparazione tra la % d’inibizione (espressa come MIC50)del Ps3-DAB e della sua forma coniugata come CRM197-3,6A,7F contro il Ps3 nativo, mostrante Antigenicità di Tipo 1 o Identità Antigenica del Ps3 successivamente sia alla DAB attivazione che alla coniugazione.
- Figura 19 mostra la curva sigmoidale (scala log) riferita al grafico di Figura 18.
- Figura 20 mostra la comparazione tra la % d’inibizione (espressa come MIC50)del Ps6A-DAB e della sua forma coniugata come CRM197-3,6A,7F contro il Ps6A nativo, mostrante Antigenicità di Tipo 1 o Identità Antigenica del Ps6A successivamente sia alla DAB attivazione che alla coniugazione.
- Figura 21 mostra la curva sigmoidale (scala log) riferita al grafico di Figura 20.
- Figura 22 mostra la comparazione tra la % d’inibizione (espressa come MIC50)del Ps7F-DAB e della sua forma coniugata come CRM197-3,6A,7F contro il Ps7F nativo, mostrante Antigenicità di Tipo 1 o Identità Antigenica del Ps7F successivamente sia alla DAB attivazione che alla coniugazione.
- Figura 23 mostra la curva sigmoidale (scala log) riferita al grafico di Figura 22.
Nella sezione sperimentale successiva l’invenzione sarà riportata in maggiore dettaglio secondo forme di realizzazione preferite, che non dovrebbero comunque essere considerate limitative per l’ambito di protezione ma solo a scopo illustrativo.
ESEMPI
ESEMPIO 1: Sintesi dell’antigene coniugato multivalente comprendente i polisaccaridi 3, 6A, 7F dello S.pneumoniae e la proteina-vettore CRM197 Attivazione chimica dei Ps 3,6A,7F agli omologhi Ps-DAB (derivati della diammina dell’acido butirrico)
Questa fase à ̈ stata condotta secondo il processo riportato dal Titolare nella Rivendicazione 1 (Step A1) del sopra menzionato Brevetto Europeo No. 1501542 qui incluso per riferimento.
Controlli specifici di detta attivazione così come le caratteristiche ottenute con le attivate strutture saccaridiche sono qui di seguito riportate per mezzo della spettroscopia<1>H-NMR.
Analisi<1>H-NMR di Ps3-DAB, Ps6A-DAB, Ps7F-DAB 1.Soluzione di Ps e derivati Ps-DAB per analisi NMR. 3-4 mg di Ps o Ps-DAB vengono disciolti in 0.7 ml di tampone D2O – tampone fosfato e trasferiti in una provetta x NMR da 5 mm. La concentrazione di tampone fosfato preparato in D2O à ̈ 100 mM pH=7.0. Il sale sodico dell’acido Trimetilsililpropionico, (CH3)3Si(CD2)2COONa o TSPA viene usato come riferimento interno. La concentrazione del TSPA à ̈ 1 mM.
2. Strumento NMR
Viene usato uno Spettrometro NMR ad alto campo da 600 MHz. Una sonda da alta risoluzione da 5mm con spirale z-gradiente capace di produrre gradienti nella direzione z (parallela al campo magnetico) con una forza di almeno 55 G.cm<-1>, viene impiegata.
3. Preparazione degli esperimenti NMR
Dopo la introduzione del campione dentro il magnete tutte le procedure di routine vengono eseguite : tuning e matching, shimming, calibrazione degli impulsi a 90 gradi. Presaturazione può essere usata per sopprimere il segnale residuo HDO. Per una buona presaturazione il centro dello spettro (01) deve essere esattamente centrato sul segnale HDO (circa 4.80 ppm), e un buon shimming à ̈ altrettanto desiderato. Dopo l’aggiustamento dei parametri per la presaturazione, vengono controllati i parametri di gradiente di diffusione. Viene usata la sequenza di eco-impulsi per mezzo di gradienti bipolari con un ritardo longitudinale dovuto alle “correnti parassite†.
4. Fingerprinting della DAB-attivazione
Gruppo –CH2-NH2a 3.08 ppm
Gruppo –CH2-NH-CH2- a 3.17 ppm
5.% della DAB-attivazione sul Ps
Rientra nel range di valori 0.5-5.0 % moli DAB
/ moli BRU (o Unità Base Ripetuta) con un range molare ottimale 1.5-3.0 %.
Derivatizzazione di Ps3-DAB, Ps6A-DAB, Ps7F-DAB ai loro omologhi esteri attivi come derivati Ps-DAB-MSE Questa reazione à ̈ stata eseguita in accordo al processo riportato dal Titolare nella Rivendicazione 8 del Brevetto Europeo No. 1501542 qui incluso per riferimento.
Coniugazione simultanea dei tre Ps attivati (polifunzionali) alla proteina-vettore CRM197 (polifunzionale)
La sintesi chimica del coniugato, conosciuta anche con il nome di reazione di coniugazione, Ã ̈ stata eseguita in accordo al processo riferito dal titolare nella Rivendicazione 8 del Brevetto Europeo No. 1501542 qui incluso come riferimento.
La procedura qui riportata, comunque, può essere considerata innovativa poiché le tre reazioni di coniugazione sono eseguite simultaneamente, piuttosto che procedere con una reazione di coniugazione alla volta (o procedura step-by-step). Questa procedura può essere preferita alla reazione step-by-step per la coniugazione di ogni antigene Ps attivato per la semplice ragione di accorciare il tempo di reazione, quindi migliorare l’efficienza della reazione, premesso che i tre Ps attivati siano nella condizione di competere comparativamente all’equilibrio per la reazione di coniugazione (questa possibilità include comparabile PM medio, comparabile range di Ps-DAB attivazione e comparabili rapporti stechiometrici tra i gruppi reattivi della proteina e quelli dei Ps attivati).
L’appropriata stechiometria di reazione tiene in considerazione il totale ammontare di succinimidil esteri e gli amino gruppi disponibili della proteinavettore. La stechiometria à ̈ preferenzialmente prefissata a considerare la reattività di non più del 20 % (o 8 su 40) degli amino gruppi disponibili nella struttura del CRM197 (come esempio) in modo che la proteina possa conservare il proprio repertorio antigenico. Sulla base dei dati sperimentali, la reazione di coniugazione à ̈ consistente con la seguente stechiometria :
CRM197 4 Ps-DAB-derivati → CRM197-(Ps)3+ Ps-DAB-derivati
Dove l’entità Ps-DAB-derivati si riferisce al totale di parti eguali di ciascuno delle tre strutture di carboidrato tipo-specifico in reazione a rendere un coniugato che mediamente ha una mole di proteina per un totale di 3 moli di Ps tipo-specifico legati, più il dovuto eccesso di Ps-DAB-derivati, come richiesto dalla costante di equilibrio :
[CRM197-(DAB-Ps)3] [Ps-DAB-derivati] [CRM197-(DAB-Ps)3]
Keq= -------------------------------------- = ------------------------------
[CRM197] [Ps-DAB-derivati]<4>[CRM197] [Ps-DAB-derivati]<3>
L’equazione chimica mette in evidenza la completa glicosilazione della proteina-vettore CRM197. L’equazione mostra anche che la reazione di coniugazione dipende dalla concentrazione di entrambi i reagenti, il nucleofilo (CRM197 attraverso gli epsilon amino gruppi dei propri residui di Lisina) e l’elettrofilo (il gruppo carbonile del gruppo estere del Ps-DAB-derivato) quindi potendo essere definita come reazione SN2. Le considerazioni sopra riportate sono consistenti con l’osservazione sperimentale che la più alta resa nella reazione di glicosilazione ottenuta con il CRM197 come proteina-vettore à ̈ stata del 100 % per la proteina e circa 80 % (in peso) dei Ps-DAB-derivati presenti in reazione, con la rimanente parte di essi essendo una piccola quantità di Ps-DAB-derivati non coniugati necessari per spingere l’equilibrio verso la propria destra. In questo tipo di reazioni, il solvente incide sulla resa di reazione perché il solvente può o meno circondare il nucleofilo, così nascondendo o meno il proprio avvicinamento all’atomo di carbonio. I solventi polari aprotici sono in genere migliori solventi per questa reazione dei solventi polari protici perché i solventi polari protici vengono solvatati attraverso il legame idrogeno del solvente per il nucleofilo e così rendendolo disattivato per l’attacco al carbonio con il proprio gruppo uscente. Un solvente polare aprotico con bassa costante dielettrica o con la parte terminale del dipolo criptica, favorirà la reazione di sostituzione nucleofilica SN2 (esempi preferiti sono : DMSO, DMF, Tetraidrofurano, etc.). Comunque, nel presente caso usante CRM197 come proteina-vettore, solventi polari protici e solventi polari aprotici funzionano molto bene quando comparati sperimentalmente. La temperatura di reazione, che regola la Keq, à ̈ la più bassa compatibile con l’uso del solvente scelto, quando si considera che la reazione à ̈ spontanea (quindi esotermica) e quindi viene generalmente posta tra i 4°C e i 20 °C.
In aggiunta alla chimica di coniugazione sopra dettagliata, altre chimiche possono essere usate per ottenere la sintesi dell’antigene coniugato multivalente ; tra queste, la coniugazione diretta della proteina (via aminazione riduttiva) ai Ps ossidati (via scoppiamento degli idrogeni alle coppie di – OH vicinali)o l’uso di spaziatori molecolari chimicamente complementari che possono servire per attivare i Ps e la proteina. Inoltre, in aggiunta alla strategia di usare chimiche che portano ad ottenere coniugati multivalenti con Ps e proteina cross-legati a causa della polifunzionalità della proteina e quella dei componenti Ps, si può considerare la sintesi del presente costrutto molecolare antigenico multivalente come basato su oligosaccaridi attivati al loro gruppo riducente terminale per poi essere coniugati alla proteina-vettore come il richiedente ha mostrato in passato in un altro modello di antigene coniugato nell’articolo più sopra menzionato, Porro M. et al. Mol. Immunol. 23 : 385-391 (1986), qui inserito come riferimento.
ESEMPIO 2 : Analisi fisico-chimica del costrutto molecolare antigenico multivalente CRM197-3,6A,7F
La tecnica analitica GPC (Cromatografia di Gel Permeazione) à ̈ stata usata per eseguire l’analisi fisica del costrutto molecolare dell’Esempio 1.
La Figura 10 mostra l’analisi GPC dell’antigene multivalente come ottenuto dalla reazione di coniugazione, prima della purificazione. Il cromatogramma proviene da Sepharose 4B-CL equilibrato in NaCl 0.14 M tamponato a pH = 7.50. La purificazione dell’antigene multivalente à ̈ ottenuta semplicemente mediante raccolta delle frazioni eluite tra il Kd = 0.00 e il Kd = 0.30. La tecnica di SEC-MALLS aiuta a definire il parametro di dispersità (Ä )del sistema molecolare ottenuto, calcolata usando l’equazione :
Ä = Mm/Mn
dove Mmà ̈ la massa molare media e Mnà ̈ il numero medio della massa molare e permette anche di determinare alcune proprietà intrinseche del sistema molecolare sopra riportato poiché l’intensità della luce diffusa (attraverso gli angoli d’impatto con la molecola) porta informazioni sulla massa molare, mentre la dipendenza angolare porta informazione sulla grandezza delle macromolecole. Infatti, se una data macromolecola di massa M à ̈ composta da elementi mi, allora l’equazione di base della diffusione de luce mostra che :
Dove rià ̈ la distanza dell’elemento midal centro di massa della molecola di massa totale M. In accordo a questa equazione, viene definita la relazione tra massa, grandezza e le quantità misurate.
La seguente Tabella 1 mostra la caratterizzazione della massa molecolare dispersa dell’antigene multivalente purificato (frazioni riunite nel range Kd = 0.00 – 0.30) analizzato per SEC-MALLS.
TABELLA 1
Massa alta Massa media Massa bassa (g/mol) (g/mol) (g/mol)
<6>5.92x10 9.67x10<5>2.69x10<5>
(66.4 %) (26.6 %) (7.0%)
I dati sperimentali ottenuti con HPLC-MALLS mostrano che la dispersione della massa del costrutto molecolare antigenico multivalente , comprende l’unità base [CRM197-3,6A,7F]n=1per circa il 7 % della dispersione e polimeri della stessa con composizione [CRM197-3,6A,7F]n=3.6per circa il 27 % della dispersione, e fino a [CRM197-3,6A,7F]n=22per il resto della dispersione che rappresenta la forma principale (66 %)del costrutto molecolare in termini di prodotto di reazione. Polimeri della unità base del costrutto molecolare sono ottenuti come entità molecolari crosslegate a causa della polifunzionalità degli antigeni Ps (ca. 2 % di attivazione DAB, su basi molari, come mostrato dalla spettroscopia<1>H-NMR) e della polifunzionalità della proteina-vettore (40 amino gruppi reattivi / mole, disponibile come 39 Lisine 1 amino derivante dall’amino acido N-terminale all’interno della struttura comprendente i totali 535 aa della sequenza.
La Figura 11 mostra l’analisi GPC, come un esempio, sullo stesso gel Sepharose 4B-CL, dei quattro componenti solo miscelati insieme (CRM197 Ps 3-DAB Ps 6A-DAB Ps 7F-DAB)in modo da verificare l’assenza di qualsiasi significativa formazione di complesso tra i singoli antigeni. I metodi chimici per la titolazione delle tre strutture Ps includono il dosaggio dell’acido uronico (tipo 3), fosforo (tipo 6A) ed esosamine (tipo 7F)in accordo alle richieste delle linee guida dell’ OMS (organizzazione Mondiale della Sanità ).
La seguente Tabella 2 mostra la caratterizzazione delle masse molecolari, disperse, dei tre Ps-DAB miscelati come analizzati per SEC-MALLS, come riferimento.
TABELLA 2
Massa alta Massa media Massa bassa (g/mol) (g/mol) (g/mol)
<5>2.75x10 7.27x10<4>1.81x10<4>
(17.0 %) (70.5 %) (12.5%)
Considerando le differenti BRU delle tre strutture dei Ps, il numero medio ± SD delle BRU/Ps à ̈ 112 ± 62
La Figura 12 mostra l’analisi SEC-HPLC dell’antigene multivalente, dopo la purificazione su Sepharose 4B-CL, con specifico riferimento al profilo della proteinavettore CRM197.
Le seguenti condizioni sperimentali erano usate nell’analisi SEC-HPLC :
Colonna : Phenomenex, Biosep-SEC-S3000, 300x7.80 (Vo 6.92 min. ; Vt 12.5 min.
Range di differenziamento dei PM : 700K – 5K
Eluente : NaCl 0.14 M NaH2PO40.05 M pH 6.80 Flusso : 1 ml/min
Rivelatore : 280 nm (determinazione della proteina CRM197)
La Figura 13 mostra l’analisi SEC-HPLC del CRM197 come proteina nativa, quando miscelata con Ps3-DAB, Ps6A-DAB e Ps7F-DAB. Le condizioni sperimentali sono le stesse come sopra riportate per le analisi eseguite in Figura 12.
Alla luce delle analisi sopra riportate il coniugato appare come una entità molecolare polidispersa nel PM, da monomerica a polimerica, che contiene l’unità base del costrutto molecolare riportato nell’equazione chimica [CRM197-(Ps)3], con un PM medio calcolato di ca. 2.7x10<5>quando si consideri il PM medio delle strutture Ps-DAB attivate polifunzionali (stimato per SEC-MALLS)a ca. 0.7x10<5>e quella del CRM197 (6.15x10<4>consistente con la sequenza di 535 aa); in accordo a ciò, le varie unità cross-legate di questa struttura base raggiunge un PM di ca. 6 milioni come valutato per SEC-MALLS. Il rapporto in peso tra la proteina-vettore e ciascuno dei tre Ps tipo-specifici à ̈ ca. 1.0 ; questo rapporto in peso corrisponde a un rapporto molare medio (R) proteina / Ps tipo-specifico di 1.0, equivalente a una mole di proteina / mole di Ps tipo-specifico, come ben suggerito dalla equazione chimica d’equilibrio.
Di conseguenza, l’entità molecolare sperimentalmente ottenuta, cross-legata, risponde a un modello molecolare costituito da diverse unità polimeriche dell’unità base consistenti di una mole di proteinavettore trasportante un totale di tre moli di Ps tipospecifico (una mole per ogni Ps tipo-specifico).
ESEMPIO 3: Analisi immunochimica del costrutto molecolare antigenico multivalente CRM197-3,6A,7F L’analisi immunochimica del costrutto molecolare antigenico multivalente CRM197-3,6A,7F à ̈ stata eseguita per SDS-PAGE usando le condizioni analitiche in accordo a Laemmli U.K., Nature 227, 680-685 (1970), qui inserito per riferimento.
La Figura 14 mostra l’analisi SDS-PAGE (in tampone glicina 9 %) mostrante il profilo dell’antigene multivalente purificato.
La Figura 15 mostra l’analisi immunoblot (Western blot)dell’antigene multivalente come rivelato qualitativamente dagli anticorpi (policlonali) dei sieri omologhi. Le condizioni analitiche usate erano quelle riportate da Towbin H. et al., PNAS 76 : 4350-4354 (1979). Silver staining in accordo a Porro M. et al., Anal. Biochem. 118: 301-306 (1981).
Gli anticorpi sierici policlonali , Ps tipo-specifici, sono descritti nella sezione sottostante dedicata al metodo d’inibizione ELISA.
Determinazione qualitativa e quantitativa di ciascun componente antigenico Ps sulla base dell’inibizione-ELISA usando anticorpi policlonali (o monoclonali).
Come ben si sa fin dalla nascita dell’Immunochimica, branca del più ampio campo dell’Immunologia, fondata negli anni Trenta del secolo passato, gli antigeni capsulari polisaccaridici sono composti di Unità Base Ripetute (BRU)che possono essere costituite da monosaccaridi omologhi (es.: Ps meningococcici) così come da più complesse sequenze di etero monosaccaridi includenti bi/tri/tetra/penta/esa/epta – sequenze saccaridiche (es.: Ps pneumococcici). Una sequenza media da 5 (preferibilmente 8) a 12 residui monosaccaridici formano la struttura base di un epitopo degli antigeni polisaccaridici, che conferiscono la dovuta specificità immunologica ad ogni struttura dei vari Ps. Questa grandezza, tipica di un singolo epitopo all’interno del sistema ABO o all’interno di una sequenza di struttura di un epitopo che si ripete all’interno di antigeni Ps batterici capsulari, à ̈ coerente con la grandezza del sito di combinazione di un anticorpo (Kabat E.A., “The nature of an antigenic determinant†J. Immunol. 97 : 1-11 , 1966) e, su queste basi, à ̈ stato possibile descrivere la reattività di una struttura Ps verso una specifica popolazione policlonale di anticorpi , mediante l’inibizione della reazione del sistema Ps-Ab usante come inibitori differenti PM del sistema (polidisperso) del Ps, in modo da documentare la relazione esistente tra antigenicità di una struttura Ps contenente unità ripetute BRU (così formanti epitopi ripetuti di identica antigenicità ) e la specificità per esso da parte dell’omologo siero policlonale (Porro M. et al, Mol. Immunol. 22 : 907-919, 1985); per comparazione della MIC50 dei vari PM della polidispersione di un dato ps, à ̈ stato possibile definire la relativa specificità di una popolazione di anticorpi policlonali (o monoclonali) per detti PM e finalmente calcolare la relativa concentrazione delle differenti strutture Ps per una loro determinazione quantitativa.
Avendo un metodo immunochimico attendibile e preciso per mappare e titolare le strutture dei Ps presenti in detto costrutto molecolare, ci sono vantaggi pratici nel determinare le caratteristiche qualitative e quantitative di detto modello di coniugato, rispetto ai metodi chimici,specialmente nei casi in cui vi sono Ps con caratteristiche strutturali di sequenza molto simili tra di loro, come nel caso del tipo 6A e 6B o il tipo 19A e 19F. Infatti, la squisita specificità di un anticorpo può facilmente discriminare tra queste similarità strutturali senza ambiguità e in tempi stretti, a differenza dei metodi chimici.
Il recente sviluppo di anticorpi monoclonali per gli antigeni Ps di S.pneumoniae (Pride M.W. et al., Clin. And Vaccine Immunol. 19(8): 1131-1141, 2012)potrebbe ulteriormente incrementare il potenziale di questo potente metodo di analisi.
La comparazione tra titolazione chimica ed immunochimica di antigeni saccaridici per verificare una possibile correlazione, à ̈ eseguita mediante l’uso dell’inibizione-ELISA, attraverso il parametro della MIC50(Minima Concentrazione Inibente del selezionato antigene saccaridico capace di inibire l’omologo sistema di riferimento Ps-Ab) sperimentalmente determinato, in modo da valutare accuratezza e precisione del metodo immunochimico rispetto a quello chimico nel controllo analitico di questo tipo di costrutto molecolare.
Protocollo d’ Inibizione-ELISA
Il protocollo seguente à ̈ stato applicato all’analisi, in modo da determinare il valore della MIC50 di ciascuno dei tre Ps-DAB derivati e la proteina CRM197 o il coniugato multivalente CRM197-3,6A,7F quali inibitori della reazione omologa di riferimento tra Polisaccaride-Anticorpo (Ps-Ab) o Proteina-Anticorpo (Prot-Ab).
I derivati tipo-specifico di riferimento (Ps-DAB) e il coniugato multivalente CRM197-3,6A,7F sono stati preparati secondo il processo riportato dal titolare nella Rivendicazione 8 del Brevetto Europeo No.
1501542.
I metodi chimici per la titolazione delle tre strutture Ps includono analisi dell’Acido Uronico (tipo 3), Fosforo (tipo 6°) ed Esosamine (tipo 7F) in accordo alle direttive dell’OMS.
La reazione d’inibizione à ̈ basata sul principio, per una data struttura di carboidrato, di una data massa molecolare, d’inibizione della reazione omologa di riferimento in accordo all’equazione immunochimica :
carboidrato
Inibitore
Ps Ab → Ps - Ab
<(purificato) (policlonale o monoclonale) (complesso)>
Così che la differenza in reattività tra la reazione di riferimento e quella inibita à ̈ rappresentativa per la specificità differente o identica della popolazione di anticorpi per l’inibitore. Usando strutture di carboidrati di differente massa molecolare, si può descrivere e costruire la curva sigmoidale tipica di quella specifica reazione e calcolare la MIC50dell’inibitore per poi compararla con quella della struttura del carboidrato di riferimento e quindi stabilire il parametro di Antigenicità dell’inibitore (su basi qualitative) e Specificità dell’anticorpo (su
basi quantitative). Tutti questi concetti ed il
relativo uso pratico sono stati riportati nelle
seguenti pubblicazioni, qui descritte per riferimento :
- Berzofsky J.A. and Schechter A.N. Mol. Immunol.,
18: 751-763 (1981);
- Porro M. et al. Mol. Immunol., 22 : 907-919
(1985).
Metodo d’analisi (illustrativo)
Soluzioni in stock :
• Ps-DAB or CRM197 a 1 mg/ml in PBS pH 7.2-7.4
o PBS 1x (1L)
• 8.0 g NaCl
• 0.31 g KH2PO4
• 2.06 g Na2HPO4.7H2O
• 0.16 g KCl
• Non aggiustare il pH
• TBS-Brij 0,1% (v/v)
o TBS 10x (1l)
• 80 g NaCl
• 1.6 g KCl
• 0.94 g Tris
• 14.56 g Tris-HCl
• 33 ml Brij-35 (30%v/v)
• Stabile a r.t. per 12 mesi
• Diluire 50 ml di tampone in 500 ml acqua MilliQuf
• PBS-Tween20 0,05% (v/v)
• Anticorpi di capra coniugati con perossidasi anti IgG o IgM murine
• Tampone Fosfato-Citrato 0,05M pH 5.0
• H2O230% (v/v)
• O-Fenilenediamina 1 mg/ml in Tampone Fosfato-Citrato 0,05M pH 5.0
• H2SO43M
Procedura:
1. Piastre rivestite (piastra polistirene GREINER 65001 SIGMA cod. M4436)
- Ps a 20 ug/ml PBS pH 7.4 37°C 2 ore o.n. 4°C. - CRM197 a 10 ug/ml PBS pH 7.4 o.n. 4°C.
- Rivestire 100 µl/pozzetto
2. Lavaggio 5x con TBS-Brij 0,1% (v/v) (1° lavaggio 20 sec.)
3. Antisieri policlonali per Pneumococco di riferimento da Statens Serum Institute, Copenhagen, DK (www.ssi.dk) in PBS-Tween 0,05% (v/v) 2 ore 37°C.
Diluizioni finali (come esempi):
a. Antisiero di coniglio verso il gruppo 3 1:100,000 v/v (Positivo ~1.0 OD 490nm)
b. Antisiero di coniglio verso il gruppo 6A 1:25,000 v/v (Positivo~1.0 OD 490nm)
c. Antisiero di coniglio verso il gruppo 7F 1:800,000 v/v (Positivo~1.0 OD 490nm)
4. Campioni incogniti: I campioni incogniti sono interpolati sulla curva sigmoidale di regressione ottenuta con la reazione di riferimento.
5. Siero murino anti-CRM197, diluizione finale, 1:100,000 v/v (Positivo ~1.0 OD 490nm).
TABELLA 3
Inibitore Soluzione Stock dell'Inibitore finale/pozzetto
1 10 100 1 10 100 200 400 ng/ml ng/ml ng/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml
0.5 ng/ml 50 ul
5 ng/ml 50 ul
50 ng/ml 50 ul
0.5 ug/ml 50 ul
5 ug/ml 50 ul
50 ug/ml 50 ul
100 ug/ml 50 ul 200 ug/ml 50 ul 500 ug/ml
1 mg/ml
6. Tempo Incubazione x Inibizione: 15 min
7. Lavaggio 5x con TBS-Brij 0,1% (v/v) (1<o>lavaggio 20 sec.)
8. Anticorpi di capra anti IgG di coniglio o murine coniugati con perossidasi in PBS-Tween 0,05% (v/v) 2 ore a 37°C
9. Lavaggio 5x con TBS-Brij 0,1% (v/v) (1<o>lavaggio 20 sec.)
10. O-Feniilenediamina 1 mg/ml in Tampone Fosfato-Citrato 0,05 M pH 5.0, H2O20,03% (v/v)
11. Dopo 5’ interrompere la reazione con H2SO43M 50 µl/pozzetto
12. Lettura a 490 nm
13. Interpolare i valori del campione incognito sulla curva sigmoidale di regressione ottenuta con la reazione di riferimento
Calcolo della % inibizione :
Valore OD inibito - Valore OD bianco _______________________________________ x 100 = (%) Valore OD Riferimento – Valore OD bianco
Quindi: % Inibizione = 100 - (%)
Calcolo della MIC50:
Questa concentrazione d’inibizione à ̈ determinata al 50 % della funzione di regressione non-lineare o della relativa curva sigmoidale. La SD del metodo à ̈ entro il 20 % del valore medio calcolato.
RISULTATI
I risultati della MIC50per il CRM197 nativo e nella sua forma coniugata come CRM197-Ps3,6A,7F mostra che la reazione di coniugazione non pregiudica le caratteristiche antigeniche del CRM197 (Identità Antigenica di Tipo 1)come si può inferire dalle analisi dei grafici delle Figure 16-17. La Figura 17 illustra la funzione di regressione non-lineare relativa alla curva sigmoidale.
I risultati della MIC50per ciascuno dei tre derivati Ps-DAB , coniugati, sono illustrati nei grafici delle Figure 18-23. Le Figure 19, 21 e 23 mostrano la funzione di regressione non-lineare della curva sigmoide.
ESEMPIO 4 : Determinazione della concentrazione per l’antigene saccaridico sia in forma attivata che coniugata multivalente: comparazione del titolo chimico con il titolo immunochimico
I titoli immunochimici sono ottenuti in accordo al metodo sopra riportato nell’esempio 3 dedicato al metodo d’Inibizione-ELISA ; i titoli chimici sono ottenuti in accordo ai metodi sopra riportati nell’Esempio 2 ; titoli immunochimici di campioni sconosciuti di ciascuno dei tre antigeni saccaridici specifici, sia in forma attivata che coniugata, erano determinati per interpolazione sulla parte lineare della curva standard di riferimento costruita per inibizione-ELISA usando una quantità di antigene saccaridico chimicamente titolata. I valori riportati sono la media di diversi saggi indipendenti. I risultati sono sintetizzati nella successiva Tabella 4.
TABLE 4
___________________________________________________
Titolo Titolo
Chimico Immunochimico (µg/ml) (µg/ml) _____________________________________________________ Ps3 0.80 0.91 (+13.4 %)
1.60 1.77 (+10.6 %) 3.20 3.31 (+3.4 %) 6.40 6.71 (+ 4.8%)
Ps6A 0.63 0.60 (-4.8 %)
1.72 1.92 (+11.6 %) 3.43 3.63 (+5.8 %) 6.87 7.31 (+6.4 %)
Ps7F 1.34 1.43 (+6.7 %)
2.68 3.00 (+11.9 %) 5.37 5.47 (+1.9 %) 10.75 11.07 (+ 3.0 %)
_______________________________________________________ Nota: La SD per il titolo chimico à ̈ entro il 5 % dei valori medi. La SD per I titoli immunochimici à ̈ entro il 20 % dei valori medi, cioà ̈ entro la SD stimata della variazione “da giorno a giorno†del metodo ELISA.
ESEMPIO 5 : Analisi immunologica in un modello murino del costrutto molecolare antigenico multivalente, come un esempio
Formulazione del Vaccino
Media del rapporto Proteina / singolo Ps tipo-specifico : 1.1 ± 0.1 (w/w)
Dose del costrutto molecolare CRM197-3,6A,7F
La dose iniettata à ̈ pari a 0.01 e 0.1 µg di ciascun Ps coniugato tipo-specifico, con e senza AlPO4come adiuvante alla dose fissa di 0.5 mg /dose (equivalente a ca. 0.120 mg di Alluminio). L’adsorbimento del costrutto molecolare multivalente all’adiuvante minerale à ̈ stato ≥ 80 % , in peso, come stimato per ELISA. In accordo alla stechiometria del coniugato multivalente, la dose totale di CRM197 0.01 ug nel caso della dose più bassa e ca. 0.1 ug nel caso della dose più alta riferita a ciascun Ps coniugato tipospecifico. Vale la pena di rimarcare che la dose iniettata di 0.01 ug per Ps tipo-specifico à ̈ la più bassa, immunogenica nel topo, che à ̈ riconosciuta da US-FDA e EMEA per i vaccini coniugati pneumococcici correntemente licenziati, che usano l’Alluminio Fosfato come adiuvante.
Animali
Ciascun gruppo di animali conteneva 10 femmine di ceppo Balb/c (o alternativamente CD1).
Via di somministrazione
i.p.
Protocollo d’immunizzazione
0, 2, 4 settimane; salassi alla settimana 0, 2, 4, 6. Immunizzazione controllo con antigeni Ps non coniugati erano omessi sulla base della conoscenza storica che antigeni Ps altamente purificati non sono significativamente immunogenici in mammiferi e non inducono richiamo immunologico di anticorpi isotipo IgG dopo ripetute iniezioni degli stessi.
Titoli ELISA
Titoli espressi come reazione all’Endpoint mostrante O.D. ≥ 2.0 relativamente alle reazioni controllo per ciascun Ps tipo-specifico e CRM197 o DT (Tossoide Difterico), l’antigene immunogenicamente identico e in correlazione statistica con CRM197 (Porro M. et al. J. Infect. Dis., 142 (5), 716-724, 1980). I sieri murini, in pool per ogni gruppo, erano diluiti serialmente a raddoppio, iniziando dalla diluizione 1/200.
MOPA (test di funzionalità )
Per analizzare l’attività Opsonica degli anticorpi murini policlonali indotti in conseguenza dell’immunizzazione con il costrutto molecolare multivalente, à ̈ stato usato il test MOPA-4 (test battericida Multiplexed via Opsono Fagocitosi)come raccomandato dalle direttive OMS, usando cellule HL60. I titoli sono espressi come media geometrica delle diluizione Endpoint mostranti attività battericida ≥ 50 % per ciascun pool di sieri e a ciascuna dose, come calcolato per interpolazione su una curva standard di riferimento, costruita in parallelo.
RISULTATI IMMUNOLOGICI
Dose di 0.01 µg Ps coniugato, tipo-specifico. Titoli espressi come Media Geometrica delle IgG o IgM verso il Ps tipo-specifico o verso il CRM197, presenti nel pool dei sieri come determinato da ELISA. SD Ã ̈ stimata ± 25 % della Media Geometrica riportata. I titoli MOPA sono riportati in parentesi e calcolati per interpolazione lineare nella procedura del test. I risultati sono sintetizzati nella successiva Tabella 5.
TABELLA 5
Senza Adiuvante Con Adiuvante
Ag
W0 W2 W4 W6 W0 W2 W4 W6
<200 200 800 3,200 3 <200 <200 200 800 <200 < 200 <200 <200
(12) (124)
<200 200 400 3,200 6° <200 <200 200 800 <200 < 200 <200 <200
(6) (135)
<200 200 1,600 6,400 7F <200 <200 200 800 <200 < 200 200 400
(26) (248)
<200 1,600 12,800 25,600 CRM197 <200 <200 800 3,200 <200 200 800 800
Dose di 0.10 µg/Ps coniugato tipo-specifico. Titoli espressi come Media Geometrica delle IgG o IgM verso il Ps tipo-specifico o verso il CRM197, presenti nel pool dei sieri come determinato da ELISA. SD Ã ̈ stimata ± 25 % della Media Geometrica riportata. I titoli MOPA sono riportati in parentesi e calcolati per interpolazione lineare nella procedura del test. I risultati sono sintetizzati nella seguente Tabella 6.
TABELLA 6
Tipo Senza Adiuvante Con Adiuvante
Ps
W0 W2 W4 W6 W0 W2 W4 W6
<200 800 6,400 25,600 3 <200 200 800 6,400 <200 200 400 800 (16) (254) (1,824)
<200 800 3,200 12,500 6° <200 200 800 3,200 <200 200 200 800 (22) (120) (1,150)
<200 1,600 6,400 25,600 7F <200 200 1,600 3,200 <200 200 400 800 (48) (168) (1,580) <200 6,400
CRM197 <200 800 3,200 12,800 25,600 102,400
<200 200
800 1,600
Le sopra elencate Tabelle 5 e 6 mostrano l’induzione anamnestica degli anticorpi isotipo IgG per ciascuno dei quattro componenti del costrutto molecolare multivalente.
In particolare, l’attività di richiamo immunologico osservata per la proteina-vettore à ̈ in parallelo osservata per ciascuno dei Ps antigeni trasportati, un comportamento ben conosciuto e tipico degli antigeni Helper T-dipendenti. L’effetto dell’adiuvante minerale à ̈ particolarmente evidente a queste basse dosi dell’antigene multivalente, un’altra caratteristica degli antigeni Helper T-dipendenti come le proteine che generano una più ampia risposta immunitaria anche grazie all’ulteriore vantaggio del rilascio lento dell’antigene nel tempo, da parte dell’ adiuvante, nel corpo dell’ospite.
Inoltre, l’effetto della glicosilazione sulla proteinavettore CRM197, come generalmente noto per le glicoproteine,può essere di beneficio per la migliorata resistenza di questa proteina verso gli enzimi proteolitici, poiché CRM197 à ̈ una proteina fragile quando esposta alle proteasi contenenti “serina†largamente presenti nei mammiferi (Porro M. et al., J. Infect. Dis., 142 (5), 716-724, 1980).
L’effetto richiamo o “booster†immunologico ottenuto verso la proteina CRM197 sottolinea anche il fatto che il costrutto molecolare multivalente ha il potenziale di funzionare come antigene nell’uomo per la prevenzione della tossicità dovuta alla Tossina Difterica, una proprietà ben documentata del CRM197 in modelli animali (vedere la bibliografia sopra riportata), nel qual caso l’antigene multivalente potrebbe anche essere usato per l’immunizzazione di infanti e bambini sostituendo l’antigene Tossoide Difterico (presente nel vaccino DPT) in modo da ulteriormente ridurre il carico quantitativo degli antigeni pediatrici in uso. Infine, in accordo alle caratteristiche immunologiche degli antigeni Helper T-dipendenti, gli anticorpi isotipo IgM non erano significativamente indotti, né “richiamati†per effetto di memoria immunologica dalla proteina-vettore o dei Ps covalentemente legati nel costrutto molecolare multivalente.
ESEMPIO 6 : Formulazione di un Vaccino Meningococcico Coniugato Quadrivalente (QMCV) e di un Vaccino Pneumococcico Polivalente Coniugato (PPCV) fino a 25-valente
La composizione/formulazione del QMCV può essere limitato a un singolo costrutto molecolare dove una mole (o frazione di essa) della proteina-vettore à ̈ legata e trasporta almeno una mole (o frazione di essa) di ciascuno delle quattro differenti strutture saccaridiche. La rispettiva quantità ponderale dell’antigene multivalente dipende dal PM selezionato delle strutture saccaridiche attivate che possono variare da apteni di basso PM costituiti da pochi (8-12) residui di monosaccaridi o BRU (Unità Base Ripetuta)comprendenti i rispettivi epitopi base [Porro M. et al. Molecular Immunology, 22 : 907-919 (1985); Porro M. et al. Molecular Immunology, 23: 385-391 (1986)] e fino a strutture saccaridiche di alto PM composte anche di 200 BRU o più che contengono la struttura ripetuta dell’epitopo base. In questo caso,la quantità di proteina-vettore per dose umana, può essere ridotta ad almeno il 25 % dell’ammontare presente in una formulazione che usa l’associazione di singoli coniugati gruppo-specifici.
La composizione del PPCV dipende dalla sua formulazione polivalente. Per esempio, per un vaccino 15-valente, contenente 15 sierotipi selezionati,o per un vaccino 18-valente, contenente 18 sierotipi selezionati, come più sopra considerato, solo cinque o sei entità del costrutto antigenico molecolare multivalente saranno necessarie,poiché in ciascuna di esse, una mole (o frazione di essa) della proteina-vettore porterà una mole (o frazione di essa) di ciascuna delle tre differenti strutture saccaridiche tipo-specifico. La corrispondente quantità ponderale dell’antigene multivalente dipende dal PM selezionato delle strutture saccaridiche che possono variare da apteni di basso PM costituiti da poche BRU e comprendenti i rispettivi epitopi (Arndt B. and Porro M. in : Immunobiology of Proteins and Peptides, Edited by M.Z. Atassi, Plenum Press, New York and London, pg. 129-148, 1991)e fino a strutture saccaridiche di alto PM composte anche da 200 BRU o più e contenenti la struttura ripetuta dell’epitopo base. In ogni caso, la quantità di proteina-vettore per dose umana, può essere ridotta ad almeno il 30 % della quantità presente in una formulazione che usa l’associazione di coniugati singoli, tipo-specifici.
BIBLIOGRAFIA
- Dagan R. et al., Vaccine 28 (34): 5513-5523, 2010. - Arndt and Porro, Immunobiology of Proteins and Peptides, Edited by M.Z. Atassi, Plenum Press, New York and London, pages 129-148, 1991.
- European patent EP 1868645
- US Patent No. 4,711,779.
- US Patent No. 5,306,492.
- European patent EP 1501542.
- Besnard J. et al., Nature, 492: 215-220, 2012.
- Porro M. et al. Medecine Tropicale, 43: 129-132, 1983.
- Porro M. et al. Molecular Immunology, 22: 907-919, 1985.
- Porro M. et al. Molecular Immunology, 23: 385-391, 1986.
- Porro M. Edited by R. Bell and G. Torrigiani (World Health Organization), pages 279-306 ; John Wiley & Sons Publishers, New York 1987.
- Uchida T. et al., J. Biol. Chem. 248, 3838-3844, 1973.
- Porro M. et al., J. Infect. Dis., 142 (5), 716-724, 1980.
- Giannini G. et al. , Nucl. Acid Res., 12, 4063-4069, 1984.
- Zucker D. and Murphy J.R., Mol. Immunol. 21, 785-793. - Reeves R.E. and Goebels W.F., J. Biol. Chem.,139: 511-519, 1941.
- Rebers P.A. and Heidelberger M., J. Am. Chem. Soc., 83: 3056-3059, 1961.
- Moreau M. et al., Carbohydrate Res., 182(1):79-99, 1988.
- Laemmli U.K., Nature 227, 680-685, 1970.
- Towbin H. et al., PNAS 76: 4350-4354, 1979.
- Porro M. et al., Anal. Biochem. 118: 301-306, 1981. - Kabat E.A., J. Immunol. 97: 1-11, 1966.
- Pride M.W. et al., Clin. And Vaccine Immunol. 19 (8):1131-1141, 2012.
- Berzofsky J.A. and Schechter A.N. Mol. Immunol., 18: 751-763, 1981.
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Costrutto molecolare antigenico multivalente consistente di una unità base comprendente una proteina-vettore Helper T-dipendente covalentemente legata ad un minimo di tre strutture saccaridiche di differente specificità sierologica, in cui ciascuna struttura saccaridica comprende almeno uno degli epitopi base ripetuti consistenti da un minimo di cinque a dodici residui monosaccaridici, come stimato mediante determinazione della massa molecolare e spettroscopia NMR, detti epitopi base ripetuti essendo stimati per reattività con anticorpi policlonali o monoclonali, tipo-specifici o gruppo-specifici, attraverso la determinazione dei loro rispettivi valori di MIC50nell’inibizione del loro sistema omologo di riferimento Polisaccaride-Anticorpo.
- 2. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo la rivendicazione 1, dove dette strutture saccaridiche sono oligosaccaridi o polisaccaridi.
- 3 Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detto epitopo base ripetuto consiste da un minimo di otto a dodici residui monosaccaridici.
- 4. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, dove la proteinavettore Helper T-dipendente à ̈ scelta dal gruppo comprendente la proteina mutante naturale della difterite CRM197, il Tossoide Difterico, il Tossoide Tetanico, la Proteina D dell’Haemophilus influenzae,le proteine di superficie dello Streptococcus pneumoniae, la tossina dello Streptococcus pneumoniae,e le loro varianti o derivati, come il Tossoide Tetanico chimicamente derivato dallo spaziatore molecolare diidrazide dell’acido adipico.
- 5. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle precedenti rivendicazioni 1-4, dove detti antigeni saccaridici veicolati di differente specificità sierologica, sono selezionati tra quelli di Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Salmonella typhi ed Escherichia coli, o una loro combinazione.
- 6. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo la rivendicazione 5, dove detti antigeni saccaridici veicolati sono almeno tre polisaccaridi capsulari selezionati tra il tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F di Streptococcus pneumoniae e/o tra i polisaccaridi del gruppo A, C, W135 e Y di Neisseria meningitidis e/o polisaccaride di tipo b di Haemophilus influenzae, e/o antigeni polisaccaridici K di Klebsiella pneumoniae o una loro combinazione.
- 7. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo la rivendicazione 6, in cui detto costrutto comprende la proteina-vettore CRM197 e tre polisaccaridi capsulari di Streptococcus pneumoniae scelti tra le triadi di 3,6A,7F; 4,5,9V; 1,6B,14; 18C,19A,23F; 6C,19F,22F; 12F,15B,33F.
- 8. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in forma monomerica o polimerica.
- 9. Costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per l’uso in un vaccino per la protezione di un soggetto dalle infezioni dovute ad almeno un agente scelto tra Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Salmonella typhi e Escherichia coli.
- 10. Formulazione di vaccino comprendente almeno un costrutto molecolare antigenico multivalente come definito in secondo ognuna delle rivendicazioni 1-8 in un veicolo fisiologicamente accettabile, facoltativamente insieme ad un adiuvante o eccipienti farmacologicamente accettabili.
- 11. Formulazione di vaccino secondo la rivendicazione 10, in cui la dose di ciascun antigene saccaridico tipo-specifico veicolato à ̈ nell’intervallo tra 0.1 e 10 µg, preferibilmente essendo 1.0 µg.
- 12. Formulazione di vaccino secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui detto adiuvante à ̈ scelto tra un adiuvante minerale selezionato tra Alluminio Fosfato, Alluminio Idrossido; un adiuvante organico scelto tra adiuvanti basati su squalene quali MF59, QF21, Addavax e un adiuvante biologico scelto tra monofosforil-lipide A e trealoso dicorinomicolato.
- 13. Formulazione di vaccino secondo ognuna delle rivendicazioni 10-12, in cui la quantità di adiuvante à ̈ nell’intervallo tra 0.1-1 mg/dose, preferibilmente essendo 0.5 mg/dose.
- 14. Formulazione di vaccino secondo ognuna delle rivendicazioni 10-13, detta formulazione essendo idonea per la somministrazione per via sottocutanea, intramuscolare o intracutanea.
- 15. Formulazione di vaccino polivalente a largo-spettro secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti Rivendicazioni 10-14, per l’uso in campo medico o veterinario per la protezione di un soggetto dalle infezioni dovute ad almeno un agente selezionato tra Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Salmonella typhi e Escherichia coli.
- 16. Formulazione di vaccino polivalente a largo spettro secondo la rivendicazione 15, in cui detto soggetto appartiene alla popolazione pediatrica.
- 17. Formulazione di vaccino polivalente secondo ognuna delle rivendicazioni 15-16, per la prevenzione di Malattie Invasive Pneumococciche dovute a Streptococcus pneumoniae, comprendente uno o più costrutti molecolari antigenici multivalenti scelti tra CRM197-3,6A,7F; CRM197-4,5,9V; CRM197-1,6B,14; CRM197-18C,19A,23F; CRM197-6C,19F,22F; CRM197-12F,15B,33F.
- 18. Formulazione di vaccino a largo spettro secondo ognuna delle rivendicazioni 15-16, per la prevenzione delle infezioni dovute a Neisseria meningitidis comprendente un costrutto molecolare antigenico multivalente contenente le strutture saccaridiche gruppo-specifiche A, C, W135 e Y.
- 19. Processo di coniugazione per la preparazione del costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni 1-7, comprendente le seguenti fasi: a) attivazione chimica delle almeno tre strutture saccaridiche antigenicamente differenti a polifunzionalità per scoppiamento d’idrogeni in coppie di ossidrili vicinali via ossidazione e aminazione riduttiva formante legami di imina ridotta con uno spaziatore alchilico diamminico, successivamente derivato ad estere attivo; b) coniugazione simultanea delle almeno tre strutture saccaridiche estere-derivate agli amino gruppi della proteina-vettore polifunzionale attraverso la formazione di legami amidici.
- 20. Processo di coniugazione secondo la rivendicazione 19, in cui le strutture saccaridiche sono chimicamente attivate nei loro corrispondenti derivati della diammina dell’acido butirrico e gli esteri attivi sono succinimidil esteri.
- 21. Processo di coniugazione secondo ognuna delle rivendicazioni 19-20 in cui detta proteina-vettore polifunzionale à ̈ il CRM197.
- 22. Processo di coniugazione secondo ognuna delle rivendicazioni 19-21, in cui dette almeno tre strutture saccaridiche sono selezionate tra le seguenti triadi di polisaccaridi dello Streptococcus pneumoniae 3,6A,7F; 4,5,9V; 1,6B,14; 18C,19A,23F; 6C,19F,22F; 12F,15B,33F.
- 23. Processo di coniugazione per preparare un costrutto molecolare antigenico multivalente secondo ognuna delle rivendicazioni 1-7, che comprende la coniugazione simultanea degli amino gruppi della proteina-vettore polifunzionale con almeno tre strutture saccaridiche antigenicamente differenti, via aminazione riduttiva formante legame(i) imina-ridotto(i), dette strutture saccaridiche essendo previamente attivate a monofunzionalità o polifunzionalità , con o senza spaziatori molecolari, per scoppiamento di idrogeni in coppie di ossidrili vicinali via ossidazione.
Priority Applications (17)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000142A ITMI20130142A1 (it) | 2013-01-31 | 2013-01-31 | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
| US14/764,953 US10300135B2 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| ES14704300.4T ES2671953T3 (es) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Vacunas glicoconjugadas polivalentes |
| EP14704300.4A EP2950815B1 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| EA201591425A EA034157B1 (ru) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Вакцинная антигенная мультивалентная молекулярная конструкция, ее получение и применение |
| CA2897272A CA2897272C (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| DK14704300.4T DK2950815T3 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | MULTIVALENT GLYCOCONJUGATE VACCINES |
| CN201480006904.3A CN104955476B (zh) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | 多价的糖结合疫苗 |
| HUE14704300A HUE038166T2 (hu) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalens glikokonjugátum vakcinák |
| AU2014211495A AU2014211495B2 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| SG11201505889RA SG11201505889RA (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| NZ711518A NZ711518A (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| HK15112112.1A HK1211224B (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| PCT/EP2014/051670 WO2014118201A1 (en) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| KR1020157023386A KR102211029B1 (ko) | 2013-01-31 | 2014-01-29 | 다가 당컨쥬게이트 백신 |
| US16/379,049 US11547755B2 (en) | 2013-01-31 | 2019-04-09 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
| US16/379,569 US11147872B2 (en) | 2013-01-31 | 2019-04-09 | Multivalent glycoconjugate vaccines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000142A ITMI20130142A1 (it) | 2013-01-31 | 2013-01-31 | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20130142A1 true ITMI20130142A1 (it) | 2014-08-01 |
Family
ID=48096009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000142A ITMI20130142A1 (it) | 2013-01-31 | 2013-01-31 | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10300135B2 (it) |
| EP (1) | EP2950815B1 (it) |
| KR (1) | KR102211029B1 (it) |
| CN (1) | CN104955476B (it) |
| AU (1) | AU2014211495B2 (it) |
| CA (1) | CA2897272C (it) |
| DK (1) | DK2950815T3 (it) |
| EA (1) | EA034157B1 (it) |
| ES (1) | ES2671953T3 (it) |
| HU (1) | HUE038166T2 (it) |
| IT (1) | ITMI20130142A1 (it) |
| NZ (1) | NZ711518A (it) |
| SG (1) | SG11201505889RA (it) |
| WO (1) | WO2014118201A1 (it) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2897084C (en) | 2013-01-04 | 2019-07-16 | Cheng Der Tony Yu | Vaccines with higher carbohydrate antigen density and novel saponin adjuvant |
| FI3583947T3 (fi) | 2014-01-21 | 2023-10-12 | Pfizer | Streptococcus pneumoniaen kapselipolysakkaridit ja niiden konjugaatit |
| BR112016015835B1 (pt) | 2014-01-21 | 2023-12-26 | Pfizer Inc | Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae |
| US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| IL312327B2 (en) * | 2014-01-21 | 2026-02-01 | Pfizer | Immunogenic preparations comprising conjugated capsular saccharide antigens and their uses |
| CN106659799B (zh) * | 2014-07-25 | 2020-07-17 | 碧奥辛斯有限责任公司 | 用于制备针对因肠致病性细菌引起的感染的广谱疫苗的包含表达内置的多个表位的分子构建体的基本单元的糖缀合物疫苗 |
| KR20250058066A (ko) * | 2015-07-21 | 2025-04-29 | 화이자 인코포레이티드 | 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도 |
| US11058757B2 (en) * | 2016-03-31 | 2021-07-13 | Pogona, LLC | Saccharide-polypeptide conjugate compositions and methods of use thereof |
| US11224652B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-01-18 | Sanofi Pasteur Inc. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3493837B1 (en) | 2016-08-05 | 2022-08-31 | Sanofi Pasteur, Inc. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| CN109890413B (zh) | 2016-09-02 | 2024-04-16 | 赛诺菲巴斯德股份有限公司 | 脑膜炎奈瑟氏菌疫苗 |
| KR101695973B1 (ko) | 2016-10-13 | 2017-01-23 | 재단법인 한국환경조사평가원 | 토양시료 채취현장용 테이블 |
| US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| IL267709B2 (en) | 2016-12-30 | 2025-04-01 | Vaxcyte Inc | Polypeptide-antigen conjugates with unnatural amino acids |
| GB2563563B (en) * | 2017-04-07 | 2020-06-03 | Helier Scient Limited | A specific, rapid test differentiating gram positive and gram negative bacteria |
| BR112019022093A2 (pt) * | 2017-04-22 | 2020-05-05 | Biological E Limited | método aprimorado para a produção em alto nível de crm |
| MX2019014829A (es) | 2017-06-10 | 2020-08-17 | Inventprise Llc | Vacunas de conjugado multivalente con polisacáridos de conjugado bivalente o multivalente que proporcionan inmunogenicidad y avidez mejoradas. |
| US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
| EP3691677A4 (en) | 2017-10-04 | 2021-07-07 | Pogona, Llc | COMPOSITIONS OF SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATES AND THEIR METHODS OF USE |
| EP3720483B1 (en) | 2017-12-06 | 2025-11-19 | Merck Sharp & Dohme LLC | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| WO2019152921A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Sanofi Pasteur Inc. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| BR112020015696A2 (pt) | 2018-02-05 | 2020-12-08 | Sanofi Pasteur, Inc. | Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente |
| BR112020018974A2 (pt) * | 2018-03-23 | 2021-01-05 | Koranex Capital | Glicoconjugados de precisão como ferramentas terapêuticas |
| TW202011985A (zh) | 2018-04-18 | 2020-04-01 | 韓商Ｓｋ生物科學股份有限公司 | 肺炎鏈球菌的莢膜多醣類以及其免疫原性接合體 |
| EP4483896A3 (en) * | 2018-07-04 | 2025-04-02 | Vaxcyte, Inc. | Improvements in immunogenic conjugates |
| EP3897705A2 (en) | 2018-12-19 | 2021-10-27 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US12053515B2 (en) | 2020-08-10 | 2024-08-06 | Inventprise, Inc. | Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24F |
| KR20220102871A (ko) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | (주)셀트리온 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 |
| WO2023133143A1 (en) * | 2022-01-05 | 2023-07-13 | Bluewillow Biologics, Inc. | Intranasal polysaccharide conjugate nanoemulsion vaccines and methods of using the same |
| CN118647396A (zh) | 2022-02-03 | 2024-09-13 | 碧奥辛斯有限责任公司 | 用于细菌和病毒抗原的基于纳米结构的载体系统 |
| KR102637097B1 (ko) | 2022-12-20 | 2024-02-22 | 주식회사 넘버제로 | 생산성 개선을 위한 해조류 양식로프 및 이의 제조 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1501542B1 (en) * | 2002-05-09 | 2007-08-22 | Biosynth S.R.L. | Improved polysaccharide and glycoconjugate vaccines |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US471179A (en) * | 1892-03-22 | Wood-screw | ||
| IT1187753B (it) * | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
| US5153312A (en) | 1990-09-28 | 1992-10-06 | American Cyanamid Company | Oligosaccharide conjugate vaccines |
| US5371197A (en) * | 1991-09-24 | 1994-12-06 | Merck & Co., Inc. | Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine |
| US7018637B2 (en) * | 1998-02-23 | 2006-03-28 | Aventis Pasteur, Inc | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines |
| IL308456A (en) * | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
-
2013
- 2013-01-31 IT IT000142A patent/ITMI20130142A1/it unknown
-
2014
- 2014-01-29 SG SG11201505889RA patent/SG11201505889RA/en unknown
- 2014-01-29 ES ES14704300.4T patent/ES2671953T3/es active Active
- 2014-01-29 AU AU2014211495A patent/AU2014211495B2/en active Active
- 2014-01-29 KR KR1020157023386A patent/KR102211029B1/ko active Active
- 2014-01-29 CN CN201480006904.3A patent/CN104955476B/zh active Active
- 2014-01-29 NZ NZ711518A patent/NZ711518A/en unknown
- 2014-01-29 WO PCT/EP2014/051670 patent/WO2014118201A1/en not_active Ceased
- 2014-01-29 HU HUE14704300A patent/HUE038166T2/hu unknown
- 2014-01-29 CA CA2897272A patent/CA2897272C/en active Active
- 2014-01-29 DK DK14704300.4T patent/DK2950815T3/en active
- 2014-01-29 US US14/764,953 patent/US10300135B2/en active Active
- 2014-01-29 EA EA201591425A patent/EA034157B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-01-29 EP EP14704300.4A patent/EP2950815B1/en active Active
-
2019
- 2019-04-09 US US16/379,569 patent/US11147872B2/en active Active
- 2019-04-09 US US16/379,049 patent/US11547755B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1501542B1 (en) * | 2002-05-09 | 2007-08-22 | Biosynth S.R.L. | Improved polysaccharide and glycoconjugate vaccines |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PORRO M ET AL: "A molecular model of artificial glycoprotein with predetermined multiple immunodeterminants for gram-positive and gram-negative encapsulated bacteria", MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 23, no. 4, 1 April 1986 (1986-04-01), pages 385 - 391, XP023682553, ISSN: 0161-5890, [retrieved on 19860401], DOI: 10.1016/0161-5890(86)90136-7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2014211495B2 (en) | 2018-08-02 |
| US10300135B2 (en) | 2019-05-28 |
| EP2950815A1 (en) | 2015-12-09 |
| HK1211224A1 (en) | 2016-05-20 |
| SG11201505889RA (en) | 2015-08-28 |
| US20170143821A1 (en) | 2017-05-25 |
| DK2950815T3 (en) | 2018-07-23 |
| ES2671953T3 (es) | 2018-06-11 |
| CA2897272A1 (en) | 2014-08-07 |
| EA034157B1 (ru) | 2020-01-13 |
| KR102211029B1 (ko) | 2021-02-03 |
| US20190224310A1 (en) | 2019-07-25 |
| US11547755B2 (en) | 2023-01-10 |
| CA2897272C (en) | 2022-04-12 |
| US11147872B2 (en) | 2021-10-19 |
| CN104955476A (zh) | 2015-09-30 |
| WO2014118201A1 (en) | 2014-08-07 |
| EA201591425A1 (ru) | 2015-11-30 |
| KR20160002687A (ko) | 2016-01-08 |
| NZ711518A (en) | 2019-05-31 |
| HUE038166T2 (hu) | 2018-09-28 |
| CN104955476B (zh) | 2020-06-16 |
| EP2950815B1 (en) | 2018-04-18 |
| AU2014211495A1 (en) | 2015-09-17 |
| US20190224309A1 (en) | 2019-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11147872B2 (en) | Multivalent glycoconjugate vaccines | |
| JP4754689B2 (ja) | 複数種オリゴ糖の糖接合体型の細菌性髄膜炎ワクチン | |
| Lesinski et al. | Vaccines against polysaccharide antigens | |
| AU2025237966A1 (en) | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof | |
| ES2200067T3 (es) | Fragmentos de polisacaridos antigenicos de tipo ii y tipo iii de streptococcus del grupo b, que tienen una estructura terminal 2,5-anhidro-d-manosa, y su vacuna conjugada. | |
| US11246919B2 (en) | Glycoconjugate vaccines comprising basic units of a molecular construct expressing built-in multiple epitopes for the formulation of a broad-spectrum vaccine against infections due to enteropathogenic bacteria | |
| TW202108167A (zh) | 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途 | |
| Gao et al. | Immunoactivity of protein conjugates of carba analogues from Neisseria meningitidis a capsular polysaccharide | |
| BRPI0612656A2 (pt) | composição imunogênica, vacina, e, kit de vacina para a administração concomitante ou seqüencial | |
| Prasanna et al. | Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine | |
| JP2026016501A (ja) | コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用 | |
| JP2020128372A (ja) | 髄膜炎菌組成物およびその方法 | |
| Haldar et al. | A candidate glycoconjugate vaccine induces protective antibodies in the serum and intestinal secretions, antibody recall response and memory T cells and protects against both typhoidal and non-typhoidal Salmonella serovars | |
| Zhang et al. | Moderate PEGylation of the carrier protein improves the polysaccharide-specific immunogenicity of meningococcal group A polysaccharide conjugate vaccine | |
| KR20260015203A (ko) | 호흡기 세포융합 바이러스 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법 | |
| HK1211224B (en) | Multivalent glycoconjugate vaccines | |
| Prasad | Conjugate Vaccines: Design and Development Considerations | |
| HK40074440B (en) | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof | |
| HK40023130B (en) | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |