ITMI20131094A1 - Metodo per predire e determinare allergie - Google Patents

Description

Titolo: "Metodo per la previsione e la rilevazione delle allergie"

DESCRIZIONE

Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda un metodo per la previsione e la rilevazione delle allergie in un soggetto e un kit adatto all’esecuzione di detto metodo.

Sfondo dell’invenzione

Gli attori principali della risposta immunitaria sono i linfociti, le cellule presentanti l'antigene (APC) e le cellule effettrici. Essi interagiscono in una rete altamente complessa e integrata, che comprende un ampio numero di differenti molecole, ognuna in grado di modulare una risposta specifica.

La risposta immunitaria à ̈ innescata in organi e tessuti linfoidi, che rappresentano il mezzo ideale per il verificarsi della risposta e che sono organizzati in modo da concentrare antigeni, cellule presentanti l'antigene e linfociti in modo da ottimizzare e massimizzare le loro interazioni. Ci sono tre principali tipi di organi linfoidi periferici: i linfonodi, i tessuti linfatici sottomucosali e la milza.

I linfonodi sono aggregati nodulari di tessuto linfoide che si trovano lungo tratti linfatici all'interno del corpo. Cellule presentanti l'antigene che hanno contattato un antigene migrano ai linfonodi dove possono presentare tali antigeni ai gruppi di linfociti naà ̄ve. Tonsille e altri tessuti linfoidi sottomucosali (come le placche di Peyer nell'intestino) controllano gli antigeni che possono entrare attraverso la cavità orale, il tratto gastrointestinale e attraverso altre superfici mucose. Gli antigeni vengono poi convogliati direttamente da questi siti ai tessuti linfoidi sottostanti attraverso cellule epiteliali specializzate. Infine, la milza à ̈ l'organo che porta i linfociti a contatto con gli antigeni che circolano nel sangue. Il sangue che entra nella milza scorre attraverso una vasta rete di canali che sono rivestiti di fagociti e cellule dendritiche. Queste cellule presentanti l'antigene possono quindi presentare gli antigeni ai linfociti nella milza.

Prima che i microrganismi invadano, i linfociti B e T naà ̄ve sono in circolazione in tutto il corpo, in movimento tra il sangue e i tessuti linfoidi periferici, come la milza e linfonodi, i tessuti dove hanno le maggiori possibilità di rilevare un antigene estraneo. Contemporaneamente, le cellule del sistema immunitario innato sono per lo più inattive in periferia, in attesa di essere stimolate da un microbo invasore.

I microrganismi invasori violano l'epitelio e si incontrano con i meccanismi dell'immunità innata. Questi meccanismi innati promuovono l'infiammazione locale e cercano di uccidere gli invasori. Contemporaneamente, alcuni dei microrganismi sono rivelati da recettori sulle cellule presentanti l'antigene, e le attivano. Le APC internalizzano i microrganismi per endocitosi, ne mostrano parti sulla loro superficie e migrano a un linfonodo locale per cercare un linfocita in grado di riconoscere gli antigeni microbici che stanno mostrando. Un linfocita che ha un recettore specifico per l'antigene visualizzato lo legherà, causando l’attivazione del linfocita. A questo punto inizia la risposta immunitaria adattativa.

La risposta immunitaria adattativa consiste nell'attivazione e nella differenziazione di linfociti B e/o T. I linfociti attivati si dividono e maturano, producendo cellule effettrici che finiranno per eliminare il microbo. I leucociti non linfoidi cooperano con i linfociti.

Sebbene il sistema immunitario svolga funzioni vitali, i suoi meccanismi possono anche essere alterati, con conseguenti malattie, come per esempio ipersensibilità, autoimmunità, perdita di autotolleranza, infiammazione cronica e così via.

Ipersensibilità

L’ipersensibilità à ̈ una reazione immunitaria anormale o patologica che à ̈ causata da una risposta immunitaria a ripetuta esposizione ad un antigene. Malattie da ipersensibilità includono malattie autoimmuni, in cui le risposte immunitarie sono dirette contro auto-antigeni, e malattie che derivano da reazioni incontrollate o eccessive verso antigeni estranei. Poiché queste reazioni tendono a verificarsi contro antigeni che non possono essere evitati (cioà ̈ auto-antigeni) e per sistemi di feedback positivi intrinseci ai vari aspetti della risposta immunitaria, le malattie da ipersensibilità tendono a manifestarsi come problemi cronici.

Le malattie da ipersensibilità sono raggruppate in quattro grandi categorie in base alle loro cause di fondo:

(i) ipersensibilità immediata (ipersensibilità di tipo I);

(ii) ipersensibilità anticorpo-mediata (ipersensibilità di tipo II);

(iii) ipersensibilità mediata da immunocomplessi (ipersensibilità di tipo III);

(iv) ipersensibilità cellulo-mediata (ipersensibilità di tipo IV).

L’ipersensibilità immediata à ̈ una rapida risposta IgE- e mast cellula-mediata vascolare e della muscolatura liscia che si verifica in individui geneticamente predisposti per esposizione a certi antigeni ambientali a cui sono stati precedentemente esposti. Queste reazioni sono note anche come allergie, e gli antigeni che inducono queste reazioni sono comunemente chiamati allergeni. Le manifestazioni di queste reazioni possono variare in intensità da febbre da fieno lieve a grave anafilassi causata da ingestione di farmaci, come la penicillina, o da iniezione come il veleno di insetti. Le allergie sono i più comuni disturbi del sistema immunitario e possono colpire fino al 20% della popolazione.

I trattamenti per le allergie comprendono evitare allergeni noti, l’assunzione di steroidi che modificano il sistema immunitario in generale e di farmaci come gli antistaminici e decongestionanti, che riducono i sintomi. Molti di questi farmaci vengono assunti per via orale, mentre l'adrenalina, che viene utilizzata per il trattamento di reazioni anafilattiche, viene iniettata. L'immunoterapia utilizza allergeni iniettati per desensibilizzare la risposta del corpo.

Allergeni

Molti allergeni come la polvere o il polline sono particelle sospese nell'aria. In questi casi, i sintomi si presentano nelle zone a contatto con l'aria, come gli occhi, il naso e polmoni. Per esempio, la rinite allergica, conosciuta anche come febbre da fieno, provoca irritazione del naso, starnuti, prurito e arrossamento degli occhi. Allergeni inalati possono anche portare a sintomi asmatici, causati dal restringimento delle vie aeree (broncocostrizione) e da aumento della produzione di muco nei polmoni, a respiro corto (dispnea), tosse e respiro affannoso.

Oltre a questi allergeni ambientali, le reazioni allergiche possono derivare da alimenti, punture di insetti, e reazioni a farmaci come l'acido acetilsalicilico e ad antibiotici come la penicillina. I sintomi di allergia alimentare includono dolore addominale, gonfiore, vomito, diarrea, prurito e gonfiore della pelle durante l'orticaria. Le allergie alimentari raramente causano reazioni respiratorie (asmatiche), o riniti. Punture di insetti, antibiotici e alcuni farmaci producono una risposta allergica sistemica chiamata anche anafilassi; possono essere colpiti sistemi multiorgano, compreso il sistema digerente, il sistema respiratorio, e il sistema circolatorio. A seconda del grado di severità, possono insorgere reazioni cutanee, broncocostrizione, edema, ipotensione, coma e anche morte.

Sostanze che vengono a contatto con la pelle, come il lattice, sono anche cause comuni di reazioni allergiche, note come dermatite da contatto o eczema. Allergie cutanee spesso causano eruzioni cutanee, o gonfiore e infiammazione della pelle, in quello che à ̈ conosciuto come un "reazione eritemato-pomfoide", caratteristica di orticaria e angioedema. L’applicazione di nuove sostanze alla pelle può generare, quindi, un rischio di sensibilizzazione seguita da allergia.

I fattori di rischio per l'allergia possono essere collocati in due categorie generali, ovvero fattori derivanti dall’ospite e fattori ambientali. Fattori dell'ospite includono ereditarietà, sesso, razza ed età, tra cui l’ereditarietà à ̈ di gran lunga il più significativo. Tuttavia, ci sono stati recenti aumenti dell'incidenza di disturbi allergici che non possono essere spiegati da soli fattori genetici. I quattro principali candidati ambientali sono le alterazioni dovute all’ esposizione a malattie infettive durante l'infanzia, l'inquinamento ambientale, i livelli di allergeni e i cambiamenti nella dieta.

Il lattice può scatenare una reazione IgE-mediata cutanea, respiratoria, e sistemica. La prevalenza di allergia al lattice nella popolazione generale si pensa possa essere meno dell'uno per cento. In uno studio ospedaliero, un paziente chirurgico su 800 (0,125%) segnala sensibilità al lattice, anche se la sensibilità tra gli operatori sanitari à ̈ più elevata, tra il 7 e il 10%.

La risposta più diffusa al lattice à ̈ una dermatite allergica da contatto, una reazione di ipersensibilizzazione ritardata che appare sottoforma di lesioni secche e crostose. Questa reazione solitamente dura tra le 48 e le 96 ore. Il sudare o lo strofinare l'area sotto il guanto aggrava le lesioni, in alcuni casi portando anche a ulcerazioni. Reazioni anafilattiche avvengono più frequentemente in pazienti sensibilizzati, che sono stati esposti ai guanti di lattice del chirurgo durante operazioni di chirurgia addominale, ma anche altre esposizioni delle mucose, come interventi dentali, possono produrre reazioni sistemiche.

La sensibilità al lattice ed alle banane possono cross-reagire; inoltre, coloro che hanno allergie al lattice possono anche avere sensibilizzazioni all'avocado, al kiwi ed alla castagna. Questi pazienti spesso hanno prurito periorale ed orticaria locale. Solo occasionalmente avere queste allergie dovute al cibo ha prodotto risposte sistemiche. I ricercatori sospettano che la cross-reattività del lattice con la banana, l'avocado, il kiwi e la castagna avvengano perchà ̈ le proteine del lattice sono strutturalmente omologhe con alcune proteine vegetali.

Gli apteni chimicamente reagiscono con, si legano a, e cambiano la forma delle proteine integrali di membrana sulle cellule epiteliali esposte. Il sistema immunitario non riconosce le cellule sensibilizzate come parti normali del corpo, causando una risposta immune mediata dalle cellule T. La risposta dermatologica risultante alla reazione include rossore, gonfiore, papule, vescicole bolle e striature.

Basi genetiche

Le malattie allergiche sono fortemente famigliari: i gemelli identici sono soggetti ad avere le stesse malattie allergiche in circa il 70% dei casi; la stessa allergia avviene nel 40% dei casi in gemelli non identici. I genitori allergici sono maggiormente soggetti ad avere figli allergici e quelle allergie dei bambini possono essere più gravi di quelle di bambini di genitori non allergici. Alcune allergie, comunque, non sono costanti nelle genealogie; genitori che sono allergici alle arachidi posso avere figli che sono allergici all'ambrosia. Sembra che la probabilità di sviluppare allergie sia ereditaria e legata ad irregolarità nel sistema immunitario, ma non lo à ̈ lo specifico allergene.

Il rischio di sensibilizzazione allergica e lo sviluppo di allergie varia con l'età, ed i bambini piccoli presentano il più alto rischio. Diversi studi hanno dimostrato che i livelli di IgE sono più alti nell'infanzia e scendono rapidamente in età compresa tra i 10 ed i 30 anni. Il picco di prevalenza di febbre da fieno à ̈ più alto nei bambini e nei giovani adulti e l'incidenza di asma à ̈ più alta nei bambini sotto i 10. Nel complesso, i ragazzi hanno un rischio più elevato di sviluppare allergie rispetto alle ragazze, anche se per alcune malattie, in particolare asma nei giovani adulti, le femmine hanno una maggiore probabilità di essere colpite.

Le differenze legate al sesso tendono a diminuire in età adulta. L’etnia può svolgere un ruolo in alcune allergie; tuttavia, à ̈ stato difficile separare i fattori razziali dalle influenze ambientali e dai cambiamenti dovuti alla migrazione. È stato suggerito che diversi loci genetici siano responsabili per l'asma, per essere precisi, in persone di origine Europea, Ispanica, Asiatica ed Africana.

La pelle

La pelle à ̈ una importante fonte potenziale di sensibilizzazione, un innesco di allergia, e un tessuto dove possono essere visualizzati sintomi, e a questo proposito, i cosmetici includono un numero sempre crescente di componenti. A causa di questo, la questione della potenziale sensibilizzazione e dell’allergia à ̈ sempre un importante punto di sperimentazione dei cosmetici prima della loro commercializzazione.

Cosmetici e allergie

I cosmetici sono definiti come "articoli destinati ad essere strofinati, versati, sparsi, o spruzzati sopra, introdotti, o altrimenti applicati al corpo umano o parti di esso per la pulizia, l’abbellimento, promuovere l'attrattiva, o alterare l'aspetto".

Il loro uso à ̈ molto diffuso in tutto il mondo. Un recente studio ha rilevato che, in media, gli adulti usano nove prodotti cosmetici al giorno. Più del 25% delle donne ne usa 15 o più.

Correlate all'uso dei cosmetici, potrebbero verificarsi reazioni avverse. La dermatite da contatto dovuta a cosmetici o ingredienti dei cosmetici ha una prevalenza che oscilla dall’1-3% al 2-4% fino al 10% in diversi studi, ma la percentuale reale à ̈ probabilmente molto più alta perché molte reazioni sono spesso lievi, transitorie e sopportabili, e sono risolte semplicemente non utilizzando più o cambiando il prodotto che ha causato la reazione.

La dermatite da contatto può essere divisa in dermatite irritativa da contatto (ICD) e dermatite da contatto allergica (ACD). Le due condizioni sono clinicamente indistinguibili e spesso coesistono. Molti degli allergeni che causano ACD sono anche irritanti.

L’ICD à ̈ una reazione cutanea non-immunologica che non comporta sensibilizzazione del sistema immunitario (precedente esposizione all'allergene). Gli irritanti per la pelle più comuni sono acidi, alcali, detergenti e solventi che danneggiano la funzione di barriera della pelle. Comuni cosmetici/prodotti per la cura della pelle che causano irritazione cutanea includono: saponi da bagno e shampoo, ombretti e mascara, struccanti, antitraspiranti, soluzioni per permanenti, acqua presente nei cosmetici e nei prodotti per la cura della pelle se la pelle à ̈ molto secca.

La dermatite irritativa da contatto à ̈ un fattore di rischio per la dermatite allergica da contatto, in quanto la penetrazione di allergeni da contatto à ̈ maggiore quando la funzionalità di barriera della pelle à ̈ disturbata.

La dermatite allergica da contatto (ACD) à ̈ una reazione immunologica della pelle che si verifica in un individuo geneticamente predisposto. La risposta allergica si verifica solo quando il sistema immunitario di una persona si à ̈ sensibilizzato nei confronti dell'allergene. In individui sensibilizzati, la dermatite allergica da contatto compare tra le 12 e le 24 ore e si esacerba fino a 96 ore dopo il contatto con l'allergene scatenante, con un picco solitamente a 48 ore. L’ACD à ̈ solitamente accompagnata da prurito intenso. Il numero di prodotti chimici noti per essere in grado di causare ACD à ̈ stimato vicino a 3.000 ed à ̈ in costante aumento.

I gruppi di allergeni che più frequentemente causano allergia ai cosmetici sono i conservanti, le essenze e la parafenilendiammina (PPD), che può essere trovata in tinture permanenti per capelli.

I conservanti nei cosmetici e nei prodotti per la cura della pelle sono la causa più comune di reazioni cutanee. Questi possono essere classificati in tre grandi categorie: antimicrobici, antiossidanti e sostanze che assorbono la luce ultravioletta. Gli antimicrobici possono essere ulteriormente suddivisi in conservanti a base di formaldeide, conservanti che rilasciano formaldeide e conservanti che non rilasciano formaldeide. I conservanti che rilasciano formaldeide (FRP) includono quaternium-15, diazolidinil urea, imidazolidinil urea, 2-bromo-2nitro-1,3-diolo, e DMDM idantoina. I conservanti che non rilasciano formaldeide includono parabeni, metilcloroisotiazolinone-metilisotiazolinone (MCI-MI), metildibromoglutaronitrile-fenossietanolo (MDBGN-PE), e iodiopropinil butilcarbammato.

Le essenze rappresentano il secondo gruppo più comune di antigeni cosmetici. Il Balsamo del Perù à ̈ una delle fragranze più coinvolte: si tratta di un liquido aromatico che deriva dalla corteccia dell'albero Myroxylon balsamum, un albero originario di El Salvador. E’ una miscela di sostanze tra cui benzil acetato, alcol benzoile, acido cinnamico, alcool cinnamico, aldeide cinnamica, eugenolo, isoeugenolo, vanillina, nerodilolo e ingredienti chiave possono essere trovati in profumi e articoli da toilette, in aromi di alimenti e bevande, e medicinali. Altri agenti sono rappresentati da miscele di fragranze a base di: muschio di quercia, aldeide cinnamica, alcool cinnamico, alfa-amil-alcol cinnamico, geraniolo, idrossicitronella, isoeugenolo ed eugenolo, muschio ambretta e moschene.

La parafenilendiammina (PPD) à ̈ il colorante più importante usato per la colorazione permanente (a ossidazione) dei capelli ed à ̈ il terzo ingrediente più comune dopo essenze e conservanti che causa la dermatite da contatto da cosmetici. Sostanze correlate alla PPD sono benzocaina e procaina (anestetici locali), coloranti azoici (usati in tinture temporanee e semi-permanenti per capelli, inchiostri per penne), coloranti tessili (in particolare vestiti scuri e abbigliamento in fibre sintetiche come poliestere o nylon), acido paraminobenzoico (PABA, reperibile nelle creme solari).

Altri importanti allergeni sono rappresentati da betaina cocamidopropile (tensioattivo non ionico che si trova principalmente in shampoo, saponi e gel da bagno); estratti botanici naturali come l’olio della pianta del tà ̈, la propoli, l’henné; la lanolina à ̈ usata nei cosmetici per le sue proprietà emollienti, idratanti ed emulsionanti.

In Italia, le regole sulla sicurezza dei cosmetici seguono le direttive UE 2003/15/CE e 2003/80/CE, attuate con D.L. 50/05, che aggiorna il precedente D.L. 713/86. In accordo ad esso, il produttore deve dichiarare su ogni prodotto: la sua formula qualitativa e quantitativa, le proprietà fisicochimiche delle materie prime e del prodotto finito, il metodo di produzione, i dati inerenti la valutazione di sicurezza del prodotto, la prova dell’effetto rivendicato e i dati esistenti riguardanti eventuali effetti indesiderati sulla salute umana conseguenti al suo uso. La lista degli ingredienti in ordine decrescente di quantità deve essere presente sull’etichetta.

Le fragranze e loro materie prime, a parte una lista il cui uso à ̈ specificamente sottoposto a limitazioni, possono anche essere identificate dal termine generale “profumi†.

Inoltre, non vi à ̈ una specifica norma che controlla l’uso dei termini “ipoallergenico†o “anallergenico†, che, sebbene scoraggiato dal Ministero della Salute Italiana (cf. circolare n.66, 11.08.1980), può essere adottato adottato dai prodotti che cercano di ridurre il più possibile l’uso nelle formulazioni cosmetiche dei prodotti più suscettibili di causare allergia. Ciò nonostante, questo non significa che essi evitano reazioni allergiche, poiché l’allergia à ̈ una reazione personale e idiosincratica, e nessuno può garantire con certezza che un cosmetico possa essere completamente sicuro.

Saggi diagnostici

Esiste una varietà di test per diagnosticare condizioni allergiche. I risultati dovrebbero essere ordinati e interpretati alla luce della storia della persona interessata rispetto all’esposizione, poiché molti risultati positivi nei test non correlano con un’allergia clinicamente rilevante. I test includono sia il contatto con la cute di una serie di possibili allergeni e la ricerca di reazioni come il rigonfiamento sia esami del sangue per la ricerca di IgE specifiche per l’allergene. Perciò, per determinare se un prodotto à ̈ allergenico o no, à ̈ necessario allestire specifici saggi in vitro e in vivo.

Il test cutaneo à ̈ il gold standard per l’identificazione di un allergene da contatto. Il test può essere condotto sia come “prick test†o come †patch test†. Nei prick test, piccole quantità di allergeni sospetti e/o i loro estratti sono introdotti nell’avambraccio interno o sul dorso del paziente mediante una piccola puntura con uno strumento di plastica o di metallo. Se il paziente à ̈ allergico alla sostanza, allora una reazione infiammatoria visibile si verificherà di solito entro 30 minuti. Nei patch test, dischetti adesivi, invece che punture, sono applicati sul dorso. La pelle à ̈ poi esaminata alla ricerca di possibili reazioni locali per almeno due volte, solitamente a 48 ore dall’applicazione del cerotto e anche due/tre giorni più tardi. Liste standardizzate di allergeni sono state progettate e validata da collaborazioni di società di ricerca dermatologica, tenendo in considerazione la diversa prevalenza di specifici allergeni nelle differenti aree mondiali. I test cutanei hanno una buona riproducibilità e i risultati, almeno per i prick test, possono essere rapidi, ma à ̈ necessario addestramento per eseguire le analisi e interpretare i risultati; il test può essere influenzato dall’età del paziente, dalla sensibilità all’istamina, dalla presenza di malattie come cancro, immunodeficienza e dall’uso di farmaci, in particolare corticosteroidi. In aggiunta, i pazienti potrebbero sviluppare una reazione locale estesa, e, occasionalmente, reazioni sistemiche, sebbene quest’ultimo sia un’evento raro. Inoltre, Qualche volta la sostanza allergenica può non essere identificata in quanto non presente nelle liste standard, e richiedere ulteriori specifiche analisi. Un'alternativa al test cutaneo à ̈ il saggio su sangue, che misura gli anticorpi IgE totali in campioni di sangue del paziente. Questo può essere condotto per mezzo di diversi metodi in vitro, inclusi ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), blotting (Western blot o dot blot) o RIA (radio immunoassay).

Alti livelli sono indicativi di atopie o allergie. Il test non à ̈ influenzato da farmaci, età e malattie e non comporta contatto del paziente con l’irritante/allergene, evitando gli effetti collaterali dei test eseguiti sulla pelle. Tuttavia, l'interpretazione dei risultati à ̈ difficoltosa quando i valori si situano tra le 20 e le 100 UI/ml, dal momento che affidabile non si può fare una chiara predizione; à ̈ riportata inoltre una variabilità tra saggi tra i laboratori (Wood) (sono infatti disponibili diversi metodi per determinare IgE specifiche, come l'ImmunoCAP, l'Immunolite e il test Turbo radioallergosorbente o RAST.

Un'altra categoria di test à ̈ rappresentata dal challenge testing, dove piccole quantità dell’allergene sospetto sono introdotte nel corpo per via orale, per inalazione o per altre vie. Eccetto che per la determinazione di allergie alimentari o da farmaci, i challenge sono eseguiti raramente. Possono essere eseguiti in combinazione con i saggi di eliminazione: ad un paziente con una sospetta sensibilità ad uno specifico allergene viene prescritto di modificare la sua dieta in modo da eliminare totalmente quell'allergene per un determinato periodo di tempo. Se il paziente migliora in maniera significativa, può essere successivamente “stimolato†con la reintroduzione dell'allergene per vedere se i sintomi si riproducono.

Sono state sperimentate numerose procedure in vitro per la diagnosi dell'ACD. Stimoli irritanti possono indurre la sintesi e il rilascio di citochine proinfiammatorie come TNF-alpha, IL-1, IL-8, e fattore stimolante le colonie monocito/macrofagiche (GM-CSF), oppure interferone-gamma, IL-2 'IL-4, identificate con metodi quali l'enzyme-linked immunospot (ELISPOT) (Mc Fadden).

Il test di trasformazione dei linfociti viene usato principalmente per ricerca.

Un'ulteriore alternativa per i saggi in vitro à ̈ quella di focalizzarsi su marcatori specifici di attivazione di cellule del sistema immunitario coinvolte nella stimolazione della reazione allergica. L’idea presentata in questo brevetto trae in effetti la sua origine da questa osservazione. CD-80 (B7-1) e CD86 (B7-2) in particolare sono due comuni marcatori usati dai laboratori di ricerca per determinare la sensibilizzazione di cellule, in particolare i macrofagi, in risposta allo stimolo costituito da diverse sostanze e molecole. Essi sono due membri della famiglia B7 di proteine e agiscono come molecole co-stimolatorie coinvolte nella presentazione dell'antigene. L'attivazione dei linfociti T da parte delle cellule presentanti l'antigene (APC) richiede infatti due segnali. Il primo à ̈ l'interazione del recettore delle cellule T con l'antigene legato al complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC II) sulle APC. Questa interazione à ̈ necessaria ma non sufficiente per attivare completamente le cellule T e richiede la costimolazione da parte di altri recettori. Tra questi, CD80 e CD86 giocano un ruolo chiave. CD80 e CD86 si legano ai corrispondenti recettori T-cellulari CD28 e CTLA-4 (CD152). La presentazione dell'antigene combinata con il segnale costimolatorio produce l'effettiva attivazione delle cellule T e la produzione autocrina di fattori di crescita. La presentazione dell'antigene in assenza di costimolazione porta alla anergia clonale delle cellule T-helper e alla mancanza di risposta.

CD80 e CD86 sono espressi da APC professionali, comprese le cellule dendritiche e i monociti, e da cellule B attivate, e la loro espressione à ̈ strettamente regolata. CD86 à ̈ espresso costitutivamente sui monociti a riposo, mentre CD80 à ̈ espresso a livelli molto bassi oppure non espresso.

Quando si verifica un evento attivante, l'espressione di CD80 e CD86 viene indotta, aiutata da alcune citochine (come l'interferone-gamma), l'adenosin monofosfato ciclico, il legame crociato di molecole MHC di classe II, CD40 o CD120b (p75, recettore II del fattore di necrosi tumorale), alcuni batteri e i loro prodotti, come il BCG, la subunità A1 della tossina colerica, o le porine di Neisseria. In genere, il CD86 viene espresso per primo, dopo 24 ore dall'attivazione, mentre il CD86 raggiunge un picco a 48 ore dall'attivazione.

In aggiunta a CD80 e CD86, altri marcatori vengono continuamente identificati come molecole costimolatorie o co-inibitorie, come TIM (molecole contenenti un dominio trans membrana immunoglobulinico e mucinico di tipo I), oppure CD2 e molte altre. Queste fanno parte per lo più delle IgsF (superfamiglia di immunoglobuline) o del TNFRSF (superfamiglia di recettori del fattore di necrosi tumorale) e agiscono come molecole co-stimolatorie o co-inibitorie secondarie, creando una rete complessa capace di rispondere a condizioni ambientali dinamiche. Tutte queste possono essere di interesse per rifinire ed integrare le informazioni fornite dall'attivazione dell'espressione di CD80 e CD 86.

E’disponibile sul mercato un test capace di identificare l’allergia da nickel che à ̈ basato sull’attivazione del ciclo cellulare, ma à ̈ stato dimostrato che non correla bene con il gold standard (il patch test).

Sommario dell'invenzione

E’ stato sorprendentemente trovato che il sangue intero può rappresentare una fonte ideale di cellule immunitarie, specialmente macrofagi, da utilizzare in un metodo per prevedere e rilevare il rischio in un soggetto di sviluppare sensibilizzazione o allergia ad una sostanza a cui detto soggetto à ̈ esposto. Descrizione delle figure

La Figura 1 mostra l'espressione di CD80 e CD86 valutati con citofluorimetro mediante un'analisi monoparamterica. I dati sono espressi come fluorescenza media, che rappresenta la media geometrica delle intensità di fluorescenza delle cellule colorate con anticorpo fluorescente proporzionale al numero di molecole colorate per cellula.

Oggetto dell'invenzione

E’ un primo oggetto dell'invenzione un metodo per la determinazione della sensibilizzazione o allergia ad una sostanza in un soggetto.

Come secondo oggetto, l'invenzione descrive l'uso di un campione di sangue intero isolato per rilevare marcatori indicativi della sensibilizzazione o allergia in un soggetto.

In un ulteriore oggetto à ̈ descritto un kit per eseguire il metodo dell'invenzione. Descrizione dettagliata dell'invenzione

Per i presenti obiettivi, "sensibilizzazione" si riferisce al processo in cui una persona dopo un primo contatto con una sostanza sviluppa una risposta immunitaria con produzione di IgE, che innescano un'allergia quando si verifica un secondo contatto con tale sostanza.

In altre parole, il metodo dell'invenzione consente di predire se una persona, che non à ̈ mai entrata in contatto con la sostanza, o che non ha sperimentato una risposta immunitaria allergica dopo un primo contatto con essa, à ̈ probabile che sia sensibilizzata ad essa e, pertanto, avrà una risposta immunitaria nel caso in cui un ulteriore contatto con tale sostanza si verifichi.

Dall'altro lato, il termine "allergia" si riferisce alla capacità di una sostanza esaminata di attivare una risposta immunitaria Ig-E mediata.

Secondo la sua più ampia portata, la presente invenzione descrive un metodo comprendente la fase di determinazione dell'espressione di marcatori specifici in un campione di sangue isolato del soggetto.

Più in particolare, detti marcatori sono espressi sulla superficie delle cellule del sistema immunitario presenti nel campione di sangue.

In una più particolare forma di realizzazione, il campione à ̈ un campione isolato di sangue intero.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, il metodo descritto comprende la fase di:

a) mettere a contatto un campione di sangue di un soggetto con la sostanza esaminata per un periodo di tempo appropriato; e di

b) rilevare l'espressione di marcatori specifici nel campione.

Più in dettaglio, dette cellule che esprimono i marcatori sono preferibilmente i macrofagi, ma anche altre cellule possono essere considerate.

Ai fini della presente invenzione, come detto sopra, il campione à ̈ un campione di sangue intero isolato. In altre parole, dopo la raccolta del campione da un soggetto, esso non à ̈ sottoposto ad alcun trattamento.

Opzionalmente, in una particolare forma di realizzazione della presente invenzione, il campione di sangue può essere trattato per rimuovere gli eritrociti prima o dopo l’incubazione con anticorpi (quindi prima della rilevazione).

In un’ulteriore particolare forma di realizzazione dell'invenzione, nella fase a) il campione può essere incubato con citochine insieme con la sostanza da testare in modo da rendere la risposta più rapida. Ai fini della presente invenzione, verrà fatto riferimento al "soggetto", che comprende non solo umani ma anche animali.

Riguardo al volume del campione raccolto, esso à ̈ compreso tra circa 50-300 µl, preferibilmente tra circa 100-200 µl e ancor più preferibilmente di 100 µl.

Come "sostanza testata" si intende il composto (molecola o elemento) sospettato di essere in grado di suscitare una risposta immunitaria in un soggetto o di sensibilizzare quella persona. Sostanze testate possono quindi essere rappresentati da:

- Additivi reologici (collagene, polisaccaridi, gomme, mucillagine);

- Antibatterico (triclosan);

- Antiossidanti (idrossitoluene butilato);

- Antitraspiranti (alluminio o sali di zinco);

- Assorbenti (talco);

- Coloranti (p-fenilendiammina);

- Conservanti (parabeni, ammonio quaternario, Kathon, fenossietanolo, esteri dell'acido p-idrossibenzoico, imidazolidin urea, formaldeide);

- Contaminanti e / o metallo (piombo, nichel);

- Tensioattivi (sodio lauril solfato (SLS), ammonio lauril solfato (ALS), sodio lauril etere solfato (SLES), ammonio laureth solfato (ALES), trietanolammina (TEA);

- Emollienti (alchil fenoli etossilati, PEG, glicole propilenico, polipropilene glicole);

- Fissativi (carbomer);

- Fotoprotettivi (cinnamato, salicilati, derivati della canfora, benzofenone, antranilati);

- Profumi;

- Agenti idratanti (propilene / butilene glicole, lanolina);

- Agenti di lucidatura (chetoni cerati);

- Nutrienti;

- Lipidi (oli, burri, idrocarburi paraffinici, idrocarburi terpenici, siliconi, esteri glicericitrigliceridi, alcoli grassi, acidi grassi);

- Solventi (toluene, xilene);

- Tensioattivi (monoetanolamina, dietanolammina, trietanolammina, laureth solfato di sodio, solfato di ammonio laureth);

- Umettanti (glicerina, sorbitolo, glicoli)

- Vitamine (vitamina A, C);

- tinte;

- altri componenti, come quelli di cui sopra.

In particolare, la sostanza testata à ̈ selezionata dal seguente elenco: nickel, kathon GC, essenze, conservanti, e parafenilendiammina (PPD), balsamo del Perù, acetato di benzile, alcol benzoile, acido cinnamico, oak Moss, alcool cinnamico, aldeide cinnamica, eugenolo, e isoeugenolo, muschio di quercia, aldeide cinnamico, alcool cinnamico, alfa amil alcol cinnamico, geraniolo, idrossi citronellale, isoeugenolo ed eugenolo, muschio ambretta e moschene, antimicrobici, antiossidanti e assorbitori di luce ultravioletta, quaternium-15, diazolidinil urea, imidazolidinil urea, 2-bromo-2-nitro-1,3-diol, e DMDM idantoina, parabeni, metilcloroisotiazolinone-metilisothiazolinone (MCI-MI), metildibromoglutaronitrile-fenossietanolo (MDBGN-PE), e Iodopropinil butilcarbammato, vanillina, nerodilol, muschio di quercia, parafenilendiammina (PPD), benzocaina e procaina (anestetico locale), i coloranti azoici, coloranti tessili, acido paraminobenzoico (PABA), betaina cocamidopropil, olio della pianta del tà ̈, propoli, henné, lanolina; tra questi nichel e Kathon GC sono i preferiti.

Ai fini della presente invenzione la sostanza esaminata può anche essere rappresentata da un prodotto, che in realtà comprende uno o più ingredienti (molecole) sospettati di essere allergici o sensibilizzanti in un soggetto.

Pertanto, la sostanza testata, per esempio, può anche essere un prodotto cosmetico o una preparazione alimentare o una sostanza chimica utilizzata per la preparazione di qualsiasi oggetto di uso quotidiano, o antigeni naturali o artificiali, o un medicamento disponibile sul mercato.

Nel passaggio a) del metodo dell’invenzione, il contatto tra il campione e la sostanza esaminata à ̈ mantenuto da circa 5 secondi a 72 ore, preferibilmente da 10 secondi a 24 ore.

Per quanto riguarda i marcatori specifici da rilevare in base al punto b) di cui sopra, sono inclusi: CD80, CD86, B7-H2, ICOS, CD70, CD27, LUCE, HVEM, CD40L, CD40, 4 1BBL, 4-1BB, OX40L, OX40, TL1A, DR3, GITRL, GITR, CD30L, CD30, TIM1, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD2, CD155, CD112, CD226, LAG3, CTLA4, B7-H1 (PDL1), B7-DC (PDL2), PD1, BTLA, CD160, PD1H, LAIR1, Galectin-9, TIM3, 2B4 (CD244), CD113, TIGIT, CD54.

Preferibilmente, marcatori specifici all’interno della presente invenzione sono CD80 e CD86 e in particolare CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2).

Tali marcatori sono espressi dai macrofagi a seguito della sensibilizzazione.

In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, i marcatori CD80 e CD86 sono entrambi rilevati nel campione di sangue intero isolato, infatti, i macrofagi esprimono sulla loro superficie entrambi i marcatori.

Per facilitare e migliorare la rilevazione dei marcatori, gli anticorpi sono preferibilmente marcati in modo opportuno.

Per esempio, la marcatura può essere effettuata con molecole fluorescenti, nanoparticelle, enzimi come perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina, isotopi radioattivi.

All’interno del metodo della presente invenzione, gli anticorpi anti-CD80 sono preferibilmente marcati con FITC, mentre gli anticorpi anti-CD86 sono preferibilmente marcati con RD1.

Il risultato del metodo, che à ̈ l'indicazione se il soggetto à ̈ stato sensibilizzato o se à ̈ allergico alla sostanza testata, può derivare da un particolare segnale sviluppato come conseguenza del legame degli anticorpi con i marcatori.

Per esempio, una colorazione specifica o un segnale può diventare visibile ed essere facilmente misurato. In alternativa, il legame potrebbe essere rilevato mediante metodi noti in letteratura, come Enzyme Linked Immunosorbent assay, metodi radioimmunologici, metodi impedenziometrici e di risonanza plasmonica. In accordo con un secondo scopo dell'invenzione, quindi, à ̈ descritto l’uso un campione di sangue intero isolato per rilevare marcatori indicativi della sensibilizzazione o allergia in un soggetto. In particolare, tali marcatori sono quelli sopra riportati.

Da un altro lato, l'invenzione descrive anche l'uso di tali marcatori per la rilevazione della sensibilizzazione o allergia in un soggetto a una sostanza testata.

In accordo con un ulteriore oggetto, viene descritto un kit per la determinazione della sensibilizzazione o allergia di un soggetto a una sostanza testata.

In particolare, tale kit comprende anticorpi contro specifici marcatori.

Preferibilmente, tali anticorpi sono anti-CD80 e anti-CD86.

In una forma di realizzazione preferita, tali anticorpi sono opportunamente marcati in modo da facilitare e migliorare la rilevazione della presenza dei marcatori.

Ai fini della presente invenzione, gli anticorpi sono anti-CD80-FITC e anti-CD86.

Inoltre, come ulteriore forma di realizzazione preferita, gli anticorpi sono immobilizzati su un supporto solido.

Il kit dell'invenzione può inoltre comprendere dispositivi per raccogliere un campione di sangue dal paziente.

Per tali finalità, possono essere utilizzati aghi come quelli utilizzati dai pazienti diabetici.

Detti dispositivi sono preferibilmente adatti per raccogliere l'aliquota di sangue richiesto dal metodo dell'invenzione (preferibilmente di 100 circa 100 µl).

Materiali e metodi

Preparazione dei campioni e analisi in citometria a flusso

8 ml di sangue intero sono stati raccolti da un donatore sano in un tubo contenente eparina e 3 ml dello stesso donatore sono stati raccolti in una provetta contenente EDTA. Il sangue à ̈ stato poi diviso in aliquote da 1 ml per testare le diverse condizioni sperimentali.

In particolare, i campioni di sangue intero sono stati direttamente incubati in una piastra a 24 pozzetti a 37° C e 5% di CO2per 2 e 24 h con 200 µg / ml di Kathon GC o 200 µg / ml di NiSO4(controlli positivi) e controlli negativi.

Dopo incubazione, 100 Î1⁄4l di sangue sono stati trasferiti in tubi eppendorf e incubati con 5 Î1⁄4l di anticorpi coniugati (e-Bioscience) anti-CD80-FITC (fluoresceina isotiocianato Isomero 1) e CD86-RD1 (rodamina) agitando delicatamente in ghiaccio per 45 min. Dopo questo passaggio, i campioni di sangue sono stati lisati con una soluzione all'8% di cloruro di ammonio (1:5) per rimuovere gli eritrociti. Dopo aver miscelato, la lisi à ̈ stata eseguita a 4°C in agitazione per 15 min. Il campione à ̈ stato successivamente centrifugato a 1500 rpm a 4°C per 3 minuti, il surnatante scartato e il pellet lavato due volte con PBA (tampone fosfato salino 1% di albumina).

Diversamente, nei campioni di sangue eparinato, il passaggio della lisi à ̈ stato condotto prima del trattamento e l'esperimento à ̈ continuato come precedentemente descritto.

In entrambe le condizioni sperimentali, i campioni di sangue sono stati analizzati con un citofluorimetro Coulter Epics XL (Coulter Corporation, USA). 10.000 cellule sono state analizzate per campione ed un'analisi monoparameterica à ̈ stata effettuata per ogni CD. L'analisi statistica dell'intensità media di fluorescenza e le rappresentazioni grafiche sono state eseguite con il software XL-2 (Coulter).

Esclusione del colorante Trypan blu

Il sangue intero, dopo la lisi degli eritrociti e dopo il trattamento con gli agenti sensibilizzanti, à ̈ stato controllato per la vitalità con esclusione del colorante Trypan blu. 50 Î1⁄4l di sospensione cellulare sono stati prelevati e sono stati aggiunti 50 Î1⁄4l di Trypan blu. La sospensione cellulare à ̈ stata ben miscelata e mantenuta a temperatura ambiente per 3-5 min. Un numero di cellule colorate e non colorate à ̈ stato contato e i risultati espressi come percentuale di cellule vitali rispetto al controllo. Risultati

Vitalità cellulare

L’esclusione del colorante Trypan blue à ̈ stato effettuata per valutare la percentuale di cellule morte nel sangue intero al t=0, dopo lisi, e dopo 24 h di incubazione a 37°C e 5% CO2 (t=24 h). I risultati ottenuti hanno evidenziato un forte aumento del numero di cellule morte nel campione lisato con un 40% di mortalità, rispetto al sangue intero valutato sia al tempo t=0 e t=24 h, dove non à ̈ stata rilevata un’apprezzabile morte cellulare.

Espressione di CD80 e CD86 (citometria a flusso) A causa della elevata mortalità osservata nel campione di sangue lisato (40%), i trattamenti di 2 e 24 h con gli agenti sensibilizzanti Kathon GC (200 Î1⁄4g/ml) o NiSO4(200 Î1⁄4g/ml) sono stati eseguiti direttamente su sangue intero.

I risultati hanno dimostrato che le 2 h di trattamento con Kathon GC 200 Î1⁄4g/ml o NiSO4200 Î1⁄4g/ml non sono state sufficienti per indurre un incremento dell'espressione di CD80 e CD86 sia in campioni di sangue con EDTA sia in eparinato, a differenza delle 24 h di incubazione.

In particolare, la Figura 1 mostra nel pannello A i dati espressi come percentuale dell'espressione delle molecole co-stimolatorie dopo trattamento con NiSO4200 Î1⁄4g /ml e Kathon GC 200 Î1⁄4g/ml, rispettivamente, in campioni di sangue eparinato ed EDTA. È importante notare l'effetto più forte indotto dal NiSO4200 Î1⁄4g/ml nel sangue eparinato, in cui la percentuale di incremento raggiunge il 369 e il 405% per CD80 e CD86, rispettivamente, come mostrato anche dal grafico riportato nel pannello B.

Dalla descrizione dell'invenzione, i vantaggi del metodo proposto saranno immediatamente evidenti.

In particolare, il metodo descritto consente di rilevare non solo una sensibilizzazione pre-esistente di un soggetto a una sostanza, ma anche di rilevare l'effetto allergico di un nuovo composto.

Come vantaggio particolare, a differenza dei sistemi attualmente in uso, il metodo dell'invenzione non richiede l'applicazione diretta dell'allergene sospetto alla pelle del soggetto, evitando così il rischio di una reazione allergica reale.

Si sottolinea inoltre che il presente metodo potrebbe essere applicabile a tutti i potenziali allergeni (cosmetici, dispositivi medicali, farmaci, prodotti per la cura personale, cibo, polvere, pollini) e potrebbe anche essere utilizzato per lo sviluppo di dispositivi medici.

Inoltre, la quantità di campione di sangue richiesta à ̈ molto piccola (circa 100 µl) e quindi può essere raccolto con un test di puntura semplice, come quelli eseguiti dai pazienti diabetici.

La possibilità di utilizzare sangue intero, che evita qualsiasi fase di pre-trattamento del campione, à ̈ un altro importante vantaggio del metodo dell'invenzione.

I vantaggi del kit proposto saranno anche evidenti al personale qualificato.

Infatti, esso rappresenta uno strumento pronto, semplice e portatile che à ̈ utile per la vita quotidiana.

Infatti, molti prodotti potrebbero potenzialmente contenere diverse sostanze capaci di innescare reazioni allergiche.

Per evitare tali circostanze, il kit dell'invenzione può essere utilizzato per la predizione del potenziale irritante ed allergenico in un soggetto, senza limitazioni di tempo e di spazio.

Per esempio, prima di testare o acquistare un prodotto cosmetico in un negozio, un consumatore può verificare l'effetto di quel composto sul suo sangue in modo rapido, semplice e discreto.

In aggiunta a quanto sopra, la disponibilità del metodo e del kit dell'invenzione consente la riduzione della sperimentazione umana, specialmente dei patch test, per verificare la sicurezza dei cosmetici e di altri prodotti.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI: 1. Un metodo per determinare la sensibilizzazione o allergia di un soggetto ad una sostanza testata che comprende la fase: a) di mettere a contatto un campione di sangue isolato del soggetto con una detta sostanza per un periodo di tempo idoneo, detta fase a) che à ̈ eventualmente preceduta o seguita da una fase di rimozione degli eritrociti dal campione, e la fase b) di rilevare l'espressione di uno o più marcatori specifici in detto campione.
2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui nella fase a) l’incubazione può essere effettuata anche in presenza di citochine.
3. 3. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto specifico marcatore o marcatori sono scelti dal gruppo comprendente: CD80, CD86, B7-H2, ICOS, CD70, CD27, LIGTH, HVEM, CD40L, CD40, 4-1BBL, 4-1BB, OX40L, OX40, TL1A, DR3, GITRL, GITR, CD30L, CD30, TIM1, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD2, CD155, CD112, CD226, LAG3, CTLA4, B7-H1 (PDL1), B7 -DC (PDL2), PD1, BTLA, CD160, PD1H, LAIR1, Galectin-9, TIM3, 2B4 (CD244), CD113, TIGIT.
4. 4. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti marcatori sono CD80 e CD86.
5. 5. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la sostanza testata à ̈ scelta tra: additivi reologici, antibatterici, antiossidanti, antitraspiranti, assorbenti, coloranti, conservanti, contaminanti, tensioattivi, emollienti, fissativi, fotoprotettivi, profumi, agenti idratanti, agenti lucidanti, sostanze nutrienti, grassi, solventi, tensioattivi, umettanti, vitamine, altri.
6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui detta sostanza esaminata à ̈ scelta tra nickel, Kathon GC.
7. 7. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il campione di sangue isolato da un campione di sangue intero isolato.
8. 8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nella fase a) il contatto tra il campione di sangue isolato e la detta sostanza viene mantenuta per un periodo tra 5 secondi a 72 ore e preferibilmente da circa 10 secondi a 24 ore.
9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui nella fase b) l'espressione di uno o più marcatori à ̈ determinata con anticorpi specifici per ciascun marcatore.
10. 10. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui detti anticorpi sono marcati.
11. 11. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 10, in cui detti anticorpi sono anti-CD80 e anti-CD86 fluorescenti.
12. 12. Un kit per la determinazione della sensibilizzazione o allergia di un soggetto a una sostanza testata comprendente anticorpi fluorescenti CD80 e CD86, eventualmente immobilizzati su un supporto solido.
13. 13. Il kit secondo la rivendicazione precedente, comprendente inoltre mezzi per raccogliere un campione di sangue da detto soggetto.
14. 14. Il kit secondo la rivendicazione 12 o 13 per eseguire il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11.