ITMI20131276A1 - Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare - Google Patents

Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare

Info

Publication number
ITMI20131276A1
ITMI20131276A1 IT001276A ITMI20131276A ITMI20131276A1 IT MI20131276 A1 ITMI20131276 A1 IT MI20131276A1 IT 001276 A IT001276 A IT 001276A IT MI20131276 A ITMI20131276 A IT MI20131276A IT MI20131276 A1 ITMI20131276 A1 IT MI20131276A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
pha
suspension
process according
cell culture
bar
Prior art date
Application number
IT001276A
Other languages
English (en)
Inventor
Simone Begotti
Original Assignee
Bio On S R L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio On S R L filed Critical Bio On S R L
Priority to IT001276A priority Critical patent/ITMI20131276A1/it
Priority to EP14759325.5A priority patent/EP3027761B1/en
Priority to US14/908,456 priority patent/US9683076B2/en
Priority to BR112016001837-0A priority patent/BR112016001837B1/pt
Priority to AU2014298034A priority patent/AU2014298034B2/en
Priority to JP2016530643A priority patent/JP6531096B2/ja
Priority to PCT/IB2014/063475 priority patent/WO2015015395A1/en
Priority to ES14759325T priority patent/ES2776149T3/es
Publication of ITMI20131276A1 publication Critical patent/ITMI20131276A1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/88—Post-polymerisation treatment
    • C08G63/90—Purification; Drying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/88—Post-polymerisation treatment
    • C08G63/89—Recovery of the polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)

Description

PROCESSO PER RECUPERARE E PURIFICARE POLIIDROSSIALCANOATI DA UNA COLTURA CELLULARE.
------
La presente invenzione concerne un processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare.
I poliidrossialcanoati (PHA) sono omopolimeri o copolimeri di idrossialcanoati, quali 3-idrossibutirrato (3HB), 3-idrossivalerato (3HV), 4-idrossivalerato (4HV) e 3-idrossiesanoato (3HH). Essi vengono sintetizzati e accumulati da vari microrganismi, in particolare batteri, come riserva di carbonio e di energia per il metabolismo cellulare. I PHA possono essere prodotti tramite fermentazione di opportuni ceppi batterici su un substrato organico, solitamente a base di carboidrati, acidi organici ed alcoli. I biopoliesteri vengono sintetizzati e immagazzinati dalle cellule da cui devono poi essere estratti così da ottenere il materiale polimerico con sufficiente grado di purezza.
Rispetto ai polimeri di sintesi e ad altri biopolimeri ottenuti da fonti rinnovabili (ad esempio l’acido polilattico (PLA)), i PHA presentano numerosi vantaggi, in particolare in termini di biodegradabilità, riciclabilità e idrofobicità, i quali rendono tali prodotti particolarmente promettenti come sostituti biodegradabili dei polimeri di origine petrolchimica.
Il processo di produzione del PHA prevede, dopo la fase fermentativa in cui le cellule batteriche sintetizzano il polimero e lo accumulano al loro interno, una fase di rimozione del PHA dalle cellule in cui le pareti cellulari vengono distrutte e separate dal PHA, e una fase di purificazione e sbiancamento del PHA.
Una tecnica di rimozione del PHA dalle cellule che lo hanno prodotto prevede l'impiego di solventi organici in grado di solubilizzare il polimero, così come descritto ad esempio nella domanda di brevetto EP 1.739.182 A1. Tale tecnica presenta numerosi inconvenienti dovuti, in particolare, all'elevata viscosità delle soluzioni di PHA le quali, per poter essere processate, devono essere diluite con ingenti quantità di solvente, con evidenti problemi di recupero dello stesso e di costi di processo. Inoltre, il PHA così recuperato deve poi essere separato dal solvente organico, ad esempio tramite precipitazione per aggiunta di un altro solvente in cui il PHA è scarsamente solubile. Ciò rende il processo con solventi estremamente costoso e problematico dal punto di vista ambientale.
Nel brevetto US 7.314.740 B2 si descrive un processo per produrre PHA che comprende effettuare una fase di rottura delle membrane cellulari che contengono il PHA tramite aggiunta di una sostanza alcalina, ad esempio una base forte, così da ottenere un valore di pH da 9 a 13,5 e contemporanea azione meccanica sulla sospensione attuata ad esempio tramite un emulsionatore o un omogeneizzatore ad alta pressione. Il polimero viene poi separato tramite centrifugazione.
Il brevetto US 7.393.668 B2 riguarda un metodo per il recupero di PHA dalle cellule che lo hanno prodotto tramite: (a) aggiunta di un prodotto alcalino sotto agitazione e azione meccanica di rottura delle membrane cellulari con solubilizzazione del materiale biologico, e successiva separazione del PHA; e (b) trattamento del PHA così ottenuto con un enzima e/o un tensioattivo per solubilizzare le impurezze contenute nel PHA, e successivo lavaggio del PHA con un solvente idrofilo e/o acqua. In particolare, allo scopo di evitare una riduzione del peso molecolare del PHA, la fase di rottura meccanica delle membrane cellulari viene realizzata prima dell'aggiunta del prodotto alcalino, in quanto si ritiene che l'azione meccanica realizzata dopo la fase di alcalinizzazione possa portare ad una sensibile e indesiderata riduzione del peso molecolare del polimero. La rottura cellulare può essere ottenuta tramite un omogeneizzatore ad alta pressione, un dispositivo ad ultrasuoni, un emulsificatore, un mulino ecc.
Nel brevetto US 7.514.525 si descrive un metodo per recuperare, purificare e isolare PHA da una massa cellulare che lo contiene che comprende: (a) solubilizzare la massa cellulare diversa da PHA in una soluzione acida, formando una sospensione di granuli di PHA parzialmente cristallizzati; (b) aggiustare il pH della sospensione ad un valore da 7 a 11 e separare il PHA solido dalla massa cellulare disciolta; (c) risospendere il PHA solido in una soluzione sbiancante; (d) essiccare il PHA solido così ottenuto. La solubilizzazione secondo la fase (a) viene condotta ad alta temperatura e per tempi lunghi, in particolare a 80°-130°C, preferibilmente 100°-110°C, per un tempo da 30 minuti a 4 ore, preferibilmente 2 ore. La separazione del PHA solido dalla massa cellulare disciolta viene ottenuta tramite prolungata centrifugazione ad alta velocità (4000 g per 20 minuti).
La presente invenzione ha innanzitutto lo scopo di realizzare un processo per il recupero e la purificazione di PHA da una massa cellulare che lo contiene che possa essere attuato in continuo, cioè senza fasi a batch quali ad esempio fasi di centrifugazione per separare il PHA da una sospensione, le quali sono in genere complesse da realizzare su grandi volumi, richiedono l'impiego di macchinari costosi e inevitabilmente riducono la produttività del processo. Un altro obiettivo della presente invenzione è quello di realizzare tale processo senza l'impiego di solventi organici, i quali, come sopra illustrato, oltre a comportare notevoli difficoltà nella realizzazione su larga scala del processo, sono indesiderabili dal punto di vista ecologico. Ulteriore obiettivo è quello di ottenere il PHA in forma il più possibile pura senza causare una riduzione del peso molecolare, la quale avrebbe inevitabili conseguenze sulle prestazioni meccaniche del materiale polimerico.
La Richiedente ha ora trovato che questi e altri scopi, che verranno meglio illustrati nella descrizione che segue, possono essere raggiunti tramite un processo come definito di seguito e nelle rivendicazioni allegate.
In un primo aspetto, la presente invenzione riguarda pertanto un processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati (PHA) da una coltura cellulare, che comprende:
(a) acidificare la coltura cellulare fino ad ottenere un valore di pH uguale o inferiore 6, e sottoporre detta coltura cellulare ad un trattamento di frammentazione cellulare tramite omogeneizzazione ad alta pressione ad una temperatura da 10°C a 80°C, così da ottenere una sospensione di PHA;
(b) basificare la sospensione di PHA così ottenuta fino ad ottenere un valore di pH uguale o superiore a 8;
(c) diluire la sospensione di PHA e sottoporla a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA come retentato e una fase acquosa come permeato;
(d) sottoporre la sospensione di PHA a una fase di sbiancamento;
(e) diluire la sospensione di PHA dopo la fase di sbiancamento e sottoporla a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA sbiancato come retentato e una fase acquosa come permeato;
(f) sottoporre la sospensione concentrata di PHA sbiancato ad essiccazione.
La coltura cellulare di partenza deriva in genere da un processo fermentativo attuato su un substrato nutritivo organico da parte di ceppi batterici capaci di produrre PHA. Tali ceppi batterici possono essere scelti ad esempio tra i seguenti generi: Cupriavidus, Azotobacter, Alcaligenes, Aeromonas, Nocardia, Ralstonia, Pseudomonas, Alcaligenes, Methylobacterium, Bacillus. Particolarmente preferiti sono i generi Ralstonia, Cuprividus e Methylobacterium, e più specificamente le specie Ralstonia eutropha, Cupriavidus necator e Methylobacterium rhodesianum.
Il substrato nutritivo può essere un qualunque substrato che possa essere metabolizzato dalle cellule batteriche con produzione di PHA, il quale può essere scelto tra succhi, melasse o polpe ottenute, ad esempio, dalla lavorazione di prodotti vegetali, quali frutta, barbabietola da zucchero, canna da zucchero, semi oleosi, e simili. Tali substrati, oltre a carboidrati e proteine, in genere contengono fattori di crescita di varia natura, composti contenenti azoto e/o fosforo e altri elementi utili per la crescita cellulare.
Al termine della fase fermentativa, la coltura cellulare può essere eventualmente sottoposta a una fase preliminare di concentrazione, allo scopo di ridurre i volumi da trattare nelle fasi successive. Preferibilmente, la fase preliminare di concentrazione porta all'ottenimento di una concentrazione cellulare da 20 a 800 g/L, più preferibilmente da 40 a 500 g/L. Tale fase di concentrazione può essere realizzata vantaggiosamente tramite filtrazione tangenziale, secondo modalità analoghe a quelle descritte successivamente in relazione alla fase (c).
Secondo la fase (a), la coltura cellulare è acidificata fino ad ottenere un valore di pH uguale o inferiore a 6, preferibilmente uguale o inferiore a 5. L'acidificazione viene in genere realizzata tramite aggiunta di un acido a temperatura ambiente, in particolare una soluzione acquosa di un acido inorganico od organico, scelto ad esempio tra: acido solforico, acido cloridrico, acido fosforico, acido nitrico, acido acetico, acido citrico, o loro miscele.
La coltura cellulare così acidificata viene quindi sottoposta ad un trattamento di frammentazione cellulare che prevede l'impiego di un omogeneizzatore ad alta pressione. Tale processo può essere realizzato in continuo tramite passaggio del liquido da una zona ad alta pressione ad una zona a bassa pressione, così da sottoporre le cellule ad uno shock meccanico tale da frammentare le membrane cellulare e liberarne il contenuto. In genere, in accordo con tecniche ben note all'esperto del settore, l'omogeneizzatore comprende una pompa volumetrica a pistoni e una valvola avente geometria regolabile, in cui viene generata una pressione dinamica in condizioni di flusso continuo.
Preferibilmente, nella zona ad alta pressione viene applicata una pressione da 500 bar a 2000 bar, più preferibilmente da 500 bar a 1500. In genere il processo di omogeneizzazione richiede da 1 a 5 passaggi all'interno del dispositivo, e il numero dei passaggi richiesti per ottenere un sufficiente grado di frammentazione cellulare diminuisce all'aumentare della pressione massima applicata.
Durante il processo di omogeneizzazione, l'azione meccanica esercitata sulla sospensione cellulare provoca un aumento della temperatura, la quale viene comunque mantenuta entro l'intervallo da 10°C a 80°C, preferibilmente da 20°C a 50°C, allo scopo di evitare eventuali degradazioni del PHA con conseguente diminuzione del peso molecolare medio.
Dopo la fase di omogeneizzazione, la sospensione di PHA viene basificata fino ad ottenere un valore di pH uguale o superiore a 8, preferibilmente uguale o superiore a 9. La basificazione può essere attuata preferibilmente tramite aggiunta di una base forte, ad esempio una soluzione di una base forte inorganica, quali potassio idrossido, sodio idrossido o loro miscele.
In una forma preferita di realizzazione, la sospensione di PHA così basificata viene trattata con almeno un tensioattivo ad una temperatura da 10°C a 80°C, preferibilmente da 20°C a 50°C.
Il tensioattivo viene preferibilmente addizionato in basse quantità, ad esempio da 0,5 a 10 g/L, e ha principalmente la funzione di favorire l'eliminazione dal PHA dei residui derivanti dalla rottura delle membrane cellulari.
Come tensioattivi, vengono preferibilmente utilizzati tensioattivi anionici, cationici o nonionici. Tali tensioattivi vengono preferibilmente scelti tra quelli aventi basso impatto ambientale, così da evitare problemi di smaltimento. Esempi di tensioattivi anionici sono: alchil o alchenil solfati, alchil o alchenil benzensolfonati, alchil o alchenil etere solfati, alchil o alchenil carbossilati, alchil o alchenil etere carbossilati, e simili. Particolarmente preferiti sono i C10-C18alchil solfati.
Come tensioattivi cationici possono essere impiegati ad esempio i sali di alchiltrimetilammonio o di dialchildimetilammonio.
Come tensioattivi non-ionici, possono essere impiegati ad esempio: poliossialchilene (preferibilmente poliossietilene) alchil o alchenil eteri, poliossialchilene (preferibilmente poliossietilene) alchil o alchenil fenileteri, copolimeri poliossietilene/poliossipropilene, e simili.
Dopo il trattamento secondo la fase (b), la sospensione di PHA viene diluita, in genere con acqua, così da ottenere una concentrazione di solidi preferibilmente da 10 a 500 g/L, più preferibilmente da 25 a 100 g/L, e quindi sottoposta a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA come retentato e una fase acquosa come permeato. La filtrazione tangenziale può essere condotta secondo tecniche note facendo passare la sospensione in modo continuo attraverso almeno un filtro a flusso tangenziale, in cui è presente almeno una membrana ceramica o polimerica, avente una dimensione media dei pori preferibilmente da 0,05 µm a 10 µm, più preferibilmente da 0,2 µm a 5 µm. Tale tecnica consente di separare il retentato dal permeato tramite passaggio in continuo della sospensione in entrata attraverso canali, preferibilmente canali tubolari, definiti dalla membrana avente sviluppo sostanzialmente cilindrico. Preferibilmente, la sospensione di PHA da sottoporre a filtrazione tangenziale viene alimentata attraverso detto almeno un filtro a flusso tangenziale con una pressione che può variare preferibilmente da 1 a 10 bar, più preferibilmente da 2 a 6 bar.
La sospensione concentrata di PHA ottenuta come retentato dalla fase di filtrazione tangenziale (c) viene quindi sottoposta ad una fase di sbiancamento, la quale può essere realizzata, ad esempio, tramite aggiunta di un agente ossidante, in particolare una soluzione acquosa di un ipoclorito (ad esempio sodio ipoclorito) oppure, preferibilmente, di idrogeno perossido. Particolarmente preferita è una soluzione di idrogeno perossido avente concentrazione da 10% a 35% in peso. Preferibilmente, la fase di sbiancamento viene condotta ad una temperatura da 10°C a 60°C.
Dopo il trattamento secondo la fase (d), la sospensione di PHA sbiancato viene diluita, in genere con acqua, così da ottenere una concentrazione di solidi preferibilmente da 10 g/L a 100 g/L, e quindi sottoposta a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA sbiancato come retentato e una fase acquosa come permeato. Tale fase di filtrazione tangenziale può essere condotta in modo del tutto analogo alla fase (c) di cui sopra.
La sospensione concentrata di PHA sbiancato viene quindi sottoposta ad essiccazione, secondo tecniche convenzionali, in particolare tramite un flusso di aria calda. A tale scopo può essere impiegato ad esempio un atomizzatore (spray dryer), un essiccatore a letto fluido (fluid bed dryer) e simili.
In una forma preferita di realizzazione, la sospensione concentrata di PHA sbiancato ottenuta dalla fase (e) viene ulteriormente concentrata tramite filtrazione ortogonale e quindi inviata alla fase (f) di essiccazione. In tal modo vengono i ridotti i tempi necessari ad ottenere l'essiccazione e il relativo dispendio energetico. La filtrazione ortogonale può rendersi necessaria nel caso in cui si voglia ottenere una sospensione ancor più concentrata rispetto ai limiti ottenibili con la filtrazione tangenziale.
L'eventuale filtrazione ortogonale della sospensione di PHA può essere condotta tramite un filtro a tamburo, un filtro a rotazione oppure un filtro a candela. Trattandosi di particelle di piccole dimensioni, onde evitare un prematuro impaccamento del filtro con conseguente arresto della permeazione della fase acquosa (impermeabilizzazione), è preferibile addizionare alla sospensione concentrata di PHA sbiancato almeno un agente flocculante, preferibilmente almeno un agente flocculante di tipo non polimerico, così da non causare un inquinamento del PHA finale. Preferibilmente, detto almeno un agente flocculante è scelto tra prodotti inorganici quali: ossido di calcio, alluminio solfato, acido fosforico, e loro miscele.
Per quanto riguarda i PHA a cui è possibile applicare il processo in accordo con la presente invenzione, questi sono in genere polimeri contenenti unità ripetitive di formula:
-O-CHR1-(CH2)n-CO- (I)
dove:
R1è scelto tra: -H, alchili C1-C12, cicloalchili C4-C16, alchenili C2-C12, eventualmente sostituiti con almeno un gruppo scelto tra: alogeno (F, Cl, Br), -CN, -OH, -COOH, -OR, -COOR (R = C1-C4alchile, benzile);
n è un intero da 1 a 6, preferibilmente è 1 o 2.
Preferibilmente, R1è metile o etile, e n è 1 o 2. I PHA possono essere sia omopolimeri sia copolimeri o terpolimeri. Nel caso di copolimeri o terpolimeri, essi possono essere costituiti da differenti unità ripetitive di formula (I), oppure da almeno un’unità ripetitiva di formula (I) in combinazione con almeno un’unità ripetitiva derivante da comonomeri che sono in grado di copolimerizzare con gli idrossialcanoati, ad esempio lattoni o lattami. In quest’ultimo caso, le unità ripetitive di formula (I) sono presenti in una quantità pari ad almeno 10% in moli rispetto alle moli totali di unità ripetitive.
Unità ripetitive di formula (I) particolarmente preferite sono quelle derivanti da: 3-idrossibutirrato, 3-idrossivalerato, 3-idrossiesanoato, 3-idrossiottanoato, 3-idrossiundec-10-enoato, 4-idrossivalerato.
PHA particolarmente preferiti sono: poli-3-idrossibutirrato (PHB), poli-3-idrossivalerato (PHV), poli-3-idrossiesanoato (PHH), poli-3-idrossiottanoato (PHO), poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossivalerato) (PHBV), poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossiesanoato) (PHBH), poli(3-idrossibutirrato-co-4-idrossibutirrato), poli(3-idrossiottanoato-co-3-idrossiundecen-10-enoato) (PHOU), poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossivaleratoco-4-idrossivalerato (PHBVV), o loro miscele.
I seguenti esempi di realizzazione sono forniti a mero scopo illustrativo della presente invenzione e non devono essere intesi in senso limitativo dell’ambito di protezione definito dalle accluse rivendicazioni.
ESEMPIO 1
E' stato condotto un processo fermentativo da parte di un ceppo di Ralstonia eutropha su un substrato organico a base di melasse derivanti dalla lavorazione di barbabietole da zucchero, fino ad ottenere una concentrazione cellulare pari a 80 g/L.
Il brodo di coltura è stato concentrato tramite un filtro a flusso tangenziale avente diametro dei pori (cut-off) pari a 1,2 µm, così da ottenere una concentrazione cellulare pari a 150 g/L.
La coltura cellulare così concentrata è stata addizionata con una soluzione di acido solforico (concentrazione 10% in peso), in quantità tale da ottenere un valore di pH pari a circa 4,5.
La coltura acidificata è stata quindi immessa in un omogeneizzatore ad alta pressione (pressione massima: 1500 bar), a temperatura ambiente. Il processo di omogeneizzazione è stato condotto in continuo con tre passaggi consecutivi all'interno dell'omogeneizzatore.
La sospensione di PHA così ottenuta è stata quindi addizionata con una soluzione di sodio idrossido (concentrazione 50% in peso), così da ottenere un valore di pH pari a circa 10,0, e quindi con una soluzione acquosa di sodio dodecilsolfato (4 g di tensioattivo per litro di sospensione), mantenendo la sospensione a temperatura ambiente.
La sospensione così trattata è stata quindi diluita in rapporto 1:4 con acqua, e quindi sottoposta a filtrazione tramite un filtro a flusso tangenziale avente cut-off pari a 0,8 µm, così da ottenere una concentrazione di solidi pari a 150 g/L.
La sospensione di PHA concentrato così ottenuta è stata quindi sottoposta a sbiancamento tramite aggiunta di una soluzione di idrogeno perossido al 30% in peso, in rapporto 1:8 rispetto al volume della sospensione.
Dopo diluizione con acqua in rapporto 1:3, la sospensione sbiancata è stata sottoposta a filtrazione tangenziale con un filtro dello stesso tipo utilizzato dopo la fase di basificazione (cut-off: 0,8 µm). Il retentato conteneva i granuli di PHA purificato, mentre il permeato è stato utilizzato per le fasi di diluizione di cui sopra.
Il retentato è stato sottoposto ad essiccamento tramite un atomizzatore (spray dryer) a 240°C, così da ottenere una polvere di PHA con un contenuto di acqua inferiore a 1% in peso.
ESEMPIO 2
Lo stesso brodo di coltura dell'Esempio 1 è stato trattato come segue per recuperare e purificare il PHA.
Il brodo di coltura è stato concentrato tramite un filtro a flusso tangenziale avente cut-off pari a 0,4 µm, così da ottenere una concentrazione cellulare pari a 250 g/L.
La coltura cellulare così concentrata è stata addizionata con una soluzione di acido solforico (concentrazione 30% in peso), in quantità tale da ottenere un valore di pH pari a circa 4,5.
La coltura acidificata è stata quindi immessa in un omogeneizzatore ad alta pressione (pressione massima: 1000 bar), a temperatura ambiente. Il processo di omogeneizzazione è stato condotto in continuo con due passaggi consecutivi all'interno dell'omogeneizzatore.
La sospensione di PHA così ottenuta è stata quindi addizionata con una soluzione di sodio idrossido (concentrazione 30% in peso), così da ottenere un valore di pH pari a circa 9,0, e quindi con una soluzione acquosa di sodio dodecilsolfato (5 g di tensioattivo per litro di sospensione), mantenendo la sospensione a temperatura ambiente.
La sospensione così trattata è stata quindi diluita in rapporto 1:3 con acqua, e quindi sottoposta a filtrazione tramite un filtro a flusso tangenziale avente cut-off pari a 0,4 µm, così da ottenere una concentrazione di solidi pari a 150 g/L.
La sospensione di PHA concentrato così ottenuta è stata quindi sottoposta a sbiancamento tramite aggiunta di una soluzione di idrogeno perossido al 30% in peso, in rapporto 1:4 rispetto al volume della sospensione. Dopo diluizione con acqua in rapporto 1:3, la sospensione sbiancata è stata sottoposta a filtrazione tangenziale con un filtro dello stesso tipo utilizzato dopo la fase di basificazione (cut-off: 0,8 µm). Il retentato conteneva i granuli di PHA purificato, mentre il permeato è stato utilizzato per le fasi di diluizione di cui sopra.
Il retentato è stato sottoposto ad ulteriore filtrazione tramite un filtro a candela, in cui la sospensione è stata immessa con pressione pari a 4,0 bar, da cui è stato ottenuto un permeato acquoso e una sospensione concentrata, la quale è stata quindi sottoposta ad essiccamento tramite un essiccatore a letto fluido (fluid bed dryer) a 180°C, così da ottenere una polvere di PHA con un contenuto di acqua inferiore a 0,5% in peso.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati (PHA) da una coltura cellulare, che comprende: (a) acidificare la coltura cellulare fino ad ottenere un valore di pH uguale o inferiore 6, e sottoporre detta coltura cellulare ad un trattamento di frammentazione cellulare tramite omogeneizzazione ad alta pressione ad una temperatura da 10°C a 80°C, così da ottenere una sospensione di PHA; (b) basificare la sospensione di PHA così ottenuta fino ad ottenere un valore di pH uguale o superiore a 8; (c) diluire la sospensione di PHA e sottoporla a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA come retentato e una fase acquosa come permeato; (d) sottoporre la sospensione concentrata di PHA a una fase di sbiancamento; (e) diluire la sospensione di PHA dopo la fase di sbiancamento e sottoporla a filtrazione tangenziale così da ottenere una sospensione concentrata di PHA sbiancato come retentato e una fase acquosa come permeato; (f) sottoporre la sospensione concentrata di PHA sbiancato ad essiccazione.
  2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la coltura cellulare viene sottoposta a una fase preliminare di concentrazione.
  3. 3. Processo secondo la rivendicazione 2, in cui la fase preliminare di concentrazione porta all'ottenimento di una concentrazione cellulare da 20 a 800 g/L, preferibilmente da 40 a 500 g/L.
  4. 4. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nella fase (a) la coltura cellulare è acidificata fino ad ottenere un valore di pH uguale o inferiore a 5.
  5. 5. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui durante l'omogeneizzazione viene applicata una pressione da 500 bar a 2000 bar, preferibilmente da 500 bar a 1500.
  6. 6. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nella fase (b) la sospensione di PHA viene basificata fino ad ottenere un valore di pH uguale o superiore a 9.
  7. 7. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la sospensione di PHA così basificata viene trattata con almeno un tensioattivo ad una temperatura da 10°C a 80°C, preferibilmente da 20°C a 50°C.
  8. 8. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui, dopo il trattamento secondo la fase (b), la sospensione di PHA viene diluita così da ottenere una concentrazione di solidi da 10 a 500 g/L, preferibilmente da 25 a 100 g/L.
  9. 9. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui, in almeno una delle fasi di filtrazione tangenziale, viene utilizzata almeno una membrana ceramica o polimerica, avente una dimensione media dei pori da 0,05 µm a 10 µm, preferibilmente da 0,2 µm a 5 µm.
  10. 10. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui, in almeno una delle fasi di filtrazione tangenziale, la sospensione di PHA viene alimentata attraverso detto almeno un filtro a flusso tangenziale con una pressione da 1 a 10 bar, preferibilmente da 2 a 6 bar.
  11. 11. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase di sbiancamento (d) viene realizzata tramite aggiunta di un agente ossidante.
  12. 12. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase di sbiancamento (d) viene condotta ad una temperatura da 10°C a 60°C.
  13. 13. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui, dopo il trattamento secondo la fase (d), la sospensione di PHA sbiancato viene diluita così da ottenere una concentrazione di solidi da 10 g/L a 100 g/L.
  14. 14. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la sospensione concentrata di PHA sbiancato ottenuta dalla fase (e) viene ulteriormente concentrata tramite filtrazione ortogonale e quindi inviata alla fase (f) di essiccazione.
  15. 15. Processo secondo la rivendicazione 14, in cui la sospensione concentrata di PHA sbiancato viene addizionata con almeno un agente flocculante e poi inviata alla fase di filtrazione ortogonale.
IT001276A 2013-07-30 2013-07-30 Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare ITMI20131276A1 (it)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT001276A ITMI20131276A1 (it) 2013-07-30 2013-07-30 Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare
EP14759325.5A EP3027761B1 (en) 2013-07-30 2014-07-28 Process for recovering and purifying polyhydroxyalkanoates from a cell culture
US14/908,456 US9683076B2 (en) 2013-07-30 2014-07-28 Processes for recovering and purifying polyhydroxyalkanoates from cell cultures
BR112016001837-0A BR112016001837B1 (pt) 2013-07-30 2014-07-28 Processo para recuperar e purificar poli-hidroxialcanoatos de uma cultura celular
AU2014298034A AU2014298034B2 (en) 2013-07-30 2014-07-28 Process for recovering and purifying polyhydroxyalkanoates from a cell culture
JP2016530643A JP6531096B2 (ja) 2013-07-30 2014-07-28 細胞培養物からポリヒドロキシアルカノエートを回収しかつ精製するための方法
PCT/IB2014/063475 WO2015015395A1 (en) 2013-07-30 2014-07-28 Process for recovering and purifying polyhydroxyalkanoates from a cell culture
ES14759325T ES2776149T3 (es) 2013-07-30 2014-07-28 Proceso para recuperar y purificar polihidroxialcanoatos a partir de un cultivo celular

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT001276A ITMI20131276A1 (it) 2013-07-30 2013-07-30 Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ITMI20131276A1 true ITMI20131276A1 (it) 2015-01-31

Family

ID=49226343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
IT001276A ITMI20131276A1 (it) 2013-07-30 2013-07-30 Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9683076B2 (it)
EP (1) EP3027761B1 (it)
JP (1) JP6531096B2 (it)
AU (1) AU2014298034B2 (it)
BR (1) BR112016001837B1 (it)
ES (1) ES2776149T3 (it)
IT (1) ITMI20131276A1 (it)
WO (1) WO2015015395A1 (it)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT201600096370A1 (it) 2016-09-26 2018-03-26 Bio On Spa Metodo per il biorisanamento di acque o suoli inquinati che comprende l'impiego di una composizione a base di un polimero biodegradabile.
IT201700035338A1 (it) * 2017-03-30 2018-09-30 Bio On Spa Composizione cosmetica comprendente un poliestere biodegradabile e una fase oleosa.
IL320247A (en) * 2018-08-24 2025-06-01 Moharram Ventures Inc Biodegradable polymer composition and method of producing the same
WO2020100598A1 (ja) * 2018-11-12 2020-05-22 株式会社カネカ ポリヒドロキシアルカノエート水分散液の製造方法
US20200375245A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Bio-On S.P.A. Filter elements suitable for use in smoking articles and processes for producing the same
US20210015170A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Bio-On S.P.A. Aerosol-generating articles suitable for use in aerosol-generating devices
IT201900013866A1 (it) 2019-08-02 2021-02-02 Bio On Spa Dispositivo per fumare comprendente almeno una capsula aromatizzante frangibile.
CN114846050B (zh) * 2019-12-23 2025-01-14 希欧生物清洁有限公司 新型生物塑料
KR20230070465A (ko) * 2020-09-21 2023-05-23 그랜트 인더스트리스, 아이엔씨. 화장품에 사용하기 위한 바이오 기반, 생분해성 복합 분말
WO2022090960A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Biotrend - Inovação E Engenharia Em Biotecnologia, S.A. Process for extraction and purification of polyhydroxyalkanoates
JP7781772B2 (ja) * 2020-11-24 2025-12-08 株式会社カネカ ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）の製造方法
US20250043130A1 (en) * 2021-12-23 2025-02-06 Kaneka Corporation Method for producing polyhydroxyalkanoate, and use of same
JPWO2023120193A1 (it) * 2021-12-23 2023-06-29
KR20230097635A (ko) * 2021-12-24 2023-07-03 씨제이제일제당 (주) 세포 파쇄 모니터링 방법 및 이를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하기 위한 방법
CN116144046B (zh) 2022-06-06 2024-01-23 北京蓝晶微生物科技有限公司 一种聚羟基脂肪酸酯凝集体的制备方法
IT202200013483A1 (it) 2022-06-27 2023-12-27 Versalis Spa Procedimento per il recupero e la purificazione di poliidrossialcanoati da un brodo di fermentazione.
JPWO2024029220A1 (it) * 2022-08-05 2024-02-08
KR20250098732A (ko) * 2023-12-22 2025-07-01 씨제이제일제당 (주) 폴리하이드록시알카노에이트 에멀젼의 제조 방법 및 이로부터 제조된 폴리하이드록시 알카노에이트 에멀젼
WO2025263926A1 (ko) * 2024-06-17 2025-12-26 연세대학교 산학협력단 마이크로 비드 형태의 폴리하이드록시알카노에이트 직접 회수 방법
WO2026009142A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Bio On S.P.A. Method for imparting hydrophobicity to a wood material, and material obtainable therefrom

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5437986A (en) * 1994-06-22 1995-08-01 Schering Corporation Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria
US20080220505A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-11 Jian Yu Recovery and purification of polyhydroxyalkanoates
WO2011045625A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Bio On S.R.L. Using cell debris generated from pha recovery for enhanced cell growth and biopolyester formation

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2004134579A (ru) 2002-04-26 2005-05-10 Канека Корпорейшн (Jp) Способ выделения поли-3-гидроксиалкановой кислоты
TW200508393A (en) 2003-01-20 2005-03-01 Kaneka Corp Method of collecting highly pure polyhydroxyalkanoate from microbial cells
US7435567B2 (en) * 2004-03-04 2008-10-14 Kaneka Corporation Method for degradation of nucleic acids and use thereof
BRPI0508083A (pt) 2004-03-04 2007-07-17 Kaneka Corp processo para produzir poliihidroxialcanoato
WO2005085461A1 (ja) * 2004-03-04 2005-09-15 Kaneka Corporation 核酸の分解方法及びその用途
JP2008054541A (ja) * 2006-08-30 2008-03-13 Kaneka Corp 醗酵生産された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分離精製方法
CN102224251B (zh) * 2008-12-09 2014-06-11 株式会社钟化 聚-3-羟基烷酸的凝集体的制备方法
US20110300592A1 (en) * 2008-12-09 2011-12-08 Kaneka Corporation Method for producing poly-3-hydroxyalkanoic acid
JP5608096B2 (ja) * 2008-12-09 2014-10-15 株式会社カネカ ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸及びその製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5437986A (en) * 1994-06-22 1995-08-01 Schering Corporation Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria
US20080220505A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-11 Jian Yu Recovery and purification of polyhydroxyalkanoates
WO2011045625A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Bio On S.R.L. Using cell debris generated from pha recovery for enhanced cell growth and biopolyester formation

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. KUNASUNDARI: "Isolation and recovery of microbial polyhydroxyalkanoates", EXPRESS POLYMER LETTERS, vol. 5, no. 7, 2 May 2011 (2011-05-02), pages 620 - 634, XP055110780, ISSN: 1788-618X, DOI: 10.3144/expresspolymlett.2011.60 *
BAILEY S M ET AL: "Separation of soluble protein from inclusion bodies in Escherichia coli lysate using crossflow microfiltration", JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBL.COMPANY. AMSTERDAM, NL, vol. 166, no. 1, 1 February 2000 (2000-02-01), pages 137 - 146, XP004187368, ISSN: 0376-7388, DOI: 10.1016/S0376-7388(99)00256-2 *
GHATNEKAR M S ET AL: "Production and recovery of poly-3-hydroxybutyrate from Methylobacterium sp V49", JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, JOHN WILEY & SONS LTD, UNITED KINGDOM, vol. 77, no. 4, 1 April 2002 (2002-04-01), pages 444 - 448, XP001577445, ISSN: 0268-2575, [retrieved on 20020212], DOI: 10.1002/JCTB.570 *
MARTIN KOLLER ET AL: "Strategies for recovery and purification of poly[( R )-3-hydroxyalkanoates] (PHA) biopolyesters from surrounding biomass", ENGINEERING IN LIFE SCIENCES, vol. 13, no. 6, 1 November 2013 (2013-11-01), pages 549 - 562, XP055110776, ISSN: 1618-0240, DOI: 10.1002/elsc.201300021 *
REN Q ET AL: "PROPERTIES OF ENGINEERED POLY-3-HYDROXYALKANOATES PRODUCED IN RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAINS", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 66, no. 4, 1 April 2000 (2000-04-01), pages 1311 - 1320, XP000925369, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.66.4.1311-1320.2000 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6531096B2 (ja) 2019-06-12
EP3027761B1 (en) 2019-12-11
BR112016001837B1 (pt) 2022-05-24
BR112016001837A2 (pt) 2017-08-01
US20160168319A1 (en) 2016-06-16
JP2016524926A (ja) 2016-08-22
AU2014298034B2 (en) 2017-12-14
WO2015015395A1 (en) 2015-02-05
US9683076B2 (en) 2017-06-20
EP3027761A1 (en) 2016-06-08
AU2014298034A1 (en) 2016-02-11
ES2776149T3 (es) 2020-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ITMI20131276A1 (it) Processo per recuperare e purificare poliidrossialcanoati da una coltura cellulare
JP5334994B2 (ja) ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその凝集体
US11332612B2 (en) Polyhydroxyalkanoate particles and aqueous dispersion of same
PT1687436E (pt) Processo para recuperar poli-hidroxialcanoatos ( phas ) a partir de biomassa celular
JP5835743B2 (ja) 生分解性と生体親和性に優れたナノ繊維の製造方法
CN114364731A (zh) 可生物降解的产品及生产方法
KR102029207B1 (ko) Pla 복합소재 및 이의 제조 방법
JP5651017B2 (ja) ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の生産方法
WO2020100598A1 (ja) ポリヒドロキシアルカノエート水分散液の製造方法
JP5384772B2 (ja) 純粋なキトサン繊維を工業的に製造するための紡糸液の製造方法
CA2571118A1 (en) Improved process for the solvent-based extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
CA2570328A1 (en) Solvent extraction of polyhydroxyalkanoates from biomass
JPWO2004029266A1 (ja) ３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法
Amano et al. Nanotube reactor with a lipase wall interior for enzymatic ring-opening oligomerization of lactone
JPWO2015068769A1 (ja) 精製大豆オリゴ糖液の製造方法
CN115298318B (zh) 聚羟基丁酸酯系树脂的制造方法
CN106687502A (zh) 从产生聚羟基烷酸酯(pha)的微生物发酵的生物质和/或从包含至少一种产生聚羟基烷酸酯的作物的生物质分离聚羟基烷酸酯(pha)的方法
Mohandessi et al. Extraction of high-purity medium-chain-length polyhydroxyalkanoates via combined mechanical treatment and mild oxidation
de Carvalho et al. Downstream processing and formulation of bioplastics
Nishida et al. Preparation of polyion complex fibers and capsules of DNA and chitosan at an aqueous interface
Zhang et al. Precipitants and additives for membrane crystallization of lysozyme
WO2015114719A1 (ja) ポリエステル樹脂組成物の製造方法およびポリエステル樹脂成形体
Anuara et al. Thin Film Composite Hollow Fiber Membrane for Separation in Biorefinery
JP2026011358A (ja) ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法およびポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液中のタンパク質を低減する方法。
CN117203165A (zh) 再生水的制造方法