ITMI20131300A1

ITMI20131300A1 - Composizione per il riempimento di difetti ossei e parodontali

Info

Publication number: ITMI20131300A1
Application number: IT001300A
Authority: IT
Inventors: Daniele Bollati; Clara Cassinelli; Giorgio Iviglia; Marco Morra
Original assignee: Nobil Bio Ricerche Srl
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2015-02-02
Also published as: AR097180A1; US20160184191A1; ES2938839T3; WO2015014872A1; EP3027163B1; EP3027163A1

Description

I0154814/GL/rf Titolare NOBIL BIO RICERCHE S.R.L.

“COMPOSIZIONE PER IL RIEMPIMENTO DI DIFETTI OSSEI E

PARODONTALI”

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda una composizione per il riempimento di difetti tissutali, quali ad esempio i difetti dovuti a perdita di tessuto soffice o riassorbimento di tessuto osseo attorno a denti naturali (difetti parodontali) o a viti da impianto (difetti perimplantari), per l’incremento della dimensione della cresta alveolare, per il riempimento di siti di estrazione e per il rialzo del seno mascellare.

Background dell’invenzione

La pratica odontoiatrica prevede frequentemente il riempimento di cavità con materiali funzionali allo scopo della rigenerazione tissutale. Rientrano in questa casistica il riempimento di difetti dovuti a perdita di tessuto soffice o riassorbimento di tessuto osseo attorno a denti naturali (difetti parodontali) o a viti da impianto (difetti perimplantari), l’incremento della dimensione della cresta alveolare, il riempimento di siti di estrazione, il rialzo del seno mascellare. Lo scopo

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

clinico del riempimento è quello di promuovere la rigenerazione tissutale, in modo che la cavità venga colmata da tessuto naturale rigenerato. Materiali per rigenerazione vengono comunemente applicati anche in caso di assenza, scarsa densità o ridotta dimensione ossea in zone in cui si vorrebbe, ad esempio, inserire una vite da impianto in sostituzione della radice naturale.

Sono disponibili sul mercato molti materiali per queste applicazioni, che si presentano perlopiù in forma di granuli, blocchi o gel, questi ultimi spesso erogabili mediante siringa. Un tipico esempio di materiale granulare è l’osso bovino, che purificato da componenti con possibile azione antigenica e ridotto in granuli di dimensione 0,3-2 millimetri, trova ampio utilizzo in chirurgia orale. Altri prodotti disponibili sono riempitivi sintetici, a base di ceramiche fosfatiche, come idrossiapatite o tricalcio fosfato, o di solfato di calcio.

I materiali appena menzionati operano perlopiù mediante azione meccanica, fornendo un’impalcatura (scaffold) funzionale all’adesione cellulare (osteoconduzione) e successiva rigenerazione ossea. Altri prodotti in commercio aggiungono ad essa un’azione biologica, mediante molecole in grado di

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

stimolare la rigenerazione ossea (osteoinduzione). Alcuni materiali a base di osso bovino in commercio, ad esempio, sono trattati in modo da non eliminare completamente la porzione organica, così che il prodotto finale contiene ancora molecole di collagene, che ha un ruolo nella neoformazione ossea. Vi sono poi prodotti sintetici in cui viene aggiunto collagene o sequenze presenti nel collagene, per favorire l’interazione con la componente cellulare e quindi la rigenerazione. Un prodotto del commercio utilizzato per il riempimento di difetti parodontali contiene amelogenina, una componente proteica che presiede alla formazione di smalto dentale e alla rigenerazione ossea. Fattori di crescita ed altre molecole biologiche con effetto osteoinduttivo sono presenti in alcuni materiali di comune utilizzo nel settore.

Mentre i prodotti citati hanno largo impiego clinico con successo adeguato, lo sviluppo delle conoscenze scientifiche nel settore ha indicato possibili vie di miglioramento. In particolare, le patologie di riassorbimento osseo in ambito odontoiatrico, inclusi i menzionati difetti parodontali e perimplantari, sono riconducibili all’ambito dell’osteoimmunologia, ovvero al risultato

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

dell’interazione tra cellule del sistema immunitario e del sistema scheletrico.

Per causa naturale, l’apparato masticatorio prevede la contiguità tra un ambiente ricco in batteri (la cavità orale) e tessuto soffice e scheletrico. Le cellule del sistema immunitario che si trovano nella zona di confine tra cavità orale e tessuto sottostante sono perennemente stimolate dal contatto con i batteri e continuamente sollecitate a mettere in atto i meccanismi difensivi cui sono preposte. Questa stimolazione si concretizza nei processi comunemente noti come “infiammazione”. Parte integrante della risposta allo stimolo batterico è la produzione di citochine e chemochine, ovvero i segnali molecolari che l’organismo attua per innescare e sostenere la risposta infiammatoria, strumento con cui vengono combattuti i batteri. E’ oggi noto che alcune delle citochine prodotte in risposta allo stimolo infiammatorio, come l’interleuchina 1, hanno un potente effetto nello stimolare la formazione di osteoclasti, ovvero le cellule che provvedono al riassorbimento osseo. Formazione di nuovo tessuto osseo e riassorbimento di tessuto osseo esistente sono normalmente bilanciati nel nostro corpo, garantendo la cosiddetta omeostasi

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

ossea, ma in condizioni di prolungata risposta infiammatoria, come quella naturalmente presente nelle zone di emersione dei denti nella cavità orale e nelle aree perimplantari, l’azione proosteoclastogenica delle citochine porta all’insorgenza di fenomeni di riassorbimento. Questi fenomeni sono favoriti, oltre che da fattori generali come la non adeguata igiene orale, anche e soprattutto da fattori individuali, come aspetti genetici nel caso della parodontite o malattia parodontale. Nel caso della periimplantite, che secondo alcune stime ha un’incidenza addirittura superiore al 20% dopo i 10 anni di servizio, si pensa che un ruolo scatenante importante sia giocato dalla natura del tessuto periimplantare, che perde alcune delle caratteristiche di controllo della risposta infiammatoria tipiche del tessuto naturale.

Al di là della stimolazione dell’osteoclastogenesi e riassorbimento del tessuto osseo, la stimolazione infiammatoria prolungata comporta distruzione del tessuto soffice a causa del cosiddetto stress ossidativo, cioè il danneggiamento di tessuti a seguito di perdita di controllo dei meccanismi di difesa basati su specie reattive ossigenate (Reactive Oxigen Species, ROS), specie

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

molecolari generate nei siti infiammatori per distruggere batteri e tessuto contaminato.

Il brevetto europeo EP 2 295 089 A2 descrive una formulazione realizzata mediante la combinazione di riempitivo ceramico sintetico o osso naturale e un gel di acido ialuronico, in modo da realizzare un gel facilmente malleabile e adattabile alle cavità. Tale trovato combina le proprietà meccaniche dei riempitivi inorganici all’effetto biostimolante dell’acido ialuronico, che garantisce anche la modellabilità e pastosità del preparato, ma non presenta effetti antiinfiammatori e antiossidanti.

Il brevetto EP 2021044 A2 rivendica un materiale malleabile per impianto in osso, contenente un solido particolato e un gel modellabile, realizzato con particelle di osso, collagene e una soluzione acquosa di polisaccaridi. Questo trovato combina la modellabilità dovuta al gel di polisaccaridi con l’azione biostimolante di collagene e l’effetto di sostegno dell’osso, ma non presenta azione antiossidante specifica in funzione della prevenzione dell’osteoclastogenesi e della distruzione tissutale.

I documenti brevettuali US2002/0192263 A1, US2003/0206937 A1 e US7785634 descrivono materiali per innesto in difetto osseo in forma di gel, aventi

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

come carrier gelatina e come riempitivo osso naturale particolato. Anche in questo caso, sono presenti alcune delle funzioni precedentemente descritte, ma manca un’attività contro il vero promotore della formazione di difetti parodontali e perimplantari, cioè l’azione di danneggiamento tissutale dovuta all’effetto di stress ossidativo e proosteoclastogenico della risposta infiammatoria alla presenza batterica.

Analoga carenza è riscontrabile nei materiali in commercio, che pur facendo uso di materiali biostimolanti e con capacità di formare gel modellabili e malleabili, come collagene, polisaccaridi, in particolare acido ialuronico, pectine, acido alginico, di riempitivi inorganici sintetici o naturali, mancano dell’attività antiossidante e tale da ridurre la formazione di citochine.

Sarebbe quindi auspicabile che i materiali da riempimento per patologie di riassorbimento non forniscano solo l’attuale azione meccanica e l’eventuale azione biologica non finalizzata al controllo della risposta infiammatoria, ma che mettano anche a disposizione un’azione antiosteoclastogenica specifica e un effetto di

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

prevenzione dei danni da stress ossidativo mediante l’esercizio di un’attività antiossidante.

I polifenoli, molecole di ampia diffusione nel mondo vegetale, presentano proprietà di grande interesse in questo ambito. Le procianidine e proantocianidine, molecole complesse composte da diverse unità ripetitive e presenti, tra l’altro, nell’uva, sono state ampiamente studiate in relazione alle loro capacità di rimineralizzazione di tessuto dentale. E’ stata anche dimostrata l’efficacia nel controllo dei processi di riassorbimento osseo da azione osteoimmunologica, in particolare mediante somministrazione sistemica nella dieta, come riportato in Govindaraj J, Emmadi P, Deepalakshmi, Rajaram V, Prakash G, Puvanakrishnan R., Protective effect of proanthocyanidins on endotoxin induced experimental periodontitis in rats. Indian J Exp Biol. 2010 Feb;48(2):133-42.

La possibilità di impiego di molecole di questo tipo per la cura e rigenerazione tissutale in difetti parodontali e perimplantari riveste ovviamente grande interesse applicativo. Particolarmente interessante sarebbe un uso locale, diversamente dall’approccio sistemico impiegato nell’articolo di Govindarai citato, in modo da concentrare l’azione benefica

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

delle molecole polifenoliche nel sito di riassorbimento di interesse. Tale uso locale è tuttavia ostacolato dall’elevata solubilità delle molecole in esame, che comporta la loro rapida rimozione dal sito di utilizzo, e dalla instabilità chimica di molti di questi composti.

Inoltre i polifenoli sono sistemi complessi e presenti in basse percentuali nelle specie vegetali di origine. Ogni frazionamento comporta un notevole incremento di costo e può portare all’inapplicabilità pratica degli interessanti principi generali sopra enunciati.

Sommario dell’invenzione

Un oggetto della presente invenzione è una composizione utilizzabile in ambito odontoiatrico avente sia un’azione antinfiammatoria che antiosteoclastogenica di aiuto nella rigenerazione ossea e tissutale.

Un secondo oggetto è un materiale di riempimento di difetti ossei contenente tale composizione ed avente proprietà meccaniche di supporto e di stimolazione biologica.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un procedimento per la realizzazione di tale composizione e materiale di riempimento a partire da

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

una fonte economica di molecole polifenoliche ed un processo di estrazione non complicato e non costoso.

Tali ed altri oggetti vengono ottenuti per mezzo di una composizione, di una materiale di riempimento e di un procedimento per la loro preparazione come delineati nelle annesse rivendicazioni, le cui definizioni formano parte integrante della presente descrizione.

Gli scopi di questa invenzione sono pertanto realizzati mediante una composizione, ed un relativo processo per la sua preparazione, che prevede l’impiego di estratti da scarti del processo di vinificazione, in particolare vinaccioli e bucce. In quanto scarti di processo, la materia prima non presenta costi sostanziali. E’ noto nell’arte che da scarti di questa natura possono essere facilmente e economicamente estratti polifenoli in miscela complessa, ad esempio con l’uso di soluzioni idroalcoliche (John Shi, Jianmei Yu, Joseph Pohorly, J. Christopher Young, Mike Bryan, Ying Wu, Optimization of the extraction of polyphenols from grape seed meal by aqueous ethanol solution, Food, Agriculture & Environment Vol.1(2) : 42-47. 2003). Questi estratti contengono acido gallico, procianidine, catechine, epicatechine, epicatechine

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

gallato. Come detto, questi estratti non possono essere utilizzati tal quali per un uso locale, in quanto idrosolubili e poco stabili. La possibilità di uso locale viene realizzata secondo la presente invenzione combinando gli estratti idroalcolici, nella loro soluzione originaria di estrazione o dopo essicazione, con molecole naturali con funzione biostimolante o di carrier inerte. In particolare, gli estratti possono essere combinati con collagene sfruttando l’effetto di reticolazione (crosslinking) esercitato da alcune di queste molecole, in particolare i cosiddetti tannini, ovvero molecole ad alto peso molecolare ottenute dalla condensazione dell’unità ripetitiva di flavanolo. E’ stato visto che l’azione di reticolazione avviene direttamente mediante gli estratti idroalcolici, senza necessità di ulteriori separazioni o processi, quindi in modo semplice e poco costoso. Il gel così ottenuto risulta stabile in ambiente acquoso, ma sorprendentemente in grado di esercitare gli effetti dei composti polifenolici per un tempo prolungato, circonvenendo le problematiche di elevata solubilità ed instabilità delle molecole polifenoliche. In questo modo, l’azione biostimolante di collagene sulla rigenerazione ossea viene combinata a quella

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

antiinfiammatoria e protettiva dei polifenoli fornendo un prodotto con caratteristiche innovative e specificatamente idoneo all’impiego.

Il gel così ottenuto può inoltre essere vantaggiosamente combinato con altri composti, in particolare polisaccaridi naturali come la pectina, per migliorare in modo sorprendente la maneggiabilità e consistenza del trovato, rendendolo particolarmente adattabile alle cavità che deve essere riempita.

Inoltre, come dimostrato negli esempi applicativi riportati in seguito, il gel può essere combinato con riempitivi ceramici granulari, dando origine ad una formulazione idealmente adatta alle applicazioni che prevedono il mantenimento di spazio, come il riempimento di difetti ossei perimplantari. Questa formulazione fornisce dunque, in un mezzo facilmente modellabile e applicabile, l’effetto meccanico di scaffolding del granulato ceramico, supplementato dall’azione biologica e proosteogenica di collagene e dall’azione antinfiammatoria, antiossidante e antiosteoclastogenica dei polifenoli.

Breve descrizione delle figure

Figura 1 rappresenta un grafico che mostra l’espressione di geni per MCB-1, IL1β e IL6 in

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

colture cellulari di macrofagi trattati con gli estratti polifenolici dell’invenzione;

Figura 2 mostra un diagramma in cui è riportata la percentuale di riduzione di assorbanza a 518 nm in esperimenti di riduzione di DPPH;

Figura 3 mostra un diagramma in cui è riportata la percentuale di riduzione di assorbanza a 518 nm in esperimenti di riduzione di DPPH con la composizione dell’invenzione (campione A) e composizioni dello stato dell’arte.

Descrizione dell’invenzione

La presente invenzione riguarda una composizione per la preparazione di un materiale di riempimento di difetti ossei, in particolare in campo odontoiatrico, in cui detta composizione comprende un gel di collagene reticolato con polifenoli in una matrice ceramica di supporto.

La matrice ceramica di supporto può essere una qualsiasi matrice, anche di origine naturale, del tipo utilizzato come riempimento di difetti ossei, quale ad esempio una polvere ossea di origine animale, ad esempio bovina, privata delle componenti immunogeniche. In certe forme di realizzazione, la matrice ceramica di supporto comprende o è costituita da granuli in ceramica fosfatica, preferibilmente in

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

idrossiapatite, beta-tricalciofosfato e loro miscele, con dimensioni preferibilmente comprese tra 50 e 2000 micrometri, più preferibilmente tra 100 e 300 micrometri.

In forme di realizzazione preferite i polifenoli comprendono o sono costituiti da miscele polifenoliche estratte da bucce e semi di uva, utilizzati come tali o preferibilmente dopo il processo di fermentazione e produzione del vino e essiccazione.

In forme di realizzazione preferite dette miscele polifenoliche sono estratti idroalcolici di bucce e semi d’uva.

E’ tuttavia possibile utilizzare, anche se meno vantaggioso, miscele ricostituite di polifenoli.

Il collagene è preferibilmente collagene tipo I, di origine bovina, suina, equina o per produzione biotecnologica ricombinante o da piante.

In certe forme di realizzazione, il rapporto in peso tra matrice ceramica (g di granulato) ed estratto di polifenoli (g di soluzione), prima dell’essiccamento o liofilizzazione, è compreso tra 45/55 e 10/90.

In certe forme di realizzazione, il materiale di riempimento secondo l’invenzione può anche contenere

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

dei polisaccaridi, preferibilmente pectina. In questo modo si otterrà un materiale di riempimento malleabile, perfettamente adatto alle applicazioni precedentemente elencate.

La composizione ed il materiale dell’invenzione possono essere preparati mediante un processo quale quello qui di seguito descritto.

Preparazione di un estratto polifenolico da vinacce

Le vinacce (bucce e semi di uva provenienti dal processo di vinificazione) vengono prima macinate, quindi estratte mediante un opportuno solvente in condizioni di agitazione, a temperatura ambiente e per un tempo compreso tra 30 minuti e due ore. Il solvente è preferibilmente una miscela idroalcolica, più preferibilmente una miscela 1 : 6 acqua/etanolo.

Preparazione del gel di collagene reticolato con polifenoli

La soluzione di estratto di polifenoli preparata nella fase precedente viene miscelata con una soluzione di collagene come sopra definito ed agitata vigorosamente fino a formazione di un gel costituito dalla reticolazione del collagene con i polifenoli dell’estratto.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

La soluzione di collagene è preferibilmente una soluzione acquosa e contiene tra lo 0,05% ed l’1% in peso di collagene, più preferibilmente tra lo 0,1% e lo 0,8% in peso.

Preparazione del materiale di riempimento secondo l’invenzione

In certe forme di realizzazione, il materiale di riempimento dell’invenzione si ottiene miscelando il gel di collagene reticolato con polifenoli con una matrice ceramica come definita precedentemente.

Il materiale così preparato può essere essiccato a formare un granulato. La fase di essiccamento può essere condotta ad una temperatura non superiore a 37°C, preferibilmente sotto vuoto, oppure per liofilizzazione secondo metodiche convenzionali.

Secondo una diversa forma di realizzazione, un materiale di riempimento malleabile può essere ottenuto mediante un procedimento che prevede di:

a) miscelare una soluzione di estratto di polifenoli ottenuta come descritto in precedenza con una matrice ceramica di supporto come sopra definita;

b) essiccare la miscela della fase a) fino ad ottenere un granulato;

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

c) miscelare una soluzione acquosa di collagene come sopra definito con una soluzione acquosa di polisaccaridi;

d) aggiungere la miscela secondo la fase c) al granulato della fase b);

e) miscelare il preparato della fase d) fino ad ottenere un materiale di riempimento malleabile.

La soluzione di polisaccaridi della fase c) è preferibilmente una soluzione di pectina in acqua o soluzione fisiologica. In forme di realizzazione preferite tale soluzione è tamponata a pH circa 5, ad esempio mediante tampone acetico. Tale soluzione di polisaccaridi ha preferibilmente una concentrazione in peso compresa tra 3% e 10%, più preferibilmente tra 5% e 8%.

La soluzione di collagene ha preferibilmente una concentrazione compresa tra 0,05% e 1% in peso, più preferibilmente tra 0,1% e 0,8%.

Nella fase c), il rapporto ponderale tra la soluzione di polisaccaridi e la soluzione di collagene è preferibilmente compreso tra 20:80 e 80:20, più preferibilmente tra 40:60 e 60:40.

Nella fase d), il rapporto ponderale tra il granulato della fase b) e la miscela della fase c) è

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

preferibilmente compreso tra 20:80 e 90:10, più preferibilmente tra 50:50 e 80:20.

Questa composizione permette di ottenere una pasta estremamente malleabile e lavorabile, atta ad essere impiegata come riempitivo osseo con proprietà migliorate. Infatti, la presenza di collagene e polifenoli derivanti dagli estratti di uva Barbera promuove l’effetto di reticolazione descritto in precedenza tra le due molecole in situ, limitando quindi la solubilizzazione delle molecole antiossidanti. La presenza di pectina permette di amalgamare la soluzione rendendola malleabile e lavorabile, e funge inoltre da carrier per il rilascio graduale di polifenoli. I granuli ceramici forniscono l’azione di supporto meccanico nel sito di impianto, coadiuvato dall’effetto sulla rigenerazione ossea di collagene.

Si è quindi prodotta una formulazione malleabile, localizzabile nel sito di impianto, che unisce al classico supporto meccanico e all’azione biostimolante, una specifica azione antiossidante e di riduzione dell’osteoclastogenesi indotta dalla risposta infiammatoria.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

Bucce e semi di uva di vari vitigni (Nebbiolo, Barbera), residui del processo di vinificazione, vengono macinati separatamente con un mixer per ottenere una farina grossolana. La farina viene posta a contatto con una soluzione acqua-etanolo al 50%, in rapporto 1:6 in peso, e agitata su uno shaker per 60 minuti. Gli estratti vengono separati dalla farina per centrifugazione ed ulteriormente filtrati con filtri 0.45 e 0.20 micrometri.

Aliquote di 20 microlitri vengono poste in colture cellulari di macrofagi J774A1, viene utilizzato anche un controllo costituito da 20 microlitri di miscela acqua-etanolo al 50%. Dopo 24 h viene eseguita una misura RT-PCR di espressione di alcuni geni legati al processo infiammatorio, si ottengono i risultati riportati in figura 1.

I dati indicano che tutti gli estratti, senza ulteriori operazioni di frazionamento e separazione, riducono in modo significativo l’espressione delle due interleuchine valutate. Entrambe sono espresse nei processi infiammatori e concorrono alla generazione di osteoclasti che inducono i fenomeni di riassorbimento osseo. Questo dato indica che i semplici estratti idroalcolici da residui del

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

processo di vinificazione sono in grado di agire sulle cellule infiammatorie.

Esempio 2

La preparazione dell’esempio 1 viene ripetuta con estratti da bucce di uva Nebbiolo, trattati allo stesso modo. 5 mL della soluzione idroalcolica così ottenuta vengono posti a contatto con 5 mL di collagene porcino Theracoll, in soluzione all’1% e agitati vigorosamente mediante un agitatore Thinky Mixer a 500 giri al minuto. Questa operazione dà origine ad un gel, formato grazie alla reticolazione del collagene, applicabile a difetti parodontali o perimplantari mediante siringa o spatola.

Esempio 3

Il gel ottenuto secondo l’esempio 2 viene miscelato con un riempitivo osseo granulato costituita da una matrice ceramiche realizzata con una miscela di idrossiapatite e tricalcio fosfato. Si ottiene un materiale di riempimento di facile impiego clinico, analogo a quello dei prodotti attuali, che combina le proprietà di sostegno meccanico del riempitivo ceramico, quelle biostimolanti di collagene e quelle antinfiammatorie degli estratti da residui di vinificazione.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

Il materiale così ottenuto può essere essiccato, in modo da formare un granulato a causa del collasso del gel, risultando del tutto analogo da un punto di vista applicativo e di manualità di utilizzo ai prodotti granulati in commercio, ma combinando le proprietà di sostegno meccanico del riempitivo ceramico, quelle biostimolanti di collagene e quelle antinfiammatorie degli estratti polifenolici.

Esempio 4

Preparazione di pasta riempitiva malleabile ad attività antiossidante: granuli ceramici di idrossiapatite e β-Tricalcio fosfato di dimensione compresa tra 100 e 300 micrometri vengono miscelati con soluzione idroalcolica di estratti di bucce di vitigno Barbera in rapporto 40:60, ottenuta come descritto nell’esempio 1.

La miscela così ottenuta è posta ad essiccare per una notte in modo da ottenere un granulato in cui gli estratti sono essiccati sulla superficie delle particelle.

Si preparano quindi:

- una soluzione di Pectina a concentrazione 7% in peso, in tampone acetato con pH controllato pari a 5;

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

- una soluzione di collagene (collagene porcino Theracoll), a concentrazione 0.5% in peso.

Le due soluzioni così preparate vengono miscelate con apposito miscelatore in rapporto 50:50, a questa soluzione viene quindi aggiunto il granulato ceramico preparato con gli estratti idroalcolici di Barbera essiccati sulla superficie in rapporto 25:75 e il tutto miscelato vigorosamente per 1 min a 2000 rpm.

Valutazione delle proprietà antiossidanti del trovato

La valutazione delle proprietà antiossidanti del trovato viene eseguita mediante il metodo detto DPPH. In questo saggio il radicale DPPH (difenilpicrilidrazile) è ridotto da composti antiossidanti a idrazina, con conseguente alterazione dello spettro di assorbimento che, nella forma non ridotta, presenta un picco di assorbanza a 515-528 nm, che impartisce una colorazione violacea alla soluzione. L’azione antiossidante provoca la riduzione dell’assorbanza a questa lunghezza d’onda e il cambiamento di colore della soluzione, che diventa giallo/incolore.

Il test viene eseguito preparando una soluzione 300 µM di DPPH in etanolo e aggiungendo un volume

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

noto di questa soluzione a un volume noto delle soluzioni in etanolo o acqua dei composti test.

Il test è stato eseguito ponendo in quattro diverse provette Falcon:

- 1 g del materiale preparato nell’esempio 4 (campione A);

- Polvere di granuli ceramici e estratti idroalcolici da bucce di uva preparata secondo quanto descritto nei primi due capoversi di esempio 4, in quantità di 750 mg, pari a quanto contenuto in 1 g di materiale preparato come nell’esempio 4 (campione B);

- 1 g di un materiale preparato come nell’esempio 4, ma senza utilizzare estratti idroalcolici da bucce di uva (campione C);

- Polvere di granuli ceramici in quantità di 750 mg, pari a quanto contenuto in 1 g di materiale preparato come nell’esempio 4 (campione D).

A ognuna di queste provette vengono aggiunti 5 cc di soluzione fisiologica. Dopo 1 h viene prelevato 1 mL di soluzione da ognuna delle quattro provette e posto in ulteriori provette pulite in modo da ottenere quattro campioni da 1 cc. Si aggiungono alle 4 provette 500 µL di soluzione 300 µM di DPPH in etanolo.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

Si osserva che la soluzione rimane di colore violaceo nel caso dei campioni che non contengono estratti idroalcolici da bucce di uva (campioni C e D). Le soluzioni diventano invece giallo/incolori nel caso del granulato ceramico arricchito con estratti idroalcolici da bucce di uva Barbera essiccati (campione B) e del materiale preparato secondo le modalità dell’esempio 4 (campione A), che aggiungono alle proprietà precedentemente descritte l’azione antiossidante specifica del trovato, rispondente alle esigenze dell’applicazione d’uso e assente nei materiali descritti nell’arte.

Determinazione dell’azione antiossidante del materiale dell’invenzione

I due preparati con azione antiossidante dell’esempio precedente (campioni A e B) vengono sottoposti al medesimo esperimento descritto sopra. Dopo 1 h vengono recuperati 100 microlitri di surnatante, che vengono destinati all’analisi UV-Visibile come descritto in seguito e il rimanente liquido viene rimosso e sostituito con liquido fresco. Dopo ulteriori 3 ore viene recuperata un’analoga quantità di surnatante e il rimanente liquido viene rimosso e sostituito con liquido

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

fresco. Analoga operazione viene svolta dopo 24 ore totali.

L’analisi UV-Visibile viene eseguita aggiungendo 500 microlitri di soluzione 300 µM di DPPH in etanolo ai 100 microlitri di soluzione campione e acquisendo lo spettro di assorbimento da 480 a 600 nanometri, mediante uno spettrofotometro UV-Vis UV-1700 Shimadzu. Il controllo è costituito dai campioni C e D dell’esperimento precedente, che non mostrano effetto antiossidante.

L’effetto di azione antiossidante viene espresso come riduzione % dell’assorbanza misurata a 518 nm dopo aggiunta di 100 microlitri di surnatante da un dato campione rispetto all’assorbanza misurata a 518 nm per il controllo (granulo o gel senza effetto antiossidante, campioni C e D). In pratica, il calcolo è il seguente :

Riduzione % = 100-A518 campione/A518riferimento. Si osservano i risultati riportati nel diagramma di figura 2. I dati indicano che la semplice miscela fisica tra polveri ed estratti idroalcolici (Campione B) comporta un effetto immediato di notevole riduzione del radicale DPPH, superiore a quello registrato sul materiale formulato del campione A (dato a 1 h). Già a 4 h, però, il formulato secondo

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

le modalità dell’esempio 4 è più efficace. Il rilascio tra 4 e 24 h si rivela ancora notevolmente efficace per il campione A, mentre la semplice miscela fisica, per i medesimi tempi, ha ormai perso efficacia antiossidante. Dopo 24 h il solo campione A è in grado di esercitare azione antiossidante nei confronti di DPPH.

Questo esperimento è interpretabile con il fatto che la semplice associazione fisica tra granulato ceramico ed estratti polifenolici comporta l’immediata dissoluzione dei medesimi estratti (effetto wash-out), che passano in soluzione in quantità elevata, generando un grosso effetto antiossidante a tempi brevi, ma una perdita di efficacia già a 4 ore. L’associazione tra gli estratti polifenolici e gli altri componenti della formulazione comporta evidentemente una modulazione della velocità di rilascio delle molecole antiossidanti o comunque una permanenza maggiore dell’effetto antiossidante, con ovvio vantaggio per l’applicazione, in modo sorprendente e non anticipabile. Infatti, se è noto che tannini presenti nelle bucce di uva e in altre specie vegetali possano interagire con il collagene, portando alla formazione di gel come descritto nell’esempio 2, non è

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

anticipabile che pur in presenza di tale associazione e dei componenti richiesti per la realizzazione della pasta malleabile descritta nell’esempio 4 venga mantenuto un effetto antiossidante qualitativamente superiore, ai fini dell’applicazione prevista, rispetto all’uso della medesima quantità di estratti senza la presente formulazione.

Confronto tra l’azione antiossidante del materiale dell’invenzione e prodotti affini in uso clinico.

L’esperimento del punto precedente viene ripetuto per confrontare l’azione antiossidante del materiale dell’invenzione con quella di due prodotti affini in uso clinico esistenti in commercio. In particolare, il preparato A viene sottoposto al medesimo test dell’esempio precedente, con osservazione ai tempi sperimentali di 1, 4 e 24 ore unitamente a:

Ostim, materiale per la rigenerazione ossea in forma di pasta, prodotto da Heraeus Kulzer GmbH, lotto 12JA34740, costituito da idrossiapatite sintetica in soluzione acquosa,

Osteobiol Gel 40, materiale per la rigenerazione ossea in forma di pasta, lotto 130154, prodotto da

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

Tecnoss srl, a base di granuli di osso bovino e gel di collagene.

I risultati ottenuti, espressi come all’esempio precedente, sono riportati nella Figura 3.

Il dato conferma che le formulazioni presenti in commercio, accuratamente progettate per fornire le caratteristiche descritte di sostegno meccanico, stimolo biologico e modellabilità, non mostrano le proprietà antiossidanti peculiari del trovato; inoltre è dimostrato che tali proprietà non sono impartite da materiali sintetici quali idrossiapatite o ceramiche fosfatiche o da materiali naturali quali collagene, comuni ai preparati in commercio e al presente trovato.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

RIVENDICAZIONI

1. Materiale di riempimento per uso odontoiatrico, detto materiale comprendendo un gel di collagene reticolato con polifenoli in una matrice ceramica di supporto, detto materiale comprendendo ulteriormente polisaccaridi.

2. Materiale secondo la rivendicazione 1, in cui la matrice ceramica di supporto comprende o è costituita da granuli in ceramica fosfatica.

3. Materiale secondo la rivendicazione 2, in cui detta ceramica fosfatica comprende idrossiapatite, beta-tricalciofosfato o loro miscele.

4. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta matrice ceramica di supporto è un granulato con dimensioni comprese tra 50 e 2000 micrometri oppure tra 100 e 300 micrometri.

5. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detti polifenoli comprendono o sono costituiti da miscele polifenoliche estratte da bucce e semi di uva, utilizzati come tali o dopo il processo di fermentazione e produzione del vino e essiccazione.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

6. Materiale secondo la rivendicazione 5, in cui dette miscele polifenoliche sono estratti idroalcolici di bucce e semi d’uva.

7. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto collagene è collagene tipo I, di origine bovina, suina, equina o per produzione biotecnologica ricombinante o da piante.

8. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui il rapporto in peso tra matrice ceramica (g di granulato) ed estratto di polifenoli (g di soluzione), prima dell’essiccamento o liofilizzazione, è compreso tra 45/55 e 10/90.

9. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui detti polisaccaridi comprendono o sono costituiti da pectina.

10. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, per l’uso in medicina.

11. Materiale secondo la rivendicazione 10, per l’uso nel riempimento di difetti ossei, quali ad esempio i difetti dovuti a perdita di tessuto soffice o riassorbimento di tessuto osseo attorno a denti naturali (difetti parodontali) o a viti da impianto (difetti perimplantari), per l’incremento della dimensione della cresta alveolare, per il riempimento

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

di siti di estrazione e per il rialzo del seno mascellare.

12. Procedimento per la preparazione del materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, comprendente:

1) una fase di preparazione di un estratto polifenolico da vinacce;

2) una fase di miscelazione dell’estratto polifenolico con una soluzione di collagene in modo da formare un gel di collagene reticolato con polifenoli;

3) una fase di miscelazione di detto gel di collagene reticolato con polifenoli con una matrice ceramica di supporto.

13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui detta fase 1) comprende_

- macinare bucce e semi d’uva;

- estrarre le bucce ed i semi macinati con un solvente, preferibilmente un solvente idroalcolico, a temperatura ambiente e per un tempo compreso tra 30 minuti e due ore.

14. Procedimento secondo la rivendicazione 13, in cui il solvente è una miscela 1 : 6 acqua/etanolo.

15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 14, in cui nella fase 2)

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

soluzione di collagene è una soluzione acquosa contenente tra lo 0,05% ed l’1% in peso di collagene, preferibilmente tra lo 0,1% e lo 0,8% in peso.

16. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 15, comprendente una fase di essiccamento della miscela della fase 3) a formare un granulato, in cui detta fase di essiccamento è preferibilmente condotta ad una temperatura non superiore a 37°C, preferibilmente sotto vuoto, oppure per liofilizzazione.

17. Procedimento per la preparazione di un materiale di riempimento malleabile secondo la rivendicazione 910, comprendente le fasi di:

b) essiccare la miscela della fase a) fino ad ottenere un granulato;

d) aggiungere la miscela secondo la fase c) al granulato della fase b);

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

18. Procedimento secondo la rivendicazione 17, in cui detta soluzione di polisaccaridi della fase c) è una soluzione di pectina in acqua o soluzione fisiologica, preferibilmente tamponata a pH circa 5, ad esempio mediante tampone acetico.

19. Procedimento secondo la rivendicazione 17 o 18, in cui detta soluzione di polisaccaridi ha una concentrazione in peso compresa tra 3% e 10%, preferibilmente tra 5% e 8%.

20. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 19, in cui detta soluzione di collagene ha una concentrazione compresa tra 0,05% e 1% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,8%.

21. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 20, in cui, nella fase c), il rapporto ponderale tra la soluzione di polisaccaridi e la soluzione di collagene è compreso tra 20:80 e 80:20, preferibilmente tra 40:60 e 60:40.

22. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 21, in cui, nella fase d), il rapporto ponderale tra il granulato della fase b) e la miscela della fase c) è compreso tra 20:80 e 90:10, preferibilmente tra 50:50 e 80:20.

P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Materiale di riempimento per uso odontoiatrico, detto materiale comprendendo un gel di collagene reticolato con polifenoli in una matrice ceramica di supporto.
2. Materiale secondo la rivendicazione 1, in cui la matrice ceramica di supporto comprende o è costituita da granuli in ceramica fosfatica.
3. Materiale secondo la rivendicazione 2, in cui detta ceramica fosfatica comprende idrossiapatite, beta-tricalciofosfato o loro miscele.
4. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta matrice ceramica di supporto è un granulato con dimensioni comprese tra 50 e 2000 micrometri oppure tra 100 e 300 micrometri.
5. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detti polifenoli comprendono o sono costituiti da miscele polifenoliche estratte da bucce e semi di uva, utilizzati come tali o dopo il processo di fermentazione e produzione del vino e essiccazione.
6. Materiale secondo la rivendicazione 5, in cui dette miscele polifenoliche sono estratti idroalcolici di bucce e semi d’uva. P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.
7. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto collagene è collagene tipo I, di origine bovina, suina, equina o per produzione biotecnologica ricombinante o da piante.
8. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui il rapporto in peso tra matrice ceramica (g di granulato) ed estratto di polifenoli (g di soluzione), prima dell’essiccamento o liofilizzazione, è compreso tra 45/55 e 10/90.
9. Materiale secondo cuna qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, comprendente ulteriormente polisaccaridi.
10. Materiale secondo la rivendicazione 9, in cui detti polisaccaridi comprendono o sono costituiti da pectina.
11. Materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, per l’uso in medicina.
12. Materiale secondo la rivendicazione 11, per l’uso nel riempimento di difetti ossei, quali ad esempio i difetti dovuti a perdita di tessuto soffice o riassorbimento di tessuto osseo attorno a denti naturali (difetti parodontali) o a viti da impianto (difetti perimplantari), per l’incremento della dimensione della cresta alveolare, per il riempimento P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L. di siti di estrazione e per il rialzo del seno mascellare.
13. Procedimento per la preparazione del materiale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, comprendente: 1) una fase di preparazione di un estratto polifenolico da vinacce; 2) una fase di miscelazione dell’estratto polifenolico con una soluzione di collagene in modo da formare un gel di collagene reticolato con polifenoli; 3) una fase di miscelazione di detto gel di collagene reticolato con polifenoli con una matrice ceramica di supporto.
14. Procedimento secondo la rivendicazione 13, in cui detta fase 1) comprende_ - macinare bucce e semi d’uva; - estrarre le bucce ed i semi macinati con un solvente, preferibilmente un solvente idroalcolico, a temperatura ambiente e per un tempo compreso tra 30 minuti e due ore.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui il solvente è una miscela 1 : 6 acqua/etanolo.
16. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 15, in cui nella fase 2) P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L. soluzione di collagene è una soluzione acquosa contenente tra lo 0,05% ed l’1% in peso di collagene, preferibilmente tra lo 0,1% e lo 0,8% in peso.
17. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 16, comprende una fase di essiccamento della miscela della fase 3) a formare un granulato, in cui detta fase di essiccamento è preferibilmente condotta ad una temperatura non superiore a 37°C, preferibilmente sotto vuoto, oppure per liofilizzazione.
18. Procedimento per la preparazione di un materiale di riempimento malleabile secondo la rivendicazione 10, comprendente le fasi di: a) miscelare una soluzione di estratto di polifenoli ottenuta come descritto in precedenza con una matrice ceramica di supporto come sopra definita; b) essiccare la miscela della fase a) fino ad ottenere un granulato; c) miscelare una soluzione acquosa di collagene come sopra definito con una soluzione acquosa di polisaccaridi; d) aggiungere la miscela secondo la fase c) al granulato della fase b); e) miscelare il preparato della fase d) fino ad ottenere un materiale di riempimento malleabile. P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.
19. Procedimento secondo la rivendicazione 18, in cui detta soluzione di polisaccaridi della fase c) è una soluzione di pectina in acqua o soluzione fisiologica, preferibilmente tamponata a pH circa 5, ad esempio mediante tampone acetico.
20. Procedimento secondo la rivendicazione 18 o 19, in cui detta soluzione di polisaccaridi ha una concentrazione in peso compresa tra 3% e 10%, preferibilmente tra 5% e 8%.
21. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 20, in cui detta soluzione di collagene ha una concentrazione compresa tra 0,05% e 1% in peso, preferibilmente tra 0,1% e 0,8%.
22. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 21, in cui, nella fase c), il rapporto ponderale tra la soluzione di polisaccaridi e la soluzione di collagene è compreso tra 20:80 e 80:20, preferibilmente tra 40:60 e 60:40.
23. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 22, in cui, nella fase d), il rapporto ponderale tra il granulato della fase b) e la miscela della fase c) è compreso tra 20:80 e 90:10, preferibilmente tra 50:50 e 80:20. P.I.: Nobil Bio Ricerche S.R.L.