ITMI20132193A1

ITMI20132193A1 - Processo microbiologico per la preparazione di intermedi utili nella sintesi di prostaglandine

Info

Publication number: ITMI20132193A1
Application number: IT002193A
Authority: IT
Inventors: Martina Letizia Contente; Francesca Costantino
Original assignee: Ind Chimica Srl
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-06-24

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

PROCESSO MICROBIOLOGICO PER LA PREPARAZIONE DI INTERMEDI UTILI NELLA SINTESI DI PROSTAGLANDINE

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un processo microbiologico per la preparazione di intermedi utili per la sintesi di prostaglandine, in particolare di Latanoprost e Bimatoprost, derivati sintetici della prostaglandina naturale PGF2a, che sono utilizzati per il trattamento di patologie della pressione oculare; questi composti sono indicati in letteratura rispettivamente con i nomi 13,14-diidro-17-fenil-18,19,20-trinor-PGF2a-isopropil estere e 17-fenil-18,19,20-trinor-PGF2a-etilammide), e hanno le seguenti formule di struttura:

Latanoprost Bimatoprost

Nelle formule di struttura sopra riportate, sono evidenziate le posizioni 13, 14 e 15 delle molecole, in quanto sono quelle rilevanti per le trasformazioni microbiologiche della presente invenzione; la stessa numerazione viene mantenuta per chiarezza di descrizione nel seguito per gli atomi corrispondenti (rispettivamente posizioni 5, 4 e 3 rispetto all’anello fenilico), anche in molecole che sono intermedi nella sintesi di Latanoprost e Bimatoprost, in cui a rigore, seguendo la nomenclatura IUPAC, questi atomi dovrebbero avere una numerazione differente.

STATO DELLA TECNICA

La sintesi di Latanoprost e Bimatoprost è descritta in vari documenti di letteratura.

Una sintesi industrialmente applicabile per la produzione di Latanoprost è descritta nel brevetto EP 364417 B9, in particolare nell’esempio 5 a pagina 7 e nello schema di pagina 10. Secondo il processo di questo brevetto, dopo aver ridotto il doppio legame in posizione 13,14 dell'intermedio 13 tramite idrogenazione con palladio su carbone, si effettua la riduzione del carbonile in posizione 15 (schema di sintesi dello schema "Tabella II” a pagina 10), ottenendo un precursore di Latanoprost come miscela epimerica al carbonio 15 che deve essere separata per cromatografia. L’origine della miscela epimerica al carbonio 15 è la riduzione non selettiva con sodio boroidruro, NaBH4(passaggio c della “Tabella II”), come riportato nello schema seguente (in cui PPB è il gruppo protettivo parafenilbenzoato):

Nel brevetto non è fornita alcuna indicazione sul rapporto tra i due epimeri nella miscela finale ma la ben nota non stereospecificità delle riduzioni ottenute con la coppia sodio boroidruro/cerio tricloruro eptaidrato fa presupporre un rapporto essenzialmente paritario dei due. Questa ipotesi è confermata dal contenuto del paragrafo [0033] di EP 364417 B9, in cui la resa di separazione cromatografica degli epimeri in posizione 15 del composto (7) è del 46%.

Nel caso del Bimatoprost, una possibile sintesi industriale è descritta nel volume “Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications of thè most relevant APIs”, Ed. Thieme, quinta edizione, alle pagine 156-157. Anche in questo caso si effettua la riduzione del carbonile in posizione 15 con la coppia sodio boroidruro/cerio tricloruro eptaidrato, che porta ad una miscela di prodotti epimeri in posizione 15:

OPPB OPPB OPPB Intermedio (III) Intermedio 15-a Intermedio 15-β

Nel passaggio dalla miscela di epimeri 15-a e 15-β a Bimatoprost è necessaria una separazione cromatografica per eliminare l’epimero 15-β indesiderato. La riduzione sopra descritta è anche oggetto di discussione nell’articolo “Phenylsubstituted prostaglandins: potent and selective antiglaucoma agente”, B. Resul et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 243-248 (schema II, pagina 244; in questo articolo l’intermedio con una funzione carbonile in posizione 15 è indicato come intermedio 10). Il risultato della riduzione con la coppia sodio boroidruro-cerio tricloruro eptaidrato e con litio tri-sec-butilboroidruro (reattivo noto come litio-selectride) è commentato sempre a pagina 244. La riduzione con litio-selectride è considerata “stereoselettiva” in quanto fornisce una miscela 7:3 dei due epimeri di riduzione mentre la coppia sodio boroidruro/cerio tricloruro eptaidrato presenta una minore selettività.

La purificazione successiva è ottenuta anche in questo caso per cromatografia. In entrambi i processi di sintesi sopra descritti, l’eliminazione del gruppo protettivo PPB è ottenuto con una idrolisi basica con carbonato di potassio in metanolo che, pur essendo di semplice esecuzione, è pur sempre un passaggio di processo aggiuntivo in più da eseguire.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La Richiedente ha messo a punto un procedimento di trasformazione microbiologica per la preparazione diretta in singolo reattore dei composti (3aR,4f?,5R,6aS)-esaidro-5-idrossi-4-[(1 E,3R)-3-idrossi-5-fenil-1 -penten-1 -il]-2 H-ciclopenta[ò]furan-2-one (6) e ( 3aR,4R,5R,6aS)-esaìdro-5-\dross\-4-[(3R)-3 -idrossi-5-fenilpentil]-2/7-ciclopenta[ò]furan-2-one (8), intermedi utili per la sintesi di prostaglandine, in cui il composto (3aR,4/?,5R,6aS)-5-(benzoilossi)esaidro-4-[(1E)-3-osso-5-fenil-1 -penten-1 -il]-2/-/-ciclopenta[b]furan-2-one (4) viene trattato con cellule intere di lievito del ceppo Pichia anomala CBS 110 in presenza di un co-substrato scelto tra glucosio e glicerolo ottenendo selettivamente il composto 6, oppure in presenza del co-substrato acido fumarico ottenendo selettivamente l'intermedio 8. Il composto 6 verrà anche indicato di seguito con il nome d’uso “lattondiolo B” e il composto 8 con il nome d’uso “lattondiolo L”. Le due trasformazioni selettive della presente invenzione sono riportate nello schema seguente:

glucosio

acido \

fumarico

8

Durante la biotrasformazione si realizza anche l’idrolisi totale del gruppo protettivo benzoato ottenendo direttamente il gruppo ossidrile.

Gli intermedi 6 e 8 sono fondamentali nella sintesi dei derivati sintetici della prostaglandina naturale PGF2a, in particolare di Latanoprost e Bimatoprost. La trasformazione dell’invenzione avviene in modo stereospecifico: gli intermedi 6 e 8 sono ottenuti con gli atomi nella corretta disposizione spaziale, così che non è richiesta alcuna purificazione cromatografica per l'eliminazione degli epimeri indesiderati.

Da una singola purificazione cromatografica è possibile quindi ottenere due intermedi immediatamente utilizzabili per la sintesi di due prostaglandine differenti.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La Figura 1 mostra in forma grafica l’andamento nel tempo della quantità di alcune specie coinvolte in una biotrasformazione secondo l’invenzione.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

È stato effettuato uno screening ristretto su 26 lieviti per identificare i ceppi in grado di trasformare quantitativamente il composto 4 negli intermedi 6 e 8 utili per la produzione di Latanoprost e Bimatoprost.

I lieviti valutati sono stati: Candida boidini CBS 6056, Kluyveromyces lactis CBS 2359, Kluyveromyces mandanus CBS 1553, Kluyveromyces marxianus var. lactis CL69, Pichia anomala CBS 110, Pichia etchellsii MIM, Pichia glucozyma CBS 5766, Saccharomyces cerevisiae CBS 1782, Saccharomyces cerevisiae CBS 3081 , Saccharomyces cerevisiae CBS 3093, Saccharomyces cerevisiae NCYC 73, Saccharomyces cerevisiae Zeus, Saccharomyces cerevisiae DAL 4741 , Saccharomyces cerevisiae DA 4741AOye1 , Saccharomyces cerevisiae DA 4741AOye2, Saccharomyces cerevisiae DA 4741AOye2Cc, Saccharomyces cerevisiae DA 4741AOye2Ks, Saccharomyces cerevisiae L12.

Gli inventori hanno trovato che, tra tutti i lieviti testati, il ceppo wild-type Pichia anomala CBS 110 dà una conversione quantitativa del composto 4, con buoni o eccellenti eccessi diastereoisomerici neH’epimero di configurazione desiderata; come noto, l'eccesso diastereoisomerico, indicato nel settore come d.e., è un valore percentuale definito dalla seguente formula:

d.e. = [(A - B)/(A B)] x 100

in cui A e B sono gli epimeri presenti rispettivamente in quantità superiore ed inferiore.

Impiegando Pichia anomala CBS 110 si ottiene una miscela di lattondiolo B (resa 44%) con un eccesso diastereoisomerico pari al 95%, e lattondiolo L (resa 30%) con un eccesso diastereoisomerico pari al 97%. Lo schema seguente mostra le biotrasformazioni coinvolte nella conversione del composto 4 con Pichia anomala, come derivato dai diversi intermedi osservati durante la trasformazione complessiva:

estera sl carbonll

riduttasi

6 (44%)

enoato enoato

riduttasi riduttasi

carboni!

estera sl riduttasi

8 (30%)

È noto che l’uso di cellule intere di lieviti può dare una miscela di alcool saturi e insaturi nella riduzione di carbonili α,β-insaturi, a seconda del ceppo e delle condizioni adottate; si veda l'articolo “Enantioselective production of 3-hydroxy metabolites of tibolone by yeast reduction”, D. Romano et al., Steroids 2008, 73, 112-115. Il risultato di queste biotrasformazioni dipende dalle velocità relative delle attività di enoato reduttasi e carbonile reduttasi, che determinano il rapporto finale dei prodotti.

Un ruolo cruciale nell’attività delle diverse riduttasi può essere svolto dal tipo dì cosubstrati aggiunti per favorire la rigenerazione dei cofattori coinvolti nelle diverse riduzioni.

Gli inventori hanno osservato che la biotrasformazione con Pichia anomala può essere specializzata utilizzando vari co-substrati in funzione deH’intermedio che si desidera ottenere: in Tabella 1 sono riportati i dati di resa molare degli intermedi 6 e 8 e i relativi eccessi diastereoisomerici dopo sette giorni ottenuti con diversi cosubstrati. Tutte le prove sono state condotte con una concentrazione di substrato pari a 1 g/L.

Tabella 1

Co-substrato Concentrazione Resa d.e. di 6 Resa d.e. di 8 co-substrato molare (%) molare (%) (g/L) int. 6 (%) int. 8 (%)

Etanolo 5 5 n.d. 12 92 Etanolo 50 10 97 20 92 Acido fumarico 5 8 n.d. 75 97 Acido fumarico 50 13 97 70 97 Glucosio 5 38 97 25 97 Glucosio 50 44 97 30 97 Glicerolo 5 57 97 29 97 Glicerolo 50 62 97 30 97 Xilosio 5 0 n.d. 21 96 Xilosio 50 0 n.d. 33 95

L'uso di acido fumarico come co-substrato consente di ottenere quantità elevate del lattondiolo L con elevata diastereoselettività, mentre utilizzando glucosio e glicerolo si osserva una prevalenza dell'intermedio 6.

L’acido fumarico è un co-substrato non convenzionale per rigenerazione del cofattore: sebbene questo acido non sia stato comunemente utilizzato in precedenza per la rigenerazione del cofattore in reazioni redox, si presume che un lievito come Pichia anomala ossidi l’acido fumarico nel ciclo di Krebs, consentendo quindi la rigenerazione di NADH.

Osservato l’effetto dell’acido fumarico come co-substrato sulla biotrasformazione, gli inventori hanno indagato l’influenza della sua quantità sulla conversione complessiva del composto 4 da cellule intere di Pichia anomala. I risultati misurati dopo sette giorni di prova sono riportati in Tabella 2.

Tabella 2

Concentrazione Resa molare int. 6 (%) Resa molare int. 8 (%) d.e. di 8 (%) acido fumarico (g/L)

0,5 59 16 97 1,0 27 42 97 1,5 < 5 82 97 5,0 7 75 97

10,0 10 75 97

50,0 13 70 97 Gli inventori hanno osservato che, quando viene impiegata una concentrazione di acido fumarico pari a 1 ,5 g/L, dopo sette giorni il composto 8 viene prodotto con rese elevate (82%) con quantità trascurabili del composto 6 nella miscela finale di reazione. La Figura 1 riporta l’andamento nel tempo (ore, h) della percentuale molare di alcune specie coinvolte nella trasformazione utilizzando una quantità di acido fumarico pari a 1,5 g/l ed una quantità di substrato 4 pari a 1 g/L.

In maniera analoga è stato valutato l’effetto della concentrazione del glicerolo sulla biotrasformazione poiché, nelle prove riassunte in Tabella 1, la presenza di glicerolo aveva fornito quantità più elevate dell’intermedio 6, utile per la sintesi di Bimatoprost. La Tabella 3 riportata di seguito mostra che la più alta resa e selettività di formazione dell’intermedio 6 è raggiunta in presenza di 50 g/L di glicerolo.

Tabella 3

Concentrazione Resa molare int. 6 (%) Resa molare int. 8 (%) d.e. di 6 (%) glicerolo (g/L)

1,5 28 10 97

5,0 57 29 97

10,0 60 30 97

50,0 62 30 97

In conclusione, la biotrasformazione della 15-chetoprostaglandina 4, intermedio nella sintesi di Latanoprost e Bimatoprost, con cellule intere di lieviti non convenzionali sembra essere un metodo utile per preparare il lattondiolo B e il lattondiolo L.

L’uso di Pichia anomala permette l'ottenimento di lattondiolo B o lattondiolo L a seconda del co-substrato impiegato: il lattondiolo B viene ottenuto in quantità prevalente usando glicerolo, mentre l’uso dì acido fumarico porta ad una resa prevalente di lattondiolo L in una semplice conversione in tre fasi e singolo recipiente del substrato 4.

La stereoselettività della riduzione del carbonile dipende dal lievito impiegato: nella sperimentazione che ha condotto alla presente invenzione, è stato verificato che con Pichia glucozyma, un lievito analogo a quello dell’invenzione, si ottiene come prodotto principale il composto (3aR,4R,5R,6aS)-esaidro-5-idrossi-4-[(3S)-3-idrossi-5-fenilpentil]-2H-ciclopenta[ò]furan-2-one (resa 69%), ovvero l’epimero del lattondiolo L (composto 8).

L’invenzione verrà ulteriormente illustrata dai seguenti esempi.

Negli esempi che seguono sono usate le seguenti abbreviazioni:

MeOH: alcol metilico;

iPrOH: alcol isopropilico;

DMSO: dimetilsolfossido;

AcOEt: acetato di etile;

spm: cicli al minuto (dall’inglese “strokes per minute”), misura della velocità di agitazione alternativa.

Le biotrasformazioni sono state seguite tramite HPLC; la rivelazione è stata effettuata con UV a 220 nm con rivelatore Merck-Hitachi 655-22. Durante le prove, campioni della miscela (0,5 mi) sono stati prelevati ad intervalli prefissati, centrifugati e la fase acquosa estratta con un uguale volume di acetato di etile; concentrazioni di substrato e di prodotto sono state determinate mediante HPLC utilizzando una colonna Purospher Star RP18e (5 pm) (Merck, Darmstadt, Germania) ed impiegando come eluente una miscela acetonitrile/HaO/MeOH (18/72/10) con portata di 0,8 ml/min.

La mobilità dei substrati e dei prodotti è: 4 = 29,0 min; 5 = 37,8 min; 6 = 58,2 min;

7 = 81,8 min; 8 = 61,6 min; 9 = 22,7 min; 10 = 69,8 min; 11 = 76,7 min.

La composizione stereochimica del composto 6 è stata determinata mediante HPLC utilizzando una colonna di silice Pinnacle II (5 pm) (Merck, Darmstadt, Germania) ed impiegando come eluente una miscela n-eptano/iPrOH (90/10) con un flusso di 1,5 ml/min.

La composizione della stereochimica del composto 8 è stata determinata mediante HPLC utilizzando una colonna Phenomenex Lux Cellulose-1 (5 pm) (Phenomenex, Castel Maggiore (BO), Italia) ed impiegando come eluente una miscela cicloesano/iPrOH (85/15) con una portata di 1,0 ml/min.

Per l’ottenimento degli spettri di massa, è stato usato uno ionizzatore di tipo elettrospray (ESI).

ESEMPIO 1

Viene eseguita una biotrasformazione preparativa utilizzando cellule di Pichia anomala CBS 110 coltivate in un fermentatore da 3 litri con 1 ,5 L di brodo di malto e 5 g/L di estratto di lievito Difco™ a pH 5,6 per 48 h, 28 °C e con velocità di agitazione 150 spm (Difco™ è un nome commerciale della società Becton, Dickinson and Company). Cellule fresche da colture sommerse sono centrifugate e lavate con tampone fosfato 0,1 M, pH 7,0, nuovamente sospese in 0,5 L di tampone fosfato per raggiungere la concentrazione di 25 gceiiuie secche/L e utilizzate per la biotrasformazione.

La biotrasformazione viene effettuata aggiungendo glucosio (2,5 g) e successivamente l'intermedio 4 (0,5 g) disciolto in 1 mL di DMSO e mantenendo la miscela di reazione sotto agitazione alternativa a 28 °C. Dopo sette giorni, la miscela di biotrasformazione viene centrifugata, e il surnatante acquoso viene estratto due volte con AcOEt (350 mL); l'estratto organico viene essiccato su Na2S04, il solvente è evaporato a dare una miscela grezza ed i singoli prodotti sono purificati con cromatografia flash (gradiente 7:3, 5:5, 2:8 n-esano/AcOEt), fornendo 142 mg di intermedio 6 e 94 mg di intermedio 8.

L’intermedio 6 mostra i seguenti dati analitici:

Aspetto: olio incolore;

Rf= 0.083 (n-esano/AcOEt 4:6);

[a]<24>D= -5.2° (c = 1, CH3CN);

d.e.: 97%;

<1>H-NMR (CDCI3,200 MHz): δ 1.78-1.98 (m, 2H), 2.23-2.36 (m, 1 H), 2.44-2.78 (m, 7H), 3.91 (q, J= 7.7 1H CH2CHOHCH2), 4.07 (q, J= 6.97 1 H, CHOH), 4.83-4.92 (m, 1 H, CHOC=0), 5.44 (dd, J<1>= 8.06, J<2>= 15.40, 1 H, Csp2-H), 5.62 (dd, J<1>= 6.60, /= 15.40, 1 H, Csp2-H), 7.16-7.29 (m, 5H, Csp2-H);

<13>C-NMR (CDCI3I50.4 MHz): δ 177.06 (C=0), 141.79 (Csp2quat.), 136.65, 130.51 (Csp2-H), 128.68, 128.63, 126.20 (Csp2-H), 82.69 (OCHCH2), 76.74 (CHOH), 72.17 (CH2CHOHCH2), 56.39 (CH2CHCHCHOH), 42.69 (CH2CHCHCHOH), 40.05, 38.89, 34.38, 31.95 (CH2);

MS (ESI m/z %): 325.3 [M<+>+Na<+>] (100).

L’intermedio 8 mostra i seguenti dati analitici:

Aspetto: olio incolore;

Rf- 0.087 (n-esano/AcOEt 4:6);

[a]<24>D= -25° (c = 2, CH3CN);

d.e.: 97%;

<1>H-NMR (CDCI3I200 MHz): δ 1.22-1.28 (m, 1 H), 1.46-1.59 (m, 3H), 1.73-1.81 (m, 3H), 2.21-2.28 (m, 1 H), 2.43-2.50 (m, 2H), 2.64-2.80 (m, 2H), 3.60-3.66 (m, 1 H, CH2CHOHCH2), 3.97 (q, J= 5.1 1 H, CHOH), 4.88-4.96 (m, 1 H, CHOC=0), 7.16-7.27 (m, 5H, Csp2-H);

<13>C-NMR(CDCI3I50.4 MHz): δ 177.95 (C=0), 142.13 (Csp2quat.), 128.68, 128.62, 126.15 (CHsp2), 84.20 (OCHCH2), 77.65 (CHOH), 71.52 (CH2CHOHCH2), 54.16 (CH2CHCHCHOH), 43.43 (CH2CHCHCHOH), 40.69, 39.31 , 36.22, 35.43, 32.26, 29.18 (CH2);

MS (ESI m/z %): 327.3 [M<+>+Na<+>] (100).

ESEMPIO 2

Viene ripetuta la prova dell’Esempio 1 , impiegando però in questo caso 25 g di glucosio come co-substrato. La prova fornisce 164 mg di intermedio 6 e 113 mg di intermedio 8, che mostrano gli stessi dati analitici riportati nell’Esempio 1.

ESEMPIO 3

Viene eseguita una biotrasformazione preparativa utilizzando cellule di Pichia anomala CBS 110 coltivate in un fermentatore da 3 litri con 1 ,5 L di brodo di malto e 5 g/L di estratto di lievito Difco™ a pH 5,6 per 48 h, 28 °C e con velocità di agitazione 150 spm. Cellule fresche da colture sommerse sono centrifugate e lavate con tampone fosfato 0,1 M, pH 7,0, nuovamente centrifugate in 0,5 L di tampone fosfato per raggiungere la concentrazione di 25 gceiiuie secche/L e utilizzate per la biotrasformazione.

La biotrasformazione viene effettuata aggiungendo glucosio (25 g), acido fumarico (143 mg) e l’intermedio 4 (0,5 g) disciolto in 1 mL di DMSO e mantenendo la miscela di reazione sotto agitazione alternativa (150 spm) a 28 °C. Dopo sette giorni, la miscela di biotrasformazione viene centrifugata e il surnatante acquoso viene estratto due volte con AcOEt (350 mL); l’estratto organico viene essiccato su Na2S04, il solvente viene evaporato a dare una miscela grezza ed i singoli prodotti sono purificati con cromatografia flash (gradiente 7:3, 5:5, 2:8 n-esano/AcOEt), fornendo 165 mg di intermedio 6 e 55 mg di intermedio 8.

L’intermedio 6 così ottenuto mostra gli stessi dati analitici riportati per questo composto nell’Esempio 1.

ESEMPIO 4

È stata ripetuta la prova dell’esempio 3, impiegando però come co-substrato solo acido fumarico (750 mg). La prova fornisce 308 mg di intermedio 8.

L’intermedio 8 così ottenuto mostra gli stessi dati analitici riportati per questo composto nell’Esempio 1.

ESEMPIO 5

È stata ripetuta la prova dell'esempio 3, impiegando però come co-substrato solo glicerolo (25 g). La prova fornisce 232 mg di intermedio 6 e 113 mg di intermedio 8.

Gli intermedi 6 e 8 mostrano gli stessi dati analitici riportati per questi composti nell’Esempio 1.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento microbiologico per la preparazione diretta in singolo reattore dei composti (3aR,4R,5R,6aS)-esaidro-5-idrossi-4-[(1E,3R)-3-idrossi-5-fenil-1 -penten-1 -il]-2/-/-ciclopenta[jb]furan-2-one (6) e (3aR, 4R,5R, 6aS)-esaidro-5-idrossi-4-[(3R)-3-idrossi-5-fenilpentil]-2/-/-ciclopenta[ò]furan-2-one (8), intermedi utili per la sintesi di prostaglandine, in cui il composto (3aR,4R,5f?,6aS)-5-(benzoilossi)esaidro-4-[(1E)-3-osso-5-fenil-1-penten-1-il]-2H-ciclopenta[b]furan-2-one (4) viene trattato con cellule intere di lievito del ceppo Pichia anomala CBS 110 in presenza di un cosubstrato scelto tra glucosio e glicerolo ottenendo selettivamente il composto 6, oppure in presenza del co-substrato acido fumarico ottenendo selettivamente l’intermedio 8, come da schema seguente: 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per la preparazione del composto 8, in cui il rapporto tra la concentrazione di acido fumarico e la concentrazione del composto di partenza 4 è compreso tra 1,5 e 50. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui detto rapporto è pari a 1 ,5. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 per la preparazione del composto 6, in cui si impiega glicerolo come co-substrato e il rapporto tra la concentrazione di glicerolo e la concentrazione del composto di partenza 4 è compreso tra 5 e 50. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui detto rapporto è pari a 50.