ITMI20141843A1 - Associazioni sinergiche stimolanti l¿espressione di sirtuina 1 - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

?ASSOCIAZIONI SINERGICHE STIMOLANTI L?ESPRESSIONE DI SIRTUINA 1?

L?invenzione ha per oggetto composizioni sinergiche a base di ingredienti attivi capaci di stimolare l?espressione di sirtuina 1.

Stato della tecnica

Le Sirtuine (SIRTs) hanno ricevuto una grande attenzione sin dalla loro scoperta, quando venne loro riconosciuto un importante ruolo biochimico e molecolare nel lievito Saccharomyces cerevisae, da cui deriv? il nome di Sir2 (Silent Information Regulator 2). Sir2 venne descritto come un regolatore del silenziamento genico, in grado di reprimere l?espressione di alcuni geni mediante deacetilazione, coinvolto anche nell?allungamento della durata della vita nel lievito.

Sir2 ? in grado di reprimere l?espressione di alcuni geni mediante la deacetilazione del gruppo ?-amino di residui di lisina N-terminale degli istoni. La presenza di altri quattro geni omologhi a Sir2 chiamati HST 1-4 (homologues of Sir2) fu identificata in S. cerevisae. La scoperta degli omologhi di Sir2 nel lievito e poco dopo anche nei batteri, nelle piante e nei mammiferi, dimostr? che Sir2 ? un membro di una grande ed antica famiglia di geni oggi identificate con il termine di ?Sirtuine?.

? noto che i mammiferi possiedono sette Sirtuine (SIRT 1-7), la pi? studiata delle quali ? la SIRT 1, gene omologo a Sir2 (Sir2 homolog 1).

Importante ? il ruolo che queste sostanze possono assumere in diverse patologie, specialmente per la SIRT 1 che ? legato alle funzioni chiave di SIRT 1 nell?organismo, sia da un punto di vista fisiologico che fisiopatologico.

SIRT 1, infatti, ha ruolo fondamentale nella regolazione di molti aspetti del metabolismo cellulare, da quello energetico a quello di sintesi, modula la trascrivibilit? genica della cromatina e regola l?attivit? di diversi fattori trascrizionali quali p53, NF-kB, PGC-1?, FOXO, Ku70, PPAR? e HSF-1, interferendo cos? sull?attivit? di geni legati alla crescita, al ciclo cellulare, all?apoptosi, all?autofagia e al metabolismo energetico.

Inoltre, questa proteina agisce come sensore metabolico e mediatore della sopravvivenza in condizioni di stress, quali la restrizione calorica e l?esercizio fisico, condizioni nelle quali la loro trascrizione risulta per l?appunto attivata.

SIRT 1 ? in grado di aumentare la stabilit? della telomerasi, ritardando cos? il progressivo accorciamento telomerico, l?ingresso delle cellule in senescenza replicativa e preservando l?integrit? genomica.

Dato che l?attivit? enzimatica di SIRT 1 dipende dalla presenza del cofattore NAD+, ? chiaro che l?attivit? di questa proteina ? direttamente legata alla regolazione del metabolismo lipidico e glucidico.

Nel caso del metabolismo lipidico, ? in grado di inibire la lipogenesi e la colesterologenesi e di aumentare l?ossidazione degli acidi grassi, la lipolisi e l?efficienza mitocondriale.

Nel caso del metabolismo glucidico, stimola la gluconeogenesi, inibisce la glicolisi e agisce come un sensore dei livelli di insulina, modulando la produzione di glucosio-sensibile di ATP e la conseguente secrezione di insulina dalle cellule beta-pancreatiche.

Oltre a ci?, molti studi recenti hanno sottolineato l?importante ruolo di SIRT 1 anche nel metabolismo degli acidi biliari.

SIRT 1 ? ampiamente espressa nelle cellule endoteliali, dove controlla funzioni importanti per la soppressione dello sviluppo dell?aterosclerosi, inclusa la upregolazione della ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), la riduzione della senescenza cellulare delle cellule muscolari lisce, la soppressione dell?infiammazione e dei ROS nelle arterie e l?incremento della crescita vascolare.

SIRT 1 agisce come molecola cardioprotettiva che protegge il cuore dall?invecchiamento, dal danno di ischemia/riperfusione, dallo stress ipertrofico e ossidativo, inibisce l?apoptosi dei cardiomiociti e regola il metabolismo energetico cardiaco.

Oltre a ci?, ? in grado di migliorare le funzioni dell?endotelio riducendo la formazione delle cellule macrofaghe schiumose, e prevenendo la calcificazione delle cellule muscolari vascolari lisce. In aggiunta ? un fattore chiave nello sviluppo vascolare dei mammiferi, poich? modula la crescita vascolare, controlla l?attivit? angiogenetica dell?endotelio, regola la crescita delle cellule progenitrici endoteliali, e mantiene l?omeostasi dell?endotelio.

SIRT 1 inibisce lo stress ossidativo, l?infiammazione e promuove l?autofagia interagendo con diverse proteine, tra cui FOXOs, NF-kB e mTOR, e con diverse vie del segnale.

L?invecchiamento ? riconosciuto come il principale fattore di rischio nel caso delle malattie neurodegenerative, e sebbene ci? ? noto gi? da molti anni, fino alla scoperta delle sirtuine, e soprattutto, dell?importante ruolo di SIRT 1 in questo contesto, non ? stato possibile utilizzare questa via per un trattamento terapeutico della neurodegenerazione.

SIRT 1, nell?Alzheimer, protegge dalla neurotossicit? indotta dal peptide A?, attraverso l?inibizione del segnale NF-kB nei microglia e pu? direttamente deacetilare la proteina tau su residui multipli.

Questo processo diminuisce l?accumulo di proteina tau iperfosforilata, i difetti cognitivi e la mortalit? precoce nei modelli murini P301L.

Nel caso del morbo di Parkinson, SIRT 1 ? in grado di diminuire la formazione di aggregati proteici anormali, mentre nella corea di Huntington ha un ruolo protettivo contro la neurotossicit? della proteina mutata. Infatti, quando ? attiva, SIRT 1 pu? deacetilare TORC1, facilitando la sua interazione con CREB e la trascrizione del BDNF, fattore neurotrofico protettivo nella corea di Huntington.

Recentemente molti studi hanno dimostrato un importante collegamento tra SIRT 1 e patogenesi della SLA, evidenziando come SIRT 1, deacetilando HSF1, possa indurre la trascrizione degli chaperon molecolari e diminuire cos? la morte neuronale.

Altri studi hanno invece analizzato la relazione tra SIRT 1 e cancro. SIRT 1 ? una molecola importantissima in questo processo, pu? infatti migliorare la stabilit? genetica, aumentare il silenziamento epigenetico, stimolare la riparazione dei danni al DNA e portare alla soppressione tumorale. In particolare, SIRT 1 ? in grado di interagire con NF-kB, fattore che promuove la formazione di metastasi, con la Survivina, gene anti-apoptotico, con la ?-catenina e con p53.

La proteina p53 ? coinvolta nel controllo del ciclo cellulare e viene definita ?guardiano del genoma?, proprio per suo ruolo di preservatore della stabilit? genomica attraverso la prevenzione delle mutazioni. La p53 acetilata, per?, attiva il programma trascrizionale con aumento della proliferazione cellulare e dell?apoptosi. Infatti, nelle cellule tumorali e cancerogene questo fattore di trascrizione ? iperacetilato. In vitro e in vivo, in modelli animali, l?iperespressione di SIRT 1 rallenta la proliferazione cellulare e inibisce l?apoptosi mediante la deacetilazione di p53, indicando SIRT 1 come un potenziale bersaglio di farmaci antitumorali.

Oltre a tutto ci?, SIRT 1 ? localizzata anche nel nucleo e nel citoplasma delle cellule di tutte le strutture oculari normali, comprese la cornea, la lente, l?iride, il corpo ciliare e la retina ed assume un ruolo chiave anche nelle patologie oculari.

Questa proteina ? in grado di preservare i neuroni dalla degenerazione Walleriana, ed ha un ruolo protettivo anche nelle alterazioni della retina, dove protegge le cellule epiteliali retiniche dai danni al DNA, dai danni legati allo stress ossidativo, dalla morte apoptotica e dall?infiammazione.

SIRT 1 ? coinvolta nella rigenerazione vascolare retinica nelle retinopatie ischemiche proliferanti ed ? in grado anche di attenuare i danni indotti dagli UVB, impedendo la fosforilazione di AKT e ERK.

Composti in grado di interagire con il pathway di SIRT 1 sono pertanto in grado di rallentare il processo di invecchiamento, di prolungare il lifespan e possono trovare applicazione farmacologica in molti disturbi quali diabete mellito di tipo 2, acidosi, iperglicemia plasmatica, insulino-resistenza, sindrome metabolica, obesit?, sindromi epatiche, steatosi epatica, ipertrigliceridemia, ipercolesterolemia, ipertensione arteriosa, aterosclerosi, coronaropatie, vasculopatie periferiche, la disfunzione cardiaca, fibrosi, ipertrofia cardiaca e ventricolare, ischemia cardiaca, ipossia, asma bronchiale, artrite reumatoide, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, Corea di Huntington, Sclerosi Laterale Amiotrofica, demenza da corpi di Lewy, malattia prionica, demenza frontotemporale, degenerazione Walleriana, degenerazione maculare, glaucoma, neurite ottica, danno retinico, retinopatie ischemiche proliferanti, retinopatia diabetica, retinite pigmentosa, cataratta senile, cheratite, ed inoltre tutte le degenerazioni cancerogene di tipo duttale invasivo, lobulare invasivo, midollare, colloide, papillare e tubulare.

Sulla base di quanto descritto risulta evidente come sostanze o associazioni di sostanze, in grado di aumentare l?espressione di SIRT 1, possano trovare impiego farmacologico, tenendo conto anche che, ? stato dimostrato che una sovra-espressione di SIRT 1 non esplica attivit? tossica.

Il resveratrolo, nota sostanza naturale presente negli acini d?uva, ? un esempio di composto che si ? rivelato in grado di stimolare SIRT 1.

Altri composti stimolanti SIRT 1 sono stati descritti in WO 2013100111 e in WO 2006/076681.

US20140031299 descrive un?associazione di resveratrolo con un precursore dell?acido nicotinico, US20110229535 descrive associazioni di resveratrolo con quercetina o piceatannolo.

Descrizione dell?invenzione

Si ? ora trovato che associazioni di almeno due composti scelti fra berberina, quercetina, tirosolo, catechina e acido ferulico producono effetti sinergici nella stimolazione SIRT 1 significativamente maggiori di quelle ottenibili con resveratrolo o con le note associazioni di resveratrolo con altri composti.

L?invenzione ha pertanto per oggetto composizioni comprendenti due o pi? composti scelti fra berberina, quercetina, tirosolo, catechina e acido ferulico.

Le composizioni dell?invenzione potranno ad esempio comprendere: - berberina associata ad almeno un composto scelto fra quercetina, tirosolo, catechina e acido ferulico, oppure

- quercetina associata ad almeno un composto scelto fra berberina, tirosolo, catechina e acido ferulico, oppure

- tirosolo associato ad almeno un composto scelto fra quercetina, berberina, catechina e acido ferulico, oppure

- catechina associata ad almeno un composto scelto fra quercetina, tirosolo, berberina e acido ferulico, oppure

- acido ferulico associato ad almeno un composto scelto fra quercetina, tirosolo, catechina e berberina.

Le composizioni dell?invenzione comprendono preferibilmente solo due di detti composti. Il resveratrolo ? preferibilmente assente.

Composizioni preferite comprendono:

- Berberina e tirosolo;

- Tirosolo e acido ferulico;

- Quercetina e acido ferulico;

- Berberina e catechina;

- Tirosolo e catechina.

Composizioni particolarmente preferite comprendono:

- Berberina e tirosolo;

- Tirosolo e acido ferulico;

- Quercetina e acido ferulico.

Le composizioni dell?invenzione sono utili per contrastare l?invecchiamento, per estendere la lifespan e per l?uso nel trattamento di patologie in cui sia desiderabile una stimolazione di SIRT 1 quali diabete mellito di tipo 2, acidosi, iperglicemia plasmatica, insulino-resistenza, sindrome metabolica, obesit?, sindromi epatiche, steatosi epatica, ipertrigliceridemia, ipercolesterolemia, ipertensione arteriosa, aterosclerosi, coronaropatie, vasculopatie periferiche, disfunzione cardiaca, fibrosi, ipertrofia cardiaca e ventricolare, ischemia cardiaca, ipossia, asma bronchiale, artrite reumatoide, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, Corea di Huntington, Sclerosi Laterale Amiotrofica, demenza da corpi di Lewy, malattia prionica, demenza frontotemporale, degenerazione Walleriana, degenerazione maculare, glaucoma, neurite ottica, danno retinico, retinopatie ischemiche proliferanti, retinopatia diabetica, retinite pigmentosa, cataratta senile, cheratite, degenerazioni cancerogene di tipo duttale invasivo, lobulare invasivo, midollare, colloide, papillare e tubulare.

Per i previsti impieghi terapeutici, le composizioni dell?invenzione saranno formulate utilizzando tecniche ed eccipienti convenzionali. Forme farmaceutiche adatte comprendono compresse, capsule soluzioni, sospensioni, sciroppi per somministrazione orale; soluzioni o emulsioni per somministrazione parenterale; gel, creme, pomate, soluzioni, lozioni, polveri, emulsioni per somministrazione topica. Le composizioni dell?invenzione potranno eventualmente contenere altri ingredienti attivi dotati di attivit? diversa da quella di stimolazione di SIRT 1 ma tale da integrare utilmente l?attivit? della composizione. Esempi di tali ulteriori ingredienti attivi comprendono ipoglicemizzanti, ipocolesterolemizzanti, anti-ipertensivi, antiinfiammatori.

Le composizioni dell?invenzione conterranno da circa 10 mg a circa 3000 mg di ognuno dei composti costituenti le associazioni sinergiche qui descritte.

La sinergia nella stimolazione di SIRT 1 non si verifica per associazioni diverse da quelle rivendicate, in particolare per associazioni di resveratrolo, curcumina, niclosamide, malvidina e altre. Si ? persino notato che alcune tali associazioni esprimono un decremento dell?espressione stessa.

Gli effetti sinergici della somministrazione contemporanea di due sostanze sulla stimolazione di SIRT 1, determinati come un effetto maggiore, statisticamente significativo, rispetto alla somma degli effetti delle due sostanze somministrate singolarmente, sono stati valutati su colture cellulari ripetendo l?esperimento per un minimo di 8 volte per ogni singola associazione, sia dopo un tempo di stimolazione di 3 ore che di 6 ore (pi? di 160 prove totali), come descritto nella seguente descrizione dettagliata.

Descrizione dettagliata dell?invenzione

Materiali e metodi

Colture cellulari

Si sono utilizzate cellule HeLa coltivate in un terreno di coltura completo, composto da DMEM (Dulbecco?s modified Eagles?s medium-Sigma) al quale ? stato aggiunto siero fetale bovino al 10% (Sigma), penicillina-streptomicina all?1% (Sigma) ed L-glutammina all?1% (Sigma).

Le cellule sono state seminate in fiasche di plastica e mantenute in incubatore a 37?C, in presenza di anidride carbonica (5%) per mantenere il pH a 7.4.

Le cellule sono state fatte crescere fino ad una confluenza dell?80% per poi essere tripsinizzate, contate con la camera di Burker e piastrate (100.000 cell/pozzetto).

Circa 24 ore prima dell?inizio dell?esperimento, il medium completo nei pozzetti ? stato cambiato con medium privo di siero, ed ? stata cos? effettuata una starvation overnight.

Le diverse sostanze utilizzate per il trattamento delle cellule (A-H), sono state preparate mediante opportuna solubilizzazione con DMSO, utilizzato a concentrazioni non tossiche per la cellula (v/v <0,5%).

Il giorno dell?esperimento sono state aggiunte nelle piastre le sostanze alle diverse concentrazioni considerate e lasciate in incubazione per 3 o 6 ore.

Al termine della fase di incubazione, dopo aver aspirato il medium dai pozzetti, sono stati aggiunti, in ciascuno di essi, 130 ?l di lisi buffer, composto da una soluzione di RIPA buffer (Tris.HCl a pH 8.0, NaCl, EDTA, Triton, SDS) a cui sono stati aggiunti un cocktail di inibitori di proteasi (Pepstatina, Leucopeptina, Aprotinina, PMSF) e di fosfatasi (sodio ortovanadato 1 ?M, sodio pirofosfato 10 ?M, sodio fluoruro 20 ?M).

Dopo aver proceduto con lo screpaggio, i campioni sono stati raccolti in ghiaccio, centrifugati, ed infine ? stato prelevato il sovranatante, che conteneva le proteine di interesse. Una parte del lisato ? stata trasferita in una eppendorf il cui contenuto proteico ? stato quantificato allo spettrofotometro, utilizzando un kit commerciale basato sulla metodica di Bradford. Le concentrazioni finali sono espresse in ?g/?L.

Western Blot

I campioni, prima del caricamento su gel, sono stati opportunamente diluiti con Laemmli Buffer (Tris.HCl 0.5 M pH 6.8, SDS 20%, glicerolo, 2-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0.2).

Il tutto ? stato fatto bollire per 5 minuti per completare la denaturazione gi? avviata dall?SDS.

Per la separazione elettroforetica ? stato usato un gel di poliacrilammide, composto da due parti, una inferiore denominata gel di corsa (Running gel), contenente acrilamide (ammide dell?acido acrilico) al 12% (acrilammide/ bis-acrilammide 30%), in cui avviene la separazione delle proteine, ed una superiore, chiamata gel di caricamento (Stacking gel), contenente acrilamide al 10%, dove sono stati costruiti i pozzetti per il caricamento del campione.

La corsa elettroforetica ? stata eseguita facendo passare una corrente a 200V per circa 1 ora, o comunque fino a quando il fronte non ha raggiunto il fondo del gel.

Una volta terminata la corsa, le proteine sono state trasferite dal gel ad una membrana di Nitrocellulosa (PVDF).

Il trasferimento ? stato eseguito facendo passare un voltaggio pari a 100V per 1 ora.

La membrana ? stata poi posta in una soluzione di bloccaggio (per prevenire le interazioni non specifiche tra anticorpo e membrana), composta da latte magro in polvere al 5% diluito in TBS-Tween 1 ? (TBS 1x, Tween20 0,1%), per 1 ora in agitatore e a temperatura ambiente.

Per la determinazione di Sirt1, si ? proceduto all?incubazione con l?anticorpo primario (AbI? anti-Sirt1, rabbit, alla diluzione di 1:1000 in TBS-Tween BSA 5%) per tutta la notte a 4?C.

Il giorno seguente la membrana ? stata incubata con l?anticorpo secondario, AbII? goat anti-rabbit diluito 1:10000 in TBS-Tween BSA 5%, per 1 ora a temperatura ambiente in agitazione. Durante questa fase all?anticorpo primario si lega in maniera specie-specifica l?anticorpo secondario coniugato ad un enzima perossidasi che legher?, nel passaggio successivo, un substrato specifico (luminolo) per la reazione di chemioluminescenza.

In seguito, sono stati effettuati una serie di lavaggi con TBS-Tween in agitazione, allo scopo di rimuovere tutto l?anticorpo secondario non legato. La membrana ? stata sviluppata in soluzione LifeAblot plus Enhanced Chemiluminescent HRP Substrate (Euroclone), dove nella stessa rimane per 3 minuti circa in agitazione. L?enzima perossidasi, presente sull?anticorpo secondario, catalizza l?ossidazione del luminolo, che viene a trovarsi perci? in uno stato eccitato, dal quale decade mediante emissione di luce.

L?impressione della lastra fotografica ? stata realizzata mediante lo strumento Kodak X-Omatic.

Test di Citotossicit?

Test di Vitalit? Cellulare- CellTiter-Blue (Promega)

Il CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega) ? un metodo fluorometrico per stimare il numero di cellule vive presenti in una piastra.

A questo scopo, sono state allestite delle piastre da 96 pozzetti, contenenti il medium, le cellule alla densit? desiderata e le sostanze da analizzare opportunamente diluite in DMSO.

Pi? precisamente sono state seminate 5000 cellule per pozzetto, in un volume di medium tale che il volume finale fosse 100 microlitri per ogni pozzetto.

Le cellule sono state trattate con le 8 sostanze prescelte per la sperimentazione, ed incubate per 3-6-24 e 48 ore.

Allo scadere del trattamento, ? stato opportunamente aggiunte il reagente (20?L/pozzetto) e la piastra ? stata incubata al buio per 4 ore a 37?C.

Infine, ? stata misurata la fluorescenza usando il Cytofluor 2300. La fluorescenza prodotta ? diretta proporzionale al numero delle cellule vitali e, attraverso l?analisi, si ottiene un valore in percentuale rispetto al controllo, ovvero rispetto alle cellule senza trattamento.

Test di Citotossicit? con Trypan Blue

La sospensione cellulare (50 ?l) ? stata diluita 1:2 con Trypan blue ed un?aliquota da 10 ?l ? stata posta nella camera di Burker.

Contando le cellule presenti sul vetrino secondo uno schema predeterminato, ed essendo il volume contenuto in una singola camera fisso e noto, con le corrette proporzioni si pu? risalire alla concentrazione di cellule vive contenute nel campione di partenza.

Numero di cellule vive = ?x? cellule traslucide (non colorate di blu)*10000 (fattore di conversione)* 2(fattore di diluizione)* 0.05 (volume di sospensione espresso in ml).

Risultati

In Tabella 1 sono riportati i risultati dell?analisi dell?espressione di SIRT 1, mediante la tecnica del Western Blot, espressi come aumento percentuale rispetto al controllo. Si pu? osservare come l?espressione di questa proteina sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo controllo. In particolare, berberina, tirosolo, acidi ferulico e catechina determinano un aumento maggiore rispetto agli altri gruppi, ma soprattutto rispetto al resveratrolo, usato come standard di riferimento.

somme delle percentuali di inibizione per ognuna delle sostanze da sole, desumibili dalla Tabella 1.

Nell?analisi dei risultati, ? considerato presente un effetto sinergico quando la somministrazione contemporanea di due sostanze [X+Y] ha un effetto maggiore, statisticamente significativo, rispetto alla somma degli effetti delle due sostanze somministrate singolarmente.

[X+Y] statisticamente superiore a [X] [Y],

dove [X+Y], rappresenta l?effetto ottenuto somministrando contemporaneamente le due sostanze X e Y, mentre [X] [Y] rappresenta la somma degli effetti ottenuti somministrando singolarmente le sostanze X e Y.

Per ciascuna associazione, l?effetto sinergico ? stato valutato dopo 3 e dopo 6 ore di stimolazione e considerando, per ciascuna sostanza, le due concentrazioni alle quali si ha ottenuto un effetto statisticamente maggiore su SIRT 1.

I risultati hanno evidenziato un incremento in percentuale statisticamente significativo (p<0,0001) sulla stimolazione di SIRT 1, sia dopo un tempo di incubazione di 3 ore, sia dopo 6 ore.

L?effetto sinergico sulla stimolazione di SIRT 1 ? stato confermato ripetendo l?esperimento per un minimo di 8 volte per ogni singola associazione.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni sinergiche stimolanti l?espressione di sirtuina 1 comprendenti due o pi? composti scelti fra berberina, quercetina, tirosolo, catechina, acido ferulico.
2. 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti berberina.
3. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti quercetina.
4. 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti tirosolo.
5. 5. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti catechina.
6. 6. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti acido ferulico.
7. 7. Composizioni secondo una delle rivendicazioni precedenti comprendenti le associazioni scelte fra: - Berberina e tirosolo; - Tirosolo e acido ferulico; - Quercetina e acido ferulico; - Berberina e catechina; - Tirosolo e catechina.
8. 8. Composizioni secondo le rivendicazioni precedenti comprendenti due composti scelti fra berberina, quercetina, tirosolo, catechina, acido ferulico.
9. 9. Composizioni delle rivendicazioni 1-8 per uso nel trattamento e nella prevenzione del processo di invecchiamento e del prolungamento del lifespan, del diabete mellito di tipo 2, acidosi, iperglicemia plasmatica, insulino-resistenza, sindrome metabolica, obesit?, sindromi epatiche, steatosi epatica, ipertrigliceridemia, ipercolesterolemia, ipertensione arteriosa, aterosclerosi, coronaropatie, vasculopatie periferiche, disfunzione cardiaca, fibrosi, ipertrofia cardiaca e ventricolare, ischemia cardiaca, ipossia, asma bronchiale, artrite reumatoide, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, Corea di Huntington, Sclerosi Laterale Amiotrofica, demenza da corpi di Lewy, malattia prionica, demenza frontotemporale, degenerazione Walleriana, degenerazione maculare, glaucoma, neurite ottica, danno retinico, retinopatie ischemiche proliferanti, retinopatia diabetica, retinite pigmentosa, cataratta senile, cheratite, degenerazioni cancerogene di tipo duttale invasivo, lobulare invasivo, midollare, colloide, papillare e tubulare.