ITMI940357A1 - Derivati polimerici del benzopiran-2-one ad attivita' immunotropa, loro uso e composizioni farmaceutiche che li contengono - Google Patents

Description

"DERIVATI POLIMERICI DEL BENZOPIRAN—2—ONE AD ATTIVITÀ' IMMUNOTROPA , LORO USO E COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE CHE LI CONTENGONO"

La presente invenzione si riferisce a derivati polimerici del benzopiran-2-one, in particolare, a copolimeri di benzopiran-2-cne con N-vinil pirrolidone. Tali derivati seno dotati di attività inmunotrcpa. La presente invenzione si riferisce anche a un procedimento per la preparazione di detti derivati, al loro uso nella fabbricazione di medicamenti e a ccnposizicni farmaceutiche che li contengono.

I composti secondo la presente invenzione sono descritti dalla seguente formula generale (I)

è un atcmo di idrogeno, oppure un gruppo -Y-A, nel quale Y è una catena C^-C^Q alchilene lineare o ramificato,

A è un atomo di alogeno, oppure un gruppo -NR^R^ , dove

R3 e R4» presi assieme all'atomo di azoto cui seno legati, formano un gruppo eterociclico azotato contenente eventualmente nell'anello eterociclico uno o più et ero atomi scelti tra N, 0, S;

1*2 e un atemo di idrogeno, oppure un monosaccaride;

n è un numero oonpreso tra 1 e 1000;

m è un numero compreso tra 1 e 1000.

E serpi di catena C^-C^Q alchilene lineare o ramificato sono metilene, dimetilene, trimetilene, tetrametilene, pentametilene , esametilene, decilene, 1-metiletilene, preferibilmente dimetilene, trimetilene, tetrametilene, pentametilene; più preferibilmente dimetilene.

Esenpi di gruppi eterociclici sono eteree io li a 6 atomi nell'anello, ad esempio piridile, pirimidile, pirazile, 1,3,5-triazinile, piperidinile , piperazinile , morfolinile, tiamorfolinile; eterocicli a 5 atomi nell'anello ad esempio pirrolile, tiazolile, ossazolile, imidazolile, 2 , 5-dioxo-pirrolinile , 2,5-dioxo-pirrolinile (maleimnido) , pirro li din ile, tiazolidinile, ossazolidinile, imidazolidinile , benzimidazolile. Gruppi preferiti sono imidazolile, benz imidazolile , 2 , 5-dioxo-pirrolinile (maleimnido) .

Esenpi di monosacc aridi sono glucosio, ribosio, fruttosio, xilosio, arabinosio nelle loro diverse forme ancmeriche; preferibilmente B-D-glucosio.

Saio particolarmente preferiti i composti di formula (I) dove Rj è idrogeno e è rispettivamente un gruppo 2-bronoetile (ccnposto IM-5) , un gruppo 2- ( 1-benzimidazol il ) etile (oonposto IM-39) , un gruppo 2-(limidazolil )etile (conposto IM-38) , un gruppo 2-N-maleinrmidoetile (eximposto IM-50) ; un gruppo 2-benzilbenzimidazol-l-il (composto IM-118) ; il oonposto dove è idrogeno e R2 è il gruppo l-B-D-gluoosile.

Studi condotti dall 'autore della presente invenzione su derivati del benzopiran-2-cne come potenziali agenti immuncmodulatori hanno portato allo sviluppo di nuovi irtmuronodulatorì sintetici.

Ir1 attività inmunotropa era stata osservata sia in derivati monemeri del benzopiran-2-one , sia in loro copolimeri ccn N-vinilpirrolidone# (Abyshev, e al. 17° Congresso Intemazionale di Chemioterapia, Berlino 1991) .

In particolare erano stati studiati il composto denominato D-20, di formula

E1 stato ora trovato, e costituisce oggetto della presente invenzione, che i ccirposti di formula generale (I) sono dotati di attività inrainotrcpa.

Vantaggiosamente, i ccnposti della presente invenzione possono essere coniugati con molti antigeni virali e loro determinanti antigenici: tali coniugati possono essere impiegati per la fabbricazione di vaccini sintetici, i quali, assieme a questi coniugati, costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione.

Composti di formula (I) seno preparati con metodi noti in letteratura, ovvero secondo la tecnica generale di polimerizzazione radicaiica, nota all'esperto del settore.

Brevemente, una soluzione di un derivato di benzopiran-2-one di formula (II)

dove R-^ e 1*2 seno come sopra definiti, viene trattata con N-vinilpirrolidcne (opportunamente in presenza di un solvente, ad esenpio etanolo) in presenza di un generatore di radicali, quale azobisisobutirronitrile.

I ccnposti secondo la presente invenzione seno stati testati per la loro attività immuncmodulante.

1700 ratti bianchi Mcngrel maschi,di peso ccnpreso tra 180 e 200 g furono trattati con eritrociti di montone, cerne agente antigene, alla dose di IO7, assieme ai composti dell'invenzione. Il 4° e 5e giorno dopo l'introduzione, come pure durante i 100 giorni successivi, le reazioni iirmunologiche furono determinate secondo il metodo descritto in "A Methodical Guide to Qcperimental and Clinical Study of New Therapeutic Preparations" Ministry of Health of The USSR. Inoltre, furono valutate le attività dei recettori dei linfociti T, l'indice di affinità morfologica (MIA) (Shabolin, V.N. e al. Iirmunology, 1990, n 6, 30-32) e il numero di linfociti T con recettori dell'istamina (Tr) (Golovastikov, I.N. e al; Intnunology, 1981, n 3, 22-24). L'attività T-repressoria dei linfociti fu studiata nel sistema di trasferimento adottivo delle cellule spleniche mediante l'inibizione specifica della risposta immmitaria (Pisarev, V.M., Ihe Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 1977, n 5, 571). Per valutare il cambiamento di macrofagi peritoneali e splenici, fu usato il metodo della formazione autoimnune di rosette (ARF), (Mg. Zhizhard, e al.; J.Kangzhau. Uhiv. Natur. Sci. Ed. 1988,voi 15, n.3, 33-338).

I dati furono trattati con il metodo statistico del t di Student. I risultati dimostrano che i. composti secondo la presente invenzione influenzano la risposta immunitaria dell'organismo e questa influenza è dipendente dalla dose sonministrata. Ad esenpio, nello studio dei mononeri, dosi comprese tra 0.01 e 10 mg/kg del ccnposto denominato D-20 sono efficaci nel determinare un sostanziale aumento della formazione di rosette (E-RPC), con il massimo auménto per la dose di 0.1 mg/kg. Dosi più elevate provocano un sostanziale aumento di cellule generatrici di anticerpi (APC),mentre l'attività dei linfociti T diminuisce. Tenendo conto che il corposto IM-5 consiste del 29% di D-20 e 71% di N-vinilpirrolidone (N-VP), detto corposto fu esaminato a dosi carprese tra 1 e 150 mg/kg. Il caiposto IM-5 ha un effetto di innesco del sisteria inmunitario a dosi maggiori o uguali a 2 mg/kg. Dosi basse (1-6 mg/kg) e dosi elevate (1-15 mg/kg) inducono una diminuzione del numero di E-EPC nell'organismo, cane illustrato in figura 1. Studi simili su E-24 e IM-22 hanno mostrato che E-24 è il ccnposto menemero che influenza il processo di formazione degli anticorpi in misura minore. Conseguentemente, l'intervallo di dosi applicate poteva variare da 1 a 150 mg/kg. La macrcmoleoola IM-22 contiene il 55% di E-24 e 45% di N-VP. I risultati dimostrano che IM-22 ha attività analoga a quella di IM-5, come si può vedere dalla figura 2, dove la sola differenza tra i dnp canposti risiede nel livello di deaccunulazione di APC. Sulla base dei dati ottenuti, e tenendo conto che la attività immunostimolante dovrebbe aumentare selettivamente alcuni processi del sistema immunitario senza inibire altre strutture innunitarie, si può concludere che le dosi ottimali seno attorno ai 10 mg/kg.

Gli studi a 100 giorni della dinamica di tali indici, quali il livello di APC, numero di E-ERC e linfociti T con recettori per l'istamina, mostrarono che l'effetto di questi preparati su reazioni immuni duravano per un certo periodo di tarpo. Per E-24, gli indici mantenevano i loro valori per 21 giorni. Nel caso di D-20, IM-5, IM-22, dopo una iniziale diminuzione e alcune fluttuazioni, il livello di E-RPC nella milza ritornava al suo valore originale il 35° giorno nel caso di D-20 e l'80° giorno nel caso dei composti secondo la presente invenzione. Il livello di APC e il numero di linfociti T con recettori per l'istamina (Tr) ritornavano ai loro valori originali solo dopo 80 giorni dalla seministrazione. Gli animali di controllo, trattati con solo veicolo, non mostrarono la presenza di tali linfociti nei nodi linfatici. I dati ottenuti sano coerenti con l'ipotesi della conparsa di recettori per l'istamina a un definito stadio della proliferazione indotta da antigene o mitogeno della differenziazione di linfociti T (Fassakhov, R.S. e al, Imnunology, 1984, n.246-49). Il meccanismo di azione potrebbe essere ipotizzato cane segue: l'interazione dell'istamina oon i recettori per quest'ultima sulla superficie cellulare attiva la adenilato ciclasi con conseguente aumento di adenosina ciclica monofosfato, il che dà luogo, in particolare, alla inibizione della capacità dei linfociti T di produrre rosette con gli eritrociti di capra e questa potrebbe essere la ragione, del loro iniziale calo nei primi giorni dopo la semninistrazione. Sembra che questo meccanismo regoli anche livello di produzione degli anticorpi. Questo può essere confermato dal confronto fra le curve di accanilo di APC e linfociti T, dove si osserva la conparsa di un picco speculare dei livelli. Quest'ultime permette anche di ipotizzare una risposta immunitaria totale, il cui valore è costante (vedi figure 3 e 4).

I conposti secondo la presente invenzione sono dotati di effetto immurostimolante più duraturo rispetto ai monaneri esaminati.

La caratterizzazione dettagliata dei carposti dell'invenzione ha rivelato diverse loro peculiarità. Cane si può vedere dalla tabella, i composti della presente invenzione aumentano in maniera indipendente e selettiva stadi differenti della risposta imnunitaria. Sulla base dell'analisi dei dati ottenuti si può concludere che il carattere generale di tali ccnposti, quali IM-5 e IM-22 è la loro dipendenza dal timo. Ciò è confermato dall'assenza del cambiamento del numero di E-RFC nell 'indice di MIA e nella reazione ospite contro trapianto, essendo gli indici dell'ospite molto bassi. La soirtni ni s trazione di IM-5 o di IM-22 determina un livello di APC , rispettivamente 10-15 e 5-7 volte maggiore di quello provocato dalla iirmunizzazione con eritrociti di montone. Probabilmente le interazioni idrofile-idrofobe di queste macromolecole sono responsabili delle diverse proprietà. Pare che la presenza di un saccaride e di un gruppo idros si fenoli co nella molecola di IM-22 la renda più idrofila e questo influisce sul suo effetto sulle membrane dei linfociti B e sull'accumulo di APC. L'inserimento di gruppi eterociclici, quali ad esempio imi da zo lo, benzimidazolo e ma le irmi de , nella catena polimerica dà luogo ad un aumento di APC da 2 a 5 volte. Probabilmente la presenza di eterocicli inpartisce ai polimeri dell 'invenzione carattere di dipendenza dal timo. E' interessante notare che i composti dell 'invenzione determinano una diminuzione dei livelli di APC quando sono provati sulla attività di linfociti T soppressori di cellule spleniche trattate con 5x10 eritrociti di montone e trasferite addotti vanente su animali della stessa linea. La valutazione percentuale della inibizione della produzione di anticorpi mostra che i ccnposti della presente invenzione stimolano questo effetto. Si nota che alla dose di 50-100 mg/kg, l 'attività dei ccnposti di cui sopra diminuisce, i composti contenenti gruppi eterociclici, stimolano i linfociti T soppressori in misura inferiore. La carpar sa di linfociti di questo tipo nell'organismo sembra nella regolazione immunitaria il principio inverso.

I ccnposti della presente invenzione influenzano i macrofagi in modo diverso e questo effetto dipende dal tipo di questi ultimi. Così, IM-5 e XM-22 promuovano l'aumento delle forme limature di macrofagi nell 'essudato peritoneale che è sostanziato dall'aumento del minerò di rosette autologhe oon i macrofagi (ARM) . Nello stesso terrpo, l'uso di IM-38, IM-39 e IM-50 dà luogo a un sostanziale aoc untilo del livello di ARM nei macrofagi peritoneali (PM) e al loro sufficiente aumento di macrofagi della milza (SM) . I dati ottenuti confermano i dati della letteratura (Besvereshenko I.A. , lumino logy, 1988, n.6 26-29) che indicano che i ccrposti macranolecolari stimolano la proliferazione delle cellule troncali emopoietiche, il che è confermato dall ' aumento di forme immature di macrofagi il cui livello nell'essudato peritoneale e nella milza di animali intatti è basso (tabella) .

I ccrposti secondo la presente invenzione trovano applicazione nel trattamento di malattie del sistema immunitario, in particolare le malattie autoimnuni.

Un adeguato modello sperimentale è rappresentato dalla artrite da adiuvante, nella cui patogenesi i linfociti T hanno un ruolo importante. I ccrposti della presente invenzione seno stati messi a confronto ccntytocoferolo acetato, che è dotato di azione stabilizzante di membrana e antiossidante. I risultati seno mostrati nella figura 5. Da questa figura si vede che il quadro clinico della artrite e l'edema alle gambe peggiorano se si usa 0(-tocoferolo acetato carne agente terapeuticoprofilattico nelle due settimane di trattamento. Tuttavia, negli stadi successivi a cominciare dalla terza settimana, la scimvinistrazione di adiuvante di Freund completo (EGA) provoca una diminuzione dell’edema. La soirministrazione di IM-22 durante gli stadi iniziali della malattia dà luogo a un diminuzione dell'edema delle gambe e solo all'inizio della terza settimana, dopo scraninistrazione di EGA, la malattia si aggravava. Al contrario, D-20 era sostanzialmente privo di effetti durante le prime due settimane, mentre a partire dalla terza settimana promuoveva la diminuzione dell'edema.

Il confronto dei livelli di E-REG e APC durante i 21 giorni dopo la somministrazione di EGA e dei composti in esame mostra che questi processi nella milza hanno andamenti diversi (vedi figura 6)Allo stesso tenpo, come si può vedere in figura 6, i cambiamenti nella reazioie inrnunitaria durante lo sviluppo della artrite da adiuvante in ratti sono di carattere fasico. I risultati dimostrano che la scarninistxazione di 3⁄4-tocoferolo acetato nelle prime fasi della malattia è inefficace. Secondo la letteratura (Pletsyty, K.D. e al. The Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 1987, n 1, 43-45), a questi stadi si osserva la attivazione di virus EGA latenti che hanno un effetto alterante sulle cellule e in questo caso né ^-tocoferolo acetato né D-20 seno in grado di stimolare la produzione antioorpale. A sua volta questo fatto provoca probabilmente 1'aggravamento della malattia.AL contrario, l'attività stimolante degli anticorpi da parte di IM-22 allevia i sintomi della malattia. Come noto (Davydova T.V. The Journal of Microbio logy Epidemiology and Iirmunohiology, 19791 n.l, 83-85) , alla fine della seconda settimana e all'inizio della terza il processo autoiitmune inizia a prevalere nella patogenesi dell'artrite da adiuvante e in questo processo gli effettori T generatori di forme attive di ossigeno giocano un ruolo inportante. Sembra che da questo memento sia (X-tooof erolo acetato, sia D-20 inizino a mostrare proprietà antiossidanti e stabilizzanti di membrana (D-20 in misura maggiore di &r tocoferolo acetato) stimolando la attività dei linfociti T. Da ciò si osserva l 'attenuarsi del quadro clinico della malattia. Anche IM-22 è in grado di agire come antiossidante. Tuttavia, la stimolazicne della genesi di anticorpi e la diminuzione della attività funzionale dei linfociti T in questo stadio della malattia non influisce sulla sviluppo di questi ultimi e la s armi nistr azione a dosi più alte addirittura peggiora la malattia. Di conseguenza, IM-22 deve essere utilizzato acme agente terapeutico-profilattico nei primi stadi della malattia, mentre negli stadi tardivi, secondo il quadro clinico, si può utilizzare D-20.

Da quanto sopra esposto, i composti della presente invenzione sono dotati di attività farmacologica, in particolare inrounotropa.

Pertanto, è un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di composti di formula (I) come agenti imminotropi.

Inoltre, costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di conposti di formula (I) in qualità di principi attivi per la preparazione di un medicamento ad attività iinnunotropa per il trattamento delle malattie del sistema immunitario.

In particolare, i composti della presente invenzione possono essere coniugati con antigeni in modo da dare un ccnplesso polimero-antigene utile per la preparazione di vaccini, quali ad esempio vaccini per le varie forme di influenza, per l'epatite B. A scopo illustrativo, seno stati preparati secondo l'invenzione complessi con i virus dell'influenza e della epatite B. I conigli imnuni zzati con i complessi dell'invenzione hanno sviluppato rispettivamente un titolo di anti corpi pari a l:262000+/-47,5 e 1:25000. I conplessi secondo la presente invenzione seno utilizzabili anche cane agenti per iitminofluorescenza diagnostica.

La presente invenzione comprende anche ccrposizioni farmaceutiche contenenti un conposto di formula (I) in miscela con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili. Le ccrposizioni secondo la presente invenzione saio p riparabili con metodi e procedimenti convenzionali noti all'esperto del settore, come ad esempio descritti in "Remìngtcn ' s Pharmaceutical Sciences Handboak" , XVII ed. , Mack Pub. , N.Y. U.S.A.

Esempi di caposezioni farmaceutiche seno le forme iniettabili, come soluziaii o sospensioni sterili o polveri liofilizzate ricostituibili, forme orali, quali capresse, capsule, pastiglie, confetti, polveri, granulati, sciroppi e soluzioni; forme rettali, quali supposte , forme vaginali, quali ovuli, candelette; forme topiche, quali creme, unguenti, lozioni.

I dosaggi e la posologia saranno stabiliti dal medico curante a seconda della gravità della patologia da trattare e dalle condizioni del paziente (età, sesso, peso) . Generalmente i dosaggi saranno conpresi tra 0,001 e 100 mg/kg.

Sono un ulteriore oggetto della presente invenzione vaccini sintetici contenenti un complesso aopo limerò di formula (I)/antigene.

Seno un ulteriore oggetto della presente invenzione conposizioni diagnostiche contenenti un complesso oopolimero di formula (I) /antigene cane agente iirnrunof luorescente.

Il seguente esenpio illustra ulteriormente l'invenzione.

ESEMPIO

Alle soluzioni dei derivati corrispondenti di benzopiran-2-cne e di N-vinil pirrolidone in etanolo vengono aggiunti 0,02 g di azobisisobutirronitrile, quindi si effettua la polimerizzazicne in fiala saldata con corrente di argon alla tenperatura di 75-80 “C. Dopo di che la fiala viene aperta e il polimero viene precipitato da etanolo e etere etilico. Il polimero viene seccato sotto vuoto a 40eC fino a peso costante. La assenza di monetneri viene determinata mediante cromatografia su strato sottile (TLC) in sisteria benzene/acetone (10:3). La massa molecolare dei polimeri viene definita mediante cromatografia su gel su Sephadex G-150, la struttura dei polimeri viene determinate ccn -^C-NMR. Le strutture seno confermate dagli spettri NMR e IR. Negli spettri IR sono evidenti le bande di assorbimento a 1765-1770 (carbonile saccaridico) 1690-1700 (carbonile del pirrolidone), 1590, 1500 ( legame carbonio-carbonio aromatico).

Nella seguente tabella seno elencate le principali caratteristiche chimico fisiche dei composti preparati:

TABELLA

Caratteristiche fisicochimiche dei polimeri sintetizzati degli immunomodulatori

Xmmunomodu latóri Contenuto eli.ti [ ] Massa molecolare in mole,% in p/gr in kDl

MI M2 DMFA,

* 25°C

IM-22 27.0 73.0 0,82 130-150

IM-39 10.0 90.0 0,92 160-200

IM—118 15,0 85.0 0,95 220-250

* MI - elementi dei frammenti benzopiranonici

Claims (11)

1. RIVENDICAZIOI 1. Composti di formula generale (I)

   deve: Rj è un a temo di idrogeno, oppure un gruppo -Y-A, nel quale Y è una catena C^-C^g alchilene lineare o ramificato, A è un atomo di alogeno, oppure un gruppo -NR^R^, dove R3 e R4, presi assieme all 'atomo di azoto cui sono legati formano un gruppo eterociclico azotato contenente eventualmente nell'anello eterocicliao uno o più eterea tomi scelti tra N, 0, S; Rj è un atomo di idrogeno, eppure un monosaccaride; n è un numero conpreso tra 1 e 1000; m è un numero ccnpreso tra 1 e 1000.
2. 2. Conposti secondo la rivendicazione 1 dove Rj è idrogeno e 3⁄4 è scelto nel gruppo costituito da un gruppo 2-brcmoetile# un grippo 2— (1— benzimidazolil)etile, un gruppo 2-(l-imidazoli)etile, un grippo 2-Nmaleimnidoetile , un gruppo 2-benzil-benzimidazol-l-ile .
3. 3. Composto secondo la rivendicazione 1, dove è idrogeno e 13⁄42 è il grippo Ι-β-D-glucosile .
4. 4. Uso dei ccrrposti delle rivendicazioni 1-3 come agenti ad attività immunotrcpa.
5. 5. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-3 per la fabbricazione di un medicamento ad attività imrmino stimolante.
6. 6. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-3 per la fabbricazione di un medicamento utile per il trattamento delle malattie autoimmuni.
7. 7. Composizioni farmaceutiche contenenti uno dei composti delle precedenti rivendicazioni come principio attivo in miscela con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.
8. 8. Complessi tra un composto delle rivendicazioni 1-3 e un antigene.
9. 9. Uso dei complessi della rivendicazione 8 per la fabbricazione di un vaccino.
10. 10. Vaccino caratterizzato dal fatto che contiene un complesso della rivendicazione 8 in miscela con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.
11. 11. Agente diagnostico caratterizzato dal fatto che contiene un complesso della rivendicazione 8 cerne agente immu nofluorescente.