ITMI952336A1 - Dipeptidi e pseudodipeptidi - Google Patents

Abstract

La presente invenzione è relativa a composti dipeptidici e pseudodipeptidici, ed al loro uso come agenti immunomodulatori, agenti utili nella terapia di malattie cardiovascolari ed infiammatorie, ad esempio nella terapia dello shock settico.

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "DIPEPTIDI E PSEUDODIPEPTIDI"

La presente invenzione è relativa a composti dipeptidici e pseudodipeptidici, ed al loro uso come agenti inrnuncmodulatori, agenti utili nella terapia di malattie cardiovascolari ed infianmatorie, ad esenpio nella terapia dello shock settico.

La presente invenzione si riferisce a conposti di formula (I)

A1-A2 (I)

dove e 3⁄42 sono residui amninoacidici o pseudoanminoacidici dei quali almeno uno è prolina, tiaprolina, acido pipecolico o acido 2-azetidincarbossilico,mentre l'altro è scelto tra prolina, tiaprolina, acido pipecolico, acido 2-azetidin-carbossilico, lisina, ornitina, arginine e istidina, essendo tali residui facoltativamente N -sostituiti da un gruppo (C1-6)alchile, benzile, (C2-6)acile o benzoile, oppure protetti sulla funzione N- o C-terminale, o ancora ammidati sulla posizione C-terminale; e potendo essere nella forma D o L sull'atomo di carbonio recante la catena laterale, oppure in forma di uno dei possibili diastereoiscmeri o enantiomeri ;

e i loro sali con acidi o basi farmaceuticamente accettabili.

Per gruppi (C1-6)alchile si intendono metile, etile, propile, iprcpile, butile, sec-butile, ter-butile, n-pentile, 3-metil-pentile, nesile, ed i rispettivi isomeri posizionali; mentre per (C2-6)acile si intendono gruppi quali formile, acetile, propicnile e butirrile, pentanoile,esanoile ed i rispettivi isomeri posizionali.

Un altro oggetto della presente invenzione riguarda l'uso dei composti di formula (I) come agenti inmuncmodulatori e agenti utili nella terapia di malattie cardiovascolari ed infianmatorie, ad esenpio nella terapia dello shock settico.

I carposti oggetto della presente invenzione, descritti dalla formula generale (I), possono essere preparati usando i metodi della sintesi di peptidi in fase solida o in soluzione, secondo procedure che seno note ai conoscitori dell'arte [si veda, ad esenpio, Merrifield, R.B., Biochemistry, 3, 1385 (1964)]. Dove non altrimenti specificato il residuo anminoacidico o pseudoatrminoacidico si intende usato nella configurazione L al carbonio recante la funzione anminica e carbossilica.

Preferibilmente, la sintesi viene effettuata in soluzione partendo da un prescelto residuo e assemblando il dipeptide o lo pseudodipeptide aggiungendo l'altro residuo desiderato. La sintesi dei composti di formula (I) può procedere sia in direzione N-terminale che in direzione C-terminale. I residui amminoacididi o pseudoantninoacidici possono venire usati come tali o sotto forma dei corrispondenti derivati protetti sulle varie funzioni reattive presenti nella loro struttura. Così, ad esenpio, la funzione carbossilica può venire convenientemente protetta mediante conversione nel corrispondente ter-butil (tBu) estere o benzil (Bzl) estere, mentre la funzione^-anminica può venire protetta tramite aimnidazione oon opportuni gruppi quali benzilossicarbcnile (Z), ter-butossicarbonile (Boc), 2,2,5,7,8-pentametil-crcman-6-solfonile (Pmc),trifluoroacetile (TFA), 4-metossibenzensolfcnile (Mbs)ed altri.

La scelta del residuo arnninoacidico o pseudoanminoacidioo eventualmente protetto potrà dipendere dal fatto che la sintesi proceda in direzione C- o N-terminale, e comunque rientra nella conoscenza del tecnico medio. Queste protezioni, e le eventuali successive deprotezioni seno effettuate con procedure del tutto familiari all'esperto della chimica dei peptidi. In ogni caso, i derivati annunciacidici o pseudoanminoacidici usati per gli scopi della presente invenzione sono anche prodotti reperibili coumercialmente.

Nella sintesi dei composti di formula (I), il gruppo protettivo della funzione α-anminica che deve formare il legame peptidico può essere opportunamente rimosso prima della condensazione. Ciò può avvenire, ad esempio per acidolisi con acidi di media forza (ad esempio acido trifluoroacetico) oppure mediante idrogenolisi catalitica utilizzando idrogeno gassoso o donatori di idrogeno quali, ad esenpio, acido formico o suoi sali, trietrisilano, idrazina in alcali, eco., scelti in funzione dell'anminoacido da sbloccare e degli altri eventualmente presenti, in presenza di opportuni catalizzatori a base di palladio metallico.

La condensazione fra i residui arminoacidici o pseudoanminoacidici viene condotta, come detto sopra, usando procedure note dallo stato dell'arte. Così, ad esempio, il gruppo carbossilico può essere fatto reagire in forma libera o sotto forma di estere attivato, ad esempio con N-idrossi-succininmide (OSu esteri), p-nitrofenolo, pentafluoro-fenolo ed analoghi agenti attivanti, in presenza dei consueti agenti condensanti quali 1’esafluorofosfato di 1-benzotriazolil-ossi-tris(dimetilarrau.no)-fosfcnio (BOP), 1'esafluorofostato di brano-tris-pirrolidinio-fosfonio (PyBroP), e simili. Quando il gruppo carbossilico viene usato come tale, la miscela di reazione potrà convenientemente venire addizionata con sostanze che attivano il carbossile in situ come , ad esempio 1-idrossi-benzotriazolo (HOBT), in quantità che variano da quantità catalitiche a un equivalente molare o più, calcolato sulla quantità del corrispondente residuo airminoacidico o pseudoamminoacidico.

La condensazione decorre generalmente ad una tenperatura conpresa tra circa 10°C e circa 50°C, preferibilmente a temperatura ambiente, in un solvente o sistema solvente organico inerte come, ad esempio, un idrocarburo alifatico idrogenato, dimetilformammide, dimetilacetammide e loro miscele.

Basi organiche terziare come, ad esenpio, 4-dimetilamminopiridina (DMAP) o trietilaimina (TEA) possono venire impiegate come aocettori dell'eventuale acidità sviluppatasi nel corso della reazione.

Per quanto riguarda i composti N0(-alchilati, essi vengono ottenuti per trattamento, a bassa tenperatura, con un'opportuna aldeide in presenza di cianoboridruro, agente riducente selettivo, in un solvente polare,preferibilmente metanolo.

Qualora si desideri ottenere un conposto di formula (I) armidati alla posizione C-terminale, si utilizzano come composti di partenza amminoacidi ccnmerciali già recanti tale funzione, oppure l'amminoacido C-terminale viene ammidato preferibilmente con un sale d'ammonio di HOBT.

I conposti di formula (I) dove uno di A1 o A2 è un residuo acilato vengono ottenuti per trattamento di detto residuo con l'opportuna anidride acilica, a basse temperature, in presenza di un catalizzatore quale DMAP. In alternativa si possono utilizzare nella condensazione derivati già Nα-acilati conmercialmente disponibili.

I prodotti ottenuti possono essere purificati per cristallizzazione da opportuni solventi o, se necessario, utilizzando tecniche cromatografiche note, quali la cromatografia in fase inversa e la cromatografia di scantoio ionico.

Di seguito vengono fomiti esempi di preparazione di alcuni composti rappresentativi della classe rivendicata.

L'analisi HPLC dei derivati anminoacidici, dei franmenti protetti e dei composti finali è stata eseguita nelle seguenti condizioni sperimentali

Dove non altrimenti indicato, tutti i passaggi sintetici avvengono a temperatura ambiente.

Per maggior chiarezza, vengono qui di seguito riportati i significati delle sigle che verranno usate nei seguenti esenpi:

ESEMPIO 1

H-(Et)Lys-Pro-OH»AcOH

A] Z-Lys(Boc)-OH (1,487 g, 3,8 limoli) é stato sciolto in 15 mi di DMF/cloruro di metilene (1:1 v/v) e seno stati poi aggiunti nell'ordine BOP (1,72 g, 3,8 rmoli), HOBT (0,52 g, 3,8 mmoli), TEA (1,08 mi, 7,8 nmoli) e H-Pro-OtBu (0,623 g, 3 mmoli) sciolto in 15 mi della stessa miscela. La soluzione é stata lasciata sotto agitazione per 1 ora. Il solvente é stato poi evaporato sotto vuoto ed il residuo ripreso con acetato di etile e lavato con bicarbonato di sodio al 5% in acqua, bisolfato di potassio al 2,5% in acqua ed acqua fino a neutralità.

Dopo anidrificazione la fase organica é stata evaporata sotto vuoto ed il residuo triturato in etere etilico recuperando 1,6 g di ZLys(Boc)-Pro-OtBu.

BJ Il prodotto ottenuto in A] (1,59 g; 2,9 imioli)é stato sciolto in 20 mi di metanolo, ed alla soluzione si sano aggiunti formiato di ammonio (0,731 g, 11,6 nmoli) sciolto in 0,6 mi di acqua e "spugna" di Pd preparata di fresco (circa 0,5 g).Dopo 2 ore il catalizzatore é stato filtrato ed il solvente é stato evaporato sotto vuoto. Il residuo é stato ripreso in 50 mi di acetato di etile e lavato con bicarbonato di sodio al 5% in acqua e con acqua, fino a neutralità. La fase organica é stata anidrificata ed evaporata sotto vuoto ottenendo 1,119 g di H-Lys(Boc)-Pro-OtBu.

C) Il composto del punto B] (1,1 g, 2,75 mmoli), è stato sciolto in 30 mi di metanolo e sono stati aggiunti 0,19 g (3 nmoli) di cianoboridruro di sodio.La reazione è stata raffreddata a -15°C e seno stati aggiunti 0,17 mi (3 limoli) di acetaldeide.Dopo 60 minuti la miscela reazione è stata evaporata sotto vuoto ed al residuo sospeso in acqua è stato aggiunto HC1 fino a pH 3. Il precipitato è stato filtrato e lavato con HC1 pH 3.

D) Il precipitato del punto C] è stato purificato per cromatografia su gel di silice su colonna Lobar LiChroprep Si 60, 40-63 pm (31x2,5 cm) precedentemente equilibrata con cloroformio/metanolo (9/1 v/v), La colonna è stata eluita con la stessa miscela a 8 mi/min. Le frazioni contenenti il prodotto puro seno state riunite ed il solvente evaporato sotto vuoto. Si sono ottenuti 0,8 g di H-(Et)Lys(Boc)-Pro-OtBu (composto 1; HPLC: gradiente (I) T.r. 20,38 min; purezza 98%) e 0,3 g di (Et)2Lys(Boc)-Pro-OtBu (ccnposto 2; HPLC: gradiente (I) T.r. 22,27 min;purezza >99%).

E) Il conposto 1 del punto D] (0,2 g, 0,41 nmoli) è stato sciolto in 6 mi di acido trifluoroacetico al 95% in acqua. Dopo 70 minuti, la miscela di reazione è stata diluita con acqua ed evaporata sotto vuoto. Il residuo è stato ripreso oon acqua, lavato aon etere etilico e liofilizzato. Il prodotto è stato purificato per cromatografia a scantoio ionico su di una colonna CM-Sephadex C-25 (16x200mm) eluendo a 3 mi/min con un gradiente di acetato di armonio a pH 6 da 0,02M a 0,2M in 270 minuti. Le frazioni raccolte seno state analizzate in HPLC, e quelle contenenti il prodotto puro sono state riunite e liofilizzate più volte, fornendo 0,122 g del prodotto del titolo.

ESEMPIO 2

(Et)2Lys-Pro-0H-AcOH

Il carposto 2 dell'Esempio 1, D] (0,3 g, 0,6 mmoli) è stato trattato come descritto nell'Esempio 1,E]. Si sono ottenuti 0,17 g del prodotto del titolo.

HPLC: (tenperatura della colonna: 60°C) gradiente (II) T.r. 10,65 min; purezza >99%.

ESEMPIO 3

Z-Pro-Arg(Pmc)-OtBu

A] Ad una sospensione di 6,9 g (12 nmoli) Z-Arg(Pnc)-OH in 60 ml di dicloroetano sano stati aggiunti, in 60 minuti a 50°C, 8,64 ml (36 nuvoli) di Ν,Ν-dimetilforraanniide-di-ter-butil-acetale. Al termine dell'aggiunta, la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione per 40 minuti a 50°C, quindi si seno aggiunti 20 ml di una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio al 5%- Il dicloroetano è stato evaporato sotto vuoto e la fase acquosa diluita con 100 mi di acetato di etile. La fase organica è stata separata e lavata con una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio al 5% e con una soluzione acquosa satura di cloruro di sodio fino a neutralità. La fase organica è stata quindi anidrificata ed evaporata sotto vuoto,ed il grezzo così ottenuto è stato purificato su una colonna di gel di silice (eluente acetato di etile/n-esano 6:4). Si sono ottenuti 3,4 g di Z-Arg(Pmc)-OtBu (HPLC, gradiente (I): T.r. 32 minuti, purezza 99%).

B] Ad una soluzione di 3,385 g (5,36 nuvoli) del prodotto di A) in 80 mi di metanolo, si sono aggiunti 1,416 g (21,44 nuvoli) di formiato di armonio sciolto in 3 mi di acqua, e Pd spugna (circa 1 g). La miscela di reazione è stata sottoposta a lenta agitazione per circa 2 ore a temperatura ambiente. Dopo aver filtrato via il catalizzatore, il solvente è stato evaporato sotto vuoto ed il residuo ripreso con acetato di etile e lavato con una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio al 5%,poi con acqua fino a neutralità.La fase organica è stata anidrificata ed evaporata sotto vuoto, fornendo 2,68 g di H-Arg(Pmc)-OtBu (HPLC, gradiente (I): T.r. 23,40 minuti, purezza 99,3%).

C] Il prodotto ottenuto in B] è stato sciolto in 30 mi di DMF/cloruro di metilene 1:1. A parte, 1,403 g (5,63 mnoli) di Z-Pro-OH sono stati sciolti in 20 mi di DMF/cloruro di metilene 1:1, e vi si seno aggiunti BOP (2,49 g, 5,63 mnoli), HOBT (0,76 g, 5,63 limoli) e TEA (1,56 mi, 11,26 mnoli). Le due soluzioni seno state poi riunite, e la miscela di reazione così ottenuta è stata posta sotto agitazione per 1 ora. Il solvente è stato quindi evaporato sotto vuoto ed il residuo ripreso con acetato di etile e lavato oon bicarbonato di sodio al 5% ed acqua fino a neutralità. Dopo anidrificazione, la fase organica è stata evaporata sotto vuoto ed il residuo triturato con etere etilico, dando così 3,71 g del prodotto del titolo.

HPLC, gradiente (I): T.r. 29,49 minuti,purezza 99,6%.

FAB-MS: m/z - 728 amu [M+H]+.

ESEMPIO 4

Z-Lys(TFA)-Pro-OtBu

A] Z-Lys-OH (0,84 g, 3 mnoli)è stato sciolto in 6 mi di una soluzione costituita da 3 mi di idrossido di sodio 1M e 3 mi di diossano,e vi si sono poi aggiunti 0,57 mi (4,5 mnoli) di etil-tiol-trifluoroacetato. La miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a 40 °C per circa 7 ore, quindi il solvente è stato evaporato sotto vuoto ed il residuo ripreso con 40 mi di bicarbonato di sodio al 5%. La fase acquosa è stata lavata con acetato di etile, portata a pH 2 ed estratta con acetato di etile.La fase organica è stata anidrificata ed evaporata sotto vuoto. E' stato ottenuto 1 g di Z-Lys(TFA)-OH in forma di un olio (HPLC, gradiente (I): T.r. 19,7 minuti, purezza 96%).

B] H-Pro-OtBu-HCl (0,283 g, 1,364 imnoli) è stato sciolto in 9 mi di DMF/cloruro di metilene 1:1. Il prodotto del punto A] (0,565 g, 1,5 mnoli)è stato sciolto in 9 mi della stessa miscela, poi vi si seno aggiunti BOP (0,66 g, 1,5 mnoli), HDBT (0,202 g, 1,5 moli) e TEA (0,63 mi, 4,5 itmoli). Le due soluzioni seno state riunite e la miscela risultante è stata posta sotto agitazione per 30 minuti, quindi è stata lavorata sostanzialmente cane descritto nell'Esenpio 4, C). Si sono così ottenuti 0,725 g del prodotto del titolo in forma di olio.

HPLC,gradiente (I): T.r.26,12 minuti,purezza 95,5%.

FAB-MS: m/z - 530 amu (M+H]+.

ESEMPIO 5

Z-Pro-Pro-OtBu

Partendo da H-Pro-OtBu*HCl (0,315 g, 1,5 nnoli) e Z-Pro-OH (0,397 g, 1,59 mnoli) e seguendo sostanzialmente la procedura dell'Esenpio 3,C], si sono ottenuti 0,54 g del prodotto del titolo.

HPLC: gradiente (I)T.r. 25,6 min;purezza 97%.

FAB-MS: m/z - 403 arnu [M+H]+.

ESEMPIO 6

Z-Lys{Boc)-Pro-OtBu

Z-Lys(Boc)-0H (1,487 g, 3,8 nmoli) è stato sciolto in 15 mi di DMF/cloruro di metilene (1:1 v/v) ed addizionato, in successione, con BOP (1,72 g, 3,8 nmoli),HOBT (0,52 g, 3,8 nmoli),TEA (1,08 mi, 7,8 mmoli) e H-Pro-OtBu (0,623 g, 3 nmoli) sciolti in 15 mi della stessa miscela. La soluzione è stata posta sotto agitazione per 1 ora,il solvente è stato quindi evaporato sotto vuoto, ed il residuo ripreso in acetato di etile e lavato con bicarbonato di sodio al 5% in acqua, bisolfato di potassio al 2,5% in acqua ed acqua fino alla neutralità.La fase organica è stata anidrificata ed evaporata sotto vuoto,ed il residuo è stato triturato in etere etilico fornendo 1,6 g del prodotto del titolo.

HPLC: gradiente (I)T.r. 28,4 min;purezza 98%.

FAB-MS: m/z - 534 amu [M+H]+.

I ccnposti della presente invenzione hanno dimostrato di possedere attività inmunoregolatrice, cardicvascolare ed antiinflamnatoria. In particolare essi si seno dimostrati utili cerne agenti anti-shock settico. Questa proprietà è stata determinata per mezzo del seguente saggio farmacologico.

Topi fenmina BALB/c, del peso di 20-22 gr. seno stati inoculati intraperitonealmente con 1 mg/topo di LPS (lipopolisaccaride sierotipo 0127:B8 - Sigma) in 0,5 mi di soluzione fisiologica. Dopodiché seno stati suddivisi in gruppi, a ciascuno dei quali seno state inoculate intraperitonealmente dosi da 62,5 pg/topo di alcuni cesposti rappresentativi dell'invenzione, 20 e 120 minuti dopo l'inoculo di LFS.

Un gruppo di animali è stato trattato con il solo LSP e tenuto cerne controllo.Gli animali sono stati tenuti sotto osservazione per almeno 4 giorni.

Di seguito vengono fomiti i risultati ottenuti.

TABELLA

Oggetto della presente invenzione è altresì l'uso dei composti di formula (I) come agenti inmunoregolatori ed agenti utili nel trattamento di patologie cardiovascolari ed infianmatorie, in particolare nello shock settico, con attinenza agli atti e agli aspetti industrialmente applicabili di detto uso, inclusa la loro incorporazione in conposizioni farmaceutiche. Esenpi di tali composizioni farmaceutiche seno le compresse, i confetti,gli sciroppi e le fiale,queste ultime adatte sia per la somministrazione orale che per quella intramuscolare o endovenosa. Esse contengano il principio attivo da solo o in unione con i comuni veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.

I dosaggi di principio attivo possono variare entro appi limiti a seconda della natura del carposto inpiegato che può venire scraninistrato una o più volte al giorno a seconda delle esigenze terapeutiche.

Claims (3)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula (I) (I) dove A1 e A2 sono residui anminoacidici o pseudoairminoacidici dei quali almeno uno è pròlina, tiaprolina, acido pipecolico o acido 2-azetidincarbossilico,mentre l'altro è scelto tra prolina, tiaprolina, acido pipecolico, acido 2-azetidin-carbossilico, lisina, ornitina, arginina e istidina, essendo tali residui facoltativamente N0(-sostituiti da un gruppo (C1-6)alchile, benzile, (C2-6)acile o benzoile, eppure protetti sulla funzione N- o C-terminale, o ancora annidati sulla posizione C-terminale; e potendo essere nella forma D o L sull'atomo di carbonio recante la catena laterale, oppure in forma di uno dei possibili diastereoisaneri o enantiomeri ; e i loro sali con acidi o basi farmaceuticamente accettabili.
2. 2. Un composto secondo la rivendicazione 1, scelto fra: dove (Et)Lys rappresenta il gruppo N-0(-etil-lisil; (Et)2Lys rappresenta il gruppo Nα(-dietil-lisil; Z-Pro rappresenta il gruppo N-benzilossicarboriil-prolil; Arg(Pmc) rappresenta il gruppo N -2,2,5,7-8-pentametilcrcman-6-solfanil-arginil; Z-Lys(TFA) rappresenta il gruppo N benzilossicarbcnil-N trifluoroacetil-lisil; Z-Lys(Boc) rappresenta il gruppo Nα-benzilossi-carbonil-N -butossicarbonil-lisil.
3. 3. Conposizioni farmaceutiche contenenti cerne principio attivo un conposto delle rivendicazioni 1 o 2, in miscela con un veicolo accettabile-4. Uso dei composti delle rivendicazioni1-2 per la preparazione di medicamenti ad attività inmuncmodulante, antiinfiarmatoria, per la terapia di malattie cardiovascolari e dello schock settico.