ITMI981467A1 - Anticorpi monoclonali umani contro l'antigene tumorale uk114 e cellule linfocitarie e ibridomi per la loro produzione - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "ANTICORPI MONOCLONALI UMANI CONTRO L'ANTIGENE TUMORALE UK114, E CELLULE LINFOCITARIE E IBRIDOMI PER LA LORO PRODUZIONE"

La presente invenzione si riferisce ad anticorpi monoclonali umani diretti contro l'antigene tumorale UK114, alle cellule linfocitarie immortalizzate e agli ibridomi in grado di produrli.

Un nuovo antigene del peso di 14 kDa è stato recentemente purificato dal fegato di capra dalla frazione resistente all'acido perclorico (Bartorelli, A., Berrà, B., Ronchi, S., Biancardi, C., Cavalca, V., Bailo, M., Mor,C. et al. J. Tumor Marker Oncology, 9: 37, 1994). La struttura primaria della proteina UK114 (Ceciliani, F., Faotto,L.,Negri,A., Colombo., I.,Berrà, B., Bartorelli,A. e Ronchi, S., FEBS 1996) è risultata altamente omologa alla famiglia di proteine definite YER057c/YJGF (Schmiedeknecht, G., Kerkhoff, C., Orso, E., Stohr,J., Aslanidis, C., Nagy,G.M., et al. Eur.J. Biochem. 242: 339, 1996). La proteina UK114 è localizzata nel citoplasma delle cellule normali mentre apparentemente viene espressa sulla membrana in seguito alla trasformazione neoplastica assumendo le caratteristiche di un antigene tumore-associato (Bartorelli,A., Bussolati,B., Millesimo,M., Gugliotta, P., e Bussolati, G. Int. J. Oncol. 8: 543, 1996). Anticorpi specifici per la proteina UK114 sono stati isolati nel siero di pazienti portatori di tumore ed in molti casi il titolo anticorpale specifico è risultato significativamente aumentato in pazienti trattati con UK101, il farmaco contenente come componente attiva la proteina UK114 eterologa (Bartorelli, A., Berrà, B., Clemente, C., Liverani, A., Santi, C., Ronchi, S., et al. J.Tumor Marker Oncology 9: 57, 1994). Tali anticorpi riconoscono la proteina UK114 di membrana ed esplicano attività citotossica mediata da complemento in vitro e in modelli murini.

Per l'ottenimento di cellule immunocompetenti specifiche in grado di produrre gli anticorpi monoclonali dell'invenzione, si è partiti da prelievi di sangue periferico provenienti da pazienti trattati con il farmaco UK101,responsivi a tale trattamento.

In questo modo, è stato possibile isolare cellule secernenti gli anticorpi monoclonali desiderati con alta efficienza, come descritto di seguito in maggior dettaglio.

La procedura adottata per la preparazione di detti anticorpi è la seguente: sono stati selezionati pazienti affetti da carcinomi refrattari al trattamento con chemioterapia e sottoposti con successo a ripetuti trattamenti con UK101 nell'ambito di un trial autorizzato dal Ministero della Sanità. Linfociti periferici dei pazienti arricchiti per la popolazione B sono stati immortalizzati con virus EBV. Tra le numerose linee policlonali ottenute, otto sono state selezionate in base alla reattività con la proteina UK114 purificata e clonate. I cloni positivi sono stati espansi e ripetutamente saggiati per evitare la frequente perdita di capacità secernente descritta per tutte le linee ottenute con trasformazione da EBV. Gli anticorpi di interesse sono stati cimentati con un pannello di linee tumorali di diversa origine e con cellule normali al fine di stabilire il selettivo riconoscimento dell'antigene tumore-associato. Gli anticorpi umani oltre alla proteina nativa purificata, sono risultati tutti capaci di riconoscere un antigene di membrana espresso su tumori gastrici (HT-29, Kato III) tumori del colon (Colo 38, LoVo), su tumori della mammella (MCF-7, MDA) e su alcuni neuroblastomi (LAN-1; SY5Y) oltreché su tumori della mammella e del polmone ottenuti da pazienti sottoposti ad intervento chirurgico.sono risultati costantemente negativi su tumori di origine ematopoietica (Molt-4, HPB-AII, HI-60, K562) e su cellule normali (linfociti periferici, fibroblasti, cellule Chang), e su cellule circostanti la neoplasia come dimostrato con analisi citofluorimetrica.

Un primo aspetto dell'invenzione si riferisce pertanto agli anticorpi monoclonali umani diretti contro la proteina UK114.

Un altro aspetto dell'invenzione si riferisce a cellule linfocitarie immortalizzate in grado di produrre gli anticorpi monoclonali contro UK114.

Oltre alle cellule immortalizzate, in particolare con il virus EBV, che presentano degli svantaggi quali una certa instabilità, la bassa resa di anticorpo prodotto, e altri, si è cercato di produrre ibridomi umani. Per tale scopo, sono state selezionate 3 linee EBV con la migliore capacità di crescita e di secrezione.

Tuttavia, benché la tecnica di fusione somatica nel modello murino sia ampiamente consolidata, ben diversa è la situazione nell’uomo. Infatti, al momento è disponibile un numero molto ridotto di plasmocitomi umani stabilizzati e nessuno di questi si è dimostrato un buon partner di fusione somatica per la generazione di ibridomi uomouomo. Migliori risultati sono stati ottenuti con l'impiego di eteromielomi derivanti a loro volta dalla fusione di una cellula umana con un mieloma murino. Tali linee danno luogo a ibridomi generalmente più stabili, capaci di crescere meglio in topo nudo sotto forma di tumore ascite.

Le tre linee EBV selezionate sono state fuse con 1'etero-mieloma K6H6 (Carrol, WL, Thielamansk, Dillay J. and Levy R.,J. Immunol. Meth.

89:61-69, 1986) ottenuto dalla ATCC e i cloni ottenuti sono stati analizzati per reattività contro 1'antigene (UK114) in sistema ELISA. Il sistema di fusione è risultato estremamente efficiente e più del 70% dei cloni ottenuti sono risultati reattivi. Gli ibridomi selezionati sono stati espansi in vitro e clonati per diluizione limite. Il risultato finale è stata la selezione di 3 ibridomi: UK#l/2G3hy, UK#l/lAllhy e UK#l/3D8hy. I primi due ibridomi sono di isotipo IgM-k e il terzo IgM- Gli ibridomi hanno mantenuto la specificità per tumori caratteristica delle linee parentali, come evidenziato nella Tabella seguente:

Inoltre la reattività degli anticorpi monoclonali umani sulle diverse linee tumorali mostra notevoli differenze in termini di numero di cellule positive ed anche di intensità di fluorescenza suggerendo l'esistenza di diversi epitopi sulla proteina UK114 espressa in membrana riconosciuti dai 3 reagenti, come mostrato in figura. I tre ibridomi sono stati adattati alla crescita in vivo in topi nu/nu e sono quindi in grado di crescere sotto forma di tumore ascite, il che consente di aumentare la concentrazione di immunoglobuline specifiche di alcuni ordini di grandezza. Inoltre, gli ibridomi sono stati adattati a crescere in terreno sintetico privo di siero:a una tappa essenziale per la purificazione di anticorpi eventualmente destinati a impieghi clinici.

Una caratteristica di particolare interesse per possibili impieghi clinici è la capacità litica che gli anticorpi UK#l/2G3hy e UK#l/lAllhy sono in grado di esercitare verso bersagli tumorali in presenza di complemento umano (Fig.allegata).

Pertanto, un ulteriore oggetto dell'invenzione si riferisce agli ibridomi umani in grado di secernere gli anticorpi monoclonali anti UK114. Uno di tali ibridomi (UK#1/3D8) è stato depositato al ECACC (European Collection of Celi Cultures) col n. 97062409 il 24 giugno 1997.

Gli anticorpi umani qui descritti costituiscono uno strumento clinico/diagnostico ottimale: innanzitutto, consentono di analizzare il repertorio umano della risposta anticorpale al trattamento con UK101,un aspetto attualmente non noto e diverso da quanto riproducibile nel modello animale; in secondo luogo, i reagenti prodotti potranno essere impiegati in diagnostica come vettori di isotopi radioattivi da impiegare nella chirurgia radio-guidata, oppure in terapia come vettori di tossine o farmaci.

In tutti i sopra citati impieghi, gli anticorpi, essendo di natura umana,non danno luogo agli indesiderati effetti collaterali tipici dei reagenti murini.

L'esempio che segue illustra in maggior dettaglio le fasi seguite per la preparazione delle cellule immortalizzate, degli ibridomi e dell'ascite,nonché le caratteristiche funzionali relative al potenziale litico.

i) Immortalizzazione di popolazioni linfocitarie B.

Sangue periferico ottenuto da un paziente affetto da carcinoma del polmone e sottoposto con successo a terapia con UK101, sono state separate su convenzionale gradiente di densità. Le cellule linfocitarie così ottenute sono state deprivate da linfociti T mediante rosette con eritrociti di montone. Le cellule B purificate (107 ml) sono state infettate con virus di Epstein-Barr (EBV) ottenuto dalla linea B95-8 (10% nel medium di coltura). Dopo una notte di incubazione a 37’C, le cellule sono state centrifugate, lavate 2X con medium di coltura e piastrate (su linfociti allogenici irradiati - 2000 rads) alla concentrazione di 5000/pozzetto in Iscove contenente 10% FCS.

ii) Selezione dei cloni specifici per UK114

I cloni ottenuti dopo circa 20 giorni di coltura sono stati saggiati per la loro capacità di produrre immunoglobuline specifiche per la proteina UK114 mediante saggio enzimatico su piastre pre-adsorbite con la proteina purificata (Bartorelli, A., Biancardi, C., Cavalca, V., Clemente, C., Ferrara, R., Arzani, C., Bailo, M., e Botta, M. J. Tumor Marker Oncology 11: 67, 1996). I cloni reattivi sono stati espansi in vitro e i surnatanti di coltura sono stati utilizzati per la determinazione dell'isotipo e per studi di distribuzione in immunofluorescenza.

iii) Produzione di ibridami

Tra le linee linfoblastoidi ottenute ne sono state selezionate 3 sulla base delle migliori caratteristiche di crescita e di secrezione da utilizzare come partner nella fusione somatica col mieloma. Poiché la disponibilità di mielomi umani idonei come partners tumorali nelle fusioni cellulari è assai limitata ed inoltre i prodotti ottenuti risultano altamente instabili, è stata scelta una linea di etero-mieloma (uomo-topo) fornita dalla ATCC capace di fondere con elevata efficienza e con migliore stabilità dei prodotti. La linea impiegata (K6H6/B5) è stata ottenuta dalla fusione di un mieloma murino con linfociti B umani normali ed è stata selezionata per essere non-secernente e sensibile alla aminopterina. Le cellule delle linee EBV sono state fuse con la linea K6H6/B5 con un rapporto 2:1 seguendo la tecnica convenzionale, impiegando come agente promotore della fusione glicole polietilenico (pH 7). Successivamente alla fusione le cellule sono state piastrate su linfociti allogenici irradiati costituenti le cellule di supporto. Dopo 24 ore sono stati aggiunti i selettori nelle seguenti proporzioni: hypoxantine 100 μΜ, aminopterina 800 nM, thymidine 15.pM, ouabain 0,1 pM. La specificità dei cloni ottenuti è stata valutata con metodo enzimatico come descritto (Bartorelli, A., Biancardi, C., Cavalca, V., Clemente, C., Ferrara, R., Arzani, C., Bailo, M., e Botta, M. J. tumor Marker Oncology 11: 67, 1996)

iv) Analisi citofluorimetrica

Le cellule delle diverse linee cellulari analizzate (2xl05) sono state risospese in tampone fosfato e incubate 1 ora a 4"C con 1'anticorpo in esame. Dopo due lavaggi, le cellule sono state incubate con anti-Ig umane coniugato con fluoresceina per 30 minuti a 4*C. L'analisi della fluorescenza è stata condotta con FACsort usando come software Lysis II. Selezionati esperimenti sono stati condotti con procedimento analogo su cellule di tumori freschi, ottenute da campioni chirurgici.

v) Crescita degli ibridami in topo nudo

2x107 cellule di ciascun ibridoma sono state risospese in 200 pi di soluzione fisiologica e inoculate intraperitoneo in topi nudi precedentemente inoculati con 0,5 mi di pristano. Dopo 15-18 giorni sono stati prelevati 2-4 mi di ascite per topo.

vi) Citotossicità mediata dal complemento

Le cellule delle linee tumorali KATO III (ca. gastrico), MOG-G-UVW (astrocitoma) e HT-29 (ca. colon) scelte come bersagli tumorali, sono state marcate con 3,7MBq di per Ih a 37 “C. Dopo ripetuti lavaggi le cellule sono state incubate 1.5h a 37eC in presenza degli anticorpi umani anti-UK114 (ascite diluita 1:10) e di 10 mi di siero umano. Come controlli della dipendenza della attività litica del complemento,sono stati utilizzati sieri umani deficitari dei fattori C8 o C9,oppure inattivati al calore.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1.Anticorpi monoclonali umani diretti contro l'antigene tumorale UK114. 2.Cellule linfocitarie immortalizzate in grado di produrre gli anticorpi della rivendicazione 1. 3.Cellule secondo la rivendicazione 2 immortalizzate con il virus EBV. 4.Ibridomi secernenti gli anticorpi monoclonali della rivendicazione 1. 5.Ibridoma secondo la rivendicazione 4 depositato al n.97062409 il 24 giugno 1997. 6.Metodo per la preparazione degli anticorpi della rivendicazione 1 comprendente: - la preparazione di campioni di cellule linfocitarie da pazienti responsivi a trattamento con UK101; - l'immmortalizzazione di tali cellule e la selezione delle linee producenti gli anticorpi; - la fusione di dette linee con eteromielomi derivanti dalla fusione di una cellula umana con un mieloma murino; - la selezione dei cloni attivi. 7.Uso degli anticorpi della rivendicazione 1 per la preparazione di reagenti, diagnostici, agenti terapeutici, potendo essere detti anticorpi legati/combinati con isotopi radioattivi, tossine o farmaci.