ITPD20060203A1 - Idrogeli di miscele di polisaccaridi per l'ingegneria tissutale e la veicolazione di composti attivi - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

“Idrogeli di miscele di polisaccaridi per l'ingegneria tissutale e la veicolazione di composti attivi"

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione è relativa a idrogeli (o matrici 3D) ottenibili da soluzioni acquose di miscele di polisaccaridi acidi e di derivati di polisaccaridi basici, quali i derivati oligosaccaridici del chitosano, opportunamente gelificate con agenti gelificanti ed al loro uso in campo biomedico.

STATO DELLA TECNICA

I polisaccaridi, essendo in generale polimeri biocompatibili, sono molto studiati, e già da tempo impiegati, per applicazioni in campo biomedico sia nella veicolazione di composti biologicamente attivi che di materiale biologico come cellule per l'ingegneria tissutale. Tale processo può essere ottenuto, come generalmente noto agli esperti del settore, mediante incapsulazione o microincapsulazione ovvero inclusione del materiale biologico da veicolare in sistemi costituiti da matrici polimeriche tridimensionali del materiale stesso. La caratteristica che rende i polisaccaridi adatti alla microincapsulazione è la loro nota capacità di formare, in soluzioni acquose ed in particolari condizioni, idrogel che sono a tutti gli effetti matrici polimeriche tridimensionali. In particolare l'ingegneria tissutale è uno dei campi in cui l’utilizzo dei polisaccaridi allo scopo di incapsulare cellule è ancora soggetto ad estesa ricerca, essendo uno degli aspetti più innovativi della ricerca biotecnologia. Questa tecnica nasce dall'esigenza di passare da una chirurgia dei trapianti di tipo sostitutivo ad una chirurgia di tipo rigenerativo con biomateriali che favoriscano la ricrescita delle stesse cellule tessutali in modo da avere un ripristino strutturale e fisiologico del tessuto originale, con il pieno recupero dell’attività metabolica ed integrazione fisica e funzionale con il tessuto circostante del nuovo tessuto generato dalle cellule impiantate.

Gli ambiti applicativi della ingegneria tessutale sono molteplici e per alcuni settori terapeutici questo approccio può contare su di una consolidata esperienza (ad esempio per la pelle artificiale). Gli enormi progressi tecnologici nei settori delle biotecnologie hanno consentito negli ultimi anni un enorme sviluppo dell'ingegneria tissutale anche in settori poco esplorati. Tra questi rientra certamente l'ingegneria tissutale per la terapia di patologie debilitanti della cartilagine articolare.

In questo campo terapeutico un'importante problematica, che si affianca a quella più nota di sviluppare nell'ambito della chirurgia rigenerativa della cartilagine dei sistemi biocompatibili capaci di ricreare una situazione spaziale e metabolica ottimale per la crescita e la proliferazione delle cellule, è quella della messa a punto di metodi di coltura in vitro di condrociti, che permetta il loro mantenimento ed espansione prima del trapianto vero e proprio. Inoltre, colture di condrociti costituiscono lo strumento più potente per lo studio dei processi molecolari che si accompagnano ai processi differenziativi e alle modificazioni metaboliche e funzionali in condizioni fisiologiche o associate a situazioni patologiche. Il limite principale all'utilizzo di colture di condrociti è che queste cellule, dopo che vengono isolate dalla loro matrice, mostrano una spiccata tendenza a de-differenziare in fibroblasti. Fattori associati o che favoriscono il processo differenziativo sono principalmente: sistemi di coltura in adesione, bassa densità cellulare, presenza di fattori pro-infiammatori come citochine, immortalizzazione delle cellule. In queste condizioni, le cellule perdono rapidamente, dopo alcuni giorni, il loro aspetto rotondeggiante tipico del fenotipo condrocitario, per assumere un aspetto allungato tipico dei fibroblasti. La modificazione fenotipica si accompagna alla clown-regolazione dell'espressione di specifici markers condrocitari, quali collagene II e collagene X e di proteoglicani ad alto peso molecolare come l'aggrecano, ed al contemporaneo incremento dell'espressione del collagene I e di proteoglicani a basso peso molecolare come biglicano o decorina. Per evitare o comunque limitare il processo differenziativo di condrociti negli ultimi 20 anni sono stati fatti numerosi sforzi per mettere a punto metodi efficaci di coltura. Questi comprendono principalmente sistemi di coltura all'interno di (e non in semplice adesione su) matrici 3D di alginato, agarosio o collagene. Comunque, sebbene questi approcci riescano a migliorare il mantenimento del fenotipo condrocitario, in essi le cellule mostrano un bassissimo tasso di crescita e replicazione, a scapito della quantità di materiale cellulare così disponibile.

Uno dei materiali più utilizzati per l'intrappolamento di cellule in microcapsule, come si vedrà più oltre, è l'alginato. Il termine alginato descrive una famiglia di polisaccaridi prodotti da alghe e batteri ( Sabra W. et al. Appi. Microbiol. Blotechnol., 2001, 56, 315-25). Esso è composto da acido β-D-mannuronico e acido α-L-guluronico, uniti attraverso legami1->4, arrangiati in strutture a blocchi lungo la catena polisaccaridica. Data la presenza di gruppi carbossilici, l'alginato è a pH fisiologico, come altri polisaccaridi con gruppi carbossilici, un polianione. Inoltre, questo polisaccaride è totalmente biocompatibile ( Uludag H. et al. Adv. Drug Deliv. Rev., 2000, 42, 29-64), mentre la caratteristica fisica più importante per la sua applicazione in campo industriale e biomedico è legata alla sua capacità di formare idrogeli a contatto con soluzioni contenenti ioni divalenti, tipicamente calcio. Infatti, il semplice trattamento di una soluzione concentrata di alginato con tali ioni porta all'istantanea formazione di un idrogelo. Proprio questa caratteristica viene sfruttata per intrappolare cellule e tessuti all'interno degli idrogeli. La tecnica nota di microincapsulazione di cellule consiste nel far gocciolare una sospensione di alginato e cellule in un bagno contenente calcio, controllando il diametro delle microcapsule mediante diversi metodi fisici. La formazione istantanea del gel provoca l'intrappolamento al suo interno delle cellule. Nonostante la biocompatibilità dell’alginato, questo polisaccaride non induce alcuna interazione con le cellule quindi non è bioadesivo nè bioattivo. Nel caso della microincapsulazione di condrociti per la riparazione della cartilagine articolare, il limite all'utilizzo dell’alginato è rappresentato soprattutto dall'assenza di capacità replicativa delle cellule al suo interno.

Più recentemente un altro polisaccaride, in questo caso basico, ha suscitato un certo interesse per un suo potenziale utilizzo nel campo della microincapsulazione di materiale biologico, essendo biocompatibile e disponibile in grande quantità come l'alginato. Si tratta nello specifico del chitosano. Il chitosano è un polisaccaride basico, di peso molecolare compreso tra 50 e 1 ,500 kDa, costituito da una catena di residui di D-glucosamina (GlcNH2) uniti da legami β1→ 4 con interdisperse unità di N-acetil-glucosamina. E' normalmente insolubile in soluzioni acquose neutre o basiche; in soluzioni acide con un pH< 5, l'amino gruppo libero viene protonato rendendo il polimero solubile. Questo polimero è già ampiamente impiegato nel settore medico in quanto mostra una bassa risposta immunologica, patologica o infettiva ( Suh Francis J.K., Matthew H.W.T. Biomaterials, 2000, 21, 2589-2598; Miyazaki S. et al. Chem. Pharm. Bull., 1981, 29, 3067-3069). Il chitosano ha tutte le caratteristiche ideali per essere impiegato come biomateriale per le sue proprietà chimico-fisiche, quali l'elevata densità di carica cationica in soluzione e la sua elevata processabilità grazie alla quale è possibile ottenere strutture porose in cui impiantare le cellule. Molte ricerche recenti si sono focalizzate sulla messa a punto di metodologie per potenziare gli effetti biologici del chitosano. In particolare la maggior parte degli sforzi è stata volta ad aumentare la cationicità del polimero o a modificarne le caratteristiche di biodisponibilità attraverso modificazioni (bio)chimiche. Ed è proprio nelle sue forme derivatizzate che il chitosano assume le proprietà richieste per l’utilizzo come biomateriale. Studi recenti hanno dimostrato infatti come un particolare derivato del chitosano con il lattosio sia biocompatibile ed in grado di indurre aggregazione di condrociti in colture primarie oltre che stimolare in questi la produzione di markers caratteristici del tessuto cartilagineo quali collagene di tipo 2 ed aggrecano ( Donati , I. et al., Biomaterials 26.2005, 987-998).

La modificazione del chitosano con gruppi saccaridici laterali, ad esempio tramite l’inserzione di unità di lattosio via reazione di animazione riduttiva, è nota e comporta, come riportato nel brevetto US 4,424,346 (Hall, LD. e Yalpani, M.), una maggior solubilità dei derivati del polisaccaride in acqua. Inoltre, nel brevetto US 4,424,346 viene menzionato che il derivato del chitosano con lattosio dà gel rigidi in soluzioni acquose a concentrazioni superiori al 3-5%, mentre non gelifica né precipita in miscela con sali o acidi (in particolare cloruri di Ca, Cr, Zn, cromato di K, acido borico) e loro combinazioni. Ancora, nel brevetto citato si menziona il fatto che il chitosano derivatizzato con un altro oligosaccarìde, il cellobiosio, non forma di per sé gel in soluzioni acquose, mentre forma gel rìgidi in miscela con alginato. Questa formazione di gel è dovuta alla forte interazione tra le cariche positive del policatione e quelle negative del polianione che porta alla coacervazione del sistema, processo che comunque costituisce un limite nella microincapsulazione.

Allo scopo di ottenere matrici polimeriche tridimensionali adatte ad inglobare materiale biologico o composti biologicamente attivi sarebbe preferibile infatti che queste matrici avessero una buona solubilità in soluzioni acquose e comunque è necessario che queste matrici abbiano un certo grado di dispersibilità in soluzioni acquose e non diano origine a precipitati insolubili, garantendo una struttura tridimensionale adeguata per la microincapsulazione.

Per ovviare a questo sono descritti diversi sistemi che prevedono l’utilizzo di miscele di polisaccaridi anche modificati e/o reticolati per migliorare le caratteristiche chimico-fisiche di queste matrici.

In particolare, W094/25080 ( GrìfTrth-Cima , L. et al.) descrive composizioni iniettabili di cellule-polisaccaridi per le quali è previsto l’uso dell'alginato in combinazione con altri polisaccaridi, essenzialmente acido ialuronico, per ottenere idrogel adatti all'incapsulazione di cellule per l'ingegneria tissutale. I polimeri previsti come utili allo scopo di formare idrogel per l'impianto di cellule isolate, sono i più vari e sono reticolati con agenti reticolanti consistenti in ioni (preferenzialmente divalenti o trivalenti), cambiamenti di pH e di temperatura. La concentrazione ionica per la reticolazione non è inferiore a 0.005 M. Gli idrogel possono anche essere complessati e stabilizzati con policationi scelti tra poliamine sintetiche, quali polietilenimina, polivinilamina, poliallilamina, e polisina.

Analogamente nella domanda di brevetto W096/40304 (Hubbell, J.) sono descritti idrogeli formati da polimeri reticolati con agenti reticolanti consistenti in ioni, cambiamenti di pH e di temperatura, radicali iniziatori, enzimi. Tra i polimeri sono menzionati polisaccaridi e questi ultimi possono essere scelti tra: alginato modificato, acido ialuronico modificato, gellano e carragenano.

Il brevetto US 6,224,893 ( Langer ; R.S. et al.) descrive reti polimeriche interpenetranti (/nte/penefraf/<'>/ig polymer networks IPN) o semi interpenetranti per il drug delivery e l'ingegnerìa tissutale. Tali IPN consistono in soluzioni in forma di idrogel di polimeri, preferìbilmente idrofilia, reticolati ionicamente o covalentemente e tra i polimeri reticolabili ionicamente sono citati: acido ialuronico, destrano, eparan solfato, condroitin solfato, eparina, alginato, gellano e carragenano, mentre tra i polimeri reticolabili covalentemente è citato il chitosano cross-linkato con isotiocianato. Gli IPN sono formati da due componenti polimeriche cross-linkate, ma non tra di loro, mentre i semi IPN prevedono due componenti di cui una sola reticolata, e comunque in ogni caso mai reticolate tra di loro. Preferenzialmente, ma non esclusivamente, la reticolazione dei polimeri è ottenuta per fotoattivazione di un radicale fotoiniziatore. Le composizioni polimeriche possono infatti essere formate da polimeri reticolabili covalentemente mediante un fotoiniziatore, o miscele di polimeri cross-linkabili covalentemente e ionicamente o polimeri idrofilia che quando esposti a una radiazione formano semi-IPN.

Il brevetto US 5,620,706 ( Severian , D. et al.) riporta complessi ionici tra polisaccaridi acidi e basici ed in particolare la coacervatone di chitosano e xantano, un polisaccaride che reca cariche negative in catena laterale, caratteristica che viene sfruttata per ottenere idrogel insolubili.

Nel WO 2005/061611 ( White , B.J. et al.) viene descrìtta la preparazione di reti di polimeri interpenetranti o semi interpenetranti consistenti in una composizione che comprende derivati cross-linkati solubili in acqua di un polisaccaride basico e un polisaccaride anionico non cross-linkato. In particolare, tali IPN sono ottenuti mediante la miscelazione di acido ialuronico con derivati cross-linkati N-carbossimetil, O-carbossimetil, O-idrossietil del chitosano o con chitosani parzialmente acetilati. Questi derivati del chitosano, rendono possibile la miscelazione in soluzione con l'acido ialuronico dal momento che, come riportato dagli Inventori, vengono solubilizzati in condizioni di pH tali da non avere alcuna carica positiva sulla catena per evitare la formazione di complessi ionici. In questo modo la coacervatone con il poliamone viene impedita dalla completa rimozione della carica su uno dei polimeri. Si tratta quindi di soluzioni polianione/polisaccaride neutri.

Ciò nonostante il problema di disporre di sistemi biocompatibili in grado di inglobare cellule mantenendone il fenotipo cellulare e nello stesso tempo permettendone la crescita e la replicazione non è ancora risolto come già discusso in precedenza.

È quindi un primo scopo della presente invenzione mettere a punto sistemi biocompatibili per l'ingegneria tissutale per la veicolazione di cellule in grado di garantirne non solo la sopravvivenza, ma anche il mantenimento delle caratteristiche fenotipiche, la crescita e la replicazione.

È un ulteriore scopo mettere a punto tali sistemi con l’impiego di polisaccaridi facilmente disponibili in commercio e senza che tali polisaccaridi siano soggetti a manipolazioni chimiche, come pure senza che siano necessarie complesse manipolazioni preparative di tali sistemi.

È ancora uno scopo disporre di sistemi biocompatibili in forma di idrogeli o matrici 3D, veicolanti cellule, facilmente impiegabili a seconda delle diverse necessità di impiego e senza manipolazioni ulteriori da parte dell'operatore sanitario.

Ancora è uno scopo della presente invenzione disporre di sistemi biocompatibili in forma di idrogeli o matrici 3D, veicolanti farmaci, facilmente impiegabili a seconda delle diverse necessità di impiego.

SOMMARIO

Per il perseguimento degli scopi sopra menzionati gli Inventori hanno individuato opportuni derivati di polisaccaridi basici che, miscelati fisicamente con polisaccaridi anionici, in opportune condizioni danno soluzioni acquose di tali polisaccaridi, non generando coacervati insolubili.

Le soluzioni acquose delle miscele possono successivamente essere gelificate con opportuni agenti gelificanti, ottenendo idrogeli o matrici tridimensionali in cui le cellule o i farmaci da veicolare possono essere inglobati. Le miscele polisaccaridiche per la preparazione delle matrici 3D dell'invenzione comprendono polisaccaridi anionici e derivati olìgosaccaridici del chitosano.

Sorprendentemente, oltre che originare composizioni in cui tali miscele fisiche di polisaccaridi polianionici e derivati di polisaccaridi policationici sono solubili in ambiente acquoso, tali composizioni quando trattate con opportuni agenti gelificanti danno origine a idrogel capaci di microincapsulare cellule ed in cui tali cellule mantengono il loro carattere fenotipico e possono proliferare.

Benché l'alginato presenti molti vantaggi per questo impiego, la tecnica della microincapsulazione può efficacemente essere ottenuta con tutti i polisaccaridi ionici che formino idrogeli istantaneamente a contatto con soluzioni di ioni (liotropici) o con soluzioni raffreddate (termotropici). Nella prima classe di polisaccaridi rientrano ad esempio, oltre all’alginato, il pectato e il carragenano. Nella seconda classe di polisaccaridi rientra, ad esempio, l’agarosio ed ancora il carragenano. Sono quindi un primo oggetto dell'invenzione composizioni consistenti in idrogeli ottenibili da soluzioni acquose di miscele di almeno un polisaccaride anionico I iotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano, in cui detti derivati del chiosano hanno un grado di derivatizzazione di almeno il 40% ed in cui dette soluzioni acquose hanno una forza ionica almeno di 100 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7, mediante il trattamento di dette soluzioni acquose di miscele di polisaccaridi con agenti capaci di geiificare i polisaccaridi anionici liotropici o termotropici compresi nella miscela stessa.

È ancora oggetto dell’invenzione il processo di preparazione delle composizioni stesse.

È un ulteriore oggetto dell'invenzione l'uso di tali composizioni per la microincapsulazione di cellule per l’impiego nell’ingegneria tissutale oppure la microincapsulazione di composti attivi per il loro impiego biomedico.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: fotografia al microscopio ottico di microcapsule ottenute secondo l’esempio 6 da soluzioni polimeriche binarie di alginato e del derivato del chitosano con lattosio (di seguito indicato come chitlac) preparata in NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. Concentrazione polimerica complessiva 2%, rapporto in peso tra poliamone e policatione 3:1. Microcapsule ottenute facendo gocciolare la soluzione binaria in una soluzione contenente CaCI250mM, mannitolo 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. Condizioni relative all'electrostatic bead generatori voltaggio 5kV, diametro interno dell'ago 0.7mm, distanza tra bagno gelificante e ago 4cm, velocità di flusso della soluzione polimerica binaria lOmUmin. Diametro medio delle capsule 870±20pm.

Figura 2: microcapsule ottenute mediante siringa con ago da 23G a partire da soluzione polisaccaridiche binarie di A) alginato e chitlac gocciolata in un bagno gelificante contenente CaCI250mM (es. 2); B) K-carragenano e chitlac gocciolata in un bagno gelificante contenente KCI 100mM (es. 4); C) agarosio e chitlac gocciolata in un bagno gelificante formato da acqua raffreddata a circa 30°C (es. 5). In tutti i casi riportati, la concentrazione polisaccaridica totale 3% e il rapporto in peso tra polianione e chitlac pari è a 1 :1

Figura 3: analisi<1>H-NMR protonica della miscela binaria di alginato (1.5%) e chitlac (0.5%) eseguita prima (A) e dopo (B) la formazione delle microcapsule, secondo l'esempio 6, da cui si evidenzia come il chitlac sia presente in entrambi i casi.

Figura 4: variazione temporale dei moduli elastico (G’ = m)e viscoso (G"=□) per una soluzione di alginato (concentrazione polimerica 1.5%, NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4) e per una soluzione binaria di alginato e chitlac (G’ = ·; G”= o) (concentrazione polimerica complessiva 2%, rapporto in peso tra alginato e chitlac 3:1, NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4). Gelificazione ottenuta attraverso la tecnica in-siiu con CaC0315mM e GDL 30mM (es. 9).

Figura 5: modulo di compressione (E) misurato su idrogeli cilindrici ottenuti tramite la tecnica in-situ a partire da una soluzione di alginato (concentrazione 1.5%) e da una soluzione binaria di alginato e chitlac concentrazione polimerica totale 2%, rapporto in peso tra alginato e chitlac 3:1) (es 9). In entrambe le soluzioni si sono usati NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4.

Figura 6: A) contenuto in proteoglicani misurato con metodo colorimetrico (blu di dimetilmetilene) di colture di condrociti mantenuti in capsule di alginato e alginato chitlac (preparate come in es. 12). B) valutazione del livello di sintesi di collagene attraverso saggio di incorporazione di [<3>H]-prolina in capsule di alginato e alginato chitlac (preparate come in es. 12).

Figura 7: Analisi RT-PCR di valutazione dell'espressione di collagene I, collagene II e aggrecano in condrociti cresciuti in capsule di alginato e in capsule di alginato:chitlac preparate secondo l’es. 12 Nella figura A l'estrazione di RNA è stata fatta da condrociti 2 giorni dopo incapsulazione, in figura B, 17 giorni dall'incapsulazione.

Figura 8: Saggio di proliferazione con [<3>H]-timidina. La curva superiore mostra i risultati ottenuti con le cellule in capsule Alginato/Chitlac preparate secondo l'es. 12, le quali mostrano un’elevata attività proliferativa fino al quindicesimo giorno di coltura. La curva inferiore mostra i risultati ottenuti con le cellule in capsule di alginato con scarsa capacità replicativa. I dati sperimentali evidenziano univocamente che dopo i primissimi giorni di coltura i condrociti nelle capsule di alginato bloccano la replicazione, mentre nelle capsule miste si osserva una rapida replicazione cellulare che si protrae fino alle prime due settimane di coltura.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Definizioni.

Per idrogel o idrogeli si intendono strutture semisolide altamente idratate in grado di mantenere forma e dimensione quando non soggette a deformazione. Idrogeli possono essere ottenute a partire da soluzioni concentrate di polisaccaridi opportunamente reticolati.

Per matrici 3D o tridimensionali si intendono strutture solide o semisolide in grado di mantenere forma e dimensione quando non soggette a deformazione. Matrici 3D possono essere ottenute a partire da soluzioni concentrate di polisaccaridi opportunamente reticolati.

Di conseguenza i termini idrogeli o matrici 3D devono essere considerati equivalenti al fine della descrizione dettagliata dell’invenzione seguente. Per microincapsulazione si intende il processo di inclusione di materiale, biologico o meno, all'interno di idrogeli usualmente, ma non esclusivamente, di forma sferica di dimensioni millimetriche o micrometriche formati da polisaccaridi liotropici o termotropici a seguito del trattamento con opportuni ioni nel primo caso o con soluzioni raffreddate nel secondo caso.

Descrizione

Gli scopi e i vantaggi delle matrici tridimensionali ottenibili a partire da soluzioni almeno binarie di polisaccaridi gelificati oggetto della presente invenzione, saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell'invenzione, saranno descritte alcuni esempi di idrogeli e la loro caratterizzazione chimico-fisica oltre che la compatibilità biologica con cellule isolate ed incapsulate negli stessi.

Per gli scopi perseguiti si è affrontato l'aspetto relativo all'identificazione e progettazione di un biomateriale per l'incapsulazione di cellule dotato di caratteristiche, in termini di segnali fisiologici, il più possibile simili a quelle della matrice extracellulare per lo sviluppo di un più efficace metodo di coltura di condrociti. In particolare si sono utilizzati biopolimeri già di largo impiego nell'ingegneria tessutale, e cioè polisaccaridi acidi, come ad esempio l’alginato, ed il chitosano modificato con oligosaccaridi qui sopra citato. La combinazione di un polisaccaride anionico ed un polisaccaride basico può però originare come già in precedenza ricordato la coacervazione del sistema con conseguente perdita della struttura tridimensionale adatta all’inclusione di materiale biologico. La formazione di coacervati costituisce quindi a tutti gli effetti una limitazione per la microincapsulazione di materiale biologico o molecole biologicamente attive. Infatti per la microincapsulazione, è fondamentale utilizzare formulazioni solubili di polisaccaridi di partenza, essendo l'intrappolamento di materiale biologico, ad esempio cellule o composti di varia natura, all'interno di idrogeli possibile come noto ad un esperto del ramo a partire da una soluzione del polimero fatta gocciolare in una soluzione contenente gli opportuni ioni reticolanti. Se nella soluzione polimerica sono presenti o si formano dei coacervati, questi venendo a contatto con la soluzione di ioni reticolanti portano alla formazione di precipitati fibrosi che non riescono ad includere il materiale biologico stesso. Da qui l'importanza di identificare la finestra di solubilità per le miscele polisaccaridiche binarie che, opportunamente trattate con agenti gelificanti siano essi soluzioni contenenti ioni o soluzioni raffreddate, portino alla formazione dell'idrogelo.

Di conseguenza per il perseguimento degli scopi dell'invenzione, al contrario di quanto riportato nel brevetto US 4,424,346, la composizione di polisaccaridi per ottenere le matrici 3D dell’invenzione comprende miscele almeno binarie di un polisaccaride anionico ed un derivato oligosaccaridico del chitosano caratterizzate dal fatto di essere in opportune condizioni solubili in soluzioni acquose e di non originare coacervati insolubili. Gli inventori hanno, infatti, sorprendentemente trovato che miscele comprendenti almeno un polisaccaride anionico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano in soluzioni acquose aventi un pH compreso in un intervallo di valori fisiologici e un'opportuna forza ionica non danno origine alla coacervazione dei due polisaccaridi che quindi rimangono in soluzione.

L'oggetto della presente invenzione in tutti i suoi aspetti preferiti e derivati nasce infatti da questa osservazione come descritto nella domanda di brevetto italiana pendente n°PD2006A000202, che viene qui incorporata come referenza.

La formazione dell'idrogel o della matrice tridimensionale è ottenibile da tale soluzione binaria mediante il suo trattamento con opportuni agenti gelificanti capaci di gelificare il polisaccaride polianionico.

Sono, infatti, oggetto dell'invenzione composizioni consistenti in un idrogelo ottenibile da soluzioni acquose di miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano, in cui detti derivati del chitosano hanno un grado di derivatizzazione di almeno il 40% ed in cui dette soluzioni acquose hanno una forza ionica almeno di 100 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7, mediante gelificazione dei polisaccaridi anionici liotropici o temotropici compresi nelle miscele stesse con agenti gelificanti.

Per la preparazione degli idrogeli oggetto della presente invenzione il chitosano può essere derivatizzato con oligosaccaridi comprendenti da 1 a 3 unità glicosidiche e in un aspetto preferito tali oligosaccaridi comprendono da 2 a 3 unità glicosidiche e più preferìbilmente sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maltotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, melibiosio. Il peso molecolare medio (di seguito codificato in MW) del chitosano impiegabile per l’ottenimento dei derivati oiigosaccarìdici menzionati può arrivare fino a 1,500kDa ed essere preferibilmente compreso nell'intervallo da 400kDa a 700kDa. Inoltre, per gli scopi della presente invenzione il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con tali oligosaccaridi deve essere superiore al 40-45% (~45%). Preferibilmente, il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con gli oligosaccaridi è compreso nell'intervallo da 50% a 80% e più preferibilmente è del 70%.

Il processo di preparazione di tali derivati oligosaccaridici del chitosano è quello noto e prevede il trattamento di una soluzione di chitosano in acido acetico (pH 4.5) e metanolo con lo zucchero riducente, ad esempio il lattosio, in presenza di sodio cianoboroidruro. L'interazione tra i gruppi amminici del chitosano e il gruppo aldeidico del lattosio porta alla formazione di un intermedio instabile chiamato base di Schiff. Questa in presenza del boroidruro viene ridotta portando alla formazione di una ammina secondaria stabile.

Per quanto riguarda i polisaccaridi polianionici, gli idrogeli oggetto dell’invenzione possono essere ottenuti con miscele polisaccaridiche comprendenti polisaccaridi anionici liotropici, ed in questo caso in un aspetto preferito questi sono scelti nel gruppo consistente in carragenani, pectati e pectinati, alginati, gellano, ramsano, wellano, xantano, o termotropici ed in questo caso sono preferibilmente scelti nel gruppo consistente in agarosio e agarosio solfato, carragenano, cellulosa solfato.

Il peso molecolare medio (MW) dei polianioni può arrivare fino a 2,000kDa e preferibilmente essere compreso da 100kDa a 1000kDa e più preferibilmente sono utilizzati pesi molecolari medi di 200kDa.

In un altro aspetto preferito sono utilizzati rapporti in peso tra i polimeri costituenti la miscela polisaccaridica pari a 1 a 1 oppure 3 (poliamone) a 1 (derivato del chitosano).

Per gli scopi della presente invenzione le miscele binarie di chitosanoderivato e polianione possono essere fino a concentrazioni polimeriche complessive del 3%. Preferibilmente tali concentrazioni polimeriche complessive sono comprese nell'intervallo da 1.5% e 3% e più preferibilmente possono essere del 2%.

Le soluzioni almeno binarie di polisaccaridi necessarie per la preparazione degli idrogeli della presente invenzione hanno un pH compreso in un intervallo fisiologico, ed in particolare compreso tra 7 e 8 e più preferibilmente il pH è uguale a 7.4, ed una osmolarità compresa tra 250 e 300mM con una forza ionica compresa tra 100nM e 350mM ottenuta preferibilmente per aggiunta di NaCI, in concentrazioni comprese tra 0.05M e 0.15M e più preferibilmente di 0.15M.

Gli agenti gelificanti possono essere scelti a seconda del tipo di polisaccaride anionico liotropico tra opportuni ioni monovalenti, divalenti o trivalenti e per polisaccaridi termotropici tra temperature non superiori a 40°C oppure non inferiori a 10°C.

Nel caso di soluzioni polisaccaridiche binari contenenti un derivato del chitosano e polianioni liotropici, l'ottenimento di idrogeli avviene per trattamento delle stesse con opportuni ioni alcalini o alcalini terrosi o dei metalli di transizione o delle terre rare a seconda del polisaccaride anionico ad opportune concentrazioni.

Preferibilmente quando gli agenti gelificanti sono scelti tra gli ioni monovalenti, questi sono scelti nel gruppo consistente in potassio, rubidio, cesio, tallio, argento e loro miscele, mentre quando sono ioni divalenti, questi sono scelti nel gruppo consistente in Ca<2+>, Ba<2+>, Sr<2>*, Cu<2+>, Pb<2+>, Mn<2+>, Zn<2+>e loro miscele, mentre quando sono scelti tra gli ioni trivalenti, questi sono scelti nel gruppo consistente in Al<3*>, Fe<3+>, Gd<3+>, Tb<3+>, EU<3+>e loro miscele.

Per polisaccaridi quali l'alginato ed il pectato, tali ioni sono ioni alcalinoterrosi con esclusione del magnesio e dei metalli di transizione e preferibilmente scelti nel gruppo consistente in calcio, bario, stronzio, piombo, rame, manganese e loro miscele; oppure sono ioni delle terre rare e preferìbilmente scelti nel gruppo consistente in gadolinio, terbio, europio e loro miscele.

Le concentrazioni delle soluzioni acquose di tali ioni adatte alla gelificazione delle soluzioni binarie di polisaccaridi sono superiori a 10mM e preferibilmente comprese tra 10mM e 100mM e più preferìbilmente di 50mM. In aggiunta, la soluzione gelificante può contenere osmoliti ionici (ad esempio NaCI) o non ionici (ad esempio mannitolo) per ottenere nella soluzione gelificante con una osmolarità pari a 0.3M. Preferibilmente, la soluzione gelificante contiene una concentrazione di CaCfe pari a 50mM e una forza ionica (ottenuta ad esempio per NaCI) pari a 0.075M, ovvero una concentrazione di osmoliti non ionici (ad esempio mannitolo) pari a 0.15M.

Nel caso dei carragenani sono utilizzati ioni alcalini scelti preferìbilmente nel gruppo consistente in potassio, rubidio e cesio, a concentrazioni non inferiori a 50mM e preferìbilmente comprese tra 50mM e 100mM e più preferìbilmente di 0.1 M.

Nel caso di soluzioni polisaccarìdiche contenenti un derivato del chitosano e polianioni che portano a idrogeli termotropici, come ad esempio l'agarosio, la preparazione di idrogeli viene eseguita tramite raffreddamento, al di sotto della temperatura di formazione del gel. In particolare, per polisaccaridi termotropici, quando l’agente gelificante è la temperatura, questa è preferibilmente compresa nell'intervallo tra 40°C e 10°C.

Le soluzioni polisaccaridiche vengono preparate ad una temperatura al di sopra della temperatura di formazione dell'idrogelo da parte del polisaccaride termotropico. A questa temperatura il polisaccaride termotropico non forma idrogeli. Preferibilmente la temperatura a cui vengono preparate le soluzioni polisaccaridiche è compresa nell'intervallo da 50°C a 30°C e più preferibilmente è di 37°C. La formazione dell'idrogelo avviene facendo gocciolare la soluzione polisaccaridica in un bagno gelificante raffreddato ad una temperatura inferiore a quella di formazione del gel. Preferibilmente, questa temperatura è compresa nell'intervallo da 10°C a 40°C e più preferibilmente è di 20°C. In un aspetto preferito gli idrogeli oggetto dell'invenzione sono preparati a partire da miscele polisaccaridiche binarie polianione-policatione, dove il polianione è rappresentato, preferibilmente, dall'alginato e il policatione da derivati oligosaccaridici del chitosano, preferìbilmente il derivato del chitosano con lattosio (chitlac).

Per gli scopi della presente invenzione, le soluzioni acquose polimeriche sono addizionate del materiale biologico o composti attivi da veicolare prima della preparazione degli idrogeli per trattamento con gli opportuni agenti gelificanti.

Le matrici 3 D o idrogeli dell’invenzione sono ottenibili secondo metodiche note ed in particolare comprendono almeno le seguenti fasi:

a) preparazione di una soluzione acquosa di una miscela di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico e di almeno un derivato oligosaccaridico del chiosano, aventi detti derivati del chitosano un grado di derivatizzazione almeno del 40% ed aventi dette soluzioni acquose una forza ionicaalmeno di 100mM e non superiore a 350 mM ed almeno un pH di 7 ed aggiunta alle soluzioni polisaccaridiche preparate di cellule e/o di composti attivi da inglobare nell'idrogel;;

b) aggiunta della soluzione preparata al punto a) con mezzi adatti per ottenere la forma voluta dell’idrogel, ad esempio mediante gocciolamento attraverso un ago, in una soluzione gelificante contenente lo ione reticolante per i polisaccaridi anionici liotropici o che si trova ad una opportuna temperatura per i polianioni termotropici;

c) rimozione del’idrogel formato ed inglobante cellule e/o composti attivi mediante opportuni mezzi, ad esempio centrifugazione o dialisi.

Le dimensioni della goccia nel caso del gocciolamento, che possono essere controllate attraverso vari metodi fìsici (ad esempio scelta del diametro esterno dell’ago, presenza di un campo elettrico o di un flusso di aria coassiale all’ago) determinano le dimensioni finali dell’idrogel in forma di microcapsula. Le capsule vengono lasciate ad esempio nella soluzione gelificante per circa 10 minuti e vengono quindi rimosse.

Con la metodica sopra descrìtta si possono ottenere idrogeli che opportunamente ed ulteriormente trattati possono assumere varie forme, preferìbilmente microcapsule, ma anche cilindri o dischi.

In particolare, le fasi che portano aH’ottenimento di cilindri di idrogel a partire dalle soluzioni polimeriche binarie sono le seguenti: a) la soluzione polimerica binaria a cui vengono addizionate le cellule e/o i composti attivi da incapsulare viene trasferita all'interno di contenitori cilindrici o discoidali chiusi alle estremità con membrana da dialisi; b) questi contenitori vengono quindi immersi nella soluzione contenente lo ione reticolante o che si trova ad una opportuna temperatura (soluzione gelificante). I contenitori cilindrici o discoidali sono lasciati nella soluzione gelificante per circa 30 minuti e quindi rimossi; c) i cilindri o dischi di gel delle soluzioni delle miscele polisaccaridiche sono estratti dai contenitori dopo aver rimosso la membrana da dialisi.

Alternativamente, nel caso dell'alginato, i cilindri possono essere preparati addizionando una forma inattiva dello ione reticolante, ad esempio CaC03o il complesso Ca-EDTA, alla soluzione polisaccaridica. Viene poi addizionata una sostanza che si idrolizzi lentamente, come ad esempio il GDL (D-glucono-5-lattone). Questa sospensione viene trasferita all'interno dei contenitori cilindrici o discoidali e lì mantenuta per 24h. I cilindri o dischi di gel delle soluzioni polisaccaridiche binarie sono quindi estratti dai contenitori. Questa metodologia viene descrìtta come formazione di cilindri per rilascio di calcio in situ.

A scopo illustrativo e non limitativo, di seguito è descrìtta in generale la preparazione di idrogeli o matrici 3D secondo l’invenzione in forma di microcapsule e cilindri ottenute da soluzioni binane di polisaccaridi secondo l’invenzione ed esempi di tali preparazioni di microcapsule inglobanti cellule isolate.

A. preparazione di matrici 3D da una soluzione di un polisaccaride anionico e un derivato oliaosaccaridico del chitosano

Preparazione di microcapsule

Le microcapsule degli esempi particolari sotto riportati sono state preparate secondo metodi noti ed in particolare: a) mediante l’utilizzo di semplici siringhe con cui le soluzioni binarie di un polisaccaride anionico ed un derivato oligosaccaridico del chitosano sono fatte gocciolare in un opportuno bagno gelificante, b) utilizzando un Electronic Bead Generator, sviluppato dal Prof. Gudmund Skjàk-Braek dell’lnstitute of Biotechnology dell’Llniversità NTNU di Trondheim (Norvegia) descritto da Strand et al., 2002, J. of Microencapsulation 19, 615-630. Tale apparato è costituito da un generatore elettrostatico con un voltaggio regolabile (fino a 10kV) tramite un opportuno interruttore, collegato ad un supporto per ago autoclavabile contenuto in una gabbia di sicurezza in plexiglass. Attraverso un sistema esterno alla gabbia, costituito da una siringa regolata da una pompa e collegata ad un tubo in lattice dal diametro interno di 1 mm, una soluzione di alginato viene fatta gocciolare in un cristallizzatore (all'interno della gabbia) contenente la soluzione gelificante nella quale viene inserito un elettrodo. Lo strumento genera una differenza di potenziale costante fra la punta dell'ago e la superficie libera della soluzione gelificante, che può essere regolata e che varia da 0 a 10 kV. La differenza di potenziale provoca il distacco repentino della goccia di polimero (carico negativamente) dalla punta dell’ago e permette quindi di avere capsule anche di piccole dimensioni (<200 pm). Le dimensioni delle capsule possono essere regolate anche variando altri fattori, quali il diametro interno dell’ago, la distanza dell’ago dalla superficie della soluzione gelificante, la velocità del flusso del polimero. Preparazione di cilindri

I cilindri e i dischi di gel degli esempi particolari sotto riportati sono stati preparati versando la soluzione polisaccaridica binaria all'interno di contenitori cilindrici o discoidali. Le dimensioni degli idrogeli cilindrici o discoidali dipendono dalla dimensione dei contenitori. Tipicamente le dimensioni dei contenitori cilindrici sono 18mm di altezza e 16mm di diametro interno mentre quelle dei contenitori discoidali sono 8mm di altezza e 16mm di diametro interno, anche se diverse dimensioni (altezza e diametro interno) sono possibili.

Esempi di preparazione di idrogeli a partire da miscele polisaccaridiche binarie di chitosani modificati con oligosaccaridi e polianioni liotropici o termotropici sono di seguito riportati.

Per la preparazione delle matrici 3D secondo gli esempi di seguito riportati sono stati impiegati soluzioni acquose di polisaccaridi anionici commerciali e del derivato del chitosano con lattosio preparato per amminazione riduttiva secondo quanto descritto nell'esempio 1.

Esempio 1 : sintesi del derivato del chitosano contenente lattosio (chitlac).

II chitosano (1.5g. grado di acetilazione 11 %) viene disciolto in 110 mL di una soluzione di metanolo (55mL) e un tampone di acido acetico all’1% a pH 4.5 (55mL). Si aggiungono 60 mL di una soluzione di metanolo (30mL) e di tampone di acido acetico aH'1% a pH 4.5 (30mL) contenente lattosio (2.2 g.) e sodio cianoboroidruro (900mg). La miscela viene lasciata in agitazione per 24 ore, trasferita in tubi da dialisi (cut off 12O00Da) e dializzata contro NaCI 0.1 M (2 cambi) e contro acqua deionizzata fino ad avere una conducibilità di 4pS a 4°C. Infine, la soluzione viene filtrata su filtri Millipore 0.45μιτι e liofilizzata.

Esempio 2: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante siringa

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac (es.1, MW ~1,500kDa) e alginato (MW ~130kDa) (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. 20mL di tale soluzione è stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente CaCl250mM e mannitolo 0.15M (bagno gelificante) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le capsule sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.

Esempio 3: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie binarie alginato : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante siringa.

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac (es.1, MW ~1,500kDa) e alginato (MW ~130kDa) (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. 20mL della soluzione è stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente CaCfe 50mM e NaCI 0.075M (bagno gelificante) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le capsule sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.

Esempio 4: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binane carragenano : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante siringa.

È stata preparata una soluzione polisaccarìdica binaria contenente chitlac (es.1, MW ~1,500kDa) e carragenano (MW ~300kDa) (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra carragenano e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. 20mL della soluzione è stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente KCI 100mM (bagno gelificante) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le capsule sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.

Esempio 5: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie agarosio : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante siringa.

È stata preparata una soluzione polisaccarìdica binaria contenente chitlac (es.1, MW ~1,500kDa) e agarosio (low gelling point) (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra agarosio e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4 a circa 60°C. 20mL della soluzione, raffreddata a circa 30°C, è stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente acqua deionizzata a circa 4°C. Le capsule erano mantenute in agitazione nella soluzione raffreddata per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.

Esempio 6: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato : chitlac 3:1 p/p 2% mediante Electrostatic Bead Generateti.

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac e alginato (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3/1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4.

20mL della soluzione era fatta gocciolare in una soluzione contenente CaCl250mM e mannitolo 0.15M (bagno gelificante). La dimensione delle capsule era controllata attraverso l'utilizzo di un Electrostatic Bead Generator. Tipicamente le condizioni utilizzate erano: voltaggio 5kV, diametro interno dell’ago 0.7mm, distanza tra bagno gelificante e ago 4cm, velocità di flusso della soluzione polimerica binaria 10mL/min. Le capsule sono state lasciate nella soluzione gelificante sotto agitazione per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata. Esempio 7: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante Electrostatic Bead Generator.

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac e alginato (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4.

20mL della soluzione è stata fatta gocciolare in una soluzione contenente CaCfe 50mM e NaCI 0.075M (bagno gelificante). La dimensione delle capsule era controllata attraverso l’utilizzo di un Electrostatic Bead Genarator come descritto per l’esempio precedente. Le capsule sono state lasciate nella soluzione gelificante sotto agitazione per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata. Esem<p>io 8: preparazione di cilindri di idrogeli a partire da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante dialisi. È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac e alginato (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4.

20mL della soluzione era trasferita in cilindri in plastica di dimensione 16mm (0) X 18mm (h) chiusi alle estremità inferiore e superiore con membrana da dialisi (cutoff ~ 12Ό00). I cilindri contenenti la soluzione polisaccaridica binaria erano immersi un 1L di una soluzione contenente CaCb 50mM e NaCI 0.15M per 30 minuti prima di essere rimossi dalla soluzione gelificante.

Esempio 9: preparazione di cilindri di idrogeli a partire da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato : chitlac 3:1 p/p al 2% mediante rilascio di calcio in situ.

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac e alginato (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3:1) contenente NaCI 0.15M, Hepes 10mM, pH 7.4. A 20mL della soluzione si aggiungevano CaC03(concentrazione finale 15mM) e GDL (D-glucono-5-lattone) (concentrazione finale 30mM). La miscela era trasferita all'interno di cilindri in plastica dimensione 16mm (0) X 18mm (h). La miscela è stata lasciata a temperatura ambiente per 24h e quindi i gel erano rimossi.

Esempio 10: incapsulazione di condrociti in microcapsule ottenute a partire da soluzioni polisaccaridiche binarie di alginato : Chitlac 3:1 p/p al 2%.

Condrociti, estratti dalla cartilagine articolare di maiale, sono stati risospesi ad una densità di 5X105 cellule/ml in una miscela alginato 1,5% e chitlac 0,5% preparati in tampone 0.15 M NaCI, 10 mM Hepes pH 7.4. La sospensione cellulare è stata mescolata gentilmente e fatta gocciolare da un Electronic bead ganerator in una soluzione gelificante composta da CaCI250 mM, mannitolo 0,15 M, Hepes 10 mM pH 7.4. Le capsule sono state lasciate gelifìcare completamente sotto lieve agitazione per 10 minuti e quindi raccolte e poste in coltura in terreno DMEM (Dulbecco’s modifìed Eagle’s medium) e prelevate a tempi successivi per effettuare i diversi saggi biochimici.

Esempio 11: incapsulazione di condrociti in microcapsule ottenute a partire da soluzioni polisaccaridiche binarie di alginato : Chitlac 3:1 p/p al 2%.

Condrociti, estratti dalla cartilagine articolare di maiale, sono stati risospesi ad una densità di 5x10<5>cellule/ml in una miscela alginato 1,5% e chitlac 0,5% preparati in tampone 0.15 M NaCI, 10 mM Hepes pH 7.4. La sospensione cellulare è stata mescolata gentilmente e fatta gocciolare da un Electronic baad ganerator in una soluzione gelificante composta da CaCI250 mM, mannitolo 0,15 M, Hepes 10 mM pH 7.4. Le capsule sono state lasciate gelifìcare completamente sotto lieve agitazione per 10 minuti e quindi raccolte e poste in coltura in terreno DMEM.

Esempio 12: incapsulazione di condrociti in capsule ottenute a partire da soluzioni polisaccaridiche binarie di alginato : Chitlac 3:1 p/p al 2% mediante siringa

Condrociti, estratti dalla cartilagine articolare di maiale, sono stati risospesi ad una densità di 5x10<5>cellule/ml in una miscela alginato 1,5% e chitlac 0,5% preparati in tampone 0.15 M NaCI, 10 mM Hepes pH 7.4. La sospensione cellulare è stata mescolata gentilmente e fatta gocciolare mediante siringa da 23G in una soluzione gelificante composta da CaCI250 mM, mannitolo 0,15 M, Hepes 10 mM pH 7.4. Le capsule sono state lasciate gelificare completamente sotto lieve agitazione per 10 minuti e quindi raccolte e poste in coltura in terreno DMEM.

Esempio 13: preparazione di microcapsule da soluzioni polisaccaridiche binarie alginato-rodamina : chitlac-fluoresceina 3:1 p/p 2%

È stata preparata una soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac marcato con fluoresceina e alginato marcato con rodamina (concentrazione polimerica totale 2%, rapporto tra alginato e chitlac = 3/1) contenente NaCI 0.1 5M, Hepes 10mM, pH 7.4. 20mL della soluzione era fatta gocciolare in una soluzione contenente CaCfe 50mM e mannitolo 0.15M (bagno gelificante). La dimensione delle capsule era controllata attraverso l’utilizzo di un Electrostatic Bead Generator. Tipicamente le condizioni utilizzate erano: voltaggio 5kV, diametro interno dell’ago 0.7mm, distanza tra bagno gelificante e ago 4cm, velocità di flusso della soluzione polimerica binaria 10mL/min. Le capsule sono state lasciate nella soluzione gelificante sotto agitazione per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata. B. Caratterizzazione di idrogel da una soluzione di un polisaccaride anionico e un derivato oligosaccaridico del chitosano.

La dimensione delle capsule/cilindri è chiaramente dipendente dal processo di preparazione delle stesse adottato. In figura 1 è riportata a titolo di esempio una fotografia al microscopio ottico di microcapsule preparate con il utilizzando un Electronic Beaci Generator, mentre in figura 2 sono mostrate capsule di dimensione superiore ottenute a partire da miscele polisaccaridiche binarie polianione/policatione utilizzando semplici siringhe e facendo gocciolare la soluzione in un bagno gelificante opportuno. I cilindri di sono stati preparati secondi gli esempi sopra riportati e hanno dimensioni di 16mm (0) X 18mm (h). Il processo di formazione delle matrici 3D avviene immediatamente quando la soluzione polimerica binaria entra in contatto con la soluzione gelificante nelle condizioni opportune di contenuto di ioni per i polianioni liotropici o con la soluzione raffreddata per quelli termotropici. Ad esempio, la formazione di dell’idrogel avviene istantaneamente quando la soluzione polimerica binaria contente l’alginato e il chitlac viene a contatto con la soluzione gelificante contenente il calcio. Ne consegue che il chitosano modificato, vale a dire il chitlac, pur non rientrando a far parte della struttura deH'idrogelo, ne rimane intrappolato all'interno. Questo è stato verificato con analisi di microscopia confocale di capsule ottenute a partire da una miscela polisaccaridica binaria contenente alginato marcato con rodamina e chitlac marcato con fluoresceina, preparate come descritto all'esempio 13. La presenza di entrambi i fluorofori all'interno della capsula ha indicato la presenza di entrambi i polisaccaridi nel manufatto finale. Inoltre, l’analisi NMR protonica, eseguita sulla soluzione polisaccaridica binaria prima e dopo la formazione delle microcapsule, preparate secondo l'es. 6, ha evidenziato come il chitlac sia presente in entrambi i casi (fig.3).

L'analisi delle proprietà meccaniche degli idrogeli ottenuti dalla soluzione polisaccaridica binaria contenente chitlac e alginato è stata eseguita su matrici con forma cilindrica ottenuti ricorrendo alla tecnica in-situ (esempio 9). Si è eseguito uno studio reologico della cinetica di formazione del gel e delle sue proprietà elastiche. In particolare, la Fig. 4 riporta l'andamento del modulo elastico (G') e modulo viscoso (G”) nel tempo per l'idrogel ottenuto a partire dalla soluzione binaria di chitlac e alginato e per quello ottenuto a partire dalla soluzione di solo alginato. Si può notare come la presenza del chitosano modificato, il chitlac, non alteri la cinetica di formazione dell’idrogelo, giacché la velocità di aumento di G' è nei due casi paragonabile. Tuttavia, è interessante notare come il valore massimo raggiunto da G' sia maggiore nel caso dell’idrogel ottenuto a partire della soluzione binaria di chitlac e alginato. Questo porta a concludere che gli idrogeli ottenibili dalle miscele polimeriche presentano proprietà meccaniche migliori di quelli ottenibili dalle soluzioni contenenti il solo polimero gelificante (ad esempio alginato).

Questo è confermato dalia comparazione di questi risultati con il valore del modulo di compressione misurato su cilindri di idrogeli ottenuti, nuovamente ricorrendo alla tecnica della formazione in situ (esempio 9), da soluzioni binarie di chitlac e alginato e da soluzioni di solo alginato. In modo parallelo a quanto accade per G', il modulo di compressione per gli idrogeli ottenuti dalla miscela binaria di chitlac e alginato è maggiore di quello del gel ottenuto dalla soluzione contenente semplicemente alginato (Fig. 5).

C. Prove biologiche su capsule di alginato M.5%Vchitlac (0.5%ì con condrociti.

Le microcapsule ottenute secondo l'es. 12 poste in coltura in terreno DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle's Medium) sono state prelevate a tempi successivi per misurarne la vitalità, utilizzando un kit di citotossicità (live/dead cytotoxicity kit), basato sulla diversa permeabilità delle cellule vive e morte a due coloranti fluorescenti (SYTO<®>10 and DEAD Red™). Si è osservato chiaramente come nelle capsule alginato:chitlac dopo 10 giorni in coltura, più del 90% delle cellule è viva.

La natura della componente macromolecolare della ECM sintetizzata nelle capsule miste ed in quelle di solo alginato, come controllo, è stata valutata attraverso RT-PCR e saggi biochimici. E’ emerso che i condrociti sintetizzano attivamente matrice e che la componente collagenica dopo diversi tempi di coltura è costituita da collagene tipo II mentre quella dei proteoglicani è rappresentata da aggrecano, entrambi marcatori condrogenici specifici (Fig. 6 e 7).

Per dimostrare ulteriormente la capacità proliferativa di queste cellule in presenza del glicopolimero chitlac è stata misurata l'incorporazione della [<3>H]-timidina all'interno delle cellule. I condrociti sono stati fatti crescere in capsule di alginato ed in capsule di alginato: chitlac di es 12 ed al mezzo di coltura è stato aggiunto 1 pCi di [<3>H]-timidina ad intervalli di interesse (1gg, 5gg, 10gg e 15gg). La radioattività così incorporata è stata misurata dopo 24 ore. I risultati sono riportati in fig. 8.

Questi risultati sono stati riconfermati con analisi a microscopia ottica su cellule incapsulate secondo l'esempio 12 e colorate con due protocolli di colorazione, uno con blu di toluidina e uno d’impregnazione argentica. Il blu di toluidina è un colorante basico che oltre ad evidenziare le strutture cellulari interagisce con i GAGs, in quanto carichi negativamente, evidenziandone la presenza nella matrice extracellulare. Le immagini riferite alle capsule di alginato hanno una colorazione più intensa a causa del segnale di fondo del polimero carico negativamente. L’impregnazione argentica invece permette d'individuare il collagene nella matrice cellulare. Dalle fotografie al microscopio ottico si evidenzia nell’intorno cellulare un alone scuro in corrispondenza del collagene ed un alone violaceo in corrispondenza dei GAGs, a conferma che le cellule continuano a sintetizzare matrice.

Dal punto di vista dell'ingegneria tissutale, le risultanze sperimentali qui riportate forniscono i dati relativi alla progettazione ed alla preparazione di matrici tridimensionali biocompatibili a partire da soluzioni binarie di polisaccaridi anionici e cationici modificati, quali i derivati oligosaccaridici del chitosano. In una realizzazione preferita questi sono rispettivamente alginato e derivato del chitosano con lattosio. Il primo è un polimero biocompatibile ma con scarsa/nulla capacità di generare risposta biologica ma capace d formare gel, il secondo è un polimero bioattivo, incapace di per sé di formare gel tridimensionali, ma capace di stimolare la proliferazione cellulare mantenendo contemporaneamente la capacità di sintesi di ECM. Nello stesso tempo il medesimo sistema a scaffold tridimensionale a composizione mista rappresenta un metodo di coltura di condrociti che ne garantisce il mantenimento fenotipico e contemporaneamente ne permette una rapida espansione.

I risultati sperimentali mostrati dimostrano quindi che le matrici 3D dell’invenzione adempiono agli scopi della stessa e possono essere utilmente impiegate in campo biomedico ed in particolare per la microincapsulazione di cellule ovvero che matrici 3D contenenti cellule possono essere impiegate nell'ingegneria tissutale. I risultati possono essere infatti essere estesi a matrici 3D per la microincapsulazione di tutti i tipi cellulari, isolati o in associazioni multicellulari, impiegati nell'ingegneria tissutale, quali, a puro titolo esemplificativo ma non esaustivo, condrociti, epatociti, cellule pancreatiche beta ed isole di Langerhans, cellule staminali mesenchimali, cellule endoteliali, osteoblasti, cheratinociti.

Tali risultati si possono inoltre estendere alla incapsulazione di farmaci o di molecole farmacologicamente attive, per la messa a punto di sistemi di rilascio differito o controllato di tali composti. In questi casi, la procedura di preparazione è la stessa di quella sopra riportata per la incapsulazione di cellule o di associazioni multicellulari per semplice sostituzione della sospensione cellulare con le molecole farmacologicamente attive, disciolte o sospese nella soluzione polimerica.

Claims (37)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni consistenti in idrogeli ottenibili da soluzioni acquose di miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico dei chitosano, in cui tali derivati del chitosano hanno un grado di derivatizzazione di almeno il 40% ed in cui tali soluzioni acquose di miscele di polisaccaridi hanno una forza ionica almeno di 100 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7, mediante il trattamento di tali soluzioni acquose di miscele di polisaccaridi con agenti chimici o fisici capaci di gelificare i polisaccaridi anionici liotropici o termotropici compresi nelle miscele stesse.
2. 2. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui i derivati oligosaccaridici del chitosano hanno un grado di derivatizzazione compreso tra il 50% ed l'80%.
3. 3. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 2 in cui i derivati oligosaccaridici del chitosano hanno un grado di derivatizzazione del 70%.
4. 4. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui i derivati oligosaccaridici del chitosano sono ottenibili dalla derivatizzazione del chitosano con oligosaccaridi comprendenti da 1 a 3 unità glicosidiche.
5. 5. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 4 in cui i derivati oligosaccaridici del chitosano sono ottenibili dalla derivatizzazione del chitosano con oligosaccaridi comprendenti da 2 a 3 unità glicosidiche.
6. 6. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 5 in cui gli oligosaccaridi sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maitotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, melibiosio.
7. 7. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 6 in cui l'oligosaccaride è lattosio.
8. 8. Composizioni consistenti in idrogeli secondo le rivendicazioni 4-7 in cui il chitosano ha un peso molecolare medio sino a 1 ,500kDa.
9. 9. Composizioni consistenti in idrogeli seconda la rivendicazione 8 in cui il chitosano ha un peso molecolare medio compreso tra 400kDa e 700kDa.
10. 10. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui i polisaccaridi anionici liotropici sono scelti nel gruppo consistente in carragenani, pectati e pectinati, alginati, gellano, ramsano, wellano, xantano.
11. 11. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 10 in cui il polisaccaride anionico liotropico è l’alginato.
12. 12. Composizioni consistenti in idrogeli seconda la rivendicazione 1 in cui i polisaccaridi anionici termotropici sono scelti nel gruppo consistente in agarosio e agarosio solfato, carragenano, cellulosa solfato.
13. 13. Composizioni consistenti in idrogeli secondo le rivendicazione 10-12 in cui i polisaccaridi anionici hanno un peso molecolare medio sino a 2,000kDa.
14. 14. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 13 in cui i polisaccaridi anionici hanno un peso molecolare medio compreso tra 100kDa e 1,000kDa.
15. 15. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 14 in cui i polisaccaridi anionici hanno un peso molecolare medio di 200kDa.
16. 16. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui le miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano comprendono i polisaccaridi anionici ed i derivati oligosaccaridici del chitosano in un intervallo di rapporti in peso tra polisaccaridi anionici e derivati oligosaccaridici del chitosano compreso tra 3:1 e 1:1.
17. 17. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui le soluzioni acquose delle miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano hanno concentrazioni polimeriche sino al 3%.
18. 18. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 17 in cui le soluzioni acquose delle miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano hanno concentrazioni polimeriche comprese tra 1.5% e 3%.
19. 19. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 18 in cui le soluzioni acquose delle miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano hanno una concentrazione polimerica di 2%.
20. 20. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui le soluzioni acquose delle miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano hanno un pH compreso tra 7 e 8.
21. 21. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui le soluzioni acquose delle miscele di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico ed almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano hanno un'osmolarità compresa tra 250 mM e 350mM per una aggiunta ulteriore di soluti non ionici.
22. 22. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui gli agenti chimici capaci di gelificare i polisaccaridi anionici liotropici sono soluzioni acquose di ioni monovalenti, divalenti o trivalenti aventi una concentrazione superiore a 10mM.
23. 23. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 22 in cui quando gli agenti gelificanti sono soluzioni acquose di ioni monovalenti questi sono scelti nel gruppo consistente in potassio, rubidio, cesio, tallio e argento e miscele degli stessi.
24. 24. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 22 in cui quando gli agenti gelificanti sono soluzioni acquose di ioni divalenti questi sono scelti nel gruppo consistente in calcio, bario, stronzio, rame, piombo, magnesio, con l'eccezione per il magnesio del caso in cui il polisaccaride anionico è alginato o pectato, manganese e zinco e miscele degli stessi.
25. 25. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 22 in cui quando gli agenti gelificanti sono soluzioni acquose di ioni trivalenti questi sono scelti nel gruppo consistente in alluminio, ferro, gadolinio, terbio ed europio e miscele degli stessi.
26. 26. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 22 in cui le soluzioni acquose degli ioni monovalenti, divalenti o trivalenti hanno una concentrazione compresa tra 10mM e 100mM.
27. 27; Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 26 in cui le soluzioni acquose degli ioni monovalenti, divalenti o trivalenti hanno una concentrazione di 50mM.
28. 28. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 1 in cui gli agenti fisici capaci di gelificare i polisaccaridi anionici termotropici sono temperature non superiori a 40°C e non inferiori a 10°C.
29. 29. Composizioni consistenti in idrogeli secondo la rivendicazione 28 in cui l’agente fisico capace di gelificare i polisaccaridi anionici termotropici è una temperatura di 20°C.
30. 30. Composizioni consistenti in idrogeli ottenibili con un processo di preparazione comprendente almeno le seguenti fasi: a) preparazione di una soluzione acquosa di una miscela di almeno un polisaccaride anionico liotropico o termotropico e di almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano, aventi i derivati del chitosano un grado di derivatizzazione almeno del 40% ed aventi le soluzioni acquose una forza ionica almeno di 100mM e non superiore a 350 mM ed almeno un pH di 7, ed aggiunta alle soluzioni polisaccaridiche preparate di cellule e/o di composti attivi da inglobare neH’idrogel; b) aggiunta della soluzione preparata al punto a) con mezzi adatti per ottenere l'idrogel di una forma voluta, in una soluzione gelificante contenente io ione reticolante per i polisaccaridi anionici liotropici o che si trova ad una opportuna temperatura per i polisaccaridi anionici termotropici; c) rimozione dell'idrogel formato ed inglobante le cellule e/o i composti attivi mediante opportuni mezzi.
31. 31. Composizioni consistenti in idrogeli secondo le rivendicazioni 2-29 ottenibili con un processo di preparazione secondo la rivendicazioni 30.
32. 32. Processo per la preparazione di idrogeli comprendente almeno le seguenti fasi: a) preparazione di una soluzione acquosa di una miscela di almeno un polisaccaride anionico I iotropico o termotropico e di almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano, aventi i derivati del chitosano un grado di derivatizzazione almeno del 40% ed aventi le soluzioni acquose una forza ionica almeno di 100mM e non superiore a 350 mM ed almeno un pH di 7, ed aggiunta alle soluzioni polisaccaridiche preparate di cellule e/o di composti attivi da inglobare nell’idrogel; b) aggiunta della soluzione preparata al punto a) con mezzi adatti per ottenere l’idrogel di una forma voluta, in una soluzione gelificante contenente lo ione reticolante per i polisaccaridi anionici liotropici o che si trova ad una opportuna temperatura per i polisaccaridi anionici termotropici; c) rimozione dell’idrogel formato ed inglobante le cellule e/o i composti attivi mediante opportuni mezzi.
33. 33. Processo secondo la rivendicazione 32 per la preparazione di idrogeli secondo le rivendicazioni 1-29.
34. 34. Processo per la preparazione di idrogeli secondo la rivendicazione 33 in cui gli idrogeli hanno forma di microcapsule o cilindri o dischi.
35. 35. Uso di idrogeli secondo una delle rivendicazione 1-31 per applicazioni in campo biomedico umano e non umano.
36. 36. Uso di idrogeli secondo la rivendicazione 35 per l’inglobamento di cellule per l’impiego nell'ingegneria tissutale.
37. 37. Uso di idrogeli secondo la rivendicazione 35 per l’inglobamento di composti attivi per l’impiego nel rilascio differito o controllato di tali composti.