ITPD20090110A1 - Complessi azoturo dissimmetrici monocationici del tecnezio - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

“COMPLESSI AZOTURO DISSIMMETRICI MONOCATIONICI DEL TECNEZIO†Campo dell’invenzione

La presente invenzione à ̈ relativa a complessi azoturo dissimmetrici monocationici di metalli radioattivi, in particolare di tecnezio-99m (<99m>Tc), in grado di accumularsi in differenti organi e/o tessuti bersaglio ed in particolare nel miocardio ed in tessuti tumorali, ed al loro uso nella diagnostica medico nucleare come radio traccianti, in particolare per l’imaging cardiaca e tumorale.

Stato della tecnica

Molti dei radionuclidi utilizzati nella preparazione di radiofarmaci sono rappresentati da metalli di transizione. Tra questi, il<99m>Tc, grazie alle sue caratteristiche chimico-fisiche, à ̈ considerato il radionuclide di elezione per l’utilizzo in medicina nucleare. Il tecnezio, infatti, decade attraverso l’emissione di una radiazione γ monocromatica con un’energia di 141 keV. Inoltre presenta un tempo di emivita di 6.02 ore, ovverossia sufficientemente lungo da permettere al radiochimico di portare a termine la sintesi del complesso ed al medico di ottenere immagini utili, e sufficientemente breve affinché la dose di radiazioni assorbita dal paziente sia minima. Inoltre il<99m>Tc à ̈ facilmente disponibile a basso costo attraverso generatori portatili di<99>Mo-<99m>Tc, installabili in ogni centro di medicina nucleare e può essere facilmente incorporato all’interno di opportune molecole, dando così origine a composti che possono essere utilizzati come agenti diagnostici. Tra i primi traccianti tecneziati sviluppati ed attualmente in uso clinico vanno in particolare ricordati il<99m>Tc-Sestamibi o<99m>Tc-MIBI (Cardiolite<®>) ed il<99m>Tc-tetrofosmin (Myoview<®>) descritti per la prima volta rispettivamente nel 1987 nel brevetto EP0233368 e nel 1989 nel brevetto EP0337654. Entrambi questi complessi del<99m>Tc hanno trovato ampio uso come radio-traccianti nella perfusione del miocardio.

Inoltre il<99m>Tc-Sestamibi à ̈ stato uno dei primi traccianti ad essere utilizzato nella diagnosi di alcuni tipi di tumore e validato come substrato di MDR-Pgp (multidrug resistance proteins) e quindi come tracciante nella visualizzazione in vivo attraverso l’uso di tecniche tomografiche dell’espressione di MDR-Pgp. Le MDR-Pgp sono particolari glicoproteine trans-membrana, ATP dipendenti, prodotte dal gene MDR-1. Queste proteine regolano l’efflusso di numerosi agenti ad azione citotossica (con caratteristiche strutturali e funzionali diverse) rendendo in questo modo le cellule tumorali resistenti all’azione di diversi farmaci.

Tale utilizzo à ̈ possibile grazie al meccanismo di accumulo del tracciante nelle cellule all’interno delle strutture mitocondriali, guidato da un processo di diffusione passiva e sostenuto da un gradiente elettrico generato da un elevato potenziale transmembrana mitocondriale, che ne determina un intrappolamento irreversibile. Il suo accumulo à ̈ particolarmente pronunciato, fino a dieci volte maggiore, in cellule tumorali sensibili che presentano una densità mitocondriale superiore rispetto a quella di cellule normali, in virtù di una maggiore differenza di gradiente elettrico (60 mV). Una riduzione dell’accumulo intracellulare di questo tracciante può essere correlata a diversi fenomeni biologici alcuni dei quali sono associati alla sovra-espressione delle glicoproteine trans-membrana MDR-Pgp. In queste cellule l’accumulo di<99m>Tc-Sestamibi à ̈ inversamente proporzionale ai livelli di espressione di Pgp, come dimostrato dall’aumentata captazione del tracciante dopo esposizione delle stesse a modulatori della glicoproteina MDR-1 (verapamil, ciclosporina A, elacridar e valspodar). Queste ultime sostanze bloccando la funzione delle MDR-Pgp inducono un aumento della concentrazione del tracciante all’interno delle cellule (Agrawal M, Abraham J, Balis F M, et al. Increased<99m>Tcsestamibi accumulation in normal liver and drug-resistant tumors after the administration of the glycoprotein inhibitor, XR9576 Clin. Cancer Res., 2003; 9: 650–656; Sharma V. Radiopharmaceuticals for assessment of multidrug resistance P-glycoprotein-mediated drug transport activity. Bioconjug Chem.

2004;15:1464–14 74).

La recente scoperta di un nuovo ed efficiente metodo per la produzione di complessi del Tc-99m contenenti il legame multiplo terminale tecnezio-azoto [<99m>Tc≡N]<2+>(WO 89/086557; WO 92/00982; WO 93/01839) ha aperto la possibilità di valutare l’attività biologica di classi completamente diverse di complessi azoturo di Tc-99m e di proporli come radio-farmaci di perfusione o recettore specifici. Il crescente interesse verso questa nuova categoria di composti à ̈ legato proprio alla presenza del gruppo [<99m>Tc≡N]<2+>, che conferisce ai complessi, in cui à ̈ contenuto, una elevata stabilità ed inerzia alla sostituzione, e resistenza ai processi di ossidoriduzione. Conseguentemente, diversi<99m>Tc(N)-complessi sono stati recentemente sviluppati e valutati quali potenziali agenti diagnostici. Esempi ne sono complessi azoturo neutri simmetrici bi-sostituiti del tipo [Tc(N)(DTC)2] descritti in WO 90/06137, in cui DTC rappresenta un legante che può essere di tipo ditiocarbammico, quali ad esempio: dietiliditiocarbammato, di n-propil ditiocarbammato e N-etil, N-etossi ditiocarbammato. Altri complessi azoturo di metalli radioattivi proposti come agenti di perfusione cardiaca sono descritti in EP 0949265 e WO02/09771. In particolare sono qui descritti complessi azoturo monocationici dissimmetrici bi-sostituiti del tipo [Tc(N)(PNP)(DTC)]<+>, in cui DTC può essere un legante ditiocarbammico contenente catene carboniose o eteree lineari e PNP un legante difosfinoamminico. Tra questi il complesso [<99m>Tc(N)DBODC(PNP5)]<+>[DBODC = bis (N-etossietil)-ditiocarbamato; PNP5 = bis (dimetossipropilfosfinoetil)-etossietilammina], abbreviato a<99m>Tc(N)-DBODC(5) (descritto nella domanda di brevetto WO02/09771) ha mostrato interessanti proprietà biologiche ed attualmente si trova in fase di studio clinico preliminare quale potenziale agente di perfusione cardiaca.

Analogamente a quanto osservato per [<99m>Tc]-Sestamibi,<99m>Tc(N)DBODC(PNP5) si localizza irreversibilmente nelle strutture mitocondriali in forza di un gradiente elettrico transmembrana negativo, come dimostrato da studi di distribuzione subcellulare, condotti su miocardio isolato di ratto. Inoltre, studi di metabolismo condotti al fine di chiarire il meccanismo di rapida rimozione di tale complesso dagli organi non bersaglio hanno dimostrato che<99m>Tc(N)DBODC(PNP5) viene eliminato nella sua forma nativa, e che l’escrezione à ̈ mediata da trasportatori Pgp/MDR-Pgp, aspetti questi che lasciano intravedere la possibilità di estendere la applicabilità diagnostica di questo complesso e dei suoi derivati dal campo cardiologico a quello oncologico. (C. Bolzati, M. Cavazza-Ceccato, S. Agostini, S. Tokunaga, D. Casara, G. Bandoli Subcellular Distribution and Metabolism Studies of the Potential Myocardial Imaging Agent [<99m>Tc(N)(DBODC)(PNP5)]. J Nucl Med 2008; 49:1336–1344).

Nella domanda di brevetto WO2007/083395 sono descritti: un intermedio per la sintesi di leganti difosfinoamminici, numerosi leganti difosfinoamminici e alcuni leganti ditiocarbammati, tra cui il pirrolidinditiocarbammato, il piperidinditiocarbammato e la 4-etil piperazinditiocarbammato, con la previsione della preparazione di complessi [<99m>Tc(N)(PNP)(DTC)]<+>, in cui il legante DTC può essere pirrolidinditiocarbammato, piperidinditiocarbamato e 4-etilpiperazinditiocarbammato. La preparazione di tali complessi non à ̈ descritta nel dettaglio e di conseguenza nessuna prova di uptake tissutale à ̈ data, benchà ̈ ne sia previsto l’uso come radio-traccianti nell’imaging cardiaco.

Sommario

La presente invenzione à ̈ relativa ad un radiofarmaco utilizzabile nella diagnostica medico nucleare rappresentato da un complesso azoturo dissimmetrico monocationico di tecnezio-99m in grado di accumularsi nei differenti organi ed in particolare nel miocardio ed in tessuti tumorali ed utilizzabile come radiotracciante.

Per questi radiofarmaci il principio attivo à ̈ rappresentato da un complesso azoturo monocationico dissimmetrico bi-sostituito, costituito, quindi, da un gruppo [Tc≡N]<2+>coordinato a due diversi leganti polidentati: un legante difosfinoamminico ed un legante ditiocarbammico aliciclico.

Sono quindi in un primo aspetto oggetto dell’invenzione complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m rappresentati dalla formula generale (I)

[Tc<V>(N)(PNP)(DTC-L)]<+>(I)

- Tc<V>(N) à ̈ [<99m>Tc≡N]<2+>;

- PNP Ã ̈ un legante difosfinoamminico;

- DTC-L Ã ̈ un legante ditiocarbammico aliciclico

e sali farmaceuticamente accettabili degli stessi

in cui:

- il legante PNP Ã ̈ rappresentato dalla formula generale (II)

R<2>

R1 R<1>

PCH2CH2NCH2CH2P

R<1>R<1>(II)

dove:

- R<1>à ̈ un gruppo alchilico o etereo, quest’ultimo rappresentato dalla formula generale (III)

-(CH2)mO(CH2)m’CH3(III)

in cui m à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤m≤4 ed m’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤m’≤3;

- R<2>à ̈ un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, un etere ciclico o un gruppo etereo avente il significato della formula generale (III) o un gruppo estereo del tipo –(CH2)m’’C(O)R†dove m’’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤m’’≤3 ed R<’’>à ̈ un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, o un gruppo etereo avente il significato della formula generale (III); - il legante ditiocarbammico aliciclico DTC-L à ̈ rappresentato dalla formula generale (IV)

S CN<n>X R<3>

S

(IV)

dove:

- n à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 3≤n≤8;

- X Ã ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo scelto tra N, O, S;

- R<3>à ̈ un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito lineare o ciclico, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, o un gruppo etereo acetalico o chetalico lineare o ciclico, un gruppo farmacoforo o una biomolecola con la condizione che il legante DTC-L non à ̈ pirrolidinditiocarbammato, piperidinditiocarbammato o 4-etil piperazinditiocarbammato.

Preferibilmente i gruppi alchilici variamente sostituiti rappresentati da R<3>del legante DTC-L sono rappresentati dalle seguenti formule generali (V), (VI), (VII):

R<4>

R<5>(V)

dove R<4>e R<5>sono indipendentemente tra di loro un gruppo alchilico od arilico variamente sostituiti, anche contenenti eteroatomi scelti tra N, O, S, variamente spaziati;

R<6>

(CH2)pY((CH2)p'CH3)p" (VI)

dove R<6>Ã ̈ un gruppo alchilico od arilico variamente sostituito, anche contenenti eteroatomi scelti tra N, O, S, variamente spaziati,

p à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p≤4; Y à ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo come ad esempio N, O, S, p’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p’≤4, p’’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤p†≤3;

(CH2)pY((CH2)p'CH3)p"

<(CH2)pY((CH2)p'CH3)p">(VII)

p à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p≤4, Y à ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo scelti tra N, O, S, p’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p’≤4, p’’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤p’’≤3.

Quando R<3>à ̈ un gruppo farmacoforo, questo à ̈ preferibilmente scelto nel gruppo consistente in 2 metossifenil piperazina, derivati della benzilguanidina, e della norepinefrina, mentre quando à ̈ una biomolecola, questa à ̈ preferibilmente scelto nel gruppo consistente in peptidi bioattivi, acidi grassi.

I complessi di azoturo del tecnezio-99m di formula generale (I) hanno dimostrato di possedere attività biologiche adatte per un loro uso come radio-traccianti.

È quindi un ulteriore oggetto dell’invenzione l’uso di complessi azoturo del tecnezio-99m di formula generale (I) come radio-traccianti a scopi diagnostici, in particolare per l’imaging cardiaco e tumorale.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione riguarda radio-farmaci per uso diagnostico costituiti da complessi azoturo monocationici bi-sostituiti dissimmetrici di<99m>Tc, in cui il gruppo [Tc≡N]<2+>à ̈ coordinato a due diversi leganti polidentati: un legante difosfinoamminico ed un legante ditiocarbammico aliciclico, in grado di raggiungere un’elevata e persistente localizzazione cardiaca e elevati rapporti cuore/polmoni e cuore/fegato e per questo utilizzabili in prima istanza nell’ imaging cardiaco. Inoltre questi composti si sono dimostrati in grado di localizzarsi in modo irreversibile nelle strutture mitocondriali di cellule tumorali permettendo così di estendere il loro uso come radio-traccianti anche al campo oncologico.

I complessi azoturo dissimmetrici monocationici del Tecnezio-99m di formula generale (I) oggetto nella presente invenzione, di cui qui sotto viene riportata la corrispondente configurazione spaziale, sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo [<99m>Tc≡N]<2+>coordinato a due diversi leganti poli-dentati: un legante difosfinoamminico coordinato al metallo mediante i due atomi di fosforo pi-ï€ acettori; un legante bidentato mononegativo quale un ditiocarbammato aliciclico di formula IV.

R<1>

R<1>N

P S

Tc CN<n>

R<1>X R<3>

R<1>P S

N

R<2>

Nella presente invenzione il legante difosfinoamminico à ̈ preferibilmente un composto di formula (II) come prima definito, mentre il legante ditiocarbammato aliciclico, ed alcuni suoi derivati sono secondo la formula generale (IV) con i significati prima definiti.

Esempi specifici di leganti difosfinoamminici PNP e ditiocarbammici DTC-L secondo la presente invenzione, e preferiti per gli scopi della stessa, sono di seguito riportati:

- leganti difosfinoamminici:

bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina,

bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina,

bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossipropilamina,

bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossipropilamina,

bis(dietossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dietilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dipropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etilamina, bis(dimetilfosfinoetil)propilammina,

bis(dietilfosfinoetil)metilamina,

bis(dietilfosfinoetil)etilamina, bis(dietilfosfinoetil)propilammina, bis(dipropilfosfinoetil)metilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etilamina, bis(dipropilfosfinoetil)propilammina, bis(diisopropilfosfinoetil)metilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)propilammina;

- leganti ditiocarbammati aliciclici:

azepina ditiocarbammato,

azocane ditiocarbammato,

1-methyl-[1,4]diazepan ditiocarbammato,

3-(dimetilammino)pirrolidin ditiocarbammato,

3-(dietilammino)pirrolidin ditiocarbammato,

4-isopropilpiperidin ditiocarbammato,

4,4-dimetossi piperidin ditiocarbammato,

4,4-dietossipiperidin ditiocarbammato,

4,4-dietossietilpiperidin ditiocarbammato,

4,4-dietossipropilpiperidin ditiocarbammato,

4,4-bis-(2-etossi-etossi)-piperidin ditiocarbammato, 1-etilomopiperazin ditiocarbammato,

morfolin ditiocarbammato,

tiomorfolin ditiocarbammato,

2,6-dimetilmorfolin ditiocarbammato,

4 morfolin piperidin ditiocarbammato,

4 N (2 metossifenil) piperazin ditiocarbammato, 4,4-piperidindiol ditiocarbammato,

2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinone ditiocarbammato, 4-piperidinol ditiocarbammato,

2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinol ditiocarbammato, 1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbammato, (7,7,9,9-tetrametil-1,4-dioxa-8-azaspiro[4.5]dec-2-il)metanol ditiocarbammato,

2-aza-5-oxabiciclo(2.2.1)-eptan ditiocarbammato,

4,7-epossi-7-metil-2,3,3a,4,5,6,7,7a-octaidro-1h-isoindol ditiocarbammato. I più preferiti tra i leganti PNP sono:

bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)metossietilamina,

mentre i più preferiti tra i leganti aliciclici DTC-L sono:

morfolin ditiocarbammato,

4 N (2 metossi fenil) piperazin ditiocarbammato,

1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbammato,

tiomorfolin ditiocarbammato,

azepina ditiocarbammato,

azocane ditiocarbammato,

1-metil-[1,4]diazepan ditiocarbammato.

Entrambi i leganti sono preparati secondo metodi di preparazione noti ad un esperto del settore.

In particolare, i leganti difosfinoamminici PNP impiegabili per i complessi azoturo del tecnezio-99m secondo l’invenzione sono stati sintetizzati in accordo a quanto descritto nel brevetto EP0949265 precedentemente citato, mentre i leganti ditiocarbammati sono preparati attraverso una via di sintesi classica che prevede il trattamento in ambiente basico per soda e a bassa temperatura dell’ammina ciclica opportunamente selezionata con disolfuro di carbonio (Pasqualini, R., Duatti, A., Bellande, E., Comazzi, V., Brucato, V., Hoffschir, D., Fagret, D., and Comet, M. (1994) Bis(dithiocarbamato) nitrido technetium-99m radiopharmaceuticals: a class of neutral myocardial imaging agents. J. Nucl. Med.

35, 334-341; Zhang, J., Wang, X., Li, C. Y., (2002) Synthesis and biodistribution of a new<99m>Tc nitrido complex for cerebral imaging. J. Nucl. Med. Biol.29, 665-669).

Secondo un primo metodo i complessi azoturo del<99m>Tc possono essere preparati in un’unica fase per addizione dello ione pertecnetato ad una miscela di reazione consistente nei leganti PNP e DTC-L scelti, un riducente, un donatore di gruppi N<3->, uno stabilizzante, un solubilizzante ed un regolatore di pH.

Secondo un altro metodo i complessi azoturo del<99m>Tc possono essere preparati con un processo comprendente le seguenti fasi:

- preparazione di una miscela di azoturi intermedi contenente il [<99m>Tc(N)]<2+>per riduzione dello ione pertecnetato in presenza di un riducente, un donatore di gruppi N<3->, uno stabilizzante ed un regolatore di pH a temperatura ambiente;

- addizione alla miscela contenente il [<99m>Tc(N)]<2+>dei leganti PNP e DTC-L selezionati ad una temperatura compresa tra RT e 100°C in presenza di un agente solubilizzante.

Il metodo di preparazione dei complessi del<99m>Tc secondo l’invenzione basato sulle due fasi sopraindicate può prevedere anche che sia l’azoturo [<99m>Tc(N)]<2+>ad essere aggiunto alla miscela di reazione consistente sostanzialmente nei leganti PNP e DTC-L e l’agente solubilizzante o viceversa che i leganti siano aggiunti all’azoturo.

In dettaglio, il primo passaggio consente la sintesi, dopo 30 min a temperatura ambiente, di una miscela di azoturo complessi intermedi contenenti il core [<99m>Tc(N)]<2+>, ottenuto in seguito alla riduzione dello ione pertecnetato condotta alla presenza di un opportuno agente riducente, quale ad esempio stagno cloruro (SnCl2), e di donatore di gruppi N<3->, quale ad esempio succinil diidrazide (SDH) e di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). La presenza di EDTA à ̈ necessaria al fine di evitare, dopo l’aggiunta del legante ditiocarbammico la precipitazione del complesso neutro Sn(DBODC)2. La preparazione à ̈ quindi completata dalla simultanea aggiunta dei leganti PNP e DTC alla stessa vial di reazione in modo tale da ottenere, dopo 30 min a 80-100 °C, la quantitativa formazione del prodotto finale. Alternativamente i complessi possono essere preparati utilizzando una via di sintesi semplificata che vede la produzione del complesso finale in alta resa a seguito dell’aggiunta dello ione pertecnetato ad una vial contenete tutti i reagenti. I complessi azoturo del tecnezio-99m secondo l’invenzione possono essere prodotti anche estemporaneamente pronti per l’uso utilizzando un kit allestito con i componenti necessari alla formazione dei complessi stessi. Tipicamente per tale scopo si può avere una preparazione dei complessi in due passaggi che prevede l’utilizzo in sequenza di una prima fiala contenente un donatore del gruppo azoturo, un agente riducente, uno stabilizzante ed un regolatore di pH e di una seconda fiala contenente i due differenti leganti, un composto difosfinoamminico e un composto ditiocarbammico aliciclico DTC-L, sciolti in opportuno solvente.

Il pertecnetato eluito da opportuno generatore à ̈ aggiunto alla prima fiala. Una soluzione fisiologica à ̈ aggiunta alla seconda fiala per discioglierne il contenuto e un opportuno quantitativo di quest’ultima à ̈ aggiunto alla prima fiala. Il prodotto finale à ̈ ottenuto a seguito di riscaldamento a 80-100°C.

Alternativamente tutti componenti possono essere allestiti in unica fiala, alla quale à ̈ aggiunto il pertecnetato (Na<99m>TcO4) eluito da opportuno generatore. Il prodotto finale à ̈ ottenuto a seguito di riscaldamento a 80-100°C.

Il donatore del gruppo azoturo à ̈ un componente essenziale nella formazione dell’azoturo complesso di<99m>Tc: acido ditiocarbazico e suoi derivati, idrazina e suoi derivati sono usati allo scopo.

Come agente riducente sono usati cloruro stannoso, sali idrogenosolfiti, sali boroidruri, ammine terziarie alifatiche e aromatiche e loro derivati, ed in particolare cloruro stannoso, sodio idrogeno solfito, sodio boro idruro, fosfine terziarie alifatiche e tris (m-solfonato fenil)fosfine.

Come stabilizzante sono preferibili l’acido etilendiammino tetraacetico (EDTA) o l’acido etilentriammino pentaacetico (DTPA).

Come regolatori di pH sono preferibili tamponi fosfato, tamponi carbonato e idrossido di sodio.

A seconda dei casi può essere aggiunto un promotore di solubilità o un tensioattivo con lo scopo di facilitare la cinetica di reazione e migliorare la solubilità e biodisponibilità del complesso finale.

Il contenuto delle suddette fiale può essere mantenuto in soluzione o in forma di liofilizzato facilitandone la conservazione e l’uso.

I complessi azoturo dissimetrici di<99m>Tc secondo l’invenzione ed ottenuti in seguito alla coordinazione di questi due diversi leganti bidentati PNP e DTC-L con lo stesso centro metallico sono caratterizzati da un’elevata stabilità in vitro ed in vivo e si sono dimostrati in grado di adempiere agli scopi della presente invenzione e di possedere caratteristiche di biodistribuzione e captazione subcellulare migliori di complessi del<99m>Tc noti ed in uso clinico.

Infatti, questi complessi hanno dimostrato un profilo farmacocinetico nei diversi organi attraverso meccanismi di uptake di distribuzione subcellulare e di farmacocinetica del tutto simili, se non superiori, a quelli di degli altri complessi monocationici quali i complessi con DTC = pirrolidinditiocarbammato, piperidinditiocarbammato o 4-etil-piperazinditiocarbammato e PNP= difosfinoammine citati nella domanda di brevetto WO2007/083395,<99m>Tc(N)DBODC(PNP5) descritto nella domanda di brevetto WO02/09771, [<99m>Tc]-Sestamibi, e [<99m>Tc]-Tetrofosmin.

Inoltre, i complessi secondo l’invenzione sono captati anche da cellule tumorali con percentuali di accumulo decisamente superiori rispetto a quelle presentate dai complessi di riferimento, per i quali questa captazione à ̈ nota (i.e. [<99m>Tc]-Sestamibi, con ciò dimostrando che effettivamente possono essere impiegabili nell’imaging di tessuti tumorali e nella valutazione dell’espressione e della funzionalità delle MDR-Pgp.

Questi aspetti supportano quindi la possibilità di estendere l’applicabilità diagnostica di questi nuovi complessi e di altri loro derivati dal campo cardiologico a quello oncologico nella visualizzazione e monitoraggio di forme neoplastiche caratterizzate da una elevata densità mitocondriale, nonché nello studio della farmaco resistenza mediata e non da Pgps.

Dal punto di vista clinico infatti, la valutazione in vivo dell’espressione e della funzionalità delle MDR-Pgp, permette di: selezionare pazienti che possono beneficiare di trattamenti terapeutici (es. con chemioterapici); distinguere se la farmaco resistenza che si à ̈ instaurata à ̈ mediata da Pgp oppure no e quindi selezionare pazienti che possono beneficiare del trattamento con inibitori delle Pgp. Inoltre, misure funzionali che definiscono lo stato di MDR-Pgp mediante l’applicazione di tecniche non invasive quali possono essere la SPECT rappresentano un maggior vantaggio rispetto alle tecniche di valutazione convenzionali in vitro che necessitano di prelievi bioptici.

Infatti, i risultati degli studi di biodistribuzione dimostrano che l’incorporazione dei leganti ditiocarbammati aliciclici, come definiti dai significati della formula generale (I), nella struttura del frammento molecolare [Tc(N)(PNP)]<2+>permette di aumentare l’accumulo cardiaco a tempi brevi dalla somministrazione di questa nuova classe di complessi, rendendoli particolarmente adatti allo sviluppo di agenti diagnostici con caratteristiche superiori rispetto a quelli attualmente in commercio, come pure tale incorporazione risulta particolarmente significativa nella captazione in cellule tumorali di questi complessi. La loro preferenziale captazione a livello subcellulare nei mitocondri li rende quindi anche particolarmente utili a scopi diagnostici nel settore oncologico, dove possono essere impiegati nella valutazione di una eventuale farmaco resistenza mediata dalle MDR-Pgp e quindi per selezionare pazienti che possono beneficiare del trattamento con inibitori delle Pgp.

Pertanto per gli scopi dell’invenzione, gli azoturo complessi secondo l’invenzione possono essere formulati in radiofarmaci da utilizzare a scopo diagnostico, combinando in ambiente asettico gli opportuni reagenti (quali donatori del gruppo azoturo, riducenti, stabilizzanti, chelanti) con additivi accettabili per uso farmaceutico, quali ad esempio: stabilizzanti come acido ascorbico e paraaminobenzoati; correttori di pH, quali tamponi carbonato e fosfato; solubilizzanti, quali ciclodestrine e meglumine; e eccipienti come D-mannitolo. Inoltre tali radiofarmaci possono essere allestiti in forma di kit da ricostituire al momento dell’uso mediante l’aggiunta ai leganti selezionati di una soluzione fresca di sodio pertecnetato (Na<99m>TcO4) eluito da opportuno generatore.

I complessi del tecnezio-99m di formula generale (I) oggetto dell’invenzione possono essere usati come radiofarmaci somministrabili per vie parenterali convenzionali, quali l’endovenosa al dosaggio determinabile da livelli di radioattività necessari all’acquisizione dell’immagine mediante opportuna strumentazione e da parametri riconducibili alle caratteristiche del paziente quali: età, peso corporeo, sesso, patologia secondo quanto noto ad un tecnico del ramo. Quando un radiofarmaco contenente<99m>Tc à ̈ somministrato per uso umano il suo dosaggio à ̈ compreso tra 37 e 1850 MBq, preferibilmente 185-740 MBq esprimente la radioattività di<99m>Tc.

La presente invenzione à ̈ di seguito illustrata attraverso alcuni dettagliati esempi, ma non limitata agli specifici esempi, e da studi di biodistribuzione e di captazione subcellulare in linee cellulari tumorali umane.

Parte sperimentale

Reagenti Chimici, i metodi analitici utilizzati e loro abbreviazioni sono qui sotto riportati. I complessi con DTC-L = pirrolidinditiocarbamato, piperidinditiocarbamato, 4-N-etil piperazin ditiocarbamato sono stati preparati allo scopo di confronto con il complessi azoturo di formula generale (I) oggetto dell’invenzione.

Composti amminodifosfinici (PNPx, x = 3, 5, 7, 10)

PNP3 abbreviato come (3) = bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina;

PNP5 abbreviato come (5) = bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina;

PNP7 abbreviato come (7) = bis(dimetossietilfosfinoetil)etossietilamina;

PNP10 abbreviato come (10) = bis(dimetossietilfosfinoetil)metossietilamina Sono di stati sintetizzati seguendo la procedura citata nella domanda di brevetto WO2007/083395.

Leganti ditiocarbammici (DTC-Ln, n = 1-5, 17, 21-24):

DTC-L1 = pirrolidineditiocarbamato;

DTC-L2 = piperidinditiocarbamato;

DTC-L3 = morfolin ditiocarbamato;

DTC-L4 = 4 N etil piperazin ditiocarbamato;

DTC-L5 = 4 N (2metossi fenil) piperazin ditiocarbamato;

DTC-L17 = 1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbamato.

DTC-L21 = tiomorfolin ditiocarbammato,

DTC-L22 = azepina ditiocarbammato,

DTC-L23 = azocane ditiocarbammato,

DTC-L24 = 1-metil-[1,4]diazepan ditiocarbammato.

In dettaglio, in un pallone a due colli immerso in un bagno ad acqua opportunamente raffreddato, a 1.6 moli di ammina ciclica sospesi in 10 mL di acqua distillata sono lentamente aggiunti 1.6 mmoli (1.5 mL) di una soluzione acquosa di NaOH seguiti da 1.6 mmoli di disolfuro di carbonio (100 µL, 4 x 25µL) goccia a goccia.

La miscela di reazione à ̈ quindi lasciata agitare temperatura ambiente per 1 h. Si osserva la formazione di una soluzione giallo-arancio. Il solvente à ̈ rimosso e il risultante residuo solido grezzo ricristallizzato da etanolo ed etere. Si ottengono dei cristalli bianchi del ditiocarbammato corrispondente.

DTC-L1 à ̈ di provenienza commerciale ed à ̈ stato acquistato da Sigma-Aldrich. DTC-L2 piperidinditiocarbamato. Resa = 41%. Anal. calcolata per C6H10NNaS2(PM 183.27): C 39.32, H 5.50, N 7.64, S 34.99.Trovato: C 40.97, H 6.01, N 7.56, S 35.24. IR (KBr cm<-1>) 2930 (-CH2); 2852 ( -CH2); 1449 ( CH2); 1409 (C-N); 1218 (C=S).<1>H NMR (D2O) Î ́: 4.19-4.15 (t, 4H, J=5.3 Hz -CH2CH2CH2N-), 1.72-1.65 (m, 4H, -CH2CH2CH2N-), 1.58-1.64 (m, 2H, -CH2CH2CH2N-).<13>C NMR (D2O) Î ́: 202.2 (C=S), 52.6 (CH2CH2CH2N-), 25.2 (-CH2CH2CH2N-), 21.9 (CH2CH2CH2N-).

DTC-L3 morfolin ditiocarbamato. Resa = 48%. Anal. Calcolato per C5H8NNaOS2(PM 185.25): C 32.42, H 4.35, N 7.56, O 8.64, S 34.62.Trovato: C 31.97, H 4.58, N 7.06, O 8.94, S 35.24. IR (KBr cm<-1>) 2930 (-CH2); 1418 (C-N); 1219 ( C=S).<1>H NMR (D2O) Î ́: 4.24 (m, 4H, -OCH2CH2N-), 3.62 (m, 4H, -OCH2CH2N-).<13>C NMR (D2O) Î ́: 212.0 (C=S), 68.91 (-OCH2CH2N-), 54.15 (-OCH2CH2N-).

DTC-L4 4-N-etil piperazin ditiocarbamato. Resa = 60%. Anal. calcolato per C7H13N2NaS2(PM 212.04): C 39.60, H 6.17, N 13.19, S 30.21. Trovato: C 40.97, H 7.58, N 13.86, S 30.54. IR (KBr cm<-1>) 2969(-CH3); 2818 ( -CH2); 1415 ( C-N); 1227 (C=S).<1>H NMR (D2O) Î ́: 4.32-4.16 (m, b, 4H, CH2CH2N(CS2)), 2.52 (m, b,4H (CH3CH2)NCH2CH2N-), 2.47-2.39 (q, b,2H, J=7.3 Hz CH3CH2N<), 1.05-0.98 (t, 3H, CH3CH2N<).<13>C NMR (D2O) Î ́: 202,10 (C=S), 50,91 ((CH3CH2)NCH2CH2), 50.75 (CH3CH2N<), 49.81 (-CH2CH2N(CS2)), 10.00 (CH3CH2N<).

DTC-L5 4-N-(2metossi fenil) piperazin ditiocarbamato. Resa =76%. Anal. Calcolato per C12H15N2NaOS2(PM 290.05): C 49.63, H 5.21, N 9.65, O 5.51, S 22.08. Trovato: C 50.97, H 5.99, N 9.89, O 5.94, S 23.24. IR (KBr cm<-1>) 1464 (F, C-N); 1236 (F, C=S).<1>H NMR (D2O) Î ́: 7.01-6.96 (m, 4H, Ar), 4.37 (m, 4H, CH2CH2N(CS2)), 3.74 (s, 3H, OCH3), 2.95 (m, 4H, CH2CH2N-Ar).<13>C NMR (D2O) Î ́: 214,10 (C=S), 155.21, 143.42 (2C, -Ar) 125.35-115.53 ( 4C, -Ar), 62.03 (2C, CH2CH2N(CS2)), 57.95 (- OCH3), 53.21 (-CH2CH2N-Ar).

DTC-L17 1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbammato. Resa = 69%.

<1>H-NMR (D2O): Î ́ (ppm): 4.40 (m, 4H, -CH2NCH2-); 4.07 (s, 4H, -OCH2CH2O-);

1.84 (m, 4H, -CH2NCH2-).<13>C-NMR (D2O): Î ́ (ppm): 208.66 (s, S2CN); 107.50 (s, CO2); 64.47 (s, -OC-CO-); 49.413 (s, -C-N-C-); 34.09 (s, -C-C-C-).

DTC-L21 tiomorfolin ditiocarbammato. Resa 60%.

<1>H-NMR,(D2O): Î ́(ppm) = 4.6 (m, 4H, -CH2NCH2-); 2.7 (m, 4H, -CH2SCH2-).<13>C-NMR,(D2O): Î ́(ppm) = 209.09 (s, (S2)CN); 54.13 (s, H2C-N-CH2); 27.07 (s, -CH2-S-CH2-).

DTC-L22 azepina ditiocarbammato. Resa 62%.

<1>H-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 4.15 (t, 4H, -CH2-N-CH2-); 1.8 (m, 4H, -N-CH2CH2-CH2CH2-CH2CH2-N-); 1.55 (m, 4H -N-CH2CH2-CH2CH2-CH2CH2-N-).<13>C-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 206.68 (s, (S2)CN); 55.75 (s, H2C-N-CH2); 26.81 (s, -N-CH2CH2-CH2CH2-CH2CH2-N-); 26.359 (s, -N-CH2CH2-CH2CH2-CH2CH2-N-).

DTC-L23 azocane ditiocarbammato. Resa 63%.

<1>H-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 4.10 (t, 4H, -CH2-N-CH2-); 1.85 (m, 4H, -CH2-CH2-N-CH2CH2-); 1.5 (m, 6H).<13>C-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 207.08 (s, (S2)CN); 56.34 (s, H2C-N-CH2); 26.82 (s, -N-CH2CH2CH2CH2-); 26.25 (s, 2C -N-CH2CH2CH2CH2-); 25.09 (s, 2C, -N-CH2CH2CH2CH2-).

DTC-L24 1-metil-[1,4]diazepan ditiocarbammato. Resa 54%.

<1>H-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 2.05 (m, 2H, -N-CH2CH2CH2-N(CH3)-); 2.45 (s, 3H, -CH3); 2.75 (m, 2H, (S2)CN-CH2CH2-N(CH3)-); 2.9 (m, 2H, (S2)CN-CH2CH2-N(CH3)-); 4.2 (m, 2H, -N-CH2CH2CH2-N(CH3)-); 4.35 (m, 2H, -N-CH2CH2CH2-N(CH3)-).<13>C-NMR, (D2O): Î ́(ppm) = 209.16 (s, S2CN-); 45.00 (s, -CH3); 25.73 (s, -N-CH2CH2CH2-N(CH3)-); 52.91 (s, -N-CH2CH2CH2-N(CH3)-); 53.68 (s, (S2)CN-CH2CH2-N(CH3)-); 55.89 (s, (S2)CN-CH2CH2-N(CH3)-); 56.20 (s, (S2)CN-CH2CH2-N(CH3)-).

Preparazione dei Complessi Dissimetrici [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>(x=3,5,7,10) (n =1-5, 17, 21-24).

Complessi dissimmetrici del tipo [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>sono ottenuti in alta resa (90-98%) attraverso le procedure sintetiche di sotto riportate; in tutti i casi, il pH, misurato alla fine della reazione, à ̈ nell’intervallo 6.5-7.5. Le rese radiochimiche (RCY) dei prodotti ottenuti attraverso le diverse procedure sintetiche

sono comprese tra 90-98%.

Metodo A: In una vial contenente 5.0 mg di succinil diidrazide (SDH), 5 mg di

acido etilendiamminico tetraacetico (EDTA), 0.10 mg SnCl2sospesi in 0.10 ml di soluzione salina e 1.0 ml di alcool etilico (EtOH) sono aggiunti 0.250 ml di [Na

<99m>TcO4] (50.0 MBq−3.0 GBq) . La miscela à ̈ incubata a temperatura ambiente per 15 min. Successivamente, alla soluzione contenente la miscela di [<99m>Tc≡N]mix<2+>intermedi, sono aggiunti 1.0 mg del legante difosfinoaminico PNPx disciolto 0.10 ml in EtOH. La soluzione à ̈ mantenuta a temperatura ambiente per 30 min. Infine, alla miscela di reazione sono aggiunti 2 mg di legante ditiocarbammico DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. In tutti i casi, la purezza radiochimica del complesso finale valutata, dopo 30 min a 80 °C, per via cromatografica TLC e HPLC à ̈ sempre superiore al 90%.

Metodo B: alla miscela di [<99m>Tc≡N]mix<2+>preparata come sopra indicato, sono aggiunti 2 mg di DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. La soluzione à ̈ incubata a temperatura ambiente per 30 min. La miscela di reazione à ̈ infine trattata con 1.0 mg di un legante PNPx disciolto in 0.10 ml di EtOH e riscaldata a 80 °C per 30 min. I prodotti ottenuti presentano lo stesso profilo cromatografico di quelli preparati con il metodo A. In questo caso, la RCY del complesso finale à ̈ compresa tra 85-90%.

Metodo C: alla miscela di [<99m>Tc≡N]mix<2+>, preparata come sopra, sono contemporaneamente aggiunti 1.0 mg di PNPx sciolti in 0.10 ml di EtOH e 2 mg di DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. RCY, determinata dopo 30 min a 80°C mediante TLC e HPLC, à ̈ sempre superiore al 95%.

Metodo D: In una vial contenente 5.0 mg di succinil diidrazide (SDH), 5 mg di acido etilendiamminico tetraacetico (EDTA), 0.10 mg SnCl2sospesi in 0.10 ml di soluzione salina, 1.0 mg del legante amminodifosfinico PNPx disciolto 0.10 ml in EtOH e 1.0 ml di EtOH sono aggiunti 0.250 ml di Na [<99m>TcO4] (50.0 MBq−3.0 GBq). La miscela à ̈ incubata a temperatura ambiente per 15 min. Successivamente, alla soluzione contenente la miscela di [<99m>Tc(N)(PNPx)]<2+>intermedi, sono aggiunti 2 mg di legante DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. In tutti i casi, la purezza radiochimica del complesso finale valutata, dopo 30 min a 80 °C, per via cromatografica TLC e HPLC à ̈ sempre superiore al 90%. Metodo E: In una vial contenente 5.0 mg di succinil diidrazide (SDH), 5 mg di acido etilendiamminico tetraacetico (EDTA), 0.10 mg SnCl2sospesi in 0.10 ml di soluzione salina, e 1.0 ml di EtOH sono aggiunti 0.250 ml di Na [<99m>TcO4] (50.0 MBq−3.0 GBq), 1.0 mg del legante amminodifosfinico PNPx disciolto 0.10 ml in EtOH e 2 mg di legante DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. In tutti i casi, la purezza radiochimica del complesso finale valutata, dopo 30 min a 80 °C, per via cromatografica TLC e HPLC à ̈ sempre superiore al 90%.

Metodo F: In una vial contenente 5.0 mg di succinil diidrazide (SDH), 5 mg di acido etilendiamminico tetraacetico (EDTA) e 0.10 mg SnCl2sospesi in 0.10 ml di soluzione salina, sono aggiunti 1-2 ml di Na [<99m>TcO4] (50.0 MBq−3.0 GBq), 1.0 mg del legante amminodifosfinico PNPx disciolto 0.5 ml di una soluzione salina contenente 2 mg/ mL di γ-ciclodestrina e 2 mg di legante DTC-Ln sciolti in 0.20 ml di soluzione salina. In tutti i casi, la purezza radiochimica del complesso finale valutata, dopo 30 min a 80 °C, per via cromatografica TLC e HPLC à ̈ sempre superiore al 90%.

Analisi cromatografiche:

Complessi dissimmetrici del tipo [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>preparati con i leganti sopra indicati e come di seguito descritto sono stati analizzati per via cromatografica TLC (Thin-layer chromatography) e HPLC (high performance liquid chromatography) .

Le analisi TLC sono state condotte utilizzando come fase fissa C18 F254S(Merck, Milano, Italia) e come fase mobile un miscela salina/alcool metilico (MeOH)/tetraidrofurano (THF)/acido acetico (HAc)(g)(2/8/1/1) o alternativamente lastre SiO2F254(Merck, Milano, Italia) e una miscela di alcool etilico (EtOH)/CHCl3/toluene (Tol)/NH4Ac 0.5 M (5/3/3/1). L’attività sulle lastre à ̈ rivelata e misurata utilizzando uno scanner Cyclone<ï£ ̈>Instrument equipaggiato con schermi phosphorus imaging e software di analisi OptiQuant image (Packard, Meridian, CT).

Le analisi HPLC sono state invece condotte utilizzando uno strumento Beckman System Gold equipaggiato con un sistema di pompe Model 126, valvola di iniezione 210A, detector UV Module 166, e detector radioattivo Model B-FC-3200 Bioscan. Loop da 100 µL. Le analisi sono condotte utilizzando una precolonna a fase inversa Beckman ODS (5 µm, 4.6 × 45 mm), e una colonna a fase inversa Beckman ODS (5 µm, 4.6 x 250 mm).

Purificazione dei Complessi [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>(x=3,5,7,10) (n = 1-5, 17, 21-24)

Prima di iniziare gli studi in vitro ed in vivo allo scopo di eliminare l’influenza di eventuali impurezze i complessi sono purificati come segue:

Metodo A. Una cartuccia SEP PAK C-18 (Waters) à ̈ condizionata con alcool etilico (EtOH) e H2O deionizzata. La miscela di reazione contenente il radio-complesso [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>à ̈ diluita con acqua deionizzata e caricata sulla SEP PAK C-18, (circa il 90% dell’attività iniziale viene trattenuta dalla resina). La colonna à ̈ quindi lavata in successione con H2O ed EtOH 35%.

Il complesso (per il 90% dell’attività caricata) à ̈ eluito con 1 ml di una miscela 9/1 di EtOH/soluzione salina. Dopo purificazione, la purezza radiochimica (RCP) dei complessi à ̈ >95%.

Metodo B. Una cartuccia contenente una resina a scambio cationico SEP PAK CM (Waters) à ̈ condizionata con H2O deionizzata. La miscela di reazione contenente il radio-complesso [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>à ̈ diluita acqua deionizzata e caricata sulla SEP PAK CM, (60-90% dell’attività iniziale viene trattenuta dalla resina). La colonna à ̈ quindi lavata in successione con H2O ed EtOH. Il complesso (per il 90% dell’attività caricata) à ̈ eluito con una miscela di EtOH/soluzione salina (9/1). Dopo purificazione, la RCP dei radio-complessi à ̈ >95%.

Metodo C: Prevede l’utilizzo in serie del metodo A e B sopra descritti.

Misure del Logk’0.

La valutazione delle caratteristiche lipofile dei radio-complessi à ̈ stata eseguita attraverso la determinazione cromatografica HPLC del corrispondente valore di Log K’0.

Logk'0(il valore di Log K’ allo 0% di solvente organico) à ̈ estrapolato da Logk', dove k' à ̈ il fattore di capacità che misura la partizione del composto tra una fase stazionaria non polare e una fase mobile polare. I valori di Logk' sono determinati utilizzando un HPLC, equipaggiato con precolonna C18 Beckman ODS, (5 µm, 4.6 x 45 mm) e colonna C18 Beckman ODS, (5 µm, 4.6 x 250 mm). Fase mobile composizioni diverse di una miscela di tampone fosfato H2PO4<->/ HPO4<2->0.02 M, pH 7.4 e alcool metilico (MeOH). Flusso 1 mL/min. Per ciascun composto à ̈ necessaria la misurazione di almeno tre valori di tempo di ritenzione ottenuti a tre differenti concentrazioni di metanolo nella fase mobile.

Logk'0Ã ̈ estrapolato dalla parte lineare della curva

Log k' = a bC

dove C Ã ̈ la concentrazione del solvente organico e Log k' Ã ̈ il Log[(tr-t0)/t0] [trtempo di ritenzione dei composti (min) e t0tempo morto che corrispondente al tempo di ritenzione del pertecnetato Na<99m>TcO4(2.77 min.)].

I risultati sono riportati in Tabella 1.

Per confronto il valore di Logk'0dei complessi noti [<99m>TcN(DTCL1)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(5)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(10)]<+>, [<99m>TcN(DTCL4)(3)]<+>,<99m>Tc(N)- DBODC(3/5) (gold standard della serie, descritto nella domanda di brevetto WO02/09771) e dei complessi noti e già impiegati in clinica [<99m>Tc]-MIBI sono ottenuti nelle stesse condizioni.

Tabella 1

TLC TLC HPLC %

<99m>Tc-Complessi RFRFRT%RCY Log k0’ legato a C18 SiO2(min) proteine [<99m>TcN(DTCL3)(3)]<+>0.65 0.41 7.89 95 2.29

[<99m>TcN(DTCL5)(3)]<+>0.41 0.57 17.33 95 3.47

<0.30 95 2.40 0.20>

[<99m>TcN(DTCL17)(3)]<+>0.20 11.40

± 0.03<95 2.92 2.67>

[<99m>TcN(DTCL17)(5)]<+>12.45

± 0.13<0.53 71 2.11 1.67>

[<99m>TcN(DTCL17)(7)]<+>0.46 12.66

± 0.12

[<99m>TcN(DTCL17)(10)]<+>0.46 0.53 10.88 72 2.11

[<99m>TcN(DTCL21)(5)]<+>0.50 0.50 94.7

[<99m>TcN(DTCL22)(5)]<+>0.40 0.60 88.6

[<99m>TcN(DTCL23)(5)]<+>0.30 0.5 88.6

[<99m>TcN(DTCL24)(5)]<+>0.20 0.1 95.6

[<99m>TcN(DTCL1)(3)]<+>11.24 95 2.51

[<99m>TcN(DTCL2)(3)]<+>0.52<0.54>

11.73<95 3.09 2.13>

± 0.03 [<99m>TcN(DTCL2)(5)]<+>14.82 92 3.20 1.64

[<99m>TcN(DTCL2)(10)]<+>0.44 0.62 11.87 75 2.25

[<99m>TcN(DTCL4)(3)]<+>0.31 0.44 10.93 94 2.71

[<99m>TcN(DBODC)(3)]<+>0.43 16.06; 95 3.35<0.53>± 0.04 3 3.68 1.10 [<99m>TcN(DBODC)(5)]<+>9

18.13

± 0.09 [<99m>Tc(MIBI)]<+>9.15 3.22

Studi di Stabilità

La stabilità in vitro dei radiocomplessi (definita come variazione della purezza radiochimica, RCP, degli stessi in funzione del tempo) à ̈ determinata attraverso studi di transchelazione nei confronti di cisteina o glutatione (A) e studi di biotrasformazione serica ed epatica (B).

(A). Studi di transchelazione con L-cisteina e glutatione dei radio-complessi sono effettuati incubando, a 37°C per 24 h, 100 µl della soluzione del radio-composto purificato (vide supra) con una miscela di tampone fosfato 0.2 M, pH 7.4 (250 µl), H2O (100 µl) e 50 µl di L-cisteina solubilizzata in H2O a diverse concentrazioni (10 mM, 1 mM). Come controllo un ugual volume di acqua à ̈ aggiunto in sostituzione della soluzione di L-cisteina.

Gli studi di transchelazione nei confronti del glutatione sono condotti applicando un protocollo analogo utilizzando 50 µl di soluzione acquosa di glutatione (10 mM). In entrambi i casi RCP dei prodotti à ̈ valutata per via cromatografia (TLC e HPLC) a 15 minuti, 1, 2 e 24 ore.

(B). Studi di biotrasformazione dei radio-complessi sono effettuati incubando, a 37°C per 24 h, 100 µl della soluzione del complesso purificato (vide supra) con 900 µl dei seguenti media: a) soluzione fisiologica; b) tampone fosfato 0.2 M, pH 7.4; c) omogenato di fegato di ratto; d) siero di ratto; e) siero umano.

A tempi stabiliti (15 minuti, 1, 2, 3 e 24 h) si prelevano delle aliquote (50 µL) e si diluiscono con tampone fosfato (950 µL, 0.02 M, pH=7.4). Le preparazioni a), b), d) ed e) (100 µL), opportunamente diluite con 900 µL di tampone fosfato (0.02 M, pH 7.4), sono analizzate direttamente via HPLC. Condizioni di eluizione: precolonna Waters Symmetry 300 C4 (5 µm, 3.9 x 20 mm) e una colonna Waters Symmetry 300 C4 (5 µm, 4.6 x 150 mm), eluite con solvente A=H2O (con 0.1% v/v di acido trifluoroacetico, pH 3) e solvente B=MeCN (con 0.1 % v/v di acido trifluoroacetico), con un flusso di 1 ml/min. Metodo: 0-2 min, B=15 % v/v; 2-20 min, B=65% v/v; 20-22 min, B=15% v/v; 22-25 min, B=15% v/v).

Il campione c) deve essere purificato, prima dell’analisi HPLC, tramite cartucce di estrazione OASIS HLB. Viene caricato su colonna, precedentemente lavata con 1 mL di alcool metilico (MeOH) e condizionata con 1 mL di H2O, lavato con 3 mL di MeOH al 5% v/v ed eluito in un’unica frazione con 1 mL di miscela di EtOH/soluzione acquosa di NaCl 0.9% 90/10 v/v. Ogni singola frazione, compreso il filtro, viene contata in contatore gamma. Il 90% dell’attività iniziale viene raccolto nella frazione di eluizione che viene analizzata mediante TLC e HPLC (100 µL). La stabilità dei complessi à ̈ valutata via TLC, sia direttamente sui campioni incubati che sulla frazione purificata, senza sostanziali modifiche di resa in termini di RCP. I complessi studiati sono stati i complessi riportati in tab. 1 da [<99m>TcN(DTCL3)(3)]<+>a [<99m>TcN(DTCL24)(5)]<+>e si sono dimostrati stabili.

Studi di Biodistribuzione.

Studi di biodistribuzione sono stati eseguiti sui prodotti purificati ed opportunamente diluiti con una soluzione fisiologica, in modo da ottenere una concentrazione di EtOH inferiore al 5% v/v idonea all’iniezione in vivo.

Ratti femmine del tipo Sprague-Dawley del peso di 180-200 g sono state anestetizzate con una miscela di Zoletil (40 mg/kg) e Xilazina (2 mg/kg) somministrata per via intraperitoneale.

0.1 ml (contenenti 10 µCi) della soluzione contenente il complesso marcato e purificato sono stati iniettati attraverso la vena giugulare.

Gruppi di animali (n=3) sono stati sacrificati a tempi diversi. Immediatamente, dopo il sacrificio, sono stati prelevati un campione di sangue e di urine e gli organi di interesse. I campioni di tessuti, lavati e pesati sono stati misurati in un contatore gamma.

Come riferimento dell’attività realmente iniettata si conta l’attività di quattro soluzioni preparate al momento dell’iniezione. I valori, espressi come percentuale di attività iniettata per grammo di tessuto (%dose/g) sono ottenuti dall’applicazione della formula seguente, nella quale si tiene conto della dose realmente iniettata:

(cpm organo) 1%dose/g = • •100 (cpmattivita' realmente iniettata) (g del campione)

I risultati ottenuti per i nuovi eterocomplessi secondo l’invenzione in confronto con complessi del Tc noti [<99m>TcN(DTCL1)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(5)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(10)]<+>, [<99m>TcN(DTCL4)(3)]<+>,<99m>Tc(N)-DBODC(3/5) e dei traccianti tecneziati attualmente in uso clinico<99m>Tc-Sestamibi (Cardiolite<®>) e<99m>Tc-tetrofosmin (Myoview<®>) sono mostrati nelle Tabelle 2-5.

Tabella 2

<99m>Tc- organi 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min complessi

Sangue 0.22 0.06 0.02 0.01 0.00 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 Cuore 1.89 2.38 2.33 2.34 2.40 ± 0.41 ± 0.04 ± 0.05 ± 0.40 ± 0.08 Polmoni 1.06 0.87 0.72 0.61 0.10 ± 0.18 ± 0.05 ± 0.02 ± 0.02 ± 0.06 Fegato 4.89 4.51 1.13 0.66 0.35 ±3.29 ±0.08 ± 0.07 ± 0.03 ± 0.07

[<99m>Tc(N)(DTC- Milza 0.53 0.50 0.28 0.03 0.14 L3)(3)]<+>± 0.13 ± 0.03 ± 0.04 ± 0.01 ± 0.01

Reni 4.85 5.34 3.89 3.18 2.50 ±0.84 ±0.23 ±0.08 ±0.26 ±0.23 Intestino 5.58 2.60 12.35 2.79 15.97

±2.26 ±0.38 ±2.12 ±0.13 ±11.12 Muscolo 0.32 0.26 0.31 0.59 0.42 ±0.10 ±0.02 ±0.01 ±0.18 ±0.04 Urine 79.30 42.42 39.84 15.71

±13.64 ±14.12 ±4.15 Sangue 0.35 0.07 0.05 0.03 0.03

± 0.00 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.01 Cuore 1.74 2.09 2.43 3.07 2.49

± 0.06 ± 0.05 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.10 Polmoni 1.37 0.86 0.90 1.01 1.17

± 0.43 ± 0.09 ± 0.09 ± 0.11 ± 0.31 Fegato 5.21 2.13 1.09 1.62 1.43

± 1.14 ± 0.08 ± 0.10 ± 0.49 ± 0.11

[<99m>Tc(N)(DTC- Milza 1.48 1.20 1.13 2.77 2.52 L5)(3)]<+>± 0.07 ± 0.03 ± 0.10 ± 0.07 ± 0.62

Reni 12.60 10.81 11.71 11.27 10.98

± 2.50 ± 1.36 ± 0.25 ± 0.60 ± 0.36 Intestino 10.43 16.74 11.34 15.27 41.30

± 0.79 ± 1.61 ± 0.64 ± 0.10 ± 6.67 Muscolo 0.15 0.21 0.17 0.37 0.37

± 0.01 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.14 ± 0.11 Urine 14.51 23.49 18.33 12.46

± 0.79 ± 5.64 ± 2.29

Tabella 3

<99m>Tc- Organi 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min complessi

[<99m>Tc(N)(DTC- Sangue 0.24 0.05 0.02 0.01 0.01 L17)(3)]<+>± 0.02 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00

Cuore 3.78 3.73 4.00 3.62 3.58

± 0.31 ± 0.30 ± 0.21 ± 0.10 ± 0.16 Polmoni 1.93 1.10 1.22 0.97 0.97

± 0.07 ± 0.10 ± 0.15 ± 0.07 ± 0.01 Fegato 1.85 0.43 0.24 0.13 0.08

± 0.02 ± 0.07 ± 0.06 ± 0.01 ± 0.00 Milza 1.65 1.33 0.86 0.49 0.31

± 0.07 ± 0.14 ± 0.09 ± 0.03 ± 0.04 Reni 12.21 6.61 5.51 5.17 3.46

± 0.73 ± 0.88 ± 0.26 ± 0.88 ± 0.17 Intestino 2.44 4.89 6.29 8.28 5.44

± 0.09 ± 1.23 ± 0.18 ± 0.66 ± 1.70 Muscolo 0.44 0.63 0.60 0.41 0.40

± 0.02 ± 0.01 ± 0.03 ± 0.01 ± 0.02 Urine 8.71 67.97 47.41 35.10 26.2

± 1.13 ± 2.80 ± 7.65 ± 7.61 ± 5.12

Sangue 0.36 0.02 0.01

± 0.18 ± 0.00 ± 0.00 Cuore 5.21 4.50 3.79

± 0.61 ± 0.39 ± 0.60 Polmoni 1.12 1.17 0.85

± 0.55 ± 0.05 ± 0.08 Fegato 1.16 0.30 0.15

± 0.43 ± 0.01 ± 0.02 Milza 1.70 0.94 0.59

<99m>± 0.06 ± 0.04 ± 0.05

[ Tc(N)(DTC-Reni 12.03 8.43 5.47 L17)(5)]<+>

± 0.73 ± 1.10 ± 0.44 Intestino 5.27 16.59 14.45

± 1.09 ± 0.11 ± 1.78 Muscolo 0.35 0.39 0.37

± 0.22 ± 0.07 ± 0.04 Urine 9.50 36.67 29.90

± 3.84 ± 2.42 ± 7.40

Sangue 0.36 0.08 0.04

± 0.03 ± 0.00 ± 0.01 Cuore 3.91 4.76 4.58

± 0.41 ± 0.71 ± 0.08 Polmoni 1.48 1.23 1.10

± 0.14 ± 0.14 ± 0.15 Fegato 1.89 0.31 0.17

± 0.03 ± 0.08 ± 0.03

[<99m>Tc(N)(DTC- Milza 1.71 0.89 0.52 L17)(7)]<+>± 0.05 ± 0.03 ± 0.05

Reni 14.91 11.67 7.21

± 0.60 ± 0.03 ± 0.40 Intestino 12.13 13.95 9.51

± 4.09 ± 4.12 ± 0.81 Muscolo 0.30 0.43 0.45

± 0.04 ± 0.10 ± 0.21 Urine 52.01 35.93

± 10.17 ± 11.79

Sangue 0.69 0.17 0.07

± 0.20 ± 0.01 ± 0.01 Cuore 3.26 3.20 2.89

± 0.19 ± 0.22 ± 0.26

[<99m>Tc(N)(DTC- Polmoni 1.85 1.12 0.95 L17)(10)]<+>± 0.09 ± 0.05 ± 0.05

Fegato 2.41 1.18 1.09

± 0.47 ± 0.16 ± 0.15 Milza 1.75 0.91 0.50

± 0.06 ± 0.04 ± 0.05 Reni 13.09 5.30 4.11

± 2.05 ± 0.03 ± 0.30 Intestino 8.46 12.76 14.27

± 0.60 ± 0.49 ± 0.59 Muscolo 0.61 0.31 0.26

± 0.29 ± 0.01 ± 0.03

Urine 43.73

± 1.31

Tabella 4

<99m>Tc-complessi organi 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min Sangue 0.20 0.08 0.03 0.01 0.01

± 0.02 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 Cuore 3.36 3.27 3.53 3.02 4.00

± 0.15 ± 0.37 ± 0.59 ± 0.32 ± 0.51 Polmoni 1.62 0.82 0.99 1.06 0.91

± 0.36 ± 0.09 ± 0.26 ± 0.10 ± 0.00 Fegato 1.81 0.75 0.18 0.14 0.10

± 0.06 ± 0.18 ± 0.02 ± 0.03 ± 0.02 [<99m>Tc(N)(DTC- Milza 1.33 1.32 0.71 0.41 0.25 L1)(3)]<+>± 0.08 ± 0.22 ± 0.15 ± 0.06 ± 0.02

Reni 11.68 8.38 5.62 4.45 3.62

±1.21 ±0.47 ±1.07 ±0.27 ±0.34 Intestino 4.77 11.11 10.76 13.81 11.76

±0.25 ±0.21 ±4.71 ±1.14 ±4.46 Muscolo 0.35 0.42 0.53 0.44 0.43

±0.02 ±0.04 ±0.02 ±0.04 ±0.01 Urine 50.94 43.59 22.93 25.22

±0.83 ±1.66 ±1.05

[<99m>Tc(N)(DTC- Sangue 0.21 0.04 0.02 0.01 0.00 L2)(3)]<+>± 0.02 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 Cuore 3.49 4.16 3.40 3.67 3.67

± 0.36 ± 0.32 ± 0.13 ± 0.55 ± 0.30 Polmoni 1.06 0.87 0.97 1.04 0.79

± 0.08 ± 0.12 ± 0.15 ± 0.35 ± 0.05 Fegato 2.39 0.54 0.23 0.18 0.13

± 0.32 ± 0.09 ± 0.12 ± 0.05 ± 0.05 Milza 3.20 2.85 1.12 1.08 0.56

± 0.14 ± 0.30 ± 0.15 ± 0.23 ± 0.05 Reni 12.81 11.74 6.19 5.81 4.07

±0.29 ±0.15 ±0.66 ±0.28 ±0.11 Intestino 1.99 4.48 10.56 12.36 13.20

±0.11 ±0.21 ±0.80 ±1.10 ±0.71 Muscolo 0.19 0.21 0.28 0.29 0.25

±0.02 ±0.01 ±0.00 ±0.01 ±0.00 Urine 46.84 22.04 9.82 9.29

±0.58 ±1.19 ±0.73

Sangue 0.45 0.36 0.34 0.28 0.27

± 0.03 ± 0.06 ± 0.06 ± 0.01 ± 0.02 Cuore 3.45 3.49 3.67 3.10 3.64

± 0.25 ± 0.45 ± 0.11 ± 0.39 ± 0.13 Polmoni 1.70 1.40 1.33 1.04 1.18

± 0.04 ± 0.09 ± 0.04 ± 0.04 ± 0.02 [<99m>Tc(N)(DTC- Fegato 2.28 0.76 0.33 0.26 0.17 L2)(5)]<+>± 0.33 ± 0.04 ± 0.03 ± 0.02 ± 0.04

Milza 3.01 2.04 1.34 0.76 0.43

± 0.19 ± 0.06 ± 0.05 ± 0.01 ± 0.13 Reni 15.99 10.51 7.56 5.02 3.97

±0.39 ±0.79 ±0.17 ±0.83 ±0.41 Intestino 4.46 8.97 6.20 11.35 7.12

±0.89 ±1.44 ±2.26 ±1.10 ±2.45 Muscolo 0.53 0.53 0.64 0.54 0.51

±0.03 ±0.07 ±0.00 ±0.07 ±0.10 Urine 27.89 53.83 31.72 25.6

±5.00 ±3.40 ±6.28 ±6.37

Sangue 0.64 0.37 0.13 0.04 0.02

± 0.13 ± 0.06 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.01 Cuore 3.98 3.79 3.58 3.63 3.73

± 0.34 ± 0.44 ± 0.32 ± 0.46 ± 0.26 Polmoni 1.72 1.48 1.30 1.40 1.15

± 0.06 ± 0.09 ± 0.14 ± 0.27 ± 0.27 Fegato 3.21 2.76 0.98 0.99 0.69

± 0.32 ± 0.04 ± 0.01 ± 0.17 ± 0.17 [<99m>Tc(N)(DTC-Milza - - - - -L2)(10)]<+>

Reni 15.25 10.51 7.82 5.54 3.57

±2.77 ±0.59 ±0.30 ±0.77 ±0.40 Intestino 11.83 8.97 10.83 13.74 8.12

±1.56 ±1.44 ±1.75 ±4.88 ±1.45 Muscolo 0.31 0.34 0.37 0.23 0.16

±0.10 ±0.02 ±0.05 ±0.02 ±0.04 Urine 27.89 24.00 36.54 39.54

±5.00 ±0.05 ±3.90 ±5.90

Sangue 0.16 0.03 0.01 0.02 0.01

± 0.04 ± 0.02 ± 0.00 ± 0.00 ± 0.00 Cuore 3.15 2.93 3.06 3.25 2.79

± 0.31 ± 0.53 ± 0.26 ± 0.46 ± 0.59 Polmoni 1.16 1.06 077 1.01 1.03

± 0.03 ± 0.13 ± 0.03 ± 0.04 ± 0.19 [99mTc(N)(DTC- Fegato 0.79 0.64 0.24 0.21 0.13 L4)(3)]+ ± 0.02 ± 0.05 ± 0.05 ± 0.06 ± 0.03 Milza 0.79 0.59 0.43 0.43 0.29

± 0.02 ± 0.01 ± 0.05 ± 0.04 ± 0.03 Reni 7.54 5.41 5.25 4.85 3.79

±1.00 ±0.07 ±0.34 ±0.17 ±0.36 Intestino 2.01 7.66 5.07 8.68 27.86

±0.19 ±5.30 ±2.52 ±1.63 ±14.59 Muscolo 0.19 0.32 0.16 0.35 0.50

±0.03 ±0.06 ±0.02 ±0.05 ±0.09 Urine 46.84 22.04 9.82 9.29

± 0.58 ± 1.19 ± 0.73

Tabella 5

<99m>Tc-complessi organi 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min Sangue 0.13 0.03 0.02 0.02 0.01

± 0.004 ± 0.02 ± 0.00 ± 0.01 ± 0.00 Cuore 2.85 2.82 3.01 2.98 2.82

<99m>± 0.09 ± 0.05 ± 0.30 ± 0.04 ± 0.04 Tc(N)DBODC(3)

Polmoni 1.18 0.63 0.55 0.59 0.34

± 0.06 ± 0.04 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.02 Fegato 1.53 0.43 0.18 0.10 0.06

± 0.29 ± 0.12 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.01

Sangue 0.14 0.03 0.02 0.02 0.01

± 0.05 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.01 ± 0.00

<99m>Cuore 2.95 2.84 3.02 2.91 2.75 Tc(N)DBODC(5)

± 0.09 ± 0.05 ± 0.30 ± 0.04 ± 0.04 Polmoni 0.88 0.64 0.57 0.39 0.29

± 0.06 ± 0.05 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.02 Fegato 2.53 1.43 0.64 0.20 0.11

± 0.25 ± 0.12 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.01 Sangue 0.13 0.015

± 0.04 ± 0.00

<99m>Tc-Sestamibi Cuore 3.09 3.29

± 0.017 ± 0.39 Polmoni 1.71 0.45

± 0.09 ± 0.02 Fegato 3.03 1.28

± 0.29 ± 0.15

Sangue 0.14 0.03

± 0.02 ± 0.01

<99m>Tc-Tetrofosmin Cuore 2.69 2.73

± 0.21 ± 0.14 Polmoni 1.22 0.4

± 0.07 ± 0.01 Fegato 1.96 0.49

± 0.39 ± 0.03

Le tabelle 6 e 7 mostrano invece rispettivamente la variazione del accumulo cardiaco (% ID/g), i rapporti cuore/polmoni e cuore/fegato di complessi azoturo oggetto dell’invenzione in funzione del tempo in confronto con i complessi noti in precedenza citati [<99m>TcN(DTCL1)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(3)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(5)]<+>, [<99m>TcN(DTCL2)(10)]<+>, [<99m>TcN(DTCL4)(3)]<+>,<99m>Tc(N)-DBODC(3/5),<99m>Tc-Sestamibi e<99m>Tc-Tetrofosmin.

Tabella 6

<99m>Tc-complessi 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min [<99m>Tc(N)(DTC- 1.89 2.38 2.33 2.34 2.40 L3)(3)]<+>± 0.41 ± 0.04 ± 0.05 ± 0.40 ± 0.08

[<99m>Tc(N)(DTC- 1.74 2.09 2.43 3.07 2.49 L5)(3)]<+>± 0.06 ± 0.05 ± 0.08 ± 0.08 ± 0.10

[<99m>Tc(N)(DTC- 3.78 3.73 4.00 3.62 3.58 L17)(3)]<+>± 0.31 ± 0.30 ± 0.21 ± 0.10 ± 0.16

[<99m>Tc(N)(DTC- 5.21 4.50 3.79

L17)(5)]<+>± 0.61 ± 0.39 ± 0.60

[<99m>Tc(N)(DTC- 3.36 3.27 3.53 3.02 4.00 L1)(3)]<+>± 0.15 ± 0.37 ± 0.59 ± 0.32 ± 0.51 [<99m>Tc(N)(DTC- 3.49 4.16 3.40 3.67 3.67 L2)(3)]<+>± 0.36 ± 0.32 ± 0.13 ± 0.55 ± 0.30 [<99m>Tc(N)(DTC- 3.45 3.49 3.67 3.10 3.64 L2)(5)]<+>± 0.25 ± 0.45 ± 0.11 ± 0.39 ± 0.13 [<99m>Tc(N)(DTC- 3.95 3.79 3.58 3.63 3.73 L2)(10)]<+>± 0.34 ± 0.44 ± 0.32 ± 0.46 ± 0.26 [<99m>Tc(N)(DTC- 3.15 2.93 3.06 3.25 2.79 L4)(3)]<+>± 0.31 ± 0.53 ± 0.26 ± 0.46 ± 0.59<99m>Tc(N)DBODC (3) 2.85 2.82 3.01 2.98 2.82 ± 0.09 ± 0.05 ± 0.30 ± 0.04 ± 0.04<99m>Tc(N)DBODC (5) 2.95 2.84 3.02 2.91 2.75 ± 0.09 ± 0.05 ± 0.30 ± 0.04 ± 0.04<99m>Tc-Sestamibi 3.09 3.29

± 0.17 ± 0.39

<99m>Tc-Tetrofosmin 2.69 2.73

± 0.21 ± 0.14

Tabella 7

<99m>Tc-complessi Rapporti 2 min 10 min 30 min 60 min 120 min [<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 2.07 3.99 3.57 2.85 4.40<L1)(3)]+>Cuore/Fegato 1.86 4.36 19.61 21.57 40.00

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 3.29 4.78 3.50 3.53 4.64

<L2)(3)]+>Cuore/Fegato 1.46 7.70 14.78 20.39 28.23

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 2.02 2.49 2.75 2.98 3.08

<L2)(5)]+>Cuore/Fegato 1.51 4.59 11.12 11.92 21.41

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 1.78 2.74 3.24 3.93 23.40

<L3)(3)]+>Cuore/Fegato 0.39 0.53 2.060 3.54 6.86

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 2.71 2.79 3.97 3.21 2.70

<L4)(3)]+>Cuore/Fegato 1.08 4.57 12.75 15.47 21.46

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 1.27 2.43 2.70 3.04 2.98

<L5)(3)]+>Cuore/Fegato 0.33 0.98 2.23 1.89 2.44

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 1.96 3.39 3.28 3.73 3.69

<L17)(3)]+>Cuore/Fegato 2.04 8.87 16.67 27.85 44.75

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 4.67 3.84 4.48

L17)(5)]<+>Cuore/Fegato 4.49 15.06 25.10

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 2.64 3.88 4.16

L17)(7)]<+>Cuore/Fegato 2.07 15.55 27.54

[<99m>Tc(N)(DTC- Cuore/Polmone 1.77 2.86 3.04

L17)(10)]<+>Cuore/Fegato 1.35 2.70 2.65

<99m>Tc(N)DBODC Cuore/Polmone 3.24 4.48 5.47 5.88 8.29

<(3)>Cuore/Fegato 1.86 6.56 16.72 29.42 47.00<99m>Tc(N)DBODC Cuore/Polmone 3.35 4.43 5.29 7.46 9.48

<(5)>Cuore/Fegato 1.16 1.98 4.71 14.55 25.00

<99m>Tc-Sestamibi Cuore/Polmone 1.81 7.31

Cuore/Fegato 1.02 2.57

<99m>Tc-Tetrofosmin Cuore/Polmone 2.20 6.66

Cuore/Fegato 1.37 5.57

Come si può osservare dai risultati ottenuti i complessi secondo l’invenzione di formula generale [Tc<v>(N) (PNP)(DTC-L)]<+>(DTC-L = ditiocarbammati aliciclici; PNP = amminodifosfine) (I), anche quando confrontati con i complessi noti, in cui DTC-L = pirrolidinditiocarbammato, piperidinditiocarbammato e 4-etil piperazinditiocarbammato, hanno rivelato interessanti proprietà biologiche caratterizzate da: una elevata e persistente captazione cardiaca; una rapida clearance ematica; una bassa e transiente captazione epatica e polmonare. La rapida e quantitativa eliminazione dell’attività da tali organi, detti non-bersaglio, permette di ottenere per questi complessi elevati rapporti cuore/fegato e cuore/polmoni, soprattutto, se comparati a quelli di<99m>Tc(N)-DBODC(5) e dei traccianti tecneziati attualmente in uso clinico<99m>Tc-Sestamibi (Cardiolite<®>) e<99m>Tc-Tetrofosmin (Myoview<®>), consentendo di ottenere immagini caratterizzate da un’elevata qualità diagnostica. Tale favorevole profilo farmacocinetico à ̈ evidenziato a tempi brevi dalla somministrazione, in 2 min p.i.

Studi in vitro di captazione subcellulare in linee cellulari di carcinoma umano

Linee cellulari

2008 (human ovarian cancer) e MCF7 (human breast cancer).

Leganti amminodifosfinici:

PNP3 abbrev. (3) = bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina

PNP5 abrev. (5); bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina

PNP7 abrev. (7); bis(dimetossietilfosfinoetil)etossietilamina

PNP10 abrev. (10); bis(dimetossietilfosfinoetil)metossietilamina.

Leganti ditiocarbammici

DTC-L17;1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbamato.

Complessi Dissimetrici

[<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>(n =17)(X=3,5,7,10).

La captazione dei<99m>Tc-complessi secondo l’invenzione in cellule tumorali à ̈ stata valutata in vitro utilizzando le seguenti linee cellulari: 2008 human ovarian cancer (fornite dal Prof. G. Marverti Dipt. di Scienze Biomediche, Università di Modena, Italia) e MCF-7 human breast cancer (ATCC, Rockville, MD). I complessi<99m>Tc-Sestamibi e<99m>Tc(N)DBODC(5) sono utilizzati come confronto di riferimento.

Le linee cellulari sono mantenute in fase di crescita logaritmica a 37°C in atmosfera di CO25%, utilizzando il medium RPMI-1640 (Euroclone, Celbio, Milano Italia), contenente siero bovino fetale (FBS 10%), tampone HEPES (25 mM), L-glutamina (4 mM), penicillina (50 unità/mL), streptomicina (50 mg/mL).

Per gli studi di captazione, le cellule sono staccate dalle piastre di coltura con tripsina (0.05%) –EDTA (0.53 mM), lavate e risospese con RPMI-1640 in modo tale da ottenere una concentrazione di 5 x 10<6>cellule/mL.

Gli esperimenti sono condotti incubando le cellule in provette di vetro precedentemente sterilizzate. Prima di ogni esperimento le cellule sono preincubate per 30 min a 4° e 37°C.

In una provetta contenete 350 µl di una sospensione cellulare opportunamente scelta, sono aggiunti 6.5 µCi/5 µL salina del radiocomplesso purificato. Ciascun campione à ̈ incubato per 120 min. a 4° o 37°C. A definiti intervalli di tempo (5, 15, 30, 60, 90 and 120 min), da ciascun campione una aliquota (8 µL) à ̈ prelevata e stratificata su FBS freddo (350 µL) contenuto in una in una microprovetta Eppendorf da 500 µl (n=3). Dopo centrifugazione (14000 g x 2 min), le microprovette sono congelate in un bagno di etanolo e ghiaccio secco.

La parte inferiore delle microprovette contenente il pellet di cellule à ̈ tagliata e collocata in una provetta per il conteggio. La restante parte della microprovetta con il surnatante à ̈, invece, posta in una seconda provetta di conteggio. L'attività di entrambe le frazioni à ̈ determinata utilizzando un contatore gamma (Packard). La percentuale di attività associata alle cellule e calcolata applicando la seguente formula:

% uptake = [cpm (pellet)]/ [cpm (pellet) cpm (supernatant)] x 100.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in doppio e ripetuti 4 volte.

La quantità di surnatante presente nel pellet à ̈ determinato essere < 1%.

Vitalità cellulare

La vitalità cellulare valutata prima e durante gli esperimenti mediante tryptan blue, era > 90%.

Risultati

I dati ottenuti dallo studio della cinetica di captazione cellulare, valutata a 4° e 37°C, dei complessi [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>comparata con quella ottenuta per i composti di riferimento<99m>Tc(N)DBODC(5) e<99m>Tc-Sestamibi sono riportati in tabella 8 e 9.

Gli esperimenti condotti a 37°C permettono di valutare l’accumulo cellulare netto correlato ai processi ATP-dipendenti, mentre quelli condotti a 4°C consentono di determinare assorbimento non specifico dei complessi unicamente correlato alle caratteristiche lipofile del prodotto (uptake non specifico).

Tab. 8 captazione nella linea cellulare 2008

<99m>Tc-compiessi 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(5)]<+>2.10±0.83 1.7610.50 3.0711.48 2.9111.12 2.2510.83 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 6.79±0.72 8.6112.54 9.9712.91 11.1112.28 13.1813.19 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(3)]<+>1 .8410.59 1.6010.82 1 .7710.49 1.8111.00 1 .3410.95 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 9.5212.48 12.4313.13 12.9312.23 15.1012.92 16.2813.53 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(7)]<+>1 .4010.74 1 .3510.48 1.0010.41 1.4510.51 2.0510.86 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 8.9811.50 13.7512.19 15.3312.52 17.2213.23 16.9213.16 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(10)]<+>1.4710.91 1.5510.91 2.0511.31 2.5910.74 3.5010.83 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 8.7111.81 13.5512.36 15.6311.94 17.8412.15 19.8412.68

(a) (a) (a) (a) (a)<99m>Tc(N)(DBODC-(5)

1 .7810.49 1 .8010.47 2.2110.77 3.1210.73 3.2711.37

(a) T = 4°C

(b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C

9.1911.21 8.4810.67 10.1311.63 11.1511.46 11.1011.80

(a) (a) (a) (a) (a) Sestamibi 2.2110.81 2.2610.53 2.0210.0.70 1.6010.45 2.2610.94 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 10.25±2.39 10.33±2.40 10.77±2.75 10.69±1.77 10.9711.51

Tab. 9 captazione nella linea cellulare MCF7

Tc-complessi 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(5)]<+>1 .6810.34 1.8510.64 2.8211.03 2.7311.02 2.2710.87 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 5.0210.71 5.6410.97 6.2310.87 5.7710.93 6.3010.60 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(3)]<+>1 .7410.60 2.3910.59 2.2710.93 2.0010.30 2.1610.23 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 4.6110.71 6.4911.07 6.8610.58 6.9211.17 6.5910.67 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(7)]<+>1 .9710.32 2.3610.45 2.6810.54 2.2910.49 2.5910.70 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 9.4511.61 15.9312.39 19.6114.29 21.5814.47 21.7714.67 [<SSfm>Tc(N)(DTC- (a) (a) (a) (a) (a) L17)(10)]<+>1 .8210.53 2.1410.57 2.3010.58 2.1210.68 2.9610.36 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 6.9711.09 13.0611.50 15.9112.35 18.6613.63 19.1314.75<uum>Tc(N)(DBODCJ5) (a) (a) (a) (a) (a) (a) T = 4°C 1.8510.61 2.5610.62 2.3710.55 2.5910.63 2.6110.51 (b) T = 37°C (b) (b) (b) (b) (b)

5.2010.68 5.9011.22 5.9710.97 6.4711 .45 6.6911.09

(a) (a) (a) (a) (a) Sestamibi 1.B210.50 2.0310.42 2.1810.56 2.3110.63 2.3610.92 (a) T = 4°C (b) (b) (b) (b) (b) (b) T = 37°C 7.14±0.81 8.2611.05 8.6011.37 8.4311 .34 7.4111.49 I dati rivelano in entrambe le linee cellulari una rapida ed elevata captazione dei complessi [<99m>Tc<V>(N)(PNPx)(DTC-Ln)]<+>superiore a quella osservata per i due prodotti di riferimento.

I radiofarmaci diagnostici contenenti<99m>Tc secondo l’invenzione somministrati ai dosaggi per uso umano compresi tra 37 e 1850 MBq, preferibilmente tra 185-740 MBq, esprimente la radioattività di<99m>Tc sono privi di tossicità acuta.

Kit per la preparazione di radiofarmaci per l’imaging diagnostico Formulazione a un e due passaggi: le vials sono allestite come segue,congelate in ghiaccio secco e liofilizzate.

Formulazione a due passaggi Formulazione a un passaggio

Run 1 Run 2 Run 1 Run 2 Vial SDH 5 mg 5 mg Vial SDH 5 mg 5 mg 1 1

EDTA 5 mg 5 mg EDTA 5 mg 5 mg SnCl2x 2H2O 0.1 0.1 SnCl2x 2H2O 0.1 0.1 mg mg mg mg Tampone 1 mL 1 mL Tampone 1 mL 1 mL Fosfato Fosfato

Vial PNP5 1.5 3.5 PNP5 1.5 3.5 2 mg mg mg mg DTC-L17 2 mg 0,5 DTC-L17 2 mg 0,5 mg mg γ-ciclodestina 3,5 2 mg γ -ciclodestina 3,5 2 mg mg mg

Dal liofilizzato il radiofarmaco contenente l’azoturo complesso di<99m>Tc può essere ottenuto come segue: 1 o 2 mL di [Na<99m>TcO4] eluito da<99>Mo-<99m>Tc generatore sono aggiunti alla vial 1 che opportunamente agitata viene posta ad incubare a temperatura ambiente per 15 min. Al termine dell’incubazione, 1.5 mL di soluzione fisiologica sono invece aggiunti alla vial 2 per discioglierne il contenuto e 1 mL di quest’ultima à ̈ prelevato e successivamente aggiunto alla vial 1. Dopo agitazione la soluzione risultante à ̈ posta a riscaldamento a 100 °C per 15 min ottenendo il prodotto finale.

Alternativamente tutti componenti possono essere allestiti in unica vial alla quale sono aggiunti 1 o 2 mL di [Na<99m>TcO4] eluito da<99>Mo-<99m>Tc generatore. La soluzione risultante à ̈ quindi riscaldata a 100 °C per 20 min.

Nessun effetto sulla resa di reazione à ̈ determinato dalla variazione della quantità dei diversi reagenti.

Claims (19)

1. Rivendicazioni 1. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m rappresentati dalla formula generale (I) [Tc<V>(N)(PNP)(DTC-L)]<+>(I) - Tc<V>(N) à ̈ [<99m>Tc≡N]<2+>; - PNP à ̈ un legante difosfinoamminico; - DTC-L à ̈ un legante ditiocarbammico aliciclico e sali farmaceuticamente accettabili degli stessi in cui - il legante PNP à ̈ rappresentato dalla formula generale (II) R<2> R1 R<1> PCH2CH2NCH2CH2P R<1>R<1>(II) dove: - R<1>à ̈ un gruppo aromatico, alchilico o etereo; quest’ultimo rappresentato dalla formula generale (III) -(CH2)mO(CH2)m’CH3(III) in cui m à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤m≤4 ed m’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤m’≤3, - R<2>à ̈ rappresentato da un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, un etere ciclico o un gruppo etereo avente il significato della formula generale (III) o un gruppo estereo del tipo –(CH2)m’’C(O)R†dove m’’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤m’’≤3 ed R<’’>à ̈ rappresentato da un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, o un gruppo etereo avente il significato della formula generale (III); - il legante ditiocarbammico aliciclico DTC-L à ̈ rappresentato dalla formula generale (IV) S CN<n>X R<3> S (IV) dove: - n à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 3≤n≤8; - X à ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo scelto tra N, O, S; - R<3>à ̈ un atomo di idrogeno, un gruppo alchilico o un gruppo alchilico variamente sostituito lineari o ciclici, un gruppo arilico, un gruppo arilico variamente sostituito, un gruppo amminico, un amminoacido, o un gruppo etereo acetalico o chetalico lineare o ciclico, un gruppo farmacoforo o una biomolecola, con la condizione che il legante DTC-L non à ̈ pirrolidinditiocarbammato, piperidinditiocarbammato o 4-etil piperazinditiocarbammato.
2. 2. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui i gruppi alchilici variamente sostituiti R<3>del legante DTC-L sono rappresentati dalle formule generali (V), (VI), (VII): R<4> R<5>(V) dove: R<4>e R<5>sono indipendentemente tra di loro un gruppo alchilico od arilico variamente sostituiti, anche contenenti eteroatomi scelti tra N, O, S, variamente spaziati; R<6> (CH2)pY((CH2)p'CH3)p" (VI) dove: R<6>à ̈ un gruppo alchilico od arilico variamente sostituito, anche contenenti eteroatomi scelti tra N, O, S, variamente spaziati, p à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p≤4; Y à ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo scelto tra N, O, S, p’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p’≤4, n†à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤n†≤3; (CH2)pY((CH2)p'CH3)p" <(CH2)pY((CH2)p'CH3)p">(VII) p à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p≤4, X à ̈ un atomo di carbonio o un eteroatomo scelto tra N, O, S, p’ à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 0≤p’≤4, n†à ̈ un numero intero compreso nell’intervallo 1≤p†≤3.
3. 3. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui il gruppo farmacoforo R<3>Ã ̈ scelto nel gruppo consistente in 2 metossifenil piperazina,derivati della benzil guanidina o della norepinefrina.
4. 4. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui la biomolecola R<3>Ã ̈ scelta nel gruppo consistente in peptidi bioattivi, acidi grassi.
5. 5. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui il legante difosfinoamminico PNP Ã ̈ selezionato nel gruppo consistente in bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dimetossietilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dietossietilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dietilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dietilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dietilfosfinoetil)metossipropilamina bis(dietillfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dipropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)metossipropilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etossipropilamina, bis(dimetilfosfinoetil)metilamina, bis(dimetilfosfinoetil)etilamina, bis(dimetilfosfinoetil)propilamina, bis(dietilfosfinoetil)metilamina, bis(dietilfosfinoetil)etilamina, bis(dietilfosfinoetil)propilamina, bis(dipropilfosfinoetil)metilamina, bis(dipropilfosfinoetil)etilamina, bis(dipropilfosfinoetil)propilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)metilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)etilamina, bis(diisopropilfosfinoetil)propilammina.
6. 6. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui il legante difosfinoamminico PNP Ã ̈ selezionato nel gruppo consistente in bis(dimetossipropilfosfinoetil)metossietilamina, bis(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilamina, bis(dimetossietllfosfinoetil)-etossietilamina, bis(dimetossietlfosfinoetil)-metossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)-metossietilamina, bis(dietossipropilfosfinoetil)-etossietilamina.
7. 7. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui il legante ditiocarbammico DTC-L Ã ̈ selezionato nel gruppo consistente in azepina ditiocarbammato, azocane ditiocarbammato, 1-metil-[1,4]diazepan ditiocarbammato, 3-(dimetilammino)pirrolidin ditiocarbammato, 3-(dietilammino)pirrolidin ditiocarbammato, 4-isopropilpiperidin ditiocarbammato, 4,4-dimetossi piperidin ditiocarbammato, 4,4-dietossipiperidin ditiocarbammato, 4,4-dietossietilpiperidin ditiocarbammato, 4,4-dietossipropil piperidin ditiocarbammato, 4,4-bis-(2-etossi-etossi)-piperidin ditiocarbammato, 1-etilomopiperazine ditiocarbammato, morfolin ditiocarbammato, tiomorfolin ditiocarbammato, 2,6-dimetilmorfolin ditiocarbammato, 4 morfolin piperidin ditiocarbammato, 4 N (2 metossi fenil) piperazin ditiocarbammato, 4,4-piperidinediol ditiocarbammato, 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinone ditiocarbammato, 4-piperidinol ditiocarbammato, 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinol ditiocarbammato, 1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbammato, (7,7,9,9-tetrametil-1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]dec-2-il)metanol ditiocarbammato, 2-aza-5-oxabiciclo(2,2,1)-eptan ditiocarbammato, 4,7-epossi-7-metil-2,3,3a,4,5,6,7,7a-octaidro-1h-isoindol ditiocarbammato.
8. 8. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 1, in cui il legante DTC-L Ã ̈ selezionato nel gruppo consistente in morfolin ditiocarbamato, 4,4-N-(2metossi fenil) piperazin ditiocarbamato, 1,4-diosso-8-azaspiro[4,5]decan ditiocarbammato, tiomorfolin ditiocarbammato, azepina ditiocarbammato, azocane ditiocarbammato, 1-metil-[1,4]diazepan ditiocarbammato.
9. 9. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo le rivendicazioni 1-8, per uso in un metodo diagnostico di visualizzazione praticato sul corpo umano o animale.
10. 10. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 9, per uso in un metodo radiodiagnostico di visualizzazione cardiaca.
11. 11. Complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m secondo la rivendicazione 9, per uso in un metodo radiodiagnostico di visualizzazione delle MDR-Pgp in tessuti tumorali.
12. 12. Uso di complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m di formula (I) come definiti alle rivendicazioni 1-8 per la preparazione di un agente radiodiagnostico per una visualizzazione radiodiagnostica praticato sul corpo umano o animale.
13. 13. Uso di complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m di formula (I) secondo la rivendicazione 12, in cui la visualizzazione à ̈ cardiaca.
14. 14. Uso di complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m di formula (I) secondo la rivendicazione 12, in cui la visualizzazione à ̈ delle MDR-Pgp in tessuti tumorali.
15. 15. Kit adatto per la preparazione di un radiofarmaco consistente nei complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m di formula (I) come definiti alle rivendicazioni 1-8, comprendente un flacone contenente un donatore di gruppi azoturo e un agente riducente ed un flacone contenente i leganti ditiocarbamanico aliciclici (DTC-L) e difosfinamminico (PNP).
16. 16. Kit adatto per la preparazione di un radiofarmaco consistente nei complessi azoturi monocationici dissimmetrici del tecnezio-99m di formula (I) come definiti alle rivendicazioni 1-8, comprendente un flacone contenente un donatore di gruppi azoturo, un agente riducente ed i leganti ditiocarbamanico (DTC-L) e difosfinoamminico (PNP).
17. 17. Kit adatto per la preparazione di un radiofarmaco secondo le rivendicazioni 15-16, in cui il contenuto dei flaconi à ̈ liofilizzato.
18. 18. Kit adatto per la preparazione di un radiofarmaco secondo le rivendicazioni 15-16, in cui il donatore di gruppi azoturo à ̈ selezionato tra acido ditiocarbazico e suoi derivati e idrazina e suoi derivati.
19. 19. Kit adatto per la preparazione di un radiofarmaco secondo le rivendicazioni 15-16, in cui l’agente riducente à ̈ selezionato tra cloruro stannoso, sodio idrogeno solfito, sodio boro idruro, fosfine terziarie alifatiche e tris (msolfonato fenil)fosfine.