ITPD20090177A1 - Metodo di preparazione di estratti purificati da cavolo laciniato nero toscano e composizioni degli stessi - Google Patents

Description

“METODO DI PREPARAZIONE DI ESTRATTI PURIFICATI DA CAVOLO LACINIATO NERO TOSCANO E COMPOSIZIONI DEGLI STESSIâ€

Campo dell’invenzione

L’invenzione à ̈ relativa ad un metodo di preparazione di estratti purificati da germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) aventi un alto titolo in glucorafanina e a composizioni comprendenti tali estratti come tali o in combinazione con l’enzima mirosinasi purificato e/o estratto e purificato da senape (Sinapis alba L.).

Stato della tecnica

È noto che le piante appartenenti alla famiglia delle Crucifere o Brassicacee, come ad esempio cavolfiori, cavoli verza, cavoli cappuccio, broccoli, cavoletti di Bruxelles, rape, ravanelli, rucola, senape e rafano, sono ricche di composti solforati di cui sono note da tempo le importanti proprietà salutistiche. Queste piante sono, infatti, ricche di vitamine, in particolare acido ascorbico e acido folico, di sali minerali, carotenoidi, fitosteroli e polifenoli, ma sono soprattutto caratterizzate dalla presenza di particolari sostanze solforate, che conferiscono loro l’odore ed il sapore caratteristici. Si tratta di un ampio gruppo di sostanze idrosolubili, stabili e non volatili contenenti zolfo, noti con il termine generale di glucosinolati. Queste sostanze sono presenti in tutte le parti della pianta, benché con profili chimici e livelli di concentrazione diversi. In genere ogni pianta presenta fino a 4 glucosinolati principali, ma nella stessa pianta possono essere presenti fino a 15 glucosinolati diversi. In natura sono stati identificati circa 120 glucosinolati che, in base alla struttura della loro catena laterale sono stati suddivisi in 3 gruppi, glucosinolati alchilici, aromatici e indolici (Verkerk R. et al.: Glucosinolates in Brassica vegetables: the influence of the food supply chain on intake, bioavailability and human health. Mol. Nutr. Food Res. (2009), 53: DOI:10.1002/mnfr.200800065). L’importanza di questo gruppo di composti à ̈ immediatamente evidente se si considera che questi sono i precursori dei veri e propri principi attivi che caratterizzano le Brassicacee e cioà ̈ degli isotiocianati. Gli isotiocianati, infatti, sono composti tendenzialmente volatili di cui sono note le capacità di favorire nell’uomo le naturali difese antiossidanti dell’organismo e di promuovere l’attività degli enzimi detossificanti. La trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati in questi vegetali avviene ad opera di un enzima endogeno, la mirosinasi, che normalmente si trova segregato in specifici distretti cellulari, ma che si attiva quando l’integrità della pianta viene lesa (Bones A.M and Rossiter J.T.: The myrosinase-glucosinolate system, its organisation and biochemistry. Physiologia Plantarum (1996), 97: 194-208). Nell’uomo invece la trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati avviene, ma solo parzialmente, a livello intestinale ad opera degli enzimi della flora batterica residente (Fuller Z. et al.: Influence of cabbage processing methods and prebiotic manipulation of colonic microflora on glucosinolate breakdown in man. Br. J. Nutr. ( 2007), 98: 364-372). La degradazione dei glucosinolati da parte dell’enzima mirosinasi dà origine ad un intermedio instabile che prima perde il gruppo solfato e subito dopo va incontro ad un processo di riarrangiamento molecolare, da cui possono originare, a seconda delle condizioni in cui avviene la reazione, vari composti: isotiocianati, tiocianati, nitrili, epitionitrili, e ossazolidintioni (Johnson I.T.: Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int. J. Vitam. Nutr. Res. (2002), 72(1): 26-31). A pH = 6-7 la mirosinasi tende a formare preferenzialmente isotiocianati, mentre a un pH < 3 o in presenza di ioni Fe<2+>dà origine prevalentemente a nitrili (Bellostas N. et al.: Fe<2+>- catalyzed formation of nitriles and thioamides from intact glucosinolates. J. Nat. Prod.(2008), 71 (1): 76-80.); anche la presenza di una particolare proteina che si ritiene agisca come co-fattore della mirosinasi, la EpithioSpecifier Protein (ESP), indirizza la mirosinasi verso la produzione di nitrili oppure di epitionitrili nel caso di isotiocianati con un doppio legame terminale, come ad esempio l’allilisotiocianato. In particolare, à ̈ noto che durante la germinazione, per la presenza della proteina ESP, la mirosinasi tende a trasformare la glucorafanina prevalentemente in sulforafano nitrile (Williams D.J. et al.: Epithiospecifier protein activity in broccoli: the link between terminal alkenyl glucosinolates and sulphoraphane nitrile. Phytochemistry (2008), 69: 2765-2773). La formazione di tiocianati avviene invece solo a partire da tre specifici glucosinolati (benzil-, allil- e 4 metilsulfinilbutil-glucosinolato) e richiede l’intervento di proteine non ancora identificate (Halkier B.A. and Gershenzon J.: Biology and biochemistry of glucosinolates. Annu. Rev. Plant. Biol. (2006), 57: 303-333).

Gli isotiocianati esercitano i loro effetti benefici stimolando, tramite traslocazione del fattore Nrf2 dal citoplasma al nucleo cellulare, la sintesi di enzimi specifici; alcuni facilitano l’eliminazione delle sostanze tossiche, altri combattono i radicali liberi dell’ossigeno e favoriscono la riparazione di eventuali danni cellulari. Tra le importanti attività biologiche degli isotiocianati, la più studiata e significativa à ̈ certamente l’attività chemoprotettiva, essendo suffragata da studi epidemiologici e da numerose evidenze sperimentali (Johnson I.T., 2002, ref. cit.; Higdon J.V. et al.: Cruciferous vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and mechanistic basis. Pharmacol. Res. (2007), 55: 224-236).

In particolare, l’azione chemoprotettiva à ̈ data dall’azione di questi composti su enzimi intracellulari coinvolti in processi di detossificazione da agenti carcinogeni in genere attraverso una duplice meccanismo d’azione: i) da una parte esercitando un controllo inibitorio sull’attività degli enzimi di fase 1 (Citocromi P-450); ii) dall’altra stimolando l’espressione e l’attività degli enzimi di fase 2. E’ noto che l’attività degli enzimi di fase 1 può favorire la liberazione di sostanze potenzialmente cancerogene da precursori inattivi, mentre quella degli enzimi di fase 2 tende a proteggere l’organismo favorendo l’eliminazione delle sostanze tossiche, la neutralizzazione dei radicali liberi dell’ossigeno e la riparazione di eventuali danni cellulari (Talalay P and Fahey J.W.: Phytochemicals from Cruciferous plants protect against cancer by modulating carcinogen metabolism. J. Nutr. (2001), 131: 3027-3033 S). Ciò si traduce in un aumento delle difese organiche che giustifica non solo l’attività chemopreventiva, ma anche parte degli effetti antinfiammatori, immunomodulanti e detossificanti esercitati in genere dagli isotiocianati.

La capacità degli isotiocianati di inibire lo sviluppo di eventuali tumori può dipendere, oltre che dal controllo dell’attività degli enzimi di fase 1 e 2, anche dalla loro capacità di inibire la proliferazione delle cellule tumorali e di indurne la morte per apoptosi, come dimostrato per l’isotiocianato derivato dalla glucorafanina, il sulforafano (Clarke J.D. et al.: Multi-targeted prevention of cancer sulforaphane. Cancer Letters (2008), 269 (2): 291-304).

Pertanto à ̈ evidente che i glucosinolati presenti nelle Brassicaeee possono esercitare i loro benefici effetti solo quando sono in grado di rendere biodisponibili, per trasformazione enzimatica ad opera della mirosinasi, gli isotiocianati. La biodisponibilità degli isotiocianati di origine vegetale à ̈ però fortemente influenzata dai processi di cottura, a cui vengono di solito sottoposte queste piante per gli scopi alimentari, i quali, inattivando la mirosinasi, impediscono la trasformazione enzimatica dei glucosinolati (Rungapamestry V. et al.: Effect of meal composition and cooking duration on the fate of sulforaphane following consumption of broccoli by healthy human subjects. Br. J. Nutr. (2007), 97: 644-652). In questo caso gli effetti benefici esercitati da queste piante dipendono dall’intervento della flora batterica intestinale che rende, in parte, disponibili in vivo i principi attivi (Shapiro T.A. et al.: Chemoprotective glucosinolates and isothiocyanates of broccoli sprouts: metabolism and excretion in humans. Cancer Epidemiol., Biomarkers & Prev. (2001), 10: 501-508).

Studi di fisiologia vegetale hanno dimostrato che i livelli di glucosinolati variano nel tempo in funzione delle diverse fasi di sviluppo della pianta e in alcuni casi sono più elevati nei germogli che nella pianta adulta. Questo à ̈ stato chiaramente dimostrato in particolare per i germogli di broccolo, che sono risultati contenere fino a 100 volte i livelli di glucosinolati presenti nella piante mature (Fahey J.W. et al.: Broccoli sprouts: an exceptionally rich source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997), 94: 10367-10372.). I germogli pertanto costituiscono non solo un alimento dotato di notevole proprietà salutistiche, ma anche un ottimo materiale di partenza per la preparazione di estratti titolati da utilizzare sia in campo farmaceutico che per la preparazione di supplementi nutrizionali. E’ stato, infatti, dimostrato che estratti di germogli di broccolo ricchi in glucorafanina, messi a contatto con l’enzima mirosinasi possono liberare una quantità di sulforafano tale da ridurre in vivo, nel ratto, l’attività carcinogenica del dimetilbenzatracene (Fahey J.W. et al. 1997, ref. cit.). E’ noto inoltre che in gastriti indotte da Helicobacter pylori, l’assunzione orale di germogli di broccolo riduce la colonizzazione batterica e l’infiammazione della mucosa gastrica (Yanaka et al.: Dietary sulforaphane-rich broccoli sprouts reduce colonization and attenuate gastritis in Helicobacter pylori-infected mice and humans. Cancer Prev. Res. (2009),2 (4): 353-360).

La possibilità di utilizzare estratti contenenti glucosinolati, arricchiti in particolare di glucorafanina, come precursore degli isotiocianati o isotiocianati pre-formati da varie varietà di Brassica per la preparazione principalmente di integratori alimentari idonei ad incrementare l’apporto di isotiocianati con scopi chemopreventivi, ha portato alla messa a punto di metodi di preparazione degli stessi a partire da diverse varietà vegetali appartenenti alle Crucifere.

La preparazione di estratti arricchiti in isotiocianati pre-formati à ̈ però da ritenersi poco utile allo scopo di preparare supplementi nutrizionali, poiché gli isotiocianati sono poco stabili e quindi tali estratti risultano di difficile maneggiabilità sotto il profilo di processi industriali di preparazioni farmaceutiche o di supplementi nutrizionali. Sono quindi generalmente da preferirsi preparazioni di estratti contenenti glucosinolati con una sostanziale inattivazione della mirosinasi endogena per limitare, se non bloccare, sia la conversione non controllata dei glucosinolati in isotiocianati sia la trasformazione di tali precursori in nitrili o epitionitrili durante le procedure di preparazione. I nitrili e gli epitionitrili sono, infatti, ritenuti dotati di una certa tossicità (Tanii H. et al : Allylnitrile: generation from cruciferous vegetables and behavioral effects on mice of repeated exposure. Food Chem. Toxicol. (2004), 42: 453-458; Boadas-Vaello P et al.: Allylnitrile metabolism by CYP2E1 and other CYPs leads to distinct lethal and vestibulotoxic effects in the mouse. Toxicol Sci. (2009),107 (2):461-472). In tal caso però i glucosinolati possono essere trasformati in isotiocianati solo dalla flora batterica intestinale. L’apporto di isotiocianati a scopo chemopreventivo à ̈ quindi notevolmente limitato se non insufficiente per questi scopi.

Pertanto per preparare prodotti, integratori alimentari o medicamenti, con un effetto chemopreventivo, gli estratti arricchiti in glucosinolati sono preparati in via generale da materiali vegetali di piante (parti o pianta intera) della famiglia delle Brassicacee previa inattivazione della mirosinasi endogena ed eventuale successiva addizione di mirosinasi esogena. Anche in questo caso però rimane il problema di limitare, se non impedire la trasformazione di glucosinolati in nitrili e/o epitionitrili a livello gastrico dove il pH acido e la eventuale presenza di ioni Fe<2+>possono indirizzare la trasformazione dei glucosinolati verso la produzione di nitrili e di epitionitrili anche in assenza di mirosinasi.

EP0772976 descrive un integratore alimentare a base di isotiocianati contenente alti livelli di sulforafano (almeno 50µg, preferibilmente 100µg e più preferibilmente1000µg) e bassi livelli di sulforafano-nitrile (al massimo 50µg, preferibilmente 20µg e più preferibilmente10µg) ed il prodotto à ̈ ottenuto da Brassicacee, e preferibilmente da fiori di broccoli, per: i) inattivazione della mirosinasi per scottatura in acqua bollente o cottura a vapore o immersione in etanolo; ii) miscelazione e macinazione in acqua per un tempo di 0,5-3 ore del materiale vegetale scottato con una mirosinasi esogena; iii) centrifugazione dell’omogenato così ottenuto; iv) concentrazione dell’omogenato in vuoto; v) aggiunta di un veicolo (amido, maltodestrina, saccarosio, destrosio e gomme vegetali); abbassamento del pH a 3,5 ed essicazione della miscela sino all’ottenimento di una polvere per la successiva preparazione di un integratore alimentare, preferibilmente in forma di compressa o bevanda. Preferibilmente l’inattivazione della mirosinasi à ̈ per scottatura a vapore a temperature tra 80-100°C (preferibilmente tra 90-100°C e più preferibilmente a 100°C) per un tempo di 0,5-15 min. (preferibilmente. 2-8 min., più preferibilmente 3-5 min.). La mirosinasi esogena può essere di provenienza commerciale, ma à ̈ preferibilmente da fonti naturali ed in particolare da vegetali della famiglia delle Brassicacee (preferibilmente da rafano). La fonte vegetale di mirosinasi à ̈ aggiunta fresca al materiale vegetale scottato in una quantità compresa tra 3-10%, i rapporti preferiti e più preferiti sono rispettivamente 4-6% e 5%.

WO 97/09889 descrive la preparazione di un supplemento alimentare ottenuto da semi germinanti di Crucifere in generale o germogli di Crucifere di 1-14 giorni (Brassica oleracea, varietà acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia, ramosa, sabauda, sabellica e selensia) o combinazioni di semi e germogli, in cui tali materiali vegetali contengono livelli non tossici di glucosinolati indolici e loro prodotti di degradazione come gli idrossibutilglucosinolati. Tali semi o germogli possono essere usati tal quali, dopo opportuni trattamenti (i. e. congelamento, essiccamento, cottura in forno o per bollitura, liofilizzazione) per arrestarne la crescita. Tali trattamenti permettono di preservare l’enzima mirosinasi endogeno (liofilizzazione) o di inattivarlo (per esempio bollitura). Si prevede inoltre che i glucosinolati o gli isotiocianati contenuti nei materiali vegetali dopo i vari trattamenti, a cui sono sottoposti, possano anche essere estratti con un solvente non tossico o facilmente rimovibile ed in particolare i solventi previsti per l’estrazione sono l’acqua bollente, anidride carbonica liquida, etanolo, l’estrazione con acqua calda o bollente à ̈ quella preferita e descritta poiché ritenuta in grado di inattivare o denaturare la mirosinasi. In caso di inattivazione della mirosinasi, questa può essere aggiunta sia in forma purificata che in forma di materiale vegetale che la contiene (ad esempio germogli di rafano). Secondo questo processo si ottengono materiali che contengono sia glucosinolati che isotiocianati.

WO 02/45527 descrive una composizione contenente glucosinolati e isotiocianati, ottenuti da Brassicacee, in particolare da broccoli e da rafano in combinazione tra di loro, in cui il materiale vegetale di partenza à ̈ tagliato a pezzi, in modo che la conversione dei glucosinolati in isotiocianati sia minima (meno del 5-10%), e scottato blandamente in modo che la mirosinasi sia preservata (inattivazione prevista del 5-10%). Successivamente il materiale vegetale così trattato à ̈ disidratato in due fasi per riscaldamento con temperature non superiori a 137,78°C per 40-60 min. nella prima fase e meno di 26,67°C per 35-45 min. nella seconda fase. Il materiale vegetale disidratato à ̈ quindi macinato sino a polvere.

DE 10308298 descrive un metodo di preparazione di estratti da piante intere di Brassicacee che prevede l’inattivazione della mirosinasi endogena, l’estrazione dei glucosinolati e la concentrazione dell’estratto per congelamento, con specifica esclusione della liofilizzazione. È previsto un ulteriore step di idrolisi enzimatica con mirosinasi esogena dei glucosinolati a isotiocianati almeno per il 50%. È descritto inoltre un kit consistente sostanzialmente in due preparazioni separate da mescolare, di cui una consiste nel materiale vegetale preparato contenente glucosinolati o glucosinolati+isotiocianati, e la seconda consiste in una preparazione contenente mirosinasi. Lo scopo à ̈ di avere preparazioni ad alto contenuto di glucosinolati privi di gluconapina e/o progoitrina e con un contenuto massimo di nitrati di 100mg/kg. L’inattivazione della mirosinasi endogena à ̈ per riscaldamento, ed i mezzi citati sono con acqua calda, a vapore o irradiazione con microonde, preferibilmente l’inattivazione della mirosinasi à ̈ per scottatura in acqua a temperature di 95-100°C per 1-15 min.. Dopo l’inattivazione il materiale vegetale à ̈ tagliato e trattato con acqua o altro mezzo acquoso e sottoposto ad estrazione a temperature di 0-8°C e centrifugazione a oltre 5000 rpm. Secondo gli inventori l’estrazione in acqua o con altro mezzo acquoso rispetto ad altri solventi à ̈ da preferirsi trattandosi di un prodotto per uso alimentare.

Tutti i metodi di preparazione qui citati appaiono non idonei all’ottenimento di estratti da Brassicacee ad alto titolo in glucosinolati, ed in particolare glucorafanina, poiché non solo la degradazione specifica dei glucosinolati in isotiocianati dovuta alla mirosinasi non risulta adeguatamente controllata, ma anche degradazioni aspecifiche, e da escludere ab origine per la possibile formazione di nitrili e/o epitionitrili, non sono menzionate né prese in considerazione. La possibilità che si formino non solo isotiocianati, che in conseguenza della loro nota instabilità possono determinare una significativa perdita dei principi attivi degli estratti preparati, ma anche nitrili ed epitionitrili non à ̈ quindi esclusa.

La disponibilità di estratti ad alto titolo in glucosinolati, che siano stabili e che non vengano degradati in isotiocianati e/o nitrili ed epitionitrili durante il processo di preparazione, à ̈ quindi ancora una necessità sentita per la preparazione di composizioni impiegabili ad esempio come supplementi alimentari con proprietà chemoprotettive.

Sommario

Come risulta evidente per quanto sopra riportato, tra gli isotiocianati che si originano dai glucosinolati una delle molecole biologicamente più interessanti à ̈ senz’altro il sulforafano. Si tratta di un isotiocianato che si forma per azione della mirosinasi dalla glucorafanina, un glucosinolato che si ritrova solo in alcune piante afferenti alla specie Brassica oleracea, in particolare nei broccoli. Infatti i broccoli dalla letteratura risultano essere uno dei vegetali preferiti per la preparazione di supplementi alimentari arricchiti in glucosinolati e/o isotiocianati.

Ora gli inventori hanno trovato che il cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.), pianta di difficile reperimento fuori dal territorio toscano, Ã ̈, rispetto ad altre Brassicacee anche coltivate sul territorio italiano, come ad es. il broccolo calabrese (Brassica oleracea var. italica), caratterizzato da semi contenenti alti livelli sia di glucosinolati totali che di glucorafanina. Hanno trovato inoltre che tale alto contenuto di glucosinolati nei semi si mantiene anche nel contenuto di questi composti nei germogli e che quindi i germogli di cavolo laciniato nero toscano costituiscono un materiale vegetale di elezione per la preparazione di estratti con un alto titolo in glucosinolati ed in particolare di glucorafanina.

È quindi un primo scopo della presente invenzione fornire un metodo di preparazione di fitocomposti e/o estratti caratterizzati da elevato titolo in glucosinolati, ed in particolare di glucorafanina, da germogli di cavolo laciniato nero toscano, in cui la proteina EpithioSpecifier Protein (ESP) e la mirosinasi responsabili della degradazione dei glucosinolati non siano presenti o siano completamente disattivate.

È ancora un altro scopo della presente invenzione fornire composizioni comprendenti tali estratti ad alto titolo preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena utilmente impiegabili per la preparazione di medicamenti o supplementi nutrizionali, in cui la glucorafanina sia convertita in sulforafano e lo stesso sia biodisponibile nel tratto gastrico e/o intestinale.

In un primo aspetto à ̈ pertanto oggetto dell’invenzione un metodo di preparazione di estratti di glucosinolati comprendente almeno le fasi di:

- irradiare germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L.

var. acephala subvar. Laciniata L.) raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con micronde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W;

- congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C;

- liofilizzare e macinare i germogli così trattati;

- sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica, e preferibilmente due, con etanolo al 70% p/p;

- opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare.

In un secondo aspetto sono oggetto dell’invenzione composizioni comprendenti estratti di germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.), preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena, in cui l’estratto ha un titolo in glucorafanina almeno del 10% p/p e quando l’estratto à ̈ combinato con mirosinasi i due componenti sono presenti in un rapporto estratto:enzima che potrà variare in funzione degli effetti che si vogliono ottenere, con un intervallo che varia tra 1:1 e 20:1 p/p. Preferibilmente tali rapporti sono compresi tra 10:1 e 5:1.

Nelle composizioni secondo l’invenzione l’enzima mirosinasi à ̈ in forma di enzima purificato o preferibilmente in forma di liofilizzato di un estratto acquoso da senape (Sinapis alba L.). Quando tale estratto viene posto in un ambiente acquoso a 37°C ed a pH 6,5-7, l’enzima si attiva e opera la trasformazione della glucorafanina in sulforafano.

Pertanto, le composizioni secondo l’invenzione sono in forme farmaceutiche adatte alla somministrazione per via orale e preferibilmente sono in forma di compresse o capsule gastroprotette e/o colon-specifiche, tranne nel caso in cui si voglia ottenere un effetto locale a livello gastrico, nel qual caso le compresse o le capsule dovranno, almeno parzialmente, rendere biodisponibile la glucorafanina in loco. Secondo un ulteriore aspetto l’invenzione ha per oggetto l’uso di tali composizioni per la chemoprotezione contro agenti tossici ambientali, di natura sia microbiologica che chimica. Un uso preferito delle composizioni secondo l’invenzione à ̈ nella chemoprotezione dell’apparato respiratorio. Per tali scopi preferibilmente l’uso di queste composizioni à ̈ come supplementi nutrizionali.

Gli scopi e i vantaggi dei metodi di preparazione di estratti ad alto titolo in glucosinolati da germogli di cavolo laciniato nero toscano e delle composizioni che li comprendono oggetto della presente invenzione, saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell’invenzione, saranno descritti esempi di preparazione di tali estratti e di composizioni oltre che dati biologici dell’effetto di tali estratti.

Breve descrizione delle figure

Figura 1: Confronto tra cromatogrammi HPLC dei desulfo-glucosinolati prima (A) e dopo l’idrolisi con mirosinasi esogena (B).

Figura 2: Cromatogrammi HPLC del contenuto di sulforafano prima (A) e dopo la liofilizzazione (B).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Definizioni

I glucosinolati sino ad ora identificati sono stati suddivisi in 3 gruppi: alchilici, aromatici e indolici, in base alla struttura della loro catena laterale indicata nella formula generale (I) sotto riportata come R (Verkerk R. et al.: 2009, ref. cit.). Essendo molecole dotate di carica negativa, in natura si presentano in genere sottoforma di sali di potassio.

OH

O

HO

HO S R

OH C

N

-O3SO

(I)

Con riferimento alla formula di struttura (I) i principali glucosinolati (qui indicati anche come GL) noti ed in parte menzionati nella descrizione dell’invenzione, e le abbreviazioni qui usate, sono come riportato di seguito:

PM

Classe nome comune abbreviazione gruppo R

(sale di K) Glucoiberina GIB 3-metilsulfinil- 461.6 Progoitrina PRO 2-idrossi-3-butenil- 427.5 Glucorafanina GRA 4-metilsulfinil-butil- 475.6 Sinigrina SIN 2-propenil- 397.5 Glucoerucina GER 4-metiltio-butil- 459.6 Glucotropeolina GTL benzil- 447.5 Gluconasturtina GST fenil-etil- 461.5 Glucobrassicina GBS indolil-3-metil- 486.6 4-metossi- N-metossi-indolil-3-4-OM-GBS 516.6 glucobrassicina metil-Neo- 1-metossi-indolil-3-Neo-GBS 516.6 glucobrassicina metil-4-idrossi- 4-idrossi-indolil-3-4-OH-GBS 502.6 glucobrassicina metil-L’enzima mirosinasi à ̈ la β-tioglucoside glucoidrolasi (EC 3.2.1.147), che normalmente si trova segregata in specifici distretti cellulari della pianta. Per azione della mirosinasi e la concomitante presenza di proteina ESP, a pH 6-7 in ambiente acquoso dalla glucorafanina si ottiene sia l’isotiocianato sulforafano, di seguito indicato anche come SF, che il sulforafano nitrile secondo una reazione di idrolisi enzimatica che porta alla liberazione di un anione solfato e D-glucosio e successivo riarrangiamento molecolare (Matusheski N.V. et al: Comparison of the bioactivity of two glucoraphanin hydrolysis products found in broccoli, sulforaphane and sulforaphane nitrile. J. Agric. Food. Chem. (2001), 49: 5743-5749).

L’EpithioSpecifier Protein (ESP) à ̈ considerata un co-fattore non catalitico della mirosinasi che promuove la formazione di epitionitrili o nitrili semplici. L’ESP isolata dalla Brassica oleracea L. ssp. Italica à ̈ una proteina di 43kDa ed ha una omologia di sequenza con la ESP della Arabidopsis thaliana (NP_175806.3) (Matusheski N.V. et al: Epithiospecifier protein from broccoli (Brassica oleracea L. ssp. Italica) inhibits formation of the anticancer agent sulforaphane. J. Agric. Food. Chem. (2006), 54: 2069-2076; Wittstock U., Burrow M.: Tipping the scalesspecifier protein in glucosinolate hydrolysis. IUBMB Life (2007), 59 (12): 744-751). Recentemente in Arabidopsis thaliana sono state identificate delle nuove proteine, omologhe della ESP, la cui specifica funzione sembra essere quella di indirizzare la mirosinasi verso la trasformazione dei glucosinolati in nitrili, da cui il nome di Nitrile-Specifier Proteins (NSP); tali proteine sono in grado di favorire la trasformazione della glucorafanina in sulforafano nitrile (Burrow M. et al.: The genetic basis of constitutive and herbivory-induced ESP-independent nitrile formation in Arabidopsis. Plant Physiol. (2009), 149: 561-574; Kissem R. and Bones A.M.: Nitrile-specifier proteins involved in glucosinolate hydrolisis in Arabidopsis Thaliana. J. Biol. Chem. (2009), 284 (18):12057-12070).

Con cavolo nero toscano o cavolo laciniato nero toscano si indica sempre la Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L., da cui si ottengono gli estratti ad alto titolo in GL, ed in particolare in GRA, secondo l’invenzione.

Descrizione

L’enorme interesse manifestato nei confronti degli isotiocianati di derivazione vegetale in questi ultimi anni, ha moltiplicato le conoscenze sugli effetti e sul meccanismo d’azione di questa classe di sostanze facendo intravvedere la possibilità di molteplici applicazioni sia in campo medico che salutistico.

Ciononostante però à ̈ necessario porre particolare attenzione nella preparazione principalmente di supplementi nutrizionali arricchiti in questi composti. Da una parte bisogna, infatti, garantire che i materiali con cui questi sono preparati abbiano un adeguato ed elevato contenuto in principi attivi stabili, dall’altra che eventuali composti non voluti, come ad esempio i nitrili, siano minimi se non al limite della non rilevabilità.

Le Brassicaee, ed in particolare i broccoli, sono certamente una fonte vegetale da cui possono essere ottenuti estratti ad alto contenuto in glucosinolati, ma questo alto contenuto in glucosinolati à ̈ naturalmente associato anche ad un adeguato contenuto dell’enzima, la mirosinasi, e del suo co-fattore EpithioSpecifier Protein (ESP) in grado di degradarli ad isotiocianati, ma anche a nitrili ed a epitionitrili. Allo scopo di ottenere estratti ad elevato contenuto in glucosinolati stabili, gli inventori hanno focalizzato la loro attenzione su una particolare sottovarietà di Brassica oleracea, la Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L. comunemente nota come cavolo laciniato nero toscano, e su una parte specifica di questa brassicacea, e cioà ̈ sui germogli.

Partendo dai germogli di cavolo laciniato nero toscano sono state infatti ottenute, con adeguate procedure, preparazioni caratterizzate da un elevato contenuto di glucosinolati, in particolare glucorafanina, in grado di rilasciare quantità apprezzabili di sulforafano in condizioni opportune.

In particolare, il metodo di preparazione degli estratti ad alto titolo in glucosinolati prevede almeno le fasi di:

- irradiare germogli di Brassica oleracea L. var. acephala subvar.

Laciniata L. raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con microonde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W per un tempo compreso tra 0,5 e 2 di minuti per strati di germogli aventi spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm , preferibilmente 1 minuto a 800 W.

- congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C;

- liofilizzare e macinare i germogli così trattati;

- sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica, e preferibilmente due, con etanolo al 70% p/p;

- opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare.

Il processo di irraggiamento dei germogli à ̈ particolarmente significativo per gli scopi della presente invenzione, poiché à ̈ stato trovato che questo blando trattamento termico dei germogli permette di inattivare non tanto la mirosinasi, la cui inattivazione risulta molto limitata, ma la proteina ESP responsabile della trasformazione della glucorafanina in sulforafano nitrile. Infatti, l’attività della mirosinasi dopo trattamento con microonde rimane intorno all’80%. Si rende pertanto necessario procedere a bloccare l’idrolisi enzimatica dei GL mediante un trattamento specifico e cioà ̈ mediante congelamento. Dall’azione combinata del trattamento termico con microonde e successivo immediato trattamento a freddo con congelamento si ottiene quindi l’effetto perseguito di mantenere l’alto contenuto di glucosinolati presente nei germogli evitando da subito eventuali processi degradativi.

Inoltre, rispetto a quanto noto, si à ̈ verificato che l’estrazione con mezzi acquosi, benché utile, non permette di avere alti titoli in glucosinolati e che l’estrazione deve essere eseguita con un solvente idroalcolico in grado non solo di estrarre in maniera completa i glucosinolati, ma anche di inattivare una eventuale attività mirosinasica residua. Si ottiene così un estratto stabile che può essere opzionalmente portato a secco, ripreso in acqua e liofilizzato. In tale forma si trova nelle condizioni migliori per essere utilizzato a livello industriale per la messa a punto di composizioni per uso orale secondo l’invenzione.

Secondo un metodo di preparazione generale gli estratti ad alto titolo in glucosinolati oggetto dell’invenzione sono preparati come di seguito descritto in dettaglio.

A. semina e raccolta dei germogli di cavolo laciniato nero toscano

In ogni ciclo di germogliazione i semi di cavolo laciniato nero toscano sono sterilizzati per 7 minuti in etanolo al 20%, risciacquati almeno tre volte con acqua deionizzata, e posti in germinatore con innaffiamento automatico regolato secondo necessità. Il giorno stabilito per la raccolta, i germogli sono sciacquati e privati delle cuticole. Per ottimizzare la crescita dei germogli sono stati testati diverse condizioni. I migliori risultati in termini di contenuto in glucosinolati sono stati ottenuti raccogliendo i germogli tra il 4° ed il 6° giorno dalla semina e preferibilmente al 5° giorno dalla semina; la luce o il buio non sembrano influenzare il livello di glucosinolati dei germogli.

B. trattamento dei germogli e preparazione del liofilizzato

Subito dopo il raccolto i germogli, privi di cuticola, sono trattati con microonde a 450-800 W per un tempo di 0,5-2 minuti per strati omogenei di germogli di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm (preferibilmente a 800 W per 1 minuto) e subito congelati a temperature comprese tra -15 e -20°C per poi procedere alla liofilizzazione. Dopo la liofilizzazione i germogli sono macinati ottenendo una polvere di colore verde. Per una miglior conservazione e per bloccare eventuali processi degradativi residui la polvere può essere conservata in boccette chiuse sotto vuoto e poste a -18°C.

C. preparazione dell’estratto idroalcolico

I germogli liofilizzati, vengono estratti almeno una volta e preferibilmente due volte con una soluzione di etanolo/acqua al 70% in un rapporto 1 (germogli liofilizzati):20 (solvente di estrazione) p/v a freddo ad una temperatura di 0°C o a temperatura ambiente (20-25°C). Le due estrazioni dei germogli liofilizzati sono eseguite nel seguente modo: a) aggiunta del mezzo di estrazione ai germogli liofilizzati, b) omogenizzazione, c) centrifugazione.

Infine i due supernatanti sono uniti, misurati e sottoposti ad eliminazione del solvente, preferibilmente per evaporazione del solvente a caldo a temperature di 40-45°C. Tale estratto può essere usato tal quale oppure, in alternativa, il residuo ottenuto dopo allontanamento del solvente di estrazione à ̈ poi ripreso in acqua in un volume pari a quello iniziale e centrifugato. Il supernatante à ̈ raccolto, riportato al volume iniziale e liofilizzato. Si ottiene in questo caso un estratto il cui peso à ̈ circa un quarto del peso iniziale dei germogli liofilizzati.

Gli estratti ottenuti con questo metodo di preparazione si sono dimostrati in grado di adempiere agli scopi dell’invenzione.

Infatti, il liofilizzato di germogli raccolti a 4-6 giorni dalla semina, privati di cuticola e trattati con microonde contiene una quantità di glucorafanina pari al 3% p/p, a fronte di un contenuto totale in glucosinolati del 5% p/p. Il trattamento con microonde permette di degradare primariamente la proteina ESP che, se presente, indirizza la trasformazione della glucorafanina verso la formazione di sulforafano nitrile invece che di sulforafano. Tale trattamento risulta perciò essenziale per bloccare degradazioni non volute dei glucosinolati presenti. Dopo il trattamento con microonde l’attività dell’enzima mirosinasi, normalmente presente nei germogli di questa pianta, risulta essere solo parzialmente ridotta, essendo comunque sempre in grado di trasformare in sulforafano circa 80% della glucorafanina presente nel liofilizzato.

D’altra parte l’inattivazione termica della mirosinasi richiede temperature elevate che possono alterare anche i livelli di glucosinolati presenti nella pianta.

Per bloccare una eventuale precoce e non voluta trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati instabili da parte della mirosinasi à ̈ essenziale perciò la successiva fase di congelamento e la liofilizzazione, mentre nella successiva fase di estrazione idroalcolica l’enzima mirosinasi risulta completamente inibito.

Dalle estrazioni idroalcoliche, sia con una ulteriore liofilizzazione sia senza la stessa, si ottiene una polvere leggermente appiccicosa con un contenuto superiore al 10% p/p ed intorno al 13% p/p in glucorafanina, a fronte di un contenuto totale di glucosinolati intorno al 20% p/p. Per migliorare la lavorabilità dell’estratto, dopo la rimozione del solvente e prima della eventuale ulteriore liofilizzazione, alla polvere può essere aggiunta una certa quantità di trealosio (30% p/p); in questo caso l’estratto risulta meno appiccicoso mentre il titolo iniziale in glucorafanina cala dal 13% all’8%.

Questo estratto non contiene l’enzima mirosinasi o lo contiene in forma disattivata e perciò la liberazione di sulforafano in vivo può verificarsi mediante un meccanismo parziale e graduale ad opera della flora batterica intestinale. Preferibilmente però, per ottenere un effetto più marcato di liberazione di sulforafano dalla glucorafanina in essi contenuta, agli estratti così ottenuti può essere addizionata una mirosinasi esogena di origine vegetale o altamente purificata o in forma di estratto vegetale liofilizzato. Preferibilmente per gli scopi della presente invenzione la mirosinasi esogena à ̈ in forma di estratto acquoso ottenuto da altre varietà di Crucifere, come ad esempio il rafano, la senape o la colza, più preferibilmente à ̈ impiegata quella da senape (Sinapis alba L.). Più preferibilmente oltre all’estrazione con acqua a temperatura ambiente e successiva centrifugazione e filtrazione, l’estratto filtrato contenente mirosinasi à ̈ ulteriormente sottoposto a dialisi. La dialisi viene eseguita con un cut-off di 12-14 kD per un massimo di due giorni. Alla fine il dializzato può essere congelato e liofilizzato con o senza l’aggiunta di trealosio all’1% come stabilizzante.

L’estratto di germogli di cavolo nero toscano avente un titolo in glucorafanina non inferiore al 10%, ottenuto con il metodo di preparazione oggetto dell’invenzione qui descritto, può essere utilmente impiegato, per la preparazione di composizioni somministrabili per via orale, adatte a permettere che la glucorafanina compresa nell’estratto sia convertita in sulforafano e che lo stesso sia biodisponibile nel tratto gastrico e/o intestinale. Per questi scopi l’estratto di germogli di cavolo nero toscano à ̈ preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena in un rapporto estratto:enzima variabile e compreso tra 1:1 e 20:1 p/p (preferibilmente compreso tra 5:1 e 10:1). Tali composizioni possono essere nelle forme note nel settore farmaceutico e/o parafarmaceutico nutrizionale per uso orale e possono quindi essere secondo quanto noto ad un esperto del settore composizioni comprendenti un estratto di cavolo nero avente un titolo almeno del 10% in glucorafanina ed opzionalmente la mirosinasi in forma purificata o di estratto combinato con eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili o di grado alimentare adatti per ottenere tali composizioni in forma liquida, ad esempio soluzioni o sospensioni, o in forma solida, ad esempio bustine monodose, tavolette erodibili, compresse, capsule. Preferibilmente, tali composizioni sono scelte tra compresse o capsule, opzionalmente gastroprotette o colon-specifiche. In particolare, le composizioni gastroprotette sono necessarie quando si vuole evitare la liberazione nello stomaco dei principi attivi contenuti negli estratti, ed in particolare della glucorafanina, ed ottenere una liberazione di sulforafano a livello dell’intestino tenue, favorendo così un assorbimento sistemico con tutti gli effetti positivi chemoprotettivi indotti a livello generale da questo composto. La gastroprotezione sia delle capsule che delle compresse à ̈ ottenibile con metodologie di tecnica farmaceutica note ad un esperto del settore. Ad esempio compresse gastroprotette possono essere ottenute rivestendo la compressa con una soluzione acquosa di gomma lacca, ammonio carbonato e trietilcitrato.

In un’altra soluzione prevista le composizioni possono essere in forma di compresse o capsule colon-specifiche, che permettono una liberazione dei principi attivi degli estratti localizzata nel colon, utili perciò quando si voglia ottenere un effetto specifico locale a livello del colon, come ad esempio una protezione preventiva in soggetti predisposti allo sviluppo di polipi intestinali o in caso di soggetti con infiammazioni croniche del crasso. Anche la formulazione colonspecifica può essere ottenuta con tecniche note ad un esperto del settore. Ad esempio può essere ottenuta rivestendo capsule di gelatina con due diversi strati protettivi; quello interno protegge la capsula dalla dissoluzione al pH 6,8 tipico dell’intestino tenue e si ottiene rivestendo la capsula di gelatina con una soluzione acquosa al 15% contenente gomma lacca (87,2%), ammonio carbonato (3,3%) e trietilcitrato (9,5%), quello esterno permette invece di superare il pH acido dello stomaco e viene depositato su quello interno, quando asciutto, utilizzando una soluzione acquosa a base di gomma lacca (84,2%), ammonio carbonato (6,3%) e trietilcitrato (9,5%). La doppia protezione permette perciò il rilascio degli attivi solo a pH 7,2 tipico del colon.

Inoltre, le composizioni possono essere in forma di compresse o capsule a rapida dissoluzione per un effetto locale a livello gastrico, utili per il trattamento delle gastriti indotte da Helicobacter pylori, contrastandone anche la proliferazione e l’infiammazione indotta.

Non si possono inoltre escludere forme farmaceutiche o parafarmaceutiche nutrizionali in cui sono combinate sia una rapida dissoluzione a livello gastrico sia una dissoluzione a livello intestinale (tenue o colon): esempi di tali forme possono essere tavolette erodibili o polveri micronizzate e trattate per ottenere granuli con rivestimenti differenziati a seconda del tipo di rilascio voluto.

Per gli scopi della chemoprevenzione i dosaggi giornalieri dell’estratto avente un titolo in glucorafanina (senza l’aggiunta di trealosio) di almeno il 10% p/p possono essere compresi tra 200 e 1000mg/die e preferibilmente tra 200 e 800 mg/die e più preferibilmente 200-400 mg/die.

Sono qui sotto riportati alcuni esempi, non esaustivi né limitativi, di possibili composizioni impiegabili per via orale.

A. Compresse gastroprotette (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 400 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 40 Cellulosa microcristallina 400 Dicalciofosfato anidro 300 Magnesio stearato vegetale 10 Silice colloidale anidra 8 Sodio croscarmellose 18 Colorante 0,2 Gomma lacca 36,30 Ammonio carbonato 2,72 Trietil citrato 4,08 Acqua purificata 388,0 B. Capsule colon-specifiche (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 200 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 10 Cellulosa microcristallina 200 Magnesio stearato vegetale 7 Silice colloidale anidra 10 Sepifilm SN<TM>24,24 (gomma lacca decerata 20-30%, polivinil pirrolidone K 30 < 5%, mono e di gliceridi acetilati 7-11%, etanolo 60-70%) Gomma lacca 36,30 Ammonio carbonato 2,72 Trietil citrato 4,08 Acqua purificata 388,0 C. Compresse filmate a rapida dissoluzione (in mg) Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 300 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 50 Cellulosa microcristallina 300 Dicalciofosfato anidro 225 Magnesio stearato vegetale 7,5 Silice colloidale anidra 6 Sodio croscarmellose 13,5 Polivinilpolipirrolidone 15

Sepifilm LP<TM>22,8 (Idrossipropilmetilcellulosa, cellulosa microcristallina,

acido stearico vegetale, pigmenti e lacche)

Gomma lacca 7

Colorante 0,4

D. Capsule (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 400

Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 80

Cellulosa microcristallina 200

Magnesio stearato vegetale 7

Silice colloidale anidra 10

Sodio croscarmellose 12 Polivinilpolipirrolidone 24

Per quanto già esposto risulta chiaro che le composizioni realizzabili con l’estratto di cavoli nero toscano secondo l’invenzione si prestano a molteplici applicazioni sia sottoforma di medicamenti che di supplementi alimentari utilmente impiegabili sia a scopi preventivi che curativi nella chemoprevenzione e/o chemoprotezione: - nei soggetti a rischio di sviluppare tumori o per familiarità o per età o per esposizione ambientale ad elementi tossici e/o a raggi UV;

- a livello del colon in soggetti già sottoposti a polipectomia allo scopo di prevenire eventuali recidive o in soggetti con infiammazioni ricorrenti dell’intestino crasso; - per ridurre l’infiammazione gastrica in presenza di gastriti indotte da Helicobacter pylori;

- per proteggere i polmoni dallo stress ossidativo indotto dal fumo di sigaretta, dallo smog o da esposizioni ad agenti chimici pro-ossidanti di varia natura, contrastando così lo sviluppo di un eventuale enfisema polmonare;

- per aumentare i sistemi di difesa delle prime vie aeree facilitando la risoluzione di disturbi di tipo catarrale anche di origine batterica o virale.

L’uso preferito si orienta però verso la protezione dell’apparato respiratorio, che per la sua fisiologica funzione si trova costantemente a contatto con microrganismi di varia natura e con un gran numero di sostanze chimiche pro-ossidanti, tossiche e cancerogeniche.

Parte Sperimentale

Il contenuto in glucosinolati negli esempi riportati, anche quando non specificamente menzionato, à ̈ stato misurato mediante analisi HPLC in accordo con il metodo ufficiale ISO 9167-1 adottato dall'UE (EEC Regulation N°1864/90, 1990), descritto in dettaglio all’esempio 1.

Il contenuto in sulforafano à ̈ stato valutato mediante cromatografia a fase inversa utilizzando come standard il sulforafano stesso, ottenuto per idrolisi a partire da una glucorafanina ad alto grado di purezza (>95% in HPLC) preparata in laboratorio. L’idrolisi à ̈ stata effettuata in tampone fosfato 0,1 M pH 7 con l’enzima mirosinasi, anch’esso purificato in laboratorio. Il sulforafano standard à ̈ stato prima estratto con acetato di etile in colonne EXtrelut NT1, poi portato a secco in rotovapor, risolubilizzato in diclorometano e aliquotato in boccetti pre-tarati per procedere alla completa evaporazione del solvente in corrente di azoto. Per preparare la curva di calibrazione il sulforafano à ̈ stato sciolto in acetonitrile al 10% a diversi livelli di concentrazione (da 1 a 0,1 mg/ml) e sottoposto ad analisi HPLC con rilevatore DAD (diode array detector) ad una lunghezza d’onda di assorbimento massimo UV di 240 nm. La validazione del metodo ha messo in evidenza che la procedura utilizzata può determinare una sottostima del contenuto in sulforafano inferiore al 10%.

I campioni da valutare sono stati estratti con acetato di etile in colonne EXtrelut NT1, portati a secco per eliminare completamente il solvente e risolubilizzati in una soluzione di acetonitrile al 50%.

Esempio 1: analisi del contenuto in glucosinolati di semi di diverse varietà di Brassica oleracea

Per individuare la specie a più alto titolo di glucorafanina (GRA) à ̈ stato confrontato il contenuto di glucosinolati (GL) in semi di diverse varietà di Brassica oleracea forniti da Suba&Unico:

- broccolo calabrese biologico (OD22),

- broccolo calabrese convenzionale (OD22),

- broccolo calabrese tardivo biologico (OD161),

- cavolo laciniato nero toscano convenzionale (OD74).

Il contenuto in glucosinolati nei vari campioni à ̈ stato misurato mediante analisi HPLC in accordo con il metodo ufficiale ISO 9167-1 adottato dall'UE (EEC Regulation N°1864/90, 1990). I glucosinolati vengono estratti dai semi con etanolo 70% ad 80°C in rapporto 1:50-1:100 p/v.

L’analisi consiste nella separazione dei desulfo-GL, ottenuti per desulfatazione enzimatica, mediante HPLC a fase inversa C-18 ed impiegando sinigrina come standard interno. Il riconoscimento dei GL à ̈ stato effettuato sulla base del tempo di ritenzione e dello spettro di assorbimento UV grazie al confronto con una libreria costruita nel laboratorio contenente i dati di più di 30 GL di riferimento.

Le analisi HPLC effettuate sui campioni sopra elencati mostrano che i semi di cavolo nero toscano OD74 convenzionale presentano il contenuto totale di GL e la quantità percentuale di GRA più alti (tabelle 1 e 2).

Tabella 1 - Confronto del contenuto di GL in semi di Brassica oleracea di diverse cultivar forniti da Suba&Unico (raccolto 2007)

GL (µmol*g<-1>)

4-OH- GL Semi GIB PRO GRA SIN GER GBS

GBS totali

1,01 0,83 23.7 2,3 16

OD22 Bio - - 43,84

± 0,06 ± 0,01 ± 0,3 ± 0,1 ± 1

6,1 3,03 17 1,1 3,5 10 0,49

OD22 Conv 41,22

± 0,5 ± 0,06 ± 1 ± 0,1 ± 0,7 ± 1 ± 0,03

8 3,8 21 1,3 3,2 13 0,39 OD161 Bio 50,69

± 1 ± 0,9 ± 1 ± 0,3 ± 0,9 ± 3 ± 0,01

4,1 55 3,3 13 0,64

OD74 Conv - - 76,04

± 0,4 ± 4 ± 0,6 ± 1 ± 0,07

Tabella 2 - Confronto del contenuto di GRA in semi di Brassica oleracea di diverse cultivar forniti da Suba&Unico (raccolto 2007).

<GRA>GRA GL totali µmol GRA / Semi

(µmoli*g<-1>(mg*g<-1>seme) (µmoli*g<-1>µmol GL tot OD22 Bio 23,7 ± 0.3 11,3 43,84 54%

OD22 Conv 17 ± 1 8,1 41,22 41%

OD161 Bio 21 ± 1 10,0 50,69 41%

OD74 Conv 55 ± 4 26.2 76.04 72%

Esempio 2: analisi del contenuto in glucosinolati di germogli di diverse varietà di Brassica oleracea

Semi di broccolo calabrese OD22 biologico e cavolo nero toscano OD74 sono stati fatti germogliare per verificare il loro contenuto in GL. In ogni ciclo di germogliazione 50 g di semi sono stati dapprima sterilizzati immergendoli per 7 minuti in etanolo al 20%, poi lavati tre volte con acqua deionizzata e posti in germinatore Vitaseed Suba&Unico che permette un’innaffiatura temporizzata ogni 2 ore. Il giorno stabilito (4° e 6° giorno dalla semina) per la raccolta i germogli sono stati brevemente lavati, privati delle cuticole e posti a -18°C. Dopo liofilizzazione sono stati macinati e la polvere à ̈ stata suddivisa in contenitori chiusi sotto vuoto e posti a -18°C.

Il contenuto in GL misurati come descritto all’esempio 1 delle diverse varietà considerate à ̈ riportato in tabella 3.

Tabella 3 - Confronto del contenuto di GL in germogli di Brassica oleracea.

GL (µmoli*g<-1>)

eo-Germogli GIB GRA<4-OH->GER GBS<4-OM->N

GL totali GBS GBS GBS OD22 Bio 20 2,4 15,1 0,9 1,09 2,8

- 42,29 6 giorni ± 2 ± 0,2 ± 0,2 ± 0,3 ± 0,08 ± 0,4

OD22 Bio 25,8 3,5 23 1,2 0,4 2,5

- 56,4 4 giorni ± 0,9 ± 0,3 ± 1 ± 0,1 ± 0,1 ± 0,2

OD74

4,6 80 5,5 16,1 1,71 1,89 2,0

conv 111,8

± 0,1 ± 2 ± 0,4 ± 0,6 ±0,07 ± 0,07 ± 0,4

4 giorni*

* privati di cuticola

Sono stati anche raccolti germogli di cavolo nero toscano OD74 di 5 giorni, ottenuti in tre cicli di germogliazione. I germogli sono stati liofilizzati, macinati e conservati a -18°C e sul materiale ottenuto à ̈ stato misurato il contenuto in GL (tabella 4).

Tabella 4 - Contenuto di GL nei germogli liofilizzati di OD74 di 5 giorni (media di otto determinazioni HPLC)

GL µmoli*g<-1>mg*g<-1>p/p

GIB 4,41 2,0

GRA 72,31 34,4 3,4%

4-OH-GBS 4,86 2,4

GER 15,45 7,1

GBS 1,10 0,5

4-OM-GBS 0,68 0,4

Neo-GBS 1,65 0,9

TOTALI 100,47 47,7 4,8%

È stato anche verificato se la crescita in condizioni di luce o di buio potesse influenzare il contenuto in GL in germogli di cavolo nero toscano OD74. Il liofilizzato ottenuto dai germogli cresciuti al buio risulta di colore giallo anziché verde a causa della minor presenza di clorofilla; il contenuto di glucosinolati questi due preparati non mostra significative differenze. I dati analitici sono riportati in Tabella 5.

Tabella 5 - Confronto tra il contenuto di GL nei germogli liofilizzati di OD74 cresciuti in luce naturale o al buio

GL Luce Buio Luce/Buio µmoli* g<-1>µmoli* g<-1>%

GIB 4,41 4,61 96

GRA 72,31 71,63 101

4-OH-GBS 4,86 5,67 86

GER 15,45 19,84 78

GBS 1,10 1,00 110

4-OM-GBS 0,68 2,24 31

Neo-GBS 1,65 2,72 61

TOTALI 100,47 107,70 93

Esempio 3: analisi del contenuto in glucosinolati di germogli di cavolo nero toscano dopo trattamento con microonde

Le prove sono state condotte utilizzando un comune microonde da cucina e i germogli (circa 35 gr) sono stati trattati con tre diverse potenze di microonde, per raggiungere differenti valori di temperatura, rispetto al campione di controllo non trattato: 150 W per 1 minuto; 450 W per 1 minuto; 800 W per 1 minuto. I germogli sono poi stati congelati, liofilizzati e macinati. Sulla polvere sono state effettuate analisi dei glucosinolati e prove di autoidrolisi ad opera della mirosinasi endogena. Il contenuto in GL misurato con HPLC come descritto all’esempio 1 ha dato i risultati riportati in tabella 6.

Tabella 6 – Contenuto di GL in germogli OD74 non trattati e trattati con microonde a 450 e 800 W

GL Controllo 450 W 800 W

GIB 0,66 0,00 0,97

GRA 72,23 72,19 65,30

4-OH-GBS 4,80 4,73 3,70

GER 12,42 13,00 11,38

1,26 1,22

GBS 1,43

4-OM-GBS 1,16 1,83 1,84

Neo-GBS 2,12 3,14 2,57

TOTALI 94,81 96,15 86,98

Esempio 4: determinazione dell’attività mirosinasica in germogli di cavolo nero toscano di 5 giorni con e senza trattamento con microonde in diverse condizioni a) attività mirosinasica totale

L’attività totale (solubile insolubile) della mirosinasi à ̈ stata misurata con il metodo pH Stat Assay (pHSA). L’attività si determina misurando la quantità di ione H<+>rilasciato nel corso della reazione di idrolisi enzimatica del substrato sinigrina per mezzo di una titolazione con NaOH 1mM.

Questo saggio si effettua direttamente sui germogli liofilizzati con e senza pretrattamento con microonde e permette perciò di determinare l’attività totale della mirosinasi data dalla somma delle forme solubile ed insolubile. I risultati sono riportati in tabella 7.

Tabella 7 – Attività mirosinasica totale determinata con pHSA in germogli OD74

5gg

Germogli OD74 Attività* (U*g<-1>) Controllo (germogli da semi 2007) 12,2 ± 0,8 Controllo (germogli da semi 2008) 9,7 ± 0,4

Trattati 800 W per 1 minuto

<1,8 ± 0,2>

(germogli da semi 2008)

*1U = enzima in grado di idrolizzare 1 µmole SIN/min a 37°C a pH 7 Confrontando questi dati con quelli relativi all’attività della sola forma solubile dell’enzima, che ha dato risultati negativi, (dati non riportati) si à ̈ concluso che i germogli liofilizzati contengono l’enzima mirosinasi in una forma insolubile, ma attiva e che il trattamento termico con microonde causa una inattivazione solo parziale della mirosinasi.

Su campioni di germogli di cavolo nero toscano trattati con microonde e e liofilizzati si à ̈ misurata successivamente l’autoidrolisi della GRA in sulforafano (SF).

b) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in tampone fosfato

Germogli liofilizzati di OD74 trattati con microonde sono stati omogeneizzati in tampone fosfato 25 mM pH 7 e lasciati per 2 ore in agitazione a 37°C. Il controllo à ̈ costituto da germogli liofilizzati non trattati. I risultati sono riportati in tabella 8.

Tabella 8 – Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in tampone fosfato 25 mM pH 7

% conversione in

% SF (p/p Campione µmoli SF * g<-1>SF della GRA

germogli) iniziale*

Controllo 6,9 10% 0,1%

150 W 40,0 55% 0,7%

450 W 55,5 77% 1,0%

800 W 60,5 84% 1,1%

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>

L’autoidrolisi di germogli trattati con microonde ad 800 W per 1 minuto e liofilizzati ha fornito una resa in sulforafano dell’84%, valore più elevato rispetto all’idrolisi in acqua riportata in seguito in tabella 9.

c) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in acqua

Sono state eseguite due prove trattando con microonde i germogli in “piccole quantità†(A) ed in “grande quantità†(B). Nella prova A sono stati trattati circa 35 g di germogli, nella B circa 300 g. La prova di autoidrolisi à ̈ stata condotta omogeneizzando il campione in acqua e lasciandolo per 2 ore in agitazione a 37°C.

Tabella 9 - Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in acqua % conversione in

Campione µmoli SF * g<-1>% SF (p/p SF della GRA

germogli) iniziale*

800 W prova A 46,2 64% 0,8% 450 W prova B 14,7 20% 0,3% 800 W prova B 34,4 48% 0,6% *valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>

L’idrolisi in acqua dei germogli trattati a 800 W (prova A) ha fornito una quantità di sulforafano inferiore a quella ottenuta con la prova analoga eseguita in soluzione tamponata a pH 7. E’ risultata una trasformazione del 64% della GRA presente nei germogli di partenza. L’autoidrolisi del campione prova B ha evidenziato un recupero in sulforafano minore rispetto a quella A. Questo risultato à ̈ presumibilmente da imputare al fatto che la quantità elevata di germogli all’interno del forno a microonde non ha consentito al vegetale di raggiungere una temperatura uniforme e la completa disattivazione della proteina ESP.

Al fine di valutare una prima stabilità del sulforafano ottenuto, il campione di germogli trattati a 800 W, relativo alla prova B, dopo autoidrolisi à ̈ stato congelato e liofilizzato. Su questo campione liofilizzato à ̈ stata effettuata una analisi del sulforafano dopo 6 giorni di conservazione a 4° C. Dal confronto tra le tabelle 9 e 10 si nota che dopo 6 giorni nel campione analizzato à ̈ ancora presente tutto il sulforafano.

Tabella 10 – Contenuto di sulforafano in germogli OD74 trattati a 800W,

autoidrolizzati, liofilizzati e conservati per sei giorni.

% conversione

% SF (p/p Campione µmoli SF * g<-1>in SF della

germogli) GRA iniziale*

800 W 34,4 48% 0,6%

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>

d) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in ambiente acido

I germogli, sia non trattati che pre-trattati con microonde, se posti in autoidrolisi in soluzione acida per HCl a pH 3 mostrano una bassa resa in sulforafano (tabella 11). Per questo motivo à ̈ necessario evitare che l’idrolisi della GRA avvenga in un ambiente acido, come ad esempio quello dello stomaco, a meno che non si voglia effettivamente far idrolizzare la glucorafanina a livello gastrico per ottenere una specifica attività a livello locale .

Tabella 11 – Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in soluzione acida per HCl a pH 3

% conversione in

Germogli

SF OD74

della GRA iniziale*

Controllo 12 %

Trattati 800 W 7,5 %

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>

Da prove eseguite in precedenza era emerso che nei germogli trattati al microonde l’enzima mirosinasi mantiene un’attività ridotta, ma tale da permettere la completa idrolisi della GRA presente inizialmente in soli 10 minuti. Per questo motivo germogli trattati con microonde e lasciati anche solo brevemente a temperatura ambiente presentano un contenuto di GRA minore di quello atteso (vedi tabella 12). Al fine di ottenere un prodotto liofilizzato al maggior contenuto di GRA à ̈ quindi necessario procedere, dopo trattamento con microonde, ad un immediato congelamento. Si può operare con un congelatore oppure, in scala di laboratorio, immergendo i germogli in azoto liquido. Il miglior prodotto si ottiene pertanto da germogli trattati con microonde 800 W per 1 minuto e immersi in azoto liquido o congelati rapidamente.

Su questo prodotto liofilizzato in polvere, à ̈ stata eseguita la valutazione della quantità di GRA e del sulforafano ottenuto in seguito alla reazione operata dall’enzima residuo endogeno, sia in soluzione tamponata, sia in acqua. I risultati sono riportati in Tabella 12.

Tabella 12 – Sulforafano ottenuto per autoidrolisi in acqua ed in tampone fosfato di germogli OD74 trattati 800 W per 1 min, immersi in azoto liquido e liofilizzati % conversione Germogli OD74 trattati 800 W GRA SF

in SF della per 1 min (µmoli * g<-1>) (µmoli * g<-1>)

GRA* Campione trattato, lasciato a T.

38 (1,8% p/p) nd nd amb. e liofilizzato

Campione trattato, congelato

immediatamente con N2liquido 61 (2,9% p/p) nd nd e liofilizzato

Autoidrolizzati 30 min in H2O - 47,7 66 Autoidrolizzati 30 min in

- 53,9 75 tampone fosfato 30 mM pH 7,8

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>

Complessivamente dalle prove di idrolisi della GRA con la mirosinasi endogena si evince che: a) la resa in sulforafano dipende dal pH a cui avviene la reazione ed in particolare pH 3 < pH 5 (acqua) < pH 7 (tampone fosfato); b) la trasformazione della glucorafanina in sulforafano aumenta in seguito ad un trattamento con microonde grazie all’inattivazione del cofattore enzimatico ESP, con rese di conversione del 75-85% in ambiente tamponato a pH 7.

Esempio 5: preparazione di estratti da germogli di cavolo nero toscano OD74 liofilizzati con alto titolo in glucorafanina.

a) estrazione in acqua a freddo di germogli liofilizzati di OD74

La liofilizzazione di un estratto idroalcolico deve essere preceduta da una fase di evaporazione del solvente e comunque comporta alcune difficoltà dovute alla presenza di residui di etanolo. Si à ̈ deciso pertanto di eseguire un’estrazione in acqua in bagno di ghiaccio. L’analisi HPLC dei glucosinolati presenti nell’estratto acquoso a freddo mostra però una perdita del 90% dei composti. Il risultato negativo à ̈ da attribuire all’enzima mirosinasi endogeno che à ̈ in grado di agire anche a basse temperature durante le fasi di omogeneizzazione e separazione solido-limpido. Le estrazioni acquose sono quindi da escludere per la preparazioni di estratti ad alto titolo in GL dai germogli liofilizzati di OD74.

b) estrazioni idroalcolica in etanolo 70% a diverse temperature

Sono state effettuate delle prove di estrazione con etanolo al 70% a diverse temperature (tabella 13):

- 80°C;

- freddo (etanolo 70% pre-raffreddato a -20°C, omogeneizzazione in bagno di ghiaccio);

- temperatura ambiente.

Le analisi non evidenziano nessuna differenza significativa nell’efficienza di estrazione e non sono state riscontrate perdite di GL per idrolisi enzimatica a carico della mirosinasi endogena presente nei germogli. Sembra quindi che la sola presenza dell’alcol sia sufficiente ad inibire attività enzimatica.

Tabella 13 - Confronto tra il valore di GL dei germogli liofilizzati di OD74 ottenuto mediante estrazione a 80°C, a freddo e a temperatura ambiente 80°C Freddo T ambiente

GL

(µmoli*g<-1>) (µmoli*g<-1>) (µmoli*g<-1>)*

GIB 4,4 4,0 0,0

GRA 72,3 71,9 77,4

4-OH-GBS 4,9 3,3 4,4

GER 15,4 17,1 11,8

GBS 1,1 0,9 1,5

4-OM-GBS 0,7 0,8 1,1

Neo-GBS 1,7 1,2 2,4

TOTALI 100,5 99,2 98,6

*Germogli ottenuti da semi del 2008

c) estratto idroalcolico da germogli liofilizzati OD74 ad elevato contenuto di GRA Germogli liofilizzati di OD74 sia non trattati che trattati con microonde, sono stati impiegati per la preparazione di un estratto idroalcolico (etanolo al 70%) a freddo. In base ai risultati sopra menzionati si à ̈ proceduto con due estrazioni successive con Ultraturrax in bagno di ghiaccio perché le analisi hanno evidenziato, nella seconda estrazione, una percentuale non trascurabile di GL. Dopo evaporazione dell’etanolo in rotovapor a 45°C, il campione à ̈ stato diluito con acqua ad un volume circa pari a quello iniziale e liofilizzato. Il peso dell’estratto liofilizzato ottenuto à ̈ risultato circa 1/4 del peso iniziale di germogli liofilizzati. L’estratto secco à ̈ stato analizzato per il contenuto dei GL mediante analisi HPLC dei desulfo-derivati e la concentrazione di GL rispetto ai germogli à ̈ risultata maggiore di circa 4 volte, con la GRA che raggiunge il 13% in peso.

Le analisi HPLC del prodotto liofilizzato ottenuto sono riportati di seguito (tabella 14).

Tabella 14 - Contenuto di GL nell’estratto idroalcolico liofilizzato ottenuto dai germogli di OD74 (media di quattro determinazioni HPLC) GL µmoli*g<-1>mg*g<-1>% p/p

GIB 17,5 8,1 0,8

GRA 273,4 130,1 13,0

4-OH-GBS 23,5 11,8 1,1

GER 91,5 42,0 4,2

GBS 6,0 2,9 0,3

4-OM-GBS 5,5 2,8 0,3

Neo-GBS 9,2 4,7 0,5

TOTALI 426,6 202,5 20

d) estratto liofilizzato addizionato con trealosio

L’estratto idroalcolico liofilizzato che à ̈ stato ottenuto à ̈ risultato possedere una buona dotazione di glucosinolati totali e di GRA in particolare, ma si presenta appiccicoso causa l’elevata igroscopicità. Per ridurre l’inconveniente, si à ̈ deciso quindi di provare ad addizionare trealosio all’estratto, prima della liofilizzazione. Di seguito si riportano in dettaglio i risultati delle relative analisi.

Tabella 15 – Contenuto di GRA in estratti idroalcolici liofilizzati di germogli di OD74

Estratto liofilizzato

GRA (µmoli * g<-1>) GRA % (p/p)

da germogli OD74

Controllo (da semi 2007) 273 13,0

Con âˆ1⁄430% Trealosio<173 8,2>

Il trealosio ha ridotto notevolmente l’igroscopicità dell’estratto liofilizzato, ma ha inciso ovviamente sul contenuto % in peso di GRA.

L’estratto liofilizzato ottenuto presenta una buona dotazione di GRA, ma à ̈ completamente privo dell’enzima mirosinasi necessario per la trasformazione del composto in sulforafano. Di conseguenza à ̈ stato messo a punto un procedimento per preparare un estratto di senape arricchito in mirosinasi che, opportunamente miscelato all’estratto liofilizzato contenente GRA, ne permetta l’idrolisi.

Esempio 6: preparazione di un estratto liofilizzato di mirosinasi attiva per la trasformazione della glucorafanina in sulforafano

Semi di senape (Sinapis alba L.) sono stati estratti con acqua deionizzata in rapporto 1:10 p/p a temperatura ambiente, data la stabilità termica della mirosinasi. Dopo centrifugazione e filtrazione, una parte dell’estratto à ̈ stato posto per due giorni in dialisi con tubo di cut-off 12-14 kD, contro acqua deionizzata. Sia il campione filtrato, sia quello dializzato sono stati posti a -20°C e successivamente liofilizzati, con e senza l’aggiunta di trealosio all’1% come stabilizzante.

Dopo la liofilizzazione à ̈ stato effettuato su ogni campione solido il saggio spettrofotometrico diretto di attività mirosinasica come descritto all’esempio 4.

Tabella 16 – Attività mirosinasica in estratti di senape liofilizzati prima e dopo dialisi e in presenza o assenza di trealosio all’1%.

Liofilizzato di Attività

Estratto filtrato(A) 50 U/g

Estratto filtrato trealosio 1% (B) 40 U/g

Estratto dializzato (C) 500 U/g

Estratto dializzato trealosio 1% (D) 100 U/g

Il prodotto indicato con la lettera C à ̈ risultato possedere la più elevata attività enzimatica riferita al peso ed à ̈ da preferire per la preparazione di formulati con l’estratto idroalcolico liofilizzato.

Esempio 7: idrolisi dei GL di germogli di cavolo nero toscano con estratto di senape dializzato e liofilizzato

a) idrolisi in acqua

A 2 ml di estratto idroalcolico liofilizzato e risolubilizzato in acqua, con una concentrazione di GRA di 28 µmoli/ml, sono stati aggiunti 2,0 mg di liofilizzato di estratto di senape dializzato di tipo C, corrispondenti ad 1 U.

Dopo 30 minuti la soluzione à ̈ risultata torbida a causa della formazione di sulforafano, scarsamente solubile in acqua. Dopo 3 ore il campione à ̈ stato analizzato come segue:

- analisi dei glucosinolati per determinare la percentuale di GRA idrolizzata; - analisi del sulforafano: tramite estrazione in colonna EXtrelut e analisi HPLC;

- analisi della presenza di isotiocianati coniugati a proteine con il metodo del benzeneditiolo (del tione);

- analisi del sulforafano dopo che un’aliquota di campione à ̈ stata liofilizzata e risolubilizzata in un uguale volume di acqua.

I risultati sono di seguito riportati in figura 1 e 2:

- dopo le tre ore di reazione il cromatogramma HPLC presenta un piccolo picco corrispondente alla GRA (figura 1). L’idrolisi à ̈ avvenuta al 95%, indicando l’uso di una quantità di mirosinasi leggermente scarsa;

- il sulforafano à ̈ risultato essere 18,9 µmoli/ml di soluzione corrispondente a circa il 67% della quantità di µmoli/ml di GRA iniziale;

- l’analisi con il metodo del Tione ha fornito un dato che corrisponde a una quantità totale di isotiocianati di 17,6 µmoli/ml, ad indicare che tutto il sulforafano che si à ̈ formato dall’idrolisi enzimatica dell’estratto rimane in forma libera e non si coniuga a proteine;

- dopo la liofilizzazione del campione idrolizzato, il sulforafano à ̈ risultato essere corrispondente a 16,7 µmoli/ml (figura 2), con una perdita di circa il 5-10%.

b) idrolisi in tampone fosfato

275 mg di estratto idroalcolico liofilizzato sono stati solubilizzati in 25 ml di tampone fosfato 25 mM pH 7 (concentrazione GRA di circa 3 µmoli/ml). Ad essi sono stati aggiunti 12,6 mg di liofilizzato di estratto di senape dializzato “tipo C†(circa 6 U di mirosinasi).

Al termine dell’idrolisi enzimatica del campione (over night), sono state eseguite le analisi HPLC del sulforafano prima e dopo la liofilizzazione. 1 ml di ciascuno dei due campioni à ̈ stato estratto in colonna EXtrelut ed eluito con 6 ml di Acetato di Etile, ottenendo un volume di eluato di 5,0 e 5,2 ml rispettivamente. Di questi 300 µl sono stati portati a secco e risolubilizzati in un uguale volume di acetonitrile al 10% per l’esecuzione dell’analisi HPLC. I risultati ottenuti mostrano che:

- il valore di concentrazione del sulforafano à ̈ risultato superiore a 3 µmoli/ml, indicando una completa trasformazione della GRA dell’estratto idroalcolico liofilizzato;

- il campione idrolizzato e liofilizzato ha fornito un valore di sulforafano di circa il 68% rispetto a quello presente prima del processo di liofilizzazione. La concentrazione di GRA risulta stabile in tutti i preparati liofilizzati (germogli o estratto idroalcolico), se tenuti al riparo dall’umidità, almeno per sei mesi a temperatura ambiente, e per anni a -20°C.

Esempio 8: effetto su enzimi detossificanti ed antiossidanti di Fase 2 di estratti idroalcolici di Brassica oleracea L. var. acephala subivar. Laciniata L. in combinazione con estratti di Sinapis alba L. in epatociti di ratto

Le colture di epatociti primari di ratto sono un ottimo modello in vitro per studi farmaco-tossicologici. Per mimare una situazione paragonabile a quella in vivo à ̈ importante utilizzare una coltura tridimensionale di epatociti messi in coltura tra due strati di collagene che permettono il ripristino della polarità cellulare, la secrezione di sostanze come albumina, transferrina, fibrinogeno, urea e sali biliari ed il mantenimento di alcune funzioni cellulari come l’adesione, la migrazione, la differenziazione, la regolazione della crescita, l’espressione genica se mantenute per più di sei settimane in queste condizioni.

Isolamento di epatociti di ratto:

Ratti maschi Sprague Dawley del peso di circa 200 g, sono stati anestetizzanti mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di sodio pentobarbitale (0,1 ml/100g), dopodiché à ̈ stata effettuata un’incisione ad U sull’addome dell’animale. L’apertura della cavità addominale ha permesso l’estrazione del fegato che à ̈ stato sottoposto a perfusione in un apparato termostatato a 42°C con 5% CO2e 95% O2. La perfusione à ̈ stata effettuata in due fasi, mediante l’utilizzo di una cannula di vetro inserita nella vena porta. Nel primo passaggio à ̈ stata perfusa una soluzione tampone Krebs-Henseleit buffer (KHB) priva di calcio (soluzione sterile a pH 7,4 contenente NaHCO30,154 M, NaCl 0,154 M, KH2PO40,154 M,MgSO40,154 M), per la totale rimozione del sangue dall’organo; in un secondo momento, à ̈ stata utilizzata una soluzione tampone KHB contenente calcio (soluzione sterile a pH 7,4 contenente Ca2<+>-free KHB e CaCl20,11 M) e collagenasi (50 mg/100ml), per indurre la digestione della matrice di collagene. Dopo 40 minuti di perfusione, sono state purificate le cellule. Gli epatociti sono stati sospesi in mezzo Leibovitz contenente albumina sierica bovina al 0,2% (BSA) e filtrati in modo da ottenere un sedimento cellulare. Dopo la rimozione del sopranatante, le cellule sono state lavate in HEPES (soluzione sterile a pH 7,65 contenente 0,8% NaCl, 0,01% NaH2PO4.12H2O, 0,02% KCl,0,038% HEPES) per tre volte a 700 rpm per 2 minuti. Il pellet cellulare ottenuto à ̈ stato risospeso in terreno di coltura William’s denominato T0(terreno William’s supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS), antibiotici quali penicillina, streptomicina, kanamycina, ampicillina e 0,5 U/ml di insulina). Prima di utilizzare gli epatociti per studi in vitro à ̈ stato necessario determinarne la vitalità mediante conta cellulare con il Trypan Blue, un colorante vitale.

Trattamento epatociti

24 ore dopo l’aggiunta del secondo strato di collagene, le cellule sono state sottoposte al trattamento per 48 ore alla dose di 20µM, 40 µM e 60µM di estratto idroalcolico di germogli di cavolo laciniato nero toscano ottenuti da semi OD74 (di seguito indicato come OD74), cambiando il terreno ogni 24 ore. Questo estratto non contiene mirosinasi, che à ̈ stata aggiunta come estratto di senape preparato “ad hoc†. L’estratto OD74 e la mirosinasi avente una concentrazione iniziale di 30 U/ml sono stati incubati per mezz’ora a 37°C. Ogni volta, prima di iniziare il trattamento à ̈ stato osservato lo stato delle cellule al microscopio ottico.

Digestione collagenasi

Il giorno dopo la fine del trattamento, à ̈ stato rimosso il mezzo dalle piastre, per aggiungere 5-6 ml/piastra di una soluzione tampone KHB contenente glucosio (5,5 g/l), Ca<2+>mM e collagenasi (50 mg/100 ml). Per garantire l’azione della collagenasi, le piastre sono state incubate a 37°C per 30 minuti e agitate manualmente per 2-3 volte. Il contenuto delle piastre à ̈ stato recuperato e centrifugato a 1200 rpm per 5 minuti a 4°C. Il pellet ottenuto à ̈ stato risospeso in 10 ml di tampone di omogenizzazione. L’omogenato à ̈ stato poi centrifugato nelle stesse condizioni descritte precedentemente ed il pellet risultante à ̈ stato sospeso in un volume pari a 5 ml di tampone di omogeneizzazione e sonicato per 3 volte con intervalli della durata di 10 secondi. Da questo punto in poi si prosegue con la classica preparazione utilizzata per le frazioni microsomiali e citosoliche necessarie alla determinazione delle attività di fase 1 e 2.

Preparazione della frazione citosolica e microsomiale

L’omogenato ottenuto à ̈ stato centrifugato a 10.000 x g per 25 min a 4°C per ottenere la separazione tra precipitato, contenente nuclei e mitocondri, e sopranatante contenente la frazione microsomiale e citosolica. Il sopranatante à ̈ stato recuperato e ultracentrifugato a 33.000 rpm per 1 ora e 10 min a 4°C. Il nuovo sopranatante à ̈ stato stoccato in aliquote, congelato in N2liquido, conservato a –80 °C ed in seguito utilizzato per saggi enzimatici di fase 2. Il pellet ottenuto dalla stessa centrifugazione à ̈ stato nuovamente omogeneizzato ed ultracentrifugato per 50 min alle stesse condizioni, per separare le proteine microsomiali da quelle non microsomiali. Il precipitato à ̈ stato risospeso in un volume di tampone fosfato pH 7,4 pari al doppio del peso dei fegati. Il tampone di risospensione utillizzato conteneva K2HPO4100 mM ed EDTA 0,1 mM. Dopo un†̃ultima omogeneizzazione, le frazioni microsomiali sono state suddivise in aliquote, rapidamente congelate e conservate a –80 °C fino al loro utilizzo in saggi enzimatici di fase1.

Determinazione del contenuto di proteine microsomiali e citosoliche

Le proteine sono state determinate secondo il metodo descritto da Lowry in cui à ̈ stata utilizzata l’albumina sierica bovina come standard (Lowry OH et al.: Protein measurement with the Folin reagent. J. Biol. Chem. (1951), 193 (1): 265-275). Saggi di attività enzimatiche citosoliche

Catalasi (CAT)

La reazione di decomposizione dell’acqua ossigenata catalizzata dall'enzima catalasi à ̈ monitorata spettrofotometricamente a 240 nm in funzione del tempo. L’attività à ̈ calcolata attraverso la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 43,6 M<-1>x cm<1>.

Glutatione reduttasi (GSSH reduttasi)

In presenza del substrato glutatione ossidato e NADPH, l’enzima glutatione reduttasi catalizza la formazione di glutatione ridotto. Il consumo di NADPH à ̈ seguito spettrofotometricamente a 340 nm. L’attività à ̈ calcolata attraverso la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 6,22 mM<-1>x cm<-1>Glutatione S-trasferasi (GST)

L’enzima glutatione S-trasferasi coniuga il substrato 1-cloro-2,4-dinitrobenzene con il glutatione ridotto. La reazione di coniugazione à ̈ seguita allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 340 nm. Il calcolo dell’attività à ̈ effetuato secondo la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 9,6 mM<-1>x cm<-1>(Habib W.H. et al.:Glutatione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. (1974), 249 (22): 7130-7139).

NAD(P)H:chinone ossidoreduttasi (NQO1) o DT-diaforasi

L’attività di questo enzima si determina nel comparto citosolico seguendo la riduzione del DCPIP (2,6-fenolodicloroindofenolo) da parte del NADPH. Tale riduzione comporta una riduzione dell’intensità della colorazione del DCPIP, misurata spettrofotometricamente a 600 nm. Il ε à ̈ pari a 22,1 mM<-1>cm<-1>(Benson AM et al.: Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. (1980), 77 (9): 5216-5220).

Gli esperimenti evidenziano la capacità degli estratti di OD74 di indurre alcuni enzimi detossificanti ed antiossidanti. Come si può vedere dalla tabella 17 gli estratti di OD74 provocano una induzione della DT-diaforasi, Catalasi, Glutatione trasferasi (GST) glutatione reduttasi (GSSH reduttasi). I dati riportati in tabella sono quelli relativi alla concentrazione di 60 µM di OD74 e dopo 48 ore di trattamento. La DT-diaforasi à ̈ aumentata rispetto al controllo di circa 4 volte, la GST e la Catalasi di circa 1,5 volte mentre la GSSH reduttasi di 1,4 volte. Come controllo positivo à ̈ stata utilizzata la glucorofanina (GRA) pura a 20 µM e i risultati in termini di capacità induttiva hanno mostrato valori simili.

Tabella 17 – attività dell’estratto di germogli di cavolo laciniato nero toscano OD74 (60 µM) su enzimi di fase 2 in confronto con glucorafanina pura (20 µM)

DT- GST CAT GSSH diaforasi (nmol/min/m (µmol/min/m reduttasi (nmol/min/ g prot) g prot) (nmol/min/m mg prot) g prot) Controllo 26,95 141,51 119,44 89,18

GRA 98,52 208,38 185,94 126,29

OD74 99,67 230,61 173,59 124,72

Claims (15)

1. Rivendicazioni 1. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati comprendente almeno le fasi di: a) irradiare germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con microonde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W; b) congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C; c) liofilizzare e macinare i germogli congelati; d) sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica con un solvente di estrazione consistente in una soluzione di etanolo:acqua in cui l’etanolo à ̈ al 70% p/p; e) opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare.
2. 2. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui l’irraggiamento con microonde dei germogli della fase a) à ̈ eseguito per un tempo compreso tra 0.5 e 2 minuti per strati degli stessi di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm.
3. 3. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui l’irraggiamento con microonde dei germogli della fase a) à ̈ a 800W per un tempo di 1 minuto per strati degli stessi di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm.
4. 4. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui alla fase d) i germogli liofilizzati e macinati sono sottoposti a due estrazioni idroalcoliche con un solvente di estrazione consistente in una miscela etanolo:acqua in cui l’etanolo à ̈ al 70% p/p.
5. 5. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo le rivendicazioni 1 e 4, in cui l’estrazione idroalcolica à ̈ eseguita in un rapporto 1 (germogli):20 (solvente di estrazione) p/v ad una temperatura compresa tra 0 e 25°C.
6. 6. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui un ulteriore step di rimozione della cuticola ai germogli à ̈ aggiunto prima dell’irraggiamento con microonde della fase a).
7. 7. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui alla fase e) dopo la rimozione del solvente e prima dell’ulteriore liofilizzazione opzionale à ̈ aggiunto trealosio.
8. 8. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui gli estratti idroalcolici hanno un titolo in glucorafanina almeno del 10% p/p.
9. 9. Composizioni per uso orale comprendenti estratti di germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) aventi un titolo in glucorafanina di almeno il 10% p/p in combinazione con eccipienti e/o diluenti di grado farmaceutico e/o alimentare.
10. 10. Composizioni per uso orale secondo la rivendicazione 9, in cui agli estratti à ̈ aggiunta mirosinasi in un rapporto estratto:enzima compreso tra 1:1 e 20:1 p/p.
11. 11. Composizioni per uso orale secondo la rivendicazione 10, in cui il rapporto estratto:enzima compreso tra 5:1 e 10:1 p/p.
12. 12. Composizioni per uso orale secondo una delle rivendicazioni 9-11, in cui tali composizioni sono in forma di compresse o capsule opzionalmente gastroprotette e/o colon-specifiche.
13. 13. Composizioni per uso orale secondo una delle rivendicazioni 9-11 in forma di supplementi nutrizionali.
14. 14. Uso delle composizioni secondo le rivendicazioni da 9 a 13 per la chemoprevenzione e/o chemoprotezione.
15. 15. Uso secondo la rivendicazione 14 per la chemoprevenzione e/o chemoprotezione dell’apparato respiratorio.