ITPD20090348A1

ITPD20090348A1 - Metodo per produrre glutatione extracellulare con alte rese

Info

Publication number: ITPD20090348A1
Application number: IT000348A
Authority: IT
Inventors: Livia Barenghi; Silvia Bradamante; Silvia Versari; Alessandro Villa
Original assignee: Silvia Bradamante
Priority date: 2009-11-21
Filing date: 2009-11-21
Publication date: 2011-05-22
Also published as: WO2011061713A1; EP2501823A1

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce a un processo per produrre glutatione. In particolare, l’invenzione riguarda una fermentazione ed un trattamento chimico e/o meccanico per produrre glutatione extracellulare (chiamato nel seguito GSH per brevità) che permette di ottenere GSH con alte rese e costi relativamente bassi.

Il GSH, γ-L-glutammil-L-cisteinilglicina, è un noto tripeptide che, in piccole quantità, è presente all’interno di tutte le cellule degli organismi viventi. Le sue molteplici funzioni sono importanti in diversi settori biomedici, tra cui enzimologia, farmacologia, tossicologia, endocrinologia e microbiologia.

Il GSH è uno dei più abbondanti antiossidanti presenti negli organismi viventi. E’ efficace nel ridurre i danni prodotti da radicali liberi e altri agenti ossidanti.

Il GSH è anche utilizzato come detossificante (per esempio, nell’avvelenamento da paracetamolo o da metalli pesanti) e come integratore dietetico per il trattamento, tra gli altri, di diabete, infertilità, cancro, cataratta e virus da immunodeficienza umana (HIV).

Il GSH è prodotto industrialmente mediante processi fermentativi in cui il prodotto è estratto dalle cellule microbiche. Allo scopo di ottenere alte rese di GSH, si può lavorare A) sull’aumento del contenuto di GSH intracellulare (mediante mutagenesi o opportune strategie di coltivazione), B) sull’aumento della densità cellulare (mediante ottimizzazione del processo produttivo) e C) sull’ottimizzazione della procedura di estrazione.

Metodi per aumentare la produzione di GSH da microrganismi sono descritti in diversi brevetti e/o studi scientifici.

Li Y. et al. in “Glutathione: a review on biotechnological production”, Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol. 66, 233-242 riassume l’avanzamento tecnologico e i risultati ottenuti nell’ambito della produzione di GSH durante gli ultimi trent’anni. In particolare descrive sia le varie strategie di coltura ed estrazione, sia le tecniche di mutagenesi adottate dai vari gruppi di ricerca. WO 2004/003217 descrive un processo per produrre GSH che prevede la coltivazione, in opportune condizioni che promuovano la produzione di GSH, di un ceppo di lievito che abbia una o più mutazioni geniche che abbiano come risultato una secrezione di GSH nel terreno di coltura significativamente aumentata rispetto al ceppo parentale non mutato. Con tale processo si ottengono fino a 20 µmoli/L di GSH extracellulare.

Liao X.Y. et al., in “Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli”, Lett Appl Microbiol, 2006, vol. 43, 211-214, descrive come aumentare la produzione di GSH in Escherichia coli utilizzando diversi costrutti genetici contenenti i geni della biosintesi del GSH, gshI e gshI I , fino ad ottenere 34,8 mg/g di peso umido di cellule.

Lin J. et al., in “Enhancement of glutathione production in a coupled system of adenosine-deaminase-deficient recombinant Escherichia coli and Saccharom yces cerevisiae”, Enzyme and Microbiol Tecnology, 2009, 44, 269-273, descrive un sistema accoppiato ad alta efficienza per la rigenerazione dell’ATP, metabolita energetico necessario per la produzione enzimatica del GSH. Tale sistema, costruito con E. coli e S. cerevisiae ambedue deficitari del gene dell’adenosina deaminasi, consente di migliorare la resa fino a 2.94 volte quella ottenuta con il controllo. La concentrazione di GSH raggiunta dopo 6 ore è 7.82 mM.

L’utilizzo di microrganismi ingegnerizzati supera il problema delle basse rese di produzione, con lo svantaggio che spesso le mutazioni introdotte non sono stabili.

EP1391517 descrive un metodo per ottenere GSH comprendente a) l’ottenimento di una biomassa attraverso una pre-coltura in condizioni aerobiche di un ceppo di lievito produttore di GSH in cui il contenuto di GSH per unità di biomassa sia > 1,2% w/w; b) la coltivazione in condizioni aerobiche della risultante biomassa fino a ottenere una biomassa di densità > 50 g/L; c) l’attivazione della biomassa ottenuta in modo da innescare la produzione di GSH e, infine, d) il recupero della biomassa coltivata, l’estrazione del GSH mediante rottura delle cellule e la sua purificazione. La resa di produzione di GSH ottenuta con il metodo sopra citato è bassa se confrontata alla quantità di biomassa utilizzata. Inoltre, l’estrazione del GSH avviene mediante rottura delle cellule.

Zhang T. et al., in “Optimization of the medium for glutathione production in Saccharom yces cerevisiae”, Process Biochem, 2007, vol. 42, 454–458, descrive come ottimizzare il terreno di coltura per aumentare le rese di produzione di GSH. Il terreno di coltura ottimizzato dà una resa di GSH intracellulare pari a 74.6 mg/L.

Udeh K.O. et al., in ”High-glutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production”, Acta Microbiol Pol, 1997, vol. 46, 105-114, descrive come ottimizzare la composizione del terreno di coltura per la produzione di GSH utilizzando un ceppo di Saccharom yces cerevisiae ad alto contenuto di glutatione. Con il metodo descritto, si ottengono fino a 17 mg di GSH /g di peso secco di lievito.

Xiong Z.Q. et al., in “Efficient extraction of intracellular reduced glutathione from fermentation broth of Saccharom yces cerevisiae by ethanol”, Bioresour Technol, 2009, vol. 100, 1011-1014, descrive come estrarre GSH dal terreno di coltura, senza la rottura delle cellule, utilizzando etanolo. L’estrazione con etanolo presenta molteplici vantaggi, principalmente il minor consumo di energia, la non distruzione delle cellule e una minor concentrazione di proteine nel brodo colturale, tutti fattori che possono ridurre la complessità e i costi del processo di purificazione.

Tale metodo comunque, se comparato alle tecniche di estrazione convenzionali (per esempio estrazione con acqua bollente), non presenta vantaggi significativi sulla resa di produzione di GSH.

Negli ultimi anni le tecniche di estrazione del GSH sono state notevolmente ottimizzate, diminuendo il consumo di solvente, accorciando i tempi di estrazione, aumentando le rese e la qualità degli estratti.

EP1500944 descrive come ottenere alte rese di GSH extracellulare mediante la coltivazione del lievito Saccharom yces cerevisiae in un bioreattore che simula una condizione di ridotta gravità. Con tale approccio si ottiene fino al 7% w/dw di GSH extracellulare. Il vantaggio di tale metodo consiste sia nelle alte rese di produzione, sia nel fatto che il GSH prodotto è extracellulare e quindi recuperabile dal terreno di coltura senza la rottura delle cellule.

Nonostante i metodi sopra descritti presentino un aumento della produzione di GSH e/o un’ottimizzazione del processo di estrazione e purificazione, talvolta risultano complessi, in particolare ad esempio di difficile utilizzo industriale, o consentono di ottenere rese di produzione ancora relativamente basse.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di fornire un metodo per la produzione di GSH che superi i limiti sopra esposti con riferimento alla tecnica nota citata.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è fornire un metodo semplice ed efficiente per ottenere alte rese di GSH extracellulare evitando l’introduzione di mutazioni geniche e/o la rottura delle cellule utilizzate per la sua produzione.

Questo scopo è raggiunto da un metodo per la produzione di GSH tramite un processo di fermentazione in accordo con le rivendicazioni seguenti.

In particolare il processo di produzione del GSH extracellulare secondo l’invenzione comprende le seguenti fasi: coltivare un microrganismo in un opportuno terreno, fornire alla coltura almeno un agente ossidante per indurre la produzione di GSH da parte di tale microrganismo, somministrare alla coltura almeno un agente modificatore atto a promuovere l’apertura di almeno un canale ionico cellulare in tale microrganismo in modo da favorire la fuoriuscita di GSH.

Con il processo dell’invenzione si ottengono rese elevate di GSH, la quantità rilasciata di GSH nel terreno di coltura è ≥ 8% (% di peso di GSH/peso secco di lievito).

Inoltre con il metodo dell’invenzione è possibile recuperare il GSH dal terreno di coltura senza dover distruggere il microrganismo produttore, né tantomeno purificare il GSH da altri composti rilasciati in seguito alla rottura del microrganismo stesso, rottura che avviene in numerosi metodi della tecnica nota per recuperare il GSH prodotto al suo interno.

Con il processo dell’invenzione è possibile isolare il GSH dal terreno di coltura in maniera semplice ed economica.

Inoltre la produzione di GSH con il processo dell’invenzione può essere eseguito potenzialmente in continuo.

Per attuare il processo dell’invenzione possono essere utilizzati microrganismi wild type o anche mutati.

In una forma preferita di attuazione, l’invenzione prevede di usare almeno un ceppo di lievito come microrganismo produttore.

Secondo una forma ulteriormente preferita di attuazione dell’invenzione, è previsto usare il ceppo di lievito Saccharom yces cerevisiae, identificato come L5267 (collezione privata Le Saffre). Le caratteristiche morfologiche, sessuali e nutrizionali del ceppo utilizzato sono conformi alle caratteristiche tipiche della specie di lievito utilizzata, come descritte per esempio da J.A. Barnet et al. in “YEAST: Characteristics and identification”, (Third ed. Cambridge University, 2000).

Secondo un’ulteriore preferito esempio, è previsto utilizzare ceppi di lievito Candida ut ilis.

Per l’attuazione del processo dell’invenzione si possono utilizzare lieviti aploidi o anche poliploidi.

In altre versioni dell’invenzione, può essere previsto utilizzare come microrganismo produttore di GSH ceppi di alghe acquatiche (es. diatomee marine) per la decontaminazione delle acque inquinate da metalli (come quelle descritte nell’articolo di Kawakami S.K. et al. BioMetals, 2006,19,51-60).

In altre versioni, può essere previsto utilizzare come organismo produttore cellule microbiche in forma planctonica o che si organizzano in biofilm.

Secondo una differente forma di attuazione preferita, come microrganismo produttore è usato un ceppo batterico, ancora più preferibilmente comprendente Escherica Coli. E’ noto in letteratura che tale ceppo è in grado di produrre GSH.

Per l’attuazione del processo dell’invenzione il terreno di coltura può essere un qualunque terreno di coltura, liquido o solido atto a garantire la vitalità cellulare.

Secondo l’invenzione vengono utilizzati agenti modificatori per indurre direttamente e/o indirettamente l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici del microrganismo in modo da favorire la fuoriuscita di GSH.

Preferibilmente, nel processo dell’invenzione vengono utilizzati agenti modificatori atti a causare l’apertura dei canali del Cloro del microorganismo.

Più preferibilmente, possono essere utilizzati agenti modificatori atti a causare l’apertura dei canali Bromo, e/o Potassio, e/o Sodio, e/o Calcio. Gli agenti modificatori utilizzati nell’invenzione per aprire uno o più canali ionici delle cellule presenti nel terreno di coltura possono essere di tipo chimico e/o meccanico.

In una forma preferita di attuazione dell’invenzione è fornito un agente modificatore tale da causare la disorganizzazione / depolarizzazione / depolimerizzazione di componenti del citoscheletro del microrganismo.

Il trattamento produce cambiamenti nel citoscheletro cellulare tali da causare direttamente e/o indirettamente l’apertura di almeno uno dei canali ionici con conseguente fuoriuscita del GSH dal microrganismo, dopo esserne stata stimolata la produzione al suo interno.

In alcuni esempi preferiti di realizzazione è previsto fornire agenti modificatori atti ad agire direttamente o indirettamente sull’actina del microrganismo.

L’agente modificatore può essere un composto chimico (ad esempio della classe delle citocalasine) che, agendo direttamente sull’actina, altera l’equilibrio monomero/polimero depolimerizzando le fibre di actina, determinando l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici cellulari e conseguentemente la fuoriuscita di GSH. E’ noto infatti che le citocalasine sono anche attivatori dei canali ionici cellulari.

In una versione preferita è previsto utilizzare la diidrocitocalasina B (DHCB), un derivato saturo della citocalasina B, che accorcia i filamenti di actina col vantaggio di non interferire nel trasporto degli zuccheri.

In altre versioni dell’invenzione possono essere utilizzati agenti chimici che sono disorganizzatori/depolarizzatori/depolimerizzatori indiretti dell’actina. Tali composti, mediando un ampio spettro di risposte cellulari che coinvolgono il citoscheletro, alterano indirettamente l’equilibrio monomero/polimero dell’actina, causando quindi l’apertura dei canali ionici e, conseguentemente, la fuoriuscita di GSH dalle cellule.

Esempi di depolarizzatori/depolimerizzatori indiretti dell’actina sono gli inibitori della Rho-Kinasi (ROCK). La Rho-kinasi, è una kinasi serina-treonina target di Rho. È un importante regolatore del citoscheletro che media gli effetti di RhoA (Ras homolog gene family, member A) sulla stabilizzazione delle fibre di actina, contrazione della muscolatura liscia, adesione cellulare, formazione di podi sulla membrana e motilità cellulare.

Tra i vari composti del summenzionato tipo può essere utilizzato, per esempio, l’agente chimico Y-27632, (R)-(+)-t rans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate.

In un’ulteriore distinta forma di realizzazione preferita del processo dell’invenzione, per favorire la fuoriuscita del GSH dal microorganismo si può utilizzare un agente meccanico, come, ad esempio, l’ipergravità.

Una variazione della pressione esterna/interna cellulare tale da modificare l‘equilibrio osmotico altera, infatti, la struttura del citoscheletro provocando l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici e favorendo la fuoriuscita di GSH. Per ottenere ipergravità si può ad esempio sottoporre il microrganismo a centrifugazione.

Nel processo dell’invenzione, per favorire la produzione di GSH nel microorganismo produttore, è previsto fornire un agente induttore di stress, come, ad esempio, ossigeno o un altro agente ossidante.

Preferibilmente viene fornita una quantità di ossigeno tale da generare uno stress ossidativo medio senza danneggiare le cellule. Più preferibilmente la quantità di ossigeno è ≥ 4%. Lo stress ossidativo viene generato ad esempio mediante gorgogliamento di ossigeno molecolare nel terreno di coltura o mediante scambio gassoso superficiale.

Il processo dell’invenzione può essere attuato in batch, fed-batch o in continuo.

Il processo dell’invenzione consente di incrementare fortemente la produzione di GSH da parte del microrganismo e la sua fuoriuscita in modo da renderlo disponibile e separabile nel terreno di coltura senza la rottura delle cellule stesse.

Infine il processo dell’invenzione può comprendere, inoltre, una fase in cui è previsto estrarre e raccogliere il GSH prodotto in modo da renderlo disponibile per un uso successivo.

La fase di estrazione del GSH dal terreno di coltura, può essere effettuata, per esempio, tramite la precipitazione del sale corrispondente in presenza di acido solforico (H2SO4) nel quale il suddetto sale, dopo salificazione dell’acido solforico, diviene insolubile.

Il procedimento dell’invenzione fornisce un metodo semplice, efficiente e potenzialmente più economico per produrre GSH extracellulare, consentendo di incrementare la produzione di GSH e al tempo stesso di recuperare in maniera semplice il GSH dal terreno di coltura.

I seguenti esempi illustrano le caratteristiche e i vantaggi dell’invenzione meglio descritti a titolo indicativo e non limitativo con riferimento agli uniti disegni in cui:

− la fig. 1 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante centrifugazione (ipergravità raggiunta pari a 10g) secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 1);

− la fig. 2 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante aggiunta di DHCB secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 2);

− la fig. 3 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante aggiunta di Y-27632 secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 3).

ESEMPIO 1

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare il ceppo omotallico poliploide L5267 (collezione privata Le Saffre).

Il lievito è stato sospeso a una concentrazione di 2,5% di peso secco in un terreno di coltura acquoso avente la seguente composizione: 3,5 g/L di KH2PO4, 0,37 g/L di KOH, 7 g/L di (NH4)2SO4, 0,5 g/L di MgSO4, 10 g/L di Na3C3H5O(COO)3, 4 g/L di cisteina, 4 g/L di glicina, 40 g/L di glucosio.

Il lievito è stato coltivato per 24 ore (tempo di fermentazione) a 28 °C.

Come agente meccanico disorganizzatore/depolarizzatore/depolimerizzatore dell’actina è stata utilizzata l’ipergravità, ottenuta sottoponendo le cellule ad una centrifugazione di 10 g mediante l’utilizzo della MidiCAR (Medium Sized Centrifuge for Acceleration Research, DESC, Amsterdam, The Netherlands). Il terreno di coltura è mantenuto ossidato durante tutto il periodo della fermentazione in ambiente saturo di ossigeno.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione, come confermato dal consumo di glucosio extracellulare e dalla concomitante produzione di etanolo e glicerolo. Il contenuto di trealosio intracellulare è pressoché costante.

Alla fine della fermentazione (dopo 24 ore) le cellule di lievito vengono separate dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di glutatione intra- ed extracellulare prodotto mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC).

La concentrazione di GSH è determinata secondo il metodo riportato da Lakritz et al. Anal Biochem 1997, 247, 63-68. In particolare, i campioni sono analizzati tramite HPLC a fase inversa utilizzando una colonna cromatografica Purospher® RP-18 “endcapped” di 5 ǋm (Merck) ed un rilevatore spettrofotometrico (Ǌ=210 nm). Il solvente utilizzato contiene NaH2PO425mM. Il pH, ottenuto mediante l’utilizzo di acido trifluoroacetico 1M, è 3,5. Il flusso, ottimizzato, è 0,6 mL/min.

L’identificazione e la misura della concentrazione di GSH sono effettuate utilizzando una soluzione standard di GSH (Sigma).

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata integrando i relativi picchi rispetto a uno standard interno a concentrazione nota (benzene d6, C6D6).

Il processo dell’invenzione consente di ottenere alte rese di GSH extracellulare. In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈8% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito). La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%.

L’aggiunta al terreno di coltura di 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB), inibitore dell’apertura del canale cloro, a una concentrazione di 10<-5>M, inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%.

La figura 1 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 di cui sopra;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 senza sottoporre il microrganismo a centrifugazione;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura come sopra descritto.

Come evidente, la centrifugazione aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto a quanto avviene in un pari processo in cui non avviene centrifugazione; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di centrifugazione.

ESEMPIO 2

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare un ceppo omotallico poliploide, lo stesso ceppo utilizzato nell’Esempio 1.

È stata generata una sospensione di lievito fino a ottenere una concentrazione pari a 2,5% di peso secco nel terreno di coltura.

Il terreno di coltura scelto ha la medesima composizione del terreno di coltura utilizzato nell’Esempio 1.

Il ceppo è stato coltivato per 24 ore a 28 °C.

Durante tutto il periodo della fermentazione, le cellule di lievito sono trattate con diidrocitocalasina B (DHCB), un derivato saturo della citocalasina B, che depolimerizza l’actina bloccando l’addizione monomerica all’estremità di crescita del polimero e non interferisce nel trasporto degli zuccheri.

La diidrocitocalasina B è aggiunta al terreno di coltura a una concentrazione di 3 µM.

Il terreno di coltura è mantenuto ossidato durante tutto il periodo della fermentazione in ambiente saturo di ossigeno.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione come confermato dal consumo di glucosio extracellulare e la concomitante produzione di etanolo e glicerolo.

La diidrocitocalasina B provoca sia la depolimerizzazione dell’actina sia l’attivazione dei canali ionici, favorendo la fuoriuscita del GSH prodotto.

Alla fine della fermentazione, il lievito viene separato dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di GSH intra- ed extracellulare prodotto mediante analisi HPLC come indicato nell’Esempio 1.

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata come indicato nell’Esempio 1.

I risultati sono confermati utilizzando il kit “Glutathione Assay” (Sigma). Il processo dell’invenzione consente di ottenere elevate rese di GSH extracellulare.

In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈ 8% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito).

La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%.

L’aggiunta al terreno di coltura di NPPB, inibitore dell’apertura del canale cloro, ad una concentrazione di 10<-5>M (come in Esempio 1), inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra, come visualizzato in figura 2. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. La figura 2 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 2 di cui sopra;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 2 senza aggiunta di DHCB; - secondo quanto descritto nell’Esempio 2 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura (non solo DHCB) come sopra descritto.

Come evidente, l’aggiunta di DHCB aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto a quanto avviene in un pari processo in cui non è fatta tale aggiunta; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di DHCB.

ESEMPIO 3

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare un ceppo omotallico poliploide, lo stesso ceppo utilizzato negli Esempi 1 e 2. È stata generata una sospensione di lievito fino a ottenere una concentrazione di lievito pari a 2,5% di peso secco nel terreno di coltura avente la medesima composizione di quello utilizzato negli Esempi 1 e 2. Il ceppo è stato coltivato per 24 ore a 28 °C.

Durante l’intero periodo di fermentazione le cellule di lievito sono sottoposte all’azione del composto (R)-(+)-t rans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate (Y-27632), un inibitore di ROCK molto potente e selettivo, non tossico, in grado di permeare le cellule, che causa la depolimerizzazione dell’ actina.

Y-27632 è aggiunto al terreno di coltura a una concentrazione di 10<-4>M. Il terreno di coltura è mantenuto ossidato per tutto il periodo della fermentazione (24 ore) in ambiente saturo di ossigeno.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione come confermato da consumo di glucosio extracellulare e concomitante produzione di etanolo e glicerolo.

Alla fine della fermentazione, il lievito viene separato dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di GSH intra- ed extracellulare prodotto mediante analisi HPLC, come negli Esempi 1 e 2.

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata come indicato negli Esempi 1 e 2.

I risultati sono confermati utilizzando il kit “Glutathione Assay” (Sigma). Il processo dell’invenzione consente di ottenere elevate rese di GSH extracellulare. In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈ 12,5% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito). La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. L’aggiunta al terreno di coltura di NPPB, ad una concentrazione di 10<-5>M (come negli Esempi 1 e 2), inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. La figura 3 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 3 di cui sopra;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 3 senza aggiunta di Y-27632; - secondo quanto descritto nell’Esempio 3 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura (non solo Y-27632) come sopra descritto.

Come evidente, l’aggiunta di Y-27632 aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto ad un pari processo in cui non è fatta tale aggiunta; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di Y-27632.

I dati mostrati in tutti e tre gli esempi evidenziano che, trattando le cellule secondo il processo dell’invenzione, si ottengono rese di produzione di GSH extracellulare molto più elevate rispetto a quelle ottenibili con le tecniche già note, senza dover ricorrere a mutazioni e/o rottura delle cellule.

Inoltre, con il processo dell’invenzione è possibile ottenere GSH extracellulare senza distruzione delle cellule della coltura.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Processo per la produzione di GSH ext racellulare com prendente le seguent i fasi: — colt ivare un m icrorganism o produt tore in un opportuno terreno di coltura, — fornire alla coltura alm eno un agente ossidante per favorire la produzione di GSH da parte del m icrorganism o, — som m inist rare alla coltura alm eno un agente m odificatore at to a prom uovere l’apertura di alm eno un canale ionico del m icrorganism o, in m odo da favorire la fuoriuscita di GSH.
2. Processo secondo la r ivendicazione precedente, in cui det to agente m odificatore è un agente m odificatore at to a causare l’apertura dei canali ionici del Cloro del m icrorganism o.
3. Processo secondo la r ivendicazione 1, oppure 2, in cui det to agente m odificatore è un agente m odificatore diret to at to a causare diret tam ente l’apertura di det to alm eno un canale ionico del m icrorganism o.
4. Processo secondo la r ivendicazione 1, oppure 2, in cui det to agente m odificatore è un agente m odificatore indiret to at to a causare indiret tam ente l’apertura di det to alm eno un canale ionico del m icrorganism o.
5. Processo secondo una o più delle r ivendicazioni precedent i, in cui det to agente m odificatore è un agente m odificatore tale da causare la disorganizzazione del citoschelet ro del m icrorganism o o di suoi com ponent i.
6. Processo secondo una o più delle rivendicazioniprecedenti,in cuidetto agente m odificatore è un agente m odificatore dell’actina del m icrorganism o.
7. Processo secondo la rivendicazione precedente, quando dipendente dalla rivendicazione 3,in cuidetto agente m odificatore è un com posto scelto nelgruppo delle citocalasine.
8. Processo secondo la rivendicazione precedente, in cuidetto agente m odificatore è un derivato saturo della citocalasina B.
9. Processo secondo la rivendicazione precedente,in cuidetto derivato saturo è la diidrocitocalasina B (DHCB).
10. Processo secondo la rivendicazione 5, quando dipendente dalla rivendicazione 4,in cuidetto agente m odificatore è un inibitore della Rho-Kinasi(ROCK).
11. Processo secondo la rivendicazione precedente,in cuidetto inibitore della Rho-Kinasi è Y-27632, (R)-(+)-trans-4-(1-Am inoethyl)-N-(4-Pyridyl)cyclohexanecarboxam ide dihydrochloride m onohydrate.
12. Processo secondo una o più delle rivendicazionida 1 a 6,in cuidetto agente m odificatore com prende uno stress m eccanico ottenuto sottoponendo ilm icrorganism o ad ipergravità.
13. Processo secondo la rivendicazione precedente, in cui detto stress m eccanico è ottenuto sottoponendo il m icrorganism o a centrifugazione.
14. Processo secondo una o più delle rivendicazioniprecedenti,in cuidetto m icrorganism o è m utato.
15. Processo secondo una o più delle rivendicazionida 1 a 13,in cuidetto m icrorganism o è wild type.
16. Processo secondo una o più delle rivendicazionida 1 a 13,in cuidetto m icrorganism o com prende alm eno un ceppo dilievito.
17. Processo secondo la rivendicazione precedente,in cuidetto alm eno un ceppo dilievito è un ceppo diSaccharom ycescerevisiae.
18. Processo secondo una o più delle rivendicazionida 1 a 14,in cuidetto m icrorganism o com prende alm eno un ceppo batterico.
19. Processo secondo la rivendicazione precedente, in cui detto microrganismo comprende Escherica Coli.
20. Processo secondo una o più delle rivendicazioniprecedenti,in cuidetto agente induttore distressè ossigeno atto a generare una condizione di stressossidativo in detto m icrorganism o.
21. Processo secondo la rivendicazioniprecedente,in cuidetto ossigeno è presente in concentrazione superiore o uguale al4% .
22. Processo, secondo una o più delle rivendicazioniprecedenti, in cui detto processo viene attuato in batch,fed-batch o in continuo.