ITPD20120107A1 - Metodo di preparazione e purificazione di una proteina vegetale impiegabile come dolcificante - Google Patents

Description

Metodo di preparazione e purificazione di una proteina vegetale impiegabile come dolcificante

Campo dell’invenzione

L’invenzione à ̈ relativa ad un metodo di preparazione della brazzeina non glicosilata mediante espressione in Pichia pastoris. Il codon usage della sequenza genomica codificante per la proteina brazzeina à ̈ stato ottimizzato in funzione del sistema di espressione.

Stato della tecnica

Il consumo di saccarosio attraverso la dieta à ̈ implicato più o meno direttamente nell’insorgenza di diverse patologie quali ad esempio obesità, carie dentali, malattie cardiovascolari, ipertensione, alcuni tipi di cancro e diabete mellito. Ad oggi, all’incirca 300 milioni di persone nel mondo soffrono di diabete ed i primi dieci paesi in cui si riscontra il numero più alto di casi di diabete sono: India, Cina, USA, Indonesia, Giappone, Pakistan, Russia, Brasile, Italia e Bangladesh. L’epidemia globale di obesità e sovrappeso assieme alle altre conseguenze dovute all’elevato consumo di zuccheri, sta rapidamente diventando uno dei principali problemi di salute pubblica. In questo contesto, la domanda di nuovi ingredienti dolcificanti, possibilmente di origine naturale, à ̈ molto elevata.

Nella ricerca di composti “dolcificanti†in sostituzione degli zuccheri, particolare interesse sembra avere la brazzeina. Si tratta di una proteina isolata per la prima volta dal frutto della pianta Africana Pentadiplandra brazzeana Bailon nel 1994 (Ming D. et al., 1994). Tra le sei proteine “dolci†sinora identificate, la brazzeina sembra essere la più promettente. Rispetto alle altre proteine di questa classe, à ̈ caratterizzata da alte resistenze al calore e al pH, nella sua forma nativa non à ̈ glicosilata e, riferendosi ai dati riportati in letteratura, possiede un potere dolcificante 500-2000 volte superiore al saccarosio in termini di SE (Equivalenti di Saccarosio) (Berlec A. et al, 2006).

Le limitazioni connesse con l’impiego della brazzeina in campo alimentare sono correlate all’ottenimento della pianta e le complicazioni associate alla produzione e coltivazione in larga scala sono le principali ragioni che rendono la produzione di brazzeina da pianta economicamente non sostenibile. Una soluzione alternativa e più economica per la produzione industriale di tale proteina à ̈ offerta dalla tecnologia del DNA ricombinante.

Pichia pastoris rappresenta un sistema di espressione esemplare per la produzione di proteine per tre ragioni fondamentali: i) può essere facilmente manipolato a livello genetico; ii) à ̈ in grado di esprimere alti livelli di proteine ricombinanti; iii) apporta modifiche post-trascrizionali sulla sequenza proteica (glicosilazioni, formazione di ponti disolfuro, processamento proteolitico, ecc.) in modo simile a quanto si osserva in organismi cellulari eucariotici superiori.

Infatti, Pichia pastoris à ̈ un microorganismo da lungo tempo e comunemente impiegato per la produzione di proteine eterologhe sia per ricerca che per applicazioni industriali (Cregg J.M. et al., 1993; Cereghino J.L. and Cregg J.M., 2000).

Miles L. et al. (Miles L. et al. 2010) descrivono un metodo di preparazione della brazzeina per espressione della stessa in lieviti ed in particolare in Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. La proteina, o parte di essa, prodotta secondo il metodo descritto nel brevetto sopracitato, viene però modificata dal sistema di espressione con l’aggiunta di glicosilazioni.

E’ noto che lieviti quali Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae possono modificare la proteina aggiungendo oligosaccaridi che differiscono da quelli osservati nei mammiferi per composizione e pattern di distribuzione delle unità saccaridiche. Tali modificazioni possono indurre reazioni allergiche nell’uomo poiché:

- la proteina con un diverso pattern di glicosilazione può essere riconosciuta dal sistema immunitario come sostanza non-self;

- catene oligosaccaridiche di maggiori dimensioni o glicosilazioni in siti diversi da quelli della proteina nativa possono impedire l’accesso ai siti di taglio sulla sequenza peptidica da parte delle protesi del tratto digestivo, come ad esempio la pepsina.

L’aggiunta di glicosilazioni non native può inoltre mascherare siti catalitici o domini di interazione della proteina, causandone la perdita parziale o totale di attività biologica e di conseguenza limitarne l’efficacia nel prodotto finale. Questo à ̈ il caso, ad esempio, della proteina ad attività Antifreeze ISP Type III HPLC 12, impiegata nella formulazione di gelati e prodotta per via ricombinante con l’impiego di Saccharomyces cerevisiae. Al termine del processo di fermentazione del lievito, si ottiene un prodotto contenente la proteina in forma attiva ed una miscela di isoforme glicoconiugate inattive (EFSA, 2008).Per quanto riguarda i possibili siti di glicosilazione, à ̈ noto che Pichia pastoris à ̈ in grado di aggiungere oligosaccaridi a residui di Asparagina all’interno di sequenze Asn-X-Thr/Ser, dove X à ̈ un qualsiasi aminoacido ad esclusione della Prolina. Un altro sito consensus di glicosilazione in lievito à ̈ stato identificato nella sequenza Asn-X-Cys (Knauer et al., 1999); tale sito à ̈ presente nella sequenza amminoacidica della brazzeina. La glicosilazione dei residui di Serina e Treonina à ̈ invece più imprevedibile in quanto non esistono dati circa la specificità e la frequenza con cui questo tipo di modificazione avviene. Non à ̈ generalmente possibile prevedere se e come una data proteina verrà glicosilata da Pichia, sulla base del fatto che essa venga glicosilata o meno nell’organismo di provenienza (Cregg J.M. et al., 2000).

Attualmente, le strategie che si possono adottare per impedire che Pichia apporti glicosilazioni non desiderate alla proteina sono:

- sostituzione delle Asparagine nei potenziali siti bersaglio di glicosilazione.

Possibili complicazioni possono insorgere qualora il residuo di Asparagina sia critico per mantenere la struttura/funzione della proteina.

- espressione “intracellulare†o “citosolica†della proteina. In questo modo si evita alla proteina il passaggio per i compartimenti del Reticolo Endoplasmatico e Golgi, nei quali sono contenuti gli enzimi responsabili del processo di glicosilazione, pur perdendo i vantaggi in termini di semplicità del processo di purificazione che si otterrebbero sfruttando la via di secrezione.

L’espressione citosolica à ̈ inoltre un’alternativa difficilmente percorribile nel caso in cui la proteina necessiti di altre modificazioni post-traduzionali, quali ad esempio la formazione di ponti disolfuro.

È ancora attuale, quindi, l’esigenza di disporre di un metodo di preparazione della brazzeina mediante tecnologie di espressione applicabili a livello industriale, in cui la proteina sia espressa in forma non glicosilata e con una opportuna configurazione strutturale.

È quindi uno scopo della presente invenzione l’ottenimento della proteina brazzeina in forma non glicosilata in un sistema di espressione in cellule applicabile all’industria alimentare.

Sommario

Ora gli inventori hanno trovato che la proteina brazzeina non glicosilata può essere ottenuta per espressione, inducibile o costitutiva, in un specifico ceppo di P. pastoris: il ceppo X33.

Tale ceppo di P. pastoris viene trasformato mediante inserzione nel suo genoma di una cassetta di espressione comprendente un promotore operativamente legato ad una sequenza nucleotidica codificante la brazzeina ed un terminatore ed opzionalmente una sequenza segnale per la secrezione della proteina espressa. È quindi oggetto della presente invenzione un metodo di preparazione della proteina brazzeina comprendente almeno i passaggi di:

- trasformare una o più cellule di Pichia pastoris, con un vettore di espressione comprendente un promotore, una sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina ed un terminatore ed opzionalmente una sequenza segnale di secrezione;

- crescere la cellula o le cellule così trasformate in un mezzo di fermentazione in condizioni aerobiche,

caratterizzato dal fatto che:

la cellula o le cellule di Pichia pastoris sono del ceppo X33 e la brazzeina prodotta da tali cellule trasformate à ̈ la proteina non glicosilata.

Per l’espressione della brazzeina in Pichia pastoris si possono utilizzare diversi promotori, compreso il promotore della formaldeide deidrogenasi (FLD1), il promotore dell’isocitrato liasi (ILC1), il promotore del fattore di elongazione della trascrizione 1 (TEF1), il promotore della fosfoglicerato chinasi 1 (PGK1), il promotore della proteina di biogenesi del perossisoma (PEX8), e altri promotori conosciuti.

Per gli scopi della presente invenzione i promotori preferiti sono il promotore dell’alcol ossidasi 1 (pAOX1; SEQ ID NO: 8) per l’espressione inducibile della brazzeina ed il promotore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (pGAP; SEQ ID NO: 12) per la sua espressione costitutiva, mentre la sequenza nucleotidica della brazzeina à ̈ una delle sequenze note della proteina nativa (SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) o una forma modificata per il primo amminoacido (SEQ ID NO: 4), ottimizzate per il sistema di espressione.

La sequenza terminatore può essere scelta tra il terminatore dell’alcol ossidasi 1 (AOX1) ed il terminatore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAP). Preferibilmente il terminatore à ̈ AOX1 (SEQ ID NO: 10).

Inoltre, preferibilmente il vettore comprende anche un segnale di secrezione: il segnale di secrezione preferito à ̈ l’α-mating factor di S. cerevisiae (α-MF; SEQ ID NO: 9), ma possono essere usati anche altri segnali di secrezione noti ed impiegabili nei lieviti come ad esempio la sequenza segnale della Fosfatasi acida di Pichia pastoris (PHO1) o dell’Invertasi di Saccharomyces cerevisiae (SUC2). Pertanto, in una realizzazione preferita il genoma del ceppo X33 di Pichia pastoris comprende stabilmente un vettore comprendente una sequenza promotore scelta tra il promotore pAOX1 o pGAP, un segnale di secrezione consistente nel fattore α del Saccharomyces cerevisiae, una sequenza nucleotidica codificante per una sequenza della brazzeina, preferibilmente ottimizzata per il sistema di espressione, il terminatore AOX1 ed un marker di selezione per l’antibiotico Zeocina<TM>(SEQ ID NO: 11).

Almeno una e preferibilmente due copie del costrutto genico che comprende la sequenza promotore pAOX1 o pGAP, la sequenza segnale di secrezione, la sequenza con il reading frame della proteina brazzeina e la sequenza terminatore AOX1 vengono integrate nel genoma del ceppo X33 di Pichia pastoris.

In un aspetto preferito le sequenze geniche per l’espressione della brazzeina sono scelte tra le sequenze di DNA di SEQ ID NO: 1, 2 e 3.

La proteina espressa viene quindi purificata dal mezzo di fermentazione dei lieviti, secondo un metodo che comprende i passaggi di: a) separazione delle cellule dal surnatante tramite filtrazione o centrifugazione; b) diluizione del surnatante ottenuto allo step a) e regolazione del pH; c) cromatografia a scambio ionico; d) concentrazione e diafiltrazione della proteina eluita dallo step c) per ridurre il contenuto di sali; e) liofilizzazione della proteina isolata.

Alla fine del processo descritto, la proteina ottenuta può essere utilizzata come sostituto al comune zucchero per uso alimentare in cibi e bevande, per impartire agli stessi un gusto percepito come dolce. Tra le diverse possibili applicazioni che si prospettano, una possibile à ̈ l’aggiunta di brazzeina in prodotti da forno, poiché la quantità di zucchero aggiunto per raggiungere la necessaria dolcezza spesso ostacola la capacità dell'impasto di lievitare.

Vista inoltre la resistenza al pH, la brazzeina potrebbe anche essere usata per impartire dolcezza a bevande a base acida, come succhi di frutta e bevande frizzanti. Un’altra possibile applicazione potrebbe essere quella di impiegare la proteina come eccipiente per prodotti farmaceutici in alternativa ad altri dolcificanti in uso nel settore.

Breve descrizione delle figure

Figura 1. La figura mostra la mappa del vettore del plasmide pPICZα per l’espressione inducibile di brazzeina in Pichia pastoris con il promotore pAOX1. Figura 2. La figura mostra la mappa del vettore del plasmide pGAPα utilizzato per l’espressione costitutiva di brazzeina in Pichia pastoris con il promotore pGAP. Figura 3. La figura mostra il diagramma schematico del processo di ottenimento del vettore del plasmide con il promotore pGAP dal vettore pPICZαA.

Figura 4. La figura mostra: il Flow through in uscita dalla colonna a scambio cationico (Sepharose CM), dopo il caricamento del campione e lavaggio (A). Il profilo di eluizione delle proteine legate alla resina Sepharose CM, in seguito ad applicazione di un gradiente crescente di NaCl (B). Il profilo cromatografico della Frazione III caricata su una colonna RP (C). L’elettroforesi in Polyacrilamide precast gel a gradiente (4-20%). Linea 1: Pesi molecolari; Linea 2: Mezzo di fermentazione ottenuto dopo 72h ore di coltura, diluito 4.6x e portato a pH 4; Linea 3: Frazione I (Proteine non legate); Linea 4: Frazione II; Linea 5: Frazione III (brazzeina) (D).

Figura 5: La figura mostra: Spettri TOCSY di un campione 6.6 mg/ml di brazzeina a pH 3.5 riportati in “Studies on solution NMR structure of brazzein†(Gao et al.

1999, Science in China) (A). Spettro TOCSY di un campione 3.3 mg/ml di brazzeina a pH 3.5 (B). Spettro TOCSY di un campione 3.3 mg/ml di brazzeina a pH 3.5 dopo trattamento a 98°C per 2h (C).

Figura 6. La figura mostra l’elettroforesi in gel di Tris Tricina di un campione di brazzeina digerito con Pepsina. Linea 1) pepsina 1.28 mg/ml; Linea 2) Surnatante raccolto dal mezzo di coltura diluito ad una concentrazione finale di brazzeina 0.5 mg/ml; Linea 3) Ultra Low Molecular Weights; Linea 4) Pepsina 1.28 mg/ml incubata con 0.5 mg/ml di brazzeina in NaCl 30 mM, pH 1.5 37 °C a 1 minuto; Linea 5) 5 minuti; Linea 6) 10 minuti, Linea 7) 20 minuti, Linea 8) 40 minuti, Linea 9) 80 minuti.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Con la seguente invenzione si descrive un nuovo, semplice, affidabile e conveniente metodo per la produzione di brazzeina non glicosilata usando il lievito Pichia pastoris e il suo processo di purificazione. P. pastoris à ̈ un lievito metilotrofico, recentemente riassegnata al genere Komagataella, che può essere ingegnerizzato geneticamente per esprimere proteine sia a scopi di ricerca che per utilizzo industriale.

Inoltre, P. pastoris può essere considerato come fonte sicura di ingredienti alimentari in quanto: (a) L’American Type Culture Collection (ATCC) classifica Pichia ad un livello 1 di biosicurezza, ossia come microorganismo che non provoca malattie in individui sani; (b) à ̈ conforme ai criteri OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) per le Good Industrial Large Scale Practices; (c) à ̈ stato usato per la produzione di molte proteine anche ad utilizzo farmaceutico e (d) viene utilizzato nel foraggiamento di animali.

Esistono procedure standard per la manipolazione genetica, simili a quelle descritte per S. cerevisiae, in Molecular cloning: a laboratory manual, 3<rd>ed., Sambrook, Joseph; Russel, David W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Il metodo di preparazione della brazzeina oggetto della presente invenzione si fonda sull’impiego di un ben definito ceppo di Pichia pastoris che sorprendentemente e contrariamente a quanto noto per questi microorganismi ha dimostrato di esprimere la proteina nella forma non glicosilata.

Per tale metodo quindi possono essere impiegati tutti i promotori noti per l’espressione di proteine e/o polipeptidi in lieviti e le sequenze geniche note della brazzeina e sue varianti ottimizzate per l’espressione in lieviti.

Qui di seguito viene descritto in dettaglio il metodo di preparazione della brazzeina non glicosilata nelle sue realizzazioni preferite che prevedono l’impiego del vettore per l’espressione inducibile pPICZα o il vettore per l’espressione costitutiva pGAPα.

Definizioni

La brazzeina à ̈ una proteina isolata dal frutto della pianta africana Pentadiplandra brazzeana Bailon la cui sequenza nota à ̈ costituita da 54 aa ed avente numero di accesso in banca dati P56552 (UniProtKB: locus DEF_PENBA).

Per gli scopi della presente invenzione le sequenze di brazzeina preferite impiegate per l’espressione inducibile o costitutiva in P. pastoris, ceppo X33 sono: (SEQ ID NO: 4) (aa 54)

MDKCKKVYEN YPVSKCQLAN QCNYDCKLDK HARSGECFYD EKRNLQCICD YCEY; (SEQ ID NO: 5) (aa 54)

QDKCKKVYEN YPVSKCQLAN QCNYDCKLDK HARSGECFYD EKRNLQCICD YCEY; (SEQ ID NO: 6) (aa 53)

DKCKKVYEN YPVSKCQLAN QCNYDCKLDK HARSGECFYD EKRNLQCICD YCEY. Le sequenze ID NO: 5 e 6 corrispondono rispettivamente alle forme di Brazzeina wild type tipo 2 e 3, la sequenza ID NO: 4 presenta una metionina all’estremità N-terminale per l’espressione opzionale in E. coli.

Queste sequenze proteiche sono codificate dalle sequenze nucleotidiche seguenti:

SEQ ID NO: 1 (165 nt)

ATGGATAAAT GCAAGAAAGT ATATGAGAAT TACCCAGTTA GCAAGTGTCA ATTGGCAAAC 60 CAGTGCAACTATGACTGTAAACTAGACAAGCATGCTAGAAGTGGAGAATGTTTTTATGAT 120 GAAAAAAGGAATTTACAATGCATATGCGATTATTGTGAGTATTAA 165 SEQ ID NO: 2 (165 nt)

CAGGATAAATGCAAGAAAGTATATGAGAATTACCCAGTTAGCAAGTGTCAATTGGCAAAC 60 CAGTGCAACTATGACTGTAAACTAGACAAGCATGCTAGAAGTGGAGAATGTTTTTATGAT 120 GAAAAAAGGAATTTACAATGCATATGCGATTATTGTGAGTATTAA 165 SEQ ID NO: 3 (162 nt)

GATAAATGCAAGAAAGTATATGAGAATTACCCAGTTAGCAAGTGTCAATTGGCAAACCAG 60 TGCAACTATGACTGTAAACTAGACAAGCATGCTAGAAGTGGAGAATGTTTTTATGATGAA 120 AAAAGGAATTTACAATGCATATGCGATTATTGTGAGTATTAA 162.

Tali sequenze sono da preferirsi in quanto senza alterare la sequenza amminoacidica della proteina presentano un codon usage ottimizzato per l’espressione in P. pastoris.

Per l’espressione inducibile della brazzeina viene usato per una realizzazione preferita del metodo oggetto dell’invenzione il vettore pPICZαA contenente il promotore AOX1 attivato in presenza di metanolo di SEQ ID NO: 8.

Per l’espressione costitutiva della brazzeina viene usato per un’altra realizzazione preferita del metodo oggetto dell’invenzione il vettore pGAPαA ricavato dalla sostituzione della sequenza del promotore AOX1 (SEQ ID NO: 8) con la sequenza del promotore pGAP (SEQ ID NO: 12).

La sequenza di secrezione della proteina preferita à ̈ l’α-mating factor di S. cerevisiae. avente la SEQ ID NO: 9.

La sequenza terminatore preferita à ̈ AOX! Di SEQ ID NO: 10.

Il ceppo X33 presenta genotipo wild-type (non presenta nessuna auxotrofia) e fenotipo Mut<+>; tale fenotipo (Methanol utilization plus) si riferisce all’abilità del ceppo di crescere più velocemente utilizzando Metanolo come fonte di carbonio, rispetto ai ceppi Mut<s>e Mut-.

Descrizione

Entrambi i vettori per la produzione inducibile pPICZα o costitutiva pGAPα della proteina comprendono una sequenza promotore, un segnale di secrezione, una sequenza che codifica per la brazzeina, un terminatore e un marker di selezione per l’antibiotico Zeocina™.

Costruzione dei vettori di espressione

Il plasmide comprendente il promotore pAOX1 (pPICZαA) per l’espressione inducibile della proteina ed un marker dominante di selezione che conferisce resistenza all’antibiotico Zeocina™, sia in P. pastoris sia in Escherichia coli, può essere commerciale e può essere ad esempio quello venduto da Invitrogen di catalogo No (V195-20).

Il cDNA della proteina à ̈ stato ottenuto per sintesi chimica (Sigma genosys) basandoci su una sequenza amminoacidica nota o nuova e preferibilmente scelta tra le sequenze SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Nel caso della SEQ ID NO: 1, cDNA preferito à ̈ ottenuto sostituendo la tripletta nucleotidica di trascrizione della glutammina all’N-terminale della SEQ ID NO: 2 con una tripletta nucleotidica di trascrizione per una metionina per l’espressione opzionale in E. coli, ed ottimizzando il codon usage della sequenza per l’espressione in Pichia patoris e E.coli.

Il codon usage à ̈ uno dei più importanti fattori che influenzano l’espressione di geni eterologhi; in generale, più codoni rari sono contenuti in una sequenza, più difficile sarà ottenere soddisfacenti livelli di espressione della proteina. Di conseguenza, l’ottimizzazione dei codoni senza alterare la sequenza amminoacidica della proteina codificata, può incrementare notevolmente i livelli di espressione di proteina. Per il metodo secondo l’invenzione l’ottimizzazione del codon usage à ̈ relativa a Pichia pastoris ed E. coli.

Inoltre, sono da eliminare tutti i possibili siti di restrizione dal cDNA che codifica per la brazzeina, in modo da rendere possibili successivi eventuali passaggi di manipolazione del gene come lo scambio tra diversi vettori o la rimozione di proteine di fusione e tags.

La sequenza cDNA scelta tra la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 e la SEQ ID NO: 3 à ̈ quindi clonata nel sito di restrizione XhoI/NotI di pPICZαA per generare il vettore pPICZαA-bra (FIG.1).

Il plasmide di espressione contenente il pGAP (FIG. 2) à ̈ invece ottenibile modificando il vettore pPICZαA-bra; il promotore pGAP à ̈ amplificato tramite PCR dal genoma di Pichia pastoris (cromosoma 4) e successivamente inserito nel plasmide pPICZαA-bra al posto del pAOX1 per generare il nuovo plasmide pGAPZαA-bra (FIG.3).

La produzione costitutiva di brazzeina à ̈ da preferire per applicazioni industriali poiché elimina il pericolo e i costi legati all’impiego di metanolo (stoccaggio e trasporto) Nell’ambito dell’utilizzo proposto per la proteina in questione, cioà ̈ il consumo umano, la rimozione del metanolo dal processo di produzione à ̈ una scelta obbligata, poiché esso à ̈ tossico per l’uomo.

Quest’ultimo sistema di espressione à ̈ preferibile anche poiché non richiede un’accurata ottimizzazione delle condizioni di coltura come nel caso dell’induzione con metanolo. Inoltre, a differenza dei plasmidi per l’espressione inducibile, i vettori che utilizzano il promotore GAP consentono di produrre in maniera semplice la proteina ricombinante in continuo, rendendo tale sistema più adatto per la produzione su larga scala.

Pertanto, il plasmide pGAPZαA-bra à ̈ da preferirsi per scopi applicativi industriali. Entrambi i plasmidi comprendono anche il segnale di secrezione α-mating factor di Saccaromices cerevisiae dopo il promotore, semplificando così il recupero della proteina eterologa secreta. Infatti, il vantaggio più grande di esprimere una proteina eterologa come proteina secreta à ̈ che P. pastoris secerne livelli molto bassi di proteine native. Altri segnali di secrezione possono essere utilizzati al posto dell’α-mating factor di Saccharomyces cerevisiae come già menzionato. Entrambi i plasmidi per l’espressione inducibile e costitutiva sono trasformati nel ceppo di E. coli DH5α al fine di amplificare il DNA per la successiva trasformazione dei lieviti.

I plasmidi pPICαA-bra e pGAPZαA-bra sono identificati mediante sequenziamento del DNA e utilizzati per l’espressione del gene della brazzeina in P. pastoris.

Trasformazione di Pichia pastoris con i vettori pPICZαA-bra o pGAPZαA-bra Dopo la linearizzazione con un adeguato enzima di restrizione, il plasmide à ̈ usato per trasformare P. pastoris ceppo X33 mediante elettroporazione. Altri metodi possono essere utilizzati per trasformare i lieviti, quali ad esempio metodi chimici. I cloni trasformati che presentano un elevato livello di espressione sono selezionati su piastre con concentrazioni crescenti di Zeocinaâ„¢: i cloni in grado di crescere sulle piastre con concentrazioni più alte di Zeocinaâ„¢ sono putativamente quelli contenenti più copie del gene della brazzeina.

I cloni selezionati possono essere conservati a -80°C in un terreno contenente il 15% di glicerolo.

Selezione dei cloni più produttivi tramite esperimenti in beute

Le singole colonie selezionate sono analizzate per il loro livello di espressione proteica al fine di individuare il più efficienti. Le colture sono incubate a 30°C per 3 giorni agitando a 230 rpm; per l’espressione inducibile il metanolo à ̈ aggiunto ogni 24 ore per mantenere l’induzione. Il surnatante della coltura à ̈ ottenuto ogni 24 ore attraverso centrifugazione ed à ̈ utilizzato per analizzare l’espressione proteica mediante Tris-Tricina SDS-PAGE elettroforesi.

Espressione della brazzeina in bioreattore

La fermentazione à ̈ eseguita in un bioreattore a 30°C, DO (concentrazione di ossigeno disciolta; essa à ̈ la percentuale di ossigeno disciolto nel mezzo dove il 100% rappresenta il terreno saturato di O2, pari a circa 220 µM) 20% (mantenuta attraverso il controllo dell’agitazione e dell’afflusso di aria) e pH 5.0. Le cellule di Pichia pastoris sono mantenute in una coltura fed-batch per 4 giorni. Per la purificazione della proteina il terreno à ̈ recuperato mediante centrifugazione e trattato come descritto in seguito.

Il medium utilizzato per l’espressione inducibile della brazzeina à ̈ un terreno minimo di sali come descritto nel manuale Pichia Fermentation Process Guidelines (Invitrogen). Dopo 24 ore di crescita l’espressione della proteina à ̈ indotta aggiungendo metanolo alla coltura, inizialmente ad una velocità bassa per permettere l’adattamento della coltura al metanolo e poi progressivamente a velocità maggiori al fine di mantenere il livello di ossigeno disciolto richiesto.

Per l’espressione costitutiva della brazzeina à ̈ utilizzato un terreno minimo di sali noto (Hohenblum H. et al., 2004) e riportato di seguito in dettaglio all’esempio 4. Dopo 24 ore di crescita si inizia la fase di feeding utilizzando una soluzione di destrosio. Si preleva il surnatante mediante centrifugazione ogni 24 ore e sullo stesso si analizza il livello di espressione proteica attraverso Tris-Tricina SDS-PAGE elettroforesi.

Alla fine del processo di fermentazione il terreno à ̈ recuperato e sottoposto ai passaggi di purificazione.

Processo di purificazione:

Come riportato nel manuale EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen) Pichia pastoris à ̈ in grado di crescere ad elevate biomasse in un terreno semplice definito e secerne inoltre un basso livello di proteine native. Di conseguenza la proteina eterologa secreta rappresenta la grande maggioranza del totale delle proteine nel medium, rendendo così relativamente facile il processo di purificazione.

Il primo passaggio del processo di purificazione à ̈ la rimozione delle cellule dal terreno di coltura mediante centrifugazione. Altri metodi come ad esempio la chiarificazione e la microfiltrazione possono essere utilizzati.

Il surnatante della coltura viene poi diluito per abbassare il valore di conduttività al fine di permettere alle proteine di legarsi al materiale cromatografico; in seguito il pH finale della soluzione viene modificato in base al tipo di cromatografia a scambio ionico che si vuole utilizzare.

Con una resina a scambio cationico come la Sepharose CM FF a valori di pH attorno a 4.0, solo la brazzeina e pochi altri contaminanti si legano alla resina. È quindi possibile eluire la brazzeina separatamente dalle altre proteine, applicando un gradiente lineare di NaCl alla colonna.

Al contrario, quando si utilizza una resina a scambio anionico, come ad esempio la Sepharose DEAE FF a valori di pH attorno a 5.0, solo i contaminanti presenti nel medium si legano alla resina, permettendo il recupero della brazzeina pura nel volume morto della colonna dopo il caricamento del campione.

In funzione del tipo di cromatografia a scambio ionico scelto per la purificazione, sono richiesti diversi passaggi di concentrazione e di filtrazione, in accordo con le caratteristiche desiderate del prodotto finale.

La soluzione concentrata di brazzeina può essere conservata come soluzione dopo sterilizzazione mediante filtrazione (filtro con pori da 0.22µm), o come polvere liofilizzando direttamente la proteina purificata.

Questo processo di purificazione non prevede passaggi chimici pericolosi o costosi ed à ̈ quindi idoneo per l’applicazione nell’industria alimentare.

Con il metodo descritto si ottiene la brazzeina non glicosilata adempiendo allo scopo della presente invenzione. La proteina ottenuta ha le caratteristiche qui sotto riportate.

Caratterizzazione del prodotto:

La proteina nel surnatante alla fine della fermentazione viene separata mediante gel elettroforesi e la concentrazione di brazzeina viene stimata dopo colorazione con Comassie e analisi densitometrica. La purezza della proteina dopo il passaggio di cromatografia a scambio ionico à ̈ stabilita mediante analisi RP-HPLC (come riportato in dettaglio di seguito all’esempio 5).

La spettrometria di massa della proteina purificata ha dato come risultato una massa molecolare pari a 6500.89±0.67 Da, dato comparabile con quello atteso di 6501 Da. Si può pertanto desumere che la brazzeina non viene degradata da proteasi presenti nel surnatante e che le sole modifiche post-trascrizionali presenti sono i quattro ponti disolfuro tipici della struttura nativa della proteina; altre modificazioni, quali ad esempio glicosilazioni, che possono alterare la struttura della proteina o mascherarne eventuali siti di taglio proteolitici, non sono presenti. La similarità strutturale della proteina ricombinante così ottenuta con la brazzeina wild-type direttamente estratta dalla sua fonte naturale à ̈ stata confermata attraverso esperimenti di TOCSY NMR, eseguiti come descritto in letteratura (Gao et al., 1999) (Figure 6A e 6B). Inoltre, come mostrato in figura 6C, la proteina mantiene la sua struttura (e di conseguenza il gusto dolce) anche dopo trattamento al calore a 98°C per 2 ore. È quindi termostabile.

Un primo passo verso la determinazione della possibile allergenicità della proteina ricombinante à ̈ stato fatto mediante test in vitro di sensibilità alla pepsina, in accordo con le linee guida generali pubblicate da FAO/WHO (WHO, 2001. Evaluation of Allergenicity of Genetically modified Foods. Report of a Joint FAO/WHO Expert consultation. World Health Organization, Ginevra). Come mostrato in figura 7, la proteina à ̈ prontamente digerita dalla pepsina dopo 10 minuti di incubazione in condizioni che simulano il fluido gastrico, suggerendo quindi che la brazzeina ricombinante ha una bassa probabilità di essere un allergene e non presenta modifiche strutturali quali ad esempio glicosilazioni che ne impediscano la proteolisi.

La presente invenzione fornisce quindi una proteina dolce, correttamente strutturata, non glicosilata, termostabile e pepsina-sensibile prodotta attraverso il metodo sopra descritto.

La proteina prodotta in questo modo à ̈ successivamente caratterizzata usando sia saggi biochimici standard che tecniche di caratterizzazione strutturale, come ad esempio quantificazione UV a 280 nm, elettroforesi in gel di Tris Tricina, HPLC, spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare.

ESEMPI

Esempio 1. Costruzione di un vettore di espressione per l’espressione inducibile o costitutiva della brazzeina

Il cDNA della brazzeina (SEQ ID NO: 2) à ̈ stato sintetizzato chimicamente (Sigma genosys) con l’ottimizzazione dei codoni per l’espressione in P. pastoris e quindi clonato nel vettore pPICZαA.

Il vettore pPICZαA per l’espressione inducibile della brazzeina à ̈ stato ottenuto dall’Invitrogen (San Diego, USA). Tale vettore à ̈ stato digerito con XhoI (Promega) e NotI (Promega). Il cDNA della brazzeina à ̈ stato legato con il vettore pPICZαA e poi trasformato nel ceppo di E. coli DH5α. I cloni trasformati (pPICZαA-bra, SEQ ID NO: 7) sono stati selezionati su piastre LB a basso contenuto di sale (10g/l triptone, 5g/l NaCl, 5g/l estratto di lievito, 15g/l agar) contententi 25µg/ml di Zeocinaâ„¢ (Invitrogen). Il plasmide pPICZαA-bra à ̈ stato quindi sequenziato per verificare l’accuratezza della sequenza e quindi usato per l’espressione del gene della brazzeina in P. pastoris. Il vettore pPICZαA comprende il promotore inducibile pAOX1 (SEQ ID NO: 8), la sequenza segnale di secrezione del fattore α di Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 9), la sequenza codificante per la brazzeina (SEQ ID NO: 2), il terminatore AOX1 (SEQ ID NO: 10) e il gene Sh ble per la resistenza all’antibiotico Zeocinaâ„¢ (SEQ ID NO: 11), come riportato in Fig.1.

Il promotore pGAP (SEQ ID NO: 12) à ̈ stato invece amplificato mediante PCR direttamente dal genoma di P. pastoris (chr 4). I primer forward e reverse utilizzati per l’amplificazione del gene GAP sono 5’-CACTTGACAGGATCCTTTTTTGTAG-3’ (SEQ ID NO: 13) e 3’-CATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG-5’ (SEQ ID NO: 14). Il prodotto di PCR à ̈ stato poi inserito nel plasmide pPICZαA-bra al posto del pAOX1 per generare il plasmide pGAPZαA-bra (SEQ ID NO: 15). Il processo di costruzione del plasmide pGAP-bra à ̈ mostrato in Fig. 3. Come per il vettore pPICZαA-bra, il vettore pGAPZαA-bra à ̈ stato trasformato nel ceppo DH5α di E. coli e poi sequenziato per verificare la correttezza della sequenza.

Esempio 2. Trasformazione delle cellule di P. pastoris con i vettori per l’espressione della brazzeina mediante elettroporazione

Le cellule del ceppo X33 di P. pastoris elettrocompetenti sono state acquistate da Invitrogen (No catalogo K1740-01) preparate usando il protocollo suggerito nel manuale Easyselectâ„¢ Pichia expression kit (Invitrogen): un’aliquota di cellule competenti di P. pastoris risospesa in 1M sorbitolo a 0°C (80 µl) à ̈ stata mescolata con 10µg di DNA linearizzato (risospeso in 10µl di acqua sterile). Il plasmide pPICZαA-bra à ̈ stato linearizzato con l’enzima di restrizione SacI (Promega; No catalogo R6061). Invece, il plasmide pGAPZαA-bra à ̈ stato linearizzato con AvrII (New England BioLabs; No catalogo R0174S).

La miscela à ̈ stata trasferita in una cuvetta per elettroporazione da 0.2 cm preraffreddata a 0°C e incubata in ghiaccio per 5 minuti. Le cellule sono state quindi elettroporate utilizzando un elettroporatore Biorad Gene Pulser II a 1500V, 25 µF, e 400 Ω.

Le cellule trasformate sono state incubate con 1 ml di sorbitolo 1M (0°C) a 30°C per 2 ore.

Le cellule sono state quindi seminate su piastre YPDS (10 g/l estratto di lievito, 20 g/l peptone, 20g/l destrosio, 1M sorbitolo, and 20 g/l agar) contenenti 100 µg/ml di Zeocinaâ„¢ come marker di selezione. Le piastre sono state incubate per 3-5 giorni a 30°C fino alla formazione delle colonie.

Esempio 3. Identificazione delle cellule di P. pastoris trasformate e test di espressione su piccola scala

I cloni trasformati che presentano il più alto livello di espressione sono stati selezionati su piastre YPDS contenenti 100, 500, 1000 e 2000 µg/ml Zeocinaâ„¢ e incubati a 30°C per 5 giorni. I cloni in grado di crescere sulle piastre con 2000 µg/ml Zeocinaâ„¢ sono i putativi cloni multi-copia (ossia che contengono più copie del gene codificante per la brazzeina).

Le colonie selezionate possono essere conservate e -80°C in terreno YPD (10 g/l estratto di lievito, 20 g/l peptone, 20 g/l destrosio) contenente 15% glicerolo v/v. I lieviti trasformati con il plasmide per l’espressione inducibile sono stati risospesi in 5 ml di terreno BMG (100 ml/l tampone potassio fosfato 1M a pH 6.0, 100 ml/l 10X YNB, 2 ml/l 0.02% biotina, 100ml/l 10% glicerolo) e incubati in beute Erlenmeyer da 25 ml per tutta la notte.

Queste colture sono state utilizzate per inoculare 10 ml di terreno BMM (100 ml/l tampone potassio fosfato 1M a pH 6.0, 100 ml/l 10X YNB, 2 ml/l 0.02% biotina, 100 ml/l 5% metanolo) in beute Erlenmeyer da 50 ml con frangiflutti ad un OD iniziale pari a 1. Tali colture sono state poi incubate a 28°C per 3 giorni in agitazione a 230 rpm; ogni 24 ore del metanolo 100% à ̈ stato aggiunto ad una concentrazione finale dello 0.5% al fine di mantenere l’induzione.

Le singole colonie selezionate per l’espressione costitutiva sono state trasferite in 5 ml di terreno YPD (10 g/l estratto di lievito, 20 g/l peptone, 20 g/l destrosio) e incubate in beute Erlenmeyer da 25 ml per tutta la notte. Queste colture sono state utilizzate per inoculare 10 ml di terreno YPD in beute Erlenmeyer da 50 ml con frangiflutti ad un OD iniziale pari a 1. Tali colture sono state poi incubate a 28°C per 3 giorni in agitazione a 230 rpm.

Il surnatante di queste colture à ̈ stato ottenuto mediante centrifugazione ogni 24 ore e utilizzato per analizzare l’espressione proteica attraverso Tris-Tricine SDS-PAGE elettroforesi.

Mediante questo passaggio à ̈ stato quindi isolato il clone che presenta la maggior efficienza di espressione che verrà poi usato per il successivo scale-up del processo in fermentatore.

Esempio 4. Espressione della brazzeina in fermentatore

Il clone più efficiente in termini di espressione di brazzeina à ̈ stato selezionato à ̈ fatto crescere in 500 ml di terreno contenente 100 ml/l tampone fosfato, 100 ml/l YNB 10X, 2.5 ml/l biotina 500X, 5 ml/l 100% glicerolo, e792.5 ml/l acqua distillata. Tale coltura à ̈ stata utilizzata per inoculare la coltura per il fermentatore (1.5 l) ad un OD iniziale pari a 1; il terreno di fermentazione contiene 18.2 g/l K2SO4, 14.9 g/l MgSO4·7H2O, 26.7 ml/l H3PO4(85%), 0.93 g/l CaSO4â‹…2H2O,4.13 g/l KOH, 40 g/l glicerolo, 4.35 ml/l PTM1. La soluzione di sali in tracce (PTM1) consiste in (per litro): 6.0g CuSO4·5H2O, 0.08g NaI, 3.0g MnSO4·H2O, 0.2g Na2MnO4·2H2O, 0.02g H3BO3, 0.5g CoCl2, 20.0g ZnCl2, 65.0g FeSO4·7H2O, 0.2g Biotina e 5.0 ml H2SO4. La coltura à ̈ stata fatta crescere per 18-24 ore fino al completo consumo del glicerolo (ciò à ̈ indicato da uno indicato da un rapido aumento del livello di ossigeno disciolto). Quando tutto il glicerolo à ̈ stato consumato, à ̈ stata iniziata una fase fed-batch con metanolo per indurre l’espressione della proteina; il medium di feeding consiste in metanolo 100% contenente 12 ml/l PTM1. Per le prime 2-3 ore, finché la coltura si adatta al metanolo, la velocità di feeding à ̈ stata impostata a 3.6 ml/h per litro di volume iniziale di fermentazione. Quando la coltura si à ̈ adattata all’utilizzo del metanolo la velocità di feeding à ̈ stata raddoppiata a 7.3 ml/h per litro di volume iniziale di fermentazione. Dopo due ore a 7.3 ml/h/litro, la velocità di feeding del metanolo à ̈ stata aumentata a 10.9 ml/h per litro di volume iniziale di fermentazione. Tale velocità à ̈ stata mantenuta fino alla fine della fermentazione.

La fermentazione per l’espressione costitutiva della brazzeina à ̈ stata effettuata in 1.5 litri di terreno contenente 9.5 g/l K2SO4, 7.8 g/l MgSO4â‹…7H2O, 23.7 ml/l H3PO4(85%), 0.6 g/l CaSO4â‹…2H2O, 2.6 g/l KOH, 40 g/l glicerolo, 4.4 ml/l PTM1. La singola colonia di lievito selezionata per l’espressione à ̈ stata inoculata in 500 ml di terreno contenente 100 ml/l tampone fosfato, 100 ml/l YNB 10X, 2.5 ml/l biotina 500X, 5 ml/l 100% glicerolo, and 792.5 ml/l acqua distillata, e usata come coltura per inoculare il terreno del fermentatore ad un OD iniziale pari a 1. La coltura à ̈ stata fatta crescere per 24 ore e poi à ̈ stata iniziata una fase fed-batch con glucosio (soluzione di feeding: 550 g/l glucosio, 12 ml/l PTM1) ad una velocità di 6 ml/h per litro di volume iniziale di fermentazione e mantenuta fino alla fine della fermentazione.

Alla fine di entrambi i processi di fermentazione (72 ore di fase fed-batch) il terreno à ̈ stato recuperato e centrifugato a 1500g al fine di separare le cellule dal surnatante. Per fermentazioni su scala maggiore possono essere utilizzati altri metodi come ad esempio la filtrazione tangenziale.

Esempio 5. Processo di purificazione

Cromatografia a scambio cationico

Il surnatante ottenuto in seguito a rimozione delle cellule à ̈ stato diluito 4.6 volte per abbassare la conduttività da 65 mS/cm a 14 mS/cm e il pH à ̈ stato portato a 4.0. Un’aliquota della soluzione à ̈ stata caricata in gel di Poliacrilammide (vedi Figura 4D, Lane 2). L’intero surnatante à ̈ stato quindi caricato in una colonna Pharmacia Biotech XK 26, riempita con 110 ml di Sepharose CM FF, preequilibrata con Buffer A (tampone Na-Acetato 20mM, pH4). E’ stato quindi raccolto il flow through contenente la frazione che non si à ̈ legata alla resina in seguito a caricamento del campione e lavaggio con Buffer A, (Frazione I, Figura 4A) e un’aliquota à ̈ stata caricata in gel (Figura 4D, Linea 3). In seguito alla prima fase di lavaggio della colonna la concentrazione di Buffer B (NaCl 1M in tampone Na-Acetato 20mM, pH 4), à ̈ stata fatta aumentare linearmente dallo 0% al 100% in 3.5 volumi colonna. Due frazioni sono state raccolte e caricate in gel (vedi Frazione II e III in Figura 4D). La brazzeina può essere separata dalle altre proteina legate alla colonna in quanto eluisce a concentrazioni più elevate di Buffer B (approssimativamente 0.6 M NaCl). In alternativa, il processo cromatografico può essere effettuato usando una eluizione a 2 step; il primo step al 40% di Buffer B per rimuovere i contaminanti non desiderati ed un secondo step al 60-70% di Buffer B per eluire la brazzeina. I successivi step di diafiltrazione possono essere effettuati usando membrane con pori di diametro da 1 a 3.5 kDa.

Alla fine del processo di purificazione descritto si ottengono non meno di 200 mg di proteina.

Cromatografia a scambio anionico

Il surnatante ottenuto in seguito a rimozione delle cellule, à ̈ stato diluito in modo tale da raggiungere una conduttività finale pari a 5 mS/cm e il pH portato a 5 (in questo caso, il valore può essere impostato nell’intervallo 4-6). La soluzione così ottenuta à ̈ stata caricata in una colonna contenente DEAE Sepharose FF, preequilibrata con Buffer C (Piperazina-HCl 20 mM, pH 5). La brazzeina pura eluisce nel flow through dopo il caricamento del campione e lavaggi con Buffer C, mentre gli altri contaminanti sono eluiti lavando la colonna con NaCl 1M. In confronto al metodo di purificazione che sfrutta lo scambio cationico, questo metodo consente di recuperare proteina purificata semplicemente in Buffer C in assenza di NaCl, tuttavia:

- il surnatante di partenza deve essere diluito approssimativamente di un fattore 10;

- la proteina eluisce in volumi più grandi e richiede ulteriori passaggi di concentrazione.

Purezza della proteina

E’ stato monitorato il profilo di assorbanza a 280 nm di una cromatografia in fase inversa HPLC e la purezza della brazzeina à ̈ stata riportata come la percentuale relativa di area del picco di eluizione della brazzeina rispetto all’area totale sottesa dal cromatogramma. Un’aliquota di Frazione III (vedi Figura 4B) à ̈ stata caricata in una colonna Phenomenex Jupiter 5u C4; l’eluente A utilizzato à ̈ composto dallo 0.1% TFA in H20 milliQ, mentre l’eluente B à ̈ formato dallo 0.085% TFA in Acetonitrile. La corsa cromatografica sfrutta un gradiente non lineare crescente di Eluente B con un flusso a 0.6 ml/min. La purezza della proteina a 280 nm à ̈ stata stimata essere del 99.9% usando un diode-array Agilent 8453 UV-visible spectrophotometer interfacciato al software Agilent Chemostation.

Referenze

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Claims (15)

1. Rivendicazioni 1. Metodo di preparazione della proteina brazzeina comprendente almeno i passaggi di: - trasformare una o più cellule di Pichia pastoris, con un vettore di espressione comprendente un promotore, una sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina ed un terminatore ed opzionalmente una sequenza segnale di secrezione; - crescere la cellula o le cellule così trasformate in un mezzo di fermentazione in condizioni aerobiche, caratterizzato dal fatto che la cellula o le cellule di Pichia pastoris sono del ceppo X33 e la proteina brazzeina prodotta dalla cellula o dalle cellule trasformate à ̈ una proteina non glicosilata.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina à ̈ scelta tra le sequenze nucleotidiche SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina à ̈ la sequenza nucleotidica SEQ ID NO: 1.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il promotore à ̈ scelto tra pFLD1, pILC1, pTEF1, pPGK1, pPEX8, pAOX1 e pGAP.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il promotore à ̈ scelto tra pAOX1 e pGAP.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il terminatore à ̈ scelto tra AOX1 e GAP.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il terminatore à ̈ AOX1.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza segnale di secrezione à ̈ scelta tra α-mating factor di Saccharomyces cerevisiae, fosfatasi acida di Pichia pastoris PHO1 e invertasi di Saccharomyces cerevisiae SUC2.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza segnale di secrezione à ̈ α-mating factor di Saccharomyces cerevisiae.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente gli ulteriori passaggi: - rimozione delle cellule dal mezzo di fermentazione mediante centrifugazione o microfiltrazione; - diluizione del surnatante e regolazione del pH; - separazione della proteina brazzeina espressa per cromatografia a scambio ionico; - concentrazione e purificazione per diafiltrazione; - opzionalmente, liofilizzazione della proteina isolata.
11. 11. Proteina brazzeina ottenibile con il metodo definito alle rivendicazioni da 1 a 9 in cui tale proteina à ̈ non glicosilata.
12. 12. Un vettore di espressione per la proteina brazzeina in cui la sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina à ̈ la sequenza SEQ ID NO: 1.
13. 13. Una cellula ricombinante di Pichia pastoris ceppo X33 comprendente nel suo genoma almeno una copia del costrutto genico in cui la sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina à ̈ scelta tra le sequenze nucleotidiche SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
14. 14. Una cellula ricombinante di Pichia pastoris ceppo X33 secondo la rivendicazione 13, in cui la sequenza nucleotidica codificante per una sequenza di brazzeina à ̈ la sequenza nucleotidica SEQ ID NO: 1.
15. 15. Una cellula ricombinante di Pichia pastoris ceppo X33 secondo la rivendicazione 13, in cui il costrutto genico comprende ulteriormente un promotore scelto tra pAOX1 e pGAP, la sequenza segnale di secrezione αmating factor di Saccharomyces cerevisiae ed il terminatore scelto tra AOX1 e GAP.