ITPD950243A1 - Processo di rivestimento di oggetti con acido ialuronico o suoi deri- vati - Google Patents

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ITPD950243A1 IT95PD000243A ITPD950243A ITPD950243A1 IT PD950243 A1 ITPD950243 A1 IT PD950243A1 IT 95PD000243 A IT95PD000243 A IT 95PD000243A IT PD950243 A ITPD950243 A IT PD950243A IT PD950243 A1 ITPD950243 A1 IT PD950243A1
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Clara Cassinelli
Marco Morra
Lanfranco Callegaro
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Fidia Advanced Biopolymers Srl
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Abstract

La presente invenzione si riferisce ad un processo per il rivestimento della superficie esterna di oggetti con acido ialuronico e suoi derivati o altri polimeri naturali o semisintetici per applicazioni in campo sanitario - chirurgico e in diagnostica. Secondo tale processo è possibile legare in maniera stabile il polimero sulle superfici di oggetti realizzati con un'ampia gamma di materiali. Le superfici trattate secondo il processo descritto nella presente invenzione sono caratterizzate da elevata bagnabilità e sono in grado di inibire l'adesione di cellule o batteri presenti nei fluidi biologici.

Description

Descrizione di una invenzione industriale dal titolo: "PROCESSO DI RIVESTIMENTO DI OGGETTI CON ACIDO IALURONICO O SUOI DERIVATI"
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE La presente invenzione si riferisce ad un processo per il rivestimento della superficie esterna di oggetti con acido ialuronico e suoi derivati o altri polimeri naturali o semisintetici per applicazioni in campo sanitario-chirurgico e in diagnostica. Secondo tale processo è possibile legare in maniera stabile il polimero sulle superfici di oggetti realizzati con un'ampia gamma di materiali. Le superfici trattate secondo il processo descritto nella presente invenzione sono caratterizzate da elevata bagnabilità e sono in grado di inibire l'adesione di cellule o batteri presenti nei fluidi biologici.
OGGETTO DELL'INVENZIONE
L'invenzione riguarda in particolare un processo per il rivestimento di oggetti biomedicali con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati. Tale strato sottile viene legato in maniera stabile al materiale sottostante. In questo modo viene realizzata una struttura composita caratterizzata, nella sua interezza, dalle proprietà del maferiale utilizzato per la realizzazione dell'oggetto, dotato però delle caratteristiche superficiali impartite dalla presenza dello strato sottile di acido ialuronico o dei suoi derivati. Tali caratteristiche conferiscono alle superfici dei materiali trattati secondo il processo della presente invenzione un'elevata idrofilia. Le superfici degli oggetti trattati secondo il metodo della presente invenzione sono in grado di prevenire l'adesione di cellule presenti in liquidi biologici e di ridurre l'adesione batterica.
CAMPO DELL'INVENZIONE
L'acido ialuronico è un mucopolisaccaride naturale presente, seppure in concentrazioni differenti, praticamente in tutti i tessuti. Come noto agli esperti dell'arte, soluzioni acquose di acido ialuronico o dei suoi sali, di derivati dell'acido ialuronico e di polisaccaridi in generale sono caratterizzate da notevole viscosità, scivolosità e capacità di agire da riduttori di attrito, caratteristica che è alla base della presenza e della funzione dei polisaccaridi della famiglia dell’acido ialuronico nel corpo umano e di altri animali (Michels R.G. et al., "Sodium hyaluronate in anterior and posterior segment surgery", Physicochemical and Pharmacological Characteristics of Hyaluronic Acid, 1-15, 1989").
Per queste loro qualità, i polisaccaridi della famiglia dell'acido ialuronico (sia quelli naturali che quelli ottenuti per azione di sintesi chimica sui composti naturali) sono stati oggetto di studio e sperimentazione. In particolare, un'intensa attività è stata svolta nell'individuazione di metodi adatti a fissare in modo permanente strati sottili di acido ialuronico (frazione Hyalectin di cui al brevetto europeo N. 0138572) o suoi derivati (US N. 4,851,521) sulla superficie di altri materiali. Lo scopo di questa attività era quello di realizzare oggetti che, pur mantenendo le caratteristiche globali del materiale di cui erano costituiti (materiale che in seguito sarà definito substrato), fossero dotati di migliorate proprietà superficiali. In particolare, a causa della loro elevata idrofilia, l'acido ialuronico o i suoi derivati si prestano particolarmente bene alla realizzazione di oggetti alle cui superfici sia richiesto uno scarso grado di adesione con specie cellulari presenti nei tessuti o fluidi biologici. Tali superfici rivestono particolare interesse in quelle applicazioni in cui l'adesione tra materiali e cellule possa recare danni ai tessuti biologici (Kaufman, H.E. et al., Science, 189, 525, 1977).
La modifica delle superfici dei materiali mediante acido ialuronico o suoi derivati ha presentato per molti alcune difficoltà. Innanzitutto si è visto che le soluzioni di acido ialuronico hanno una tensione superficiale piuttosto elevata, uguale o inferiore a quella dell’acqua (F. H. Silver et al., Journal of Applied Biomaterials, 5, 89, (1994). Come noto, per ottenere una ricopertura omogenea mediante processo di applicazione da soluzione, il materiale applicato deve avere una tensione superficiale inferiore rispetto al substrato, in modo da ricoprirlo in maniera completa ed omogenea. Poiché praticamente la totalità dei materiali polimerici utilizzabili come substrati presenta tensione superficiale inferiore a quella dell'acqua (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 304, 1994) la formazione di uno strato sottile di acido ialuronico che ricopra in maniera omogenea il substrato risulta impedita.
Da notare, infine, che l'addo ialuronico è solubile in acqua, per cui oggetti ottenuti per semplice ricopertura con uno strato di addo ialuronico da soluzione perdono immediatamente la loro ricopertura se posti a contatto con soluzioni acquose, compresi i fluidi biologia. Derivati dell’acido ialuronico, anche se non solubili in acqua, sono comunque estremamente idrofili ed hanno una elevata tendenza a rigonfiare in presenza di acqua o soluzioni acquose (H.N.Joshi and E.M. Topp, International Journ. of Pharm. 80 (1992) 213-225). Questa caratteristica comporta, in ambiente acquoso, l'immediato distacco dello strato superficiale idrofilo applicato sul substrato mediante semplice processo di ricopertura da soluzione. Per questi motivi, sono stati studiati dei metodi che prevedono la formazione di un legame chimico tra la superficie del substrato e l'acido ialuronico o i suoi derivati. La presenza di un legame chimico stabile impedisce la dissoluzione dello strato superficiale e conferisce all'oggetto proprietà superficiali migliorate e stabili nel tempo.
La realizzazione di un legame chimico tra il substrato e lo strato superficiale presuppone l’esistenza di gruppi chimici adeguati in entrambi. Mentre la struttura chimica deH'addo ialuronico assicura la presenza di diverse funzionalità adeguate, la superficie della maggior parte dei materiali sintetici non è particolarmente adatta a questo tipo di operazione. Per questo motivo, i processi tesi a realizzare un legame chimico tra uno strato superficiale di acido ialuronico o suoi derivati ed un substrato sintetico prevedono in genere due stadi. Nel primo stadio vengono introdotti gruppi chimici adeguati sulla superficie, mentre nel secondo, viene attivata la reazione tra i gruppi chimici superficiali introdotti sul substrato e l'acido ialuronico o suoi derivati. Ad esempio, nei brevetti U.S.
4,657,820, U.S. 4,663,233, U.S. 4,722,867, U.S. 4,801,475, U.S. 4,810,586, U.S. 4,959,074, U.S. 5,023,114, U.S. 5,037,677, viene descritto l'uso di uno strato intermedio tra substrato e strato superficiale di acido ialuronico. Tale strato intermedio aderisce fisicamente al substrato e contiene gruppi chimici adatti a formare un legame con i gruppi chimici dell'acido ialuronico. Per facilitare lo scorrimento e la ricopertura omogenea del substrato da parte di quest'ultimo, inoltre, nei suddetti brevetti si descrive l'uso di albumina che, aggiunta all'acido ialuronico, migliora la capacità di bagnare uniformemente lo strato intermedio.
In altri documenti ancora viene utilizzata la tecnologia del plasma per introdurre gruppi reattivi sul substrato. Questa tecnica (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 6, 1994), consente di modificare la superficie dei materiali polimerici in maniera veloce ed efficace. Nella domanda di brevetto intemazionale WO 94/06485 viene descritta l'introduzione di gruppi funzionali sulla superficie di un materiale polimerico mediante trattamento con plasma di metanolo. Il materiale trattato viene in seguito posto a contatto con una soluzione di epicloridrina che garantisce la presenza di gruppi adatti a reagire con polisaccaridi. In altri articoli (Acta Physiologica Scandinava, 116, 201, 1982; Journal of Biomedicai Materials Research, 18, 953, 1984, Elan et al.) si descrive un trattamento con plasma di ossigeno seguito dall'applicazione di 3-glicidossipropiltrimetossisilano. Le superfici così trattate vengono utilizzate per la formazione di legame covalente con polisaccaridi. Tuttavia, benché in generale soddisfacenti, i metodi sopra descritti presentano alcune difficoltà. In particolare, l'uso di uno strato intermedio presenta la necessità di adeguare la composizione di quest'ultimo alla natura del substrato, in modo da rendere l'adesione la più elevata possibile. Nel caso di produzione di oggetti costituiti con materiali nuovi, o non comunemente utilizzati, è necessario dedicare tempo ed indagini per individuare la formulazione più adeguata per lo strato intermedio. Se gli oggetti da ricoprire sono composti da materiali diversi, risulta difficile applicare uno strato intermedio adeguato per ogni componente evitando sovrapposizioni e sconfinamenti degli strati intermedi in zone non opportune. L'uso dell'albumina per favorire la bagnabilità del substrato, inoltre, può non essere desiderato, specialmente nel caso di prodotti destinati ad applicazioni biomediche. Passando agli altri esempi citati, è preferibile evitare l'uso di epicloridrina e di 3-glicidossipropiltrimetossisilano, essendo noto che entrambi i composti sono estremamente pericolosi per la salute. Infatti, secondo la classificazione dei prodotti pericolosi adottata dalla Comunità Economica Europea, tali composti sono marcati con le denominazioni definite a rischio "R45" ed "R40" rispettivamente, come riportato, ad esempio, nella maggior parte dei cataloghi di prodotti e reagenti chimici. Tale designazione indica, nel primo caso, che il composto può provocare il cancro e, nel secondo, che esiste la possibilità di effetti irreversibili. Più in generale, la ressa di tutte le reazioni, che coinvolgono dei gruppi funzionali immobilizzati su una superficie e molecole grosse come i polisaccaridi precedentemente descritti, è seriamente limitata dall'effetto denominato, nella comune accezione chimica, di ingombro sferico. Le elevate dimensione della molecola del polisaccaride impediscono o ostacolano il contatto tra gruppi reattivi e le probabilità di un incontro reattivo efficace sono decisamente basse. Per ovviare a questa limitazione, nella domanda di brevetto italiana n. PD95A000039 depositata il 7.2.95 viene descritto un processo di ricopertura di oggetti mediante acido ialuronico e suoi derivati, che prevede la reazione in soluzione tra il polimero ed una molecola in grado di legarsi sia ad esso che al substrato (definita "molecola bifunzionale"), dove gli effetti di ingombro sierico sono decisamente ridotti. Il prodotto di reazione viene in seguito fatto reagire con la superficie del substrato, resa reattiva e bagnabile da un trattamento mediante plasma. Anche se questo processo risolve alcuni dei problemi esistenti negli altri processi descritti, esso impone di osservare una cura particolare nella fase di asciugatura della superficie ricoperta dalla soluzione contenente il prodotto di reazione tra la molecola bifunzionale e l'acido ialuronico o derivati. Infatti, l'adesione del prodotto di reazione tra l'acido ialuronico e la molecola bifunzionale al substrato avviene al momento dell'allontanamento dell'acqua. Per ottenere una ricopertura omogenea, nel caso di oggetti con geometria complessa, è necessario adottare sistemi di asciugatura costosi o complessi come stufe da vuoto, sistemi di rotazione o altri metodi analoghi. Altri metodi descritti nell'arte prevedono la reazione tra polisaccaridi e gruppi amminici. Nel brevetto giapponese JP 04126074 (27.04.92) viene descritto l'uso di un trattamento con plasma di ammoniaca per introdurre gruppi amminici sulla superficie di substrati polimerici.
Tali gruppi amminici vengono in seguito fatti reagire con acido ialuronico o altri polisaccaridi mediante l'uso di un agente condensante. Nel brevetto US 4,810,784 la superficie di un oggetto in materiale polimerico viene trattata con soluzioni reattive, in modo da introdurre cariche elettrostatiche negative sulla superficie stessa. La superficie così trattata viene posta a contatatto con una soluzione acquosa di polietileneimmina (PEI), un polimero caratterizzato dalla presenza di gruppi amminici e dotato di carica elettrostatica positiva. L'interazione tra le cariche di diverso segno lega PEI sulla superficie modificata e viene dunque ottenuta una superficie ricca di gruppi amminici. Eparina ed airi polisaccaridi vengono legati alla superficie amminata dopo essere stati trattati con soluzioni di nitriti. Come noto nella chimica organica, l'azione dei nitriti provoca la formazione di gruppi aldeidici. Questi ultimi reagiscono con la superficie amminata, legando irreversibilmente il polisaccaride alla superficie stessa. La medesima reazione viene sfruttata introducendo gruppi aldeidici mediante blanda ossidazione con periodato (C. Brink et al., "Colloids and Surfaces", 149, 66, 1992). La reazione tra PEI e gruppi aldeidici presenti o introdotti su polisaccaridi è, inoltre, stata utilizzata per legare alla superficie polisaccaridi in diverse conformazioni (E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995). Il brevetto US 5,409,696 descrive la modifica della superficie di materiali con trattamento mediante plasma contenente vapore d'acqua e successiva reazione della superficie trattata con PEI. La superficie ricca di gruppi amminici così ottenuta è in grado di legare irreversibilmente eparina e altri polisaccaridi mediante l'azione di agenti condensanti. Tipicamente, viene descritta la reazione tra gruppi carbossilici del polisaccaride e gruppi amminici della superficie promossa da etildimetilamminopropilcarbodiimmide (EDC). L'impiego di questo processo per la ricopertura dell'interno di tubi destinati ad entrare a contatto con il sangue è stata descritta da P.V. Narayanan (Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 6, 181, 1994).
La sperimentazione ha rivelato che i processi descritti nei brevetti e negli articoli citati non sono completamente soddisfacenti per quanto riguarda la realizzazione di oggetti modificati in superficie mediante acido ialuronico o suoi derivati. Infatti, l'introduzione di gruppi funzionali di tipo amminico mediante plasma di ammoniaca, come nel brevetto JP 04126074 (27.04.92), non è facilmente sfruttabile in un processo produttivo. Gli esperti del settore conoscono che la densità di gruppi funzionali introdotti mediante tale tecnica sulla superficie del substrato è piuttosto bassa e troppo dipendente dalla geometria precisa del reattore utilizzato per il trattamento mediante plasma, dalla natura del substrato, dalla presenza di additivi e/o contaminanti sulla superficie ed all'interno del substrato e dalle condizioni di conservazione del substrato prima e dopo il trattamento, per potere essere di effettiva utilità in un contesto di produzione industriale. Questo aspetto negativo viene riconosciuto dagli addetti al settore e, nei brevetti sopra descritti US 4,810,874 e US 5,409,696, vi si pone rimedio utilizzando PEI, che consente di ottenere un'elevata densità di gruppi amminici. Questi ultimi processi, tuttavia, pur risolvendo efficacemente il primo stadio del processo, cioè l'introduzione di gruppi reattivi sulla superficie del materiale, si rivelano carenti nel secondo stadio, che riguarda il legame tra l'acido ialuronico o suoi derivati e la superficie. Infatti, come precedentemente ricordato, il brevetto US 4,810,874 prescrive l'attivazione di eparina o altri polisaccaridi mediante trattamento chimico. Non è quindi possibile utilizzare il polisaccaride come tale ma è necessario partire da un materiale modificato mediante un'operazione chimica, con relativi costi di tempo, reagenti, mano d'opera e smaltimento reflui. Inoltre, contrariamente agli altri polisaccaridi, l'acido ialuronico è scarsamente sensibile alle reazioni di ossidazione parziale che consentono di introdurre sul polisaccàride stesso gruppi reattivi di tipo aldeidico (J.E. Scott and M.J. Tigwell, Biochem. J., 173, 103, 1978; B.J. Kvam et al., Carbohydrate Research, 230, 1, 1992). Per quanto riguarda il brevetto US 5,409,696 il processo proposto non riesce, se sottoposto a verifica sperimentale, a produrre una struttura superficiale in grado di sfruttare completamente le caratteristiche intrinseche dell'acido ialuronico. Come noto agli esperti, e come dimostrato nell'esempio 4 della domanda di brevetto italiana n. PD 95A000030 del 07.02.1995, le superfici di oggetti ricoperti da addo ialuronico non consentono l'adesione cellulare, a causa della loro natura fortemente idratata ed idrofila (il mantenimento di questa caratteristica è decisamente importante, in quanto consente di realizzare materiali e dispositivi dotati di capacità antiadesive). Utilizzando, invece, il processo descritto nel brevetto US 5,409,696, come evidenziato negli esempi comparativi contenuti nell'apposita sezione, non è possibile ottenere strutture superficiali in grado di inibire l'adesione cellulare. Risultati analoghi si osservano quando, invece dell'arido ialuronico, si utilizzano i suoi esteri semisintetici solubili in acqua (EPA 0216453). Evidentemente, il modo in cui si stabilisce il legame tra superficie amminata e polisaccaride non consente, operando secondo il processo descritto, un pieno sfruttamento delle caratteristiche di idrofilia dell'acido ialuronico o dei suoi derivati.
Non deve essere inoltre trascurato il particolare che il proceso oggetto del brevetto US 5,409,696 trova applicazione solamente nella modifica superficiale di materiali polimerici, come indicato dal suo titolo "Radiofrequency plasma treated polymeric surfaces having immobilized antithrombogenic agente" e dalla descrizione delle modalità operative. Nella comune pratica biomedica e chirurgica trovano notevole applicazione anche materiali ceramici o metallici, ed è auspicabile che i processi di modifica siano applicabili anche a questi substrati.
Dalla precedente descrizione, risulta evidente che esiste la necessità di un metodo che consenta la formazione di un legame chimico tra un substrato, di qualunque natura, ed acido ialuronico o suoi derivati, in maniera semplice e affidabile, e che consenta di sfruttarne appieno le caratteristiche intrinseche.
La Richiedente ha ora sorprendentemente trovato che tale metodo esiste e che questo consente la produzione di oggetti, realizzati in materiale metallico, polimerico, ceramico, ricoperti con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati o altri polimeri, legati chimicamente al substrato. Tali oggetti presentano le caratteristiche globali del materiale di cui sono realizzati e le favorevoli caratteristiche superficiali impartite dalla presenza di una ricopertura stabile di acido ialuroncio o di un suo derivato.
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE
Nella sua forma più ampia, la presente invenzione consente la ricopertura di un oggetto mediante uno strato di acido ialuronico, o di un suo derivato o di un polisaccaride contenente gruppi carbossilici, mediante formazione di un legame chimico con la superficie del substrato. Secondo il metodo della presente invenzione, un materiale, di qualunque natura, verrà trattato mediante plasma di aria, ossigeno, argon, azoto o altri gas o vapori in grado di introdurre funzionalità ossigenate sulla superficie e/o di esercitare un effetto di pulizia e rimozione di contaminanti organici. L'uso di plasma contenente vapore d'acqua, come rivendicato nel brevetto US 5,409,696, non è richiesto secondo il processo della presente invenzione. La superficie del materiale così trattato sarà esposta ad una soluzione acquosa di PEI, in modo da creare una elevata concentrazione superficiale di gruppi amminici. Il materiale così ottenuto verrà fatto reagire con acido ialuronico, suoi derivati o altri polisaccaridi contenenti gruppi carbossilici, in presenza di agenti condensanti quali EDC, in soluzione acquosa o dicicloesilcarbodiimmide (DCC), in solventi organici. Sarà inoltre presente una molecola in grado di aiutare la reazione promossa da EDC: rientrano in questa classe, senza peraltro limitarne l'ampiezza, molecole quali l'idrossisuccinimmide (NHS), l'idrossisulfosuccinimmide, l'idrossibenzotriazoloidrato e molecole analoghe. Il processo, oggetto della presente invenzione, si basa sulla sorprendente osservazione che molecole quali NHS sono in grado di contribuire alla reazione di condensazione promossa da EDC anche quando essa coinvolge gruppi legati sulla superficie ed in assenza di quelle strutture molecolari note agli esperi come "bracci spaziatori". E' infatti noto che NHS aiuta la reazione tra gruppi amminici e gruppi carbossilici promossa da EDC quando entrambi i gruppi si trovino in soluzione (domanda di brevetto italiana N. PD95A000030 del 07.02.1995). Per quanto riguarda, in particolare, l'acido ialuronico, è noto che in soluzione, in assenza di NHS, si formano dei prodotti di reazione intermedi, genericamente definiti come N-acilurea, che ostacolano il pieno compimento della reazione (X.Xu et al. Trans. IV World Biom. Cong., 170, 1992). Quando i gruppi amminici sono legati alla superficie è necessario, per renderli sufficientemente reattivi, ricorrere alle strutture molecolari note agli esperti come "bracci spaziatori". Un "braccio spaziatore" è una sequenza di atomi di carbonio che, allontanando il gruppo reattivo dalla superficie, lo rende più libero e ne aumenta la reattività. Ad esempio, il prodotto CovaLink (Nunc) è costituito da polistirene che contiene gruppi amminici secondari separati dalla superficie da un "braccio spaziatore" di nove atomi di carbonio (K. Gregorius et al. J. Immunol. Meth., 181, 65, 1995) ed NHS si rivela efficace per aumentare la resa della reazione promossa da EDC (J.V. Staros et al., Anal. Biochem., 156, 220, 1986). Ovviamente, la realizzazione in superficie di strutture molecolari complesse, quali gruppi funzionali supportati su bracci spaziatori, impone costi e limitazioni di processo notevoli. Nel processo della presente invenzione, i gruppi amminici si trovano legati alla superficie ed all'interno della struttura di PEI, e non è necessario ricorrere a bracci spaziatori o prestare cura ad altri aspetti strutturali. L'osservazione che NHS è in grado di favorire la reazione di condensazione di gruppi amminici superficiali promossa da EDC, anche in assenza di bracci spaziatori e senza particolare cura degli aspetti molecolari della superficie, è sorprendente e determinante ai fini della realizzazione del processo. Ancora più sorprendente e non anticipabile sulla base delle conoscenze preesistenti è l'osservazione del decisivo effetto della presenza di NHS nella miscela di reazione sulle proprietà di antiadesione cellulare di superfici ricoperte da acido ialuronico o suoi derivati. Infatti, operando in assenza di NHS, come descritto nel brevetto US 5,409,696 non è possibile impartire alle superfici ricoperte da acido ialuronico proprietà antiadesive nei confronti di cellule. Al contrario, operando secondo la presente invenzione, si ottengono superfici perfettamente resistenti alla colonizzazione cellulare. Pur non essendo gli inventori chiamati a spiegare i motivi dei risultati ottenuti e senza voler essere limitati da una particolare teoria, si supponde che la differenza di comportamento sia ascrivibile ad una delle seguenti ragioni: o, in assenza di NHS, la resa della reazione è troppo bassa per cui, pur legandosi dell'acido ialuronico sulla superficie, la sua quantità non è sufficiente a mascherare completamente la superficie del materiale sottostante; oppure il legame che si stabilisce in assenza di NHS provoca un'alterazione delle caratteristiche dell'acido ialuronico legato alla superficie. La struttura risultante non conserva le proprietà che sarebbe lecito attendersi dalla natura del polimero e dalla comune conoscenza chimica.
In una forma particolarmente favorevole della presente invenzione, un materiale polimerico, metallico o ceramico sarà sottoposto a trattamento mediante plasma di aria o di ossigeno. Le condizioni del trattamento non sono limitanti e possono dipendere dalla geometria del prodotto. Tempi più lunghi saranno utilizzati per modificare l'interno di tubi o parti scarsamente accessibili, mentre per superfici piatte o scoperte saranno necessari tempi più brevi.
Il materiale trattato sarà posto in una soluzione acquosa di PEI, a concentrazione compresa tra lo 0.01% e il 10% e preferibilmente tra lo 0.5 ed il 2%. Il tempo di reazione non è limitante e sarà compreso tra 10 minuti e 10 ore. Al termine di questa fase, il materiale verrà lavato e posto in una soluzione di acido ialuronico o suo derivato o altro polisaccaride contenente gruppi carbossilici. La concentrazione del polisaccaride sarà compresa tra lo 0.005 ed il 5% e preferibilmente tra lo 0.05 e l'l%. Alla soluzione verranno aggiunte NHS e EDC, in concentrazione compresa tra 0.001 e 1%. La reazione avverrà a temperatura ambiente o con lieve riscaldamento e potrà durare da 10 minuti a 48 ore. Qualora il polisaccaride ed il substrato lo consentano, la reazione potrà avvenire in solvente organico, utilizzando DCC ed NHS nelle concentrazioni specificate in precedenza.
L'importanza del trovato non può sfuggire agli esperti del ramo. II metodo della presente invenzione consente, infatti, di ottenere oggetti dotati delle favorevoli caratteristiche superficiali impartite dalla presenza di una ricopertura di acido ialuronico o di un suo derivato, stabile nel tempo, per la presenza di legami chimici tra lo strato superficiale ed il substrato. Le superfici di tali oggetti, inoltre, presenteranno elevate caratteristiche di resistenza all'adesione di cellule e batteri presenti nei fluidi biologici.
In alternativa all'acido ialuronico o ai suoi derivati parziali (EPA 0216453), o a polisaccaridi contenenti gruppi carbossilici, è possibile applicare il suddetto processo ad esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico (EP 0265116), esteri interni di polisaccaridi acidi (EPA 0341745), esteri della carbossimetilcellulosa, carbossimetilchitina e carbossimetilamido (EP 0342557), esteri attivi di polisaccaridi carbossilici (domanda di brevetto italiana N. PD94A000043) esteri solfatati di acido ialuronico (domanda di brevetto italiana N. PD94000054), esteri dell'acido alginico (EP 0251905), esteri del gellano (EPA 0518710), esteri interni del gellano (WO 94/03499), esteri della chitina e del chitosano (EPA 0603264), esteri dell'acido pectico e pectinico (EPA 0621877).
Si citano di seguito alcuni esempi puramente illustrativi e tutte quelle variazioni che possono risultare ovvie all'esperto del ramo sono comprese nella presente invenzione.
ESEMPI DI PREPARAZIONE
Esempio 1
Un campione di polistirene, ottenuto da capsule Petri di grado batteriologico (Corning) viene sottoposto a trattamento mediante plasma in un reattore a piatti paralleli (Gambetti Kenologia). Il trattamento viene svolto con una pressione di 100 mTorr di ossigeno, una potenza di scarica di 50 W, una velocità di flusso di 20 cm3(Std)/min ed un tempo di trattamento di 30 secondi. I campioni trattati vengono immersi per due ore in una soluzione allo 0.5% di PEI (Aldrich) in acqua. Dopo due ore essi vengono estratti, lavati con acqua ed immersi in provette contenenti 5mL delle seguenti soluzioni:
1) 1% (in peso) di acido ialuronico (Fidia Advanced Biopolymers, Brindisi)
2) 1% (in peso) di acido ialuronico, 0.02 g di l-etil-3-(3-dimetilamminopropiDcarbodiimmide (Sigma), 0.02 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma).
3) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 25% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers).
4) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 25% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers), 0.02 g di 1-etil-3-(3-dimetilammino-propil)carbodiimmide (Sigma), 0.3 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma).
5) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 50 % con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers).
6) 1% (in peso) di acido ialuronico esterificato al 50% con alcool benzilico, 0.02 g di l-etil3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (Sigma), 0.02 g di N-idrossisuccinimmide (Sigma).
I campioni vengono mantenuti a temperatura ambiente nelle provette per 12 ore ed in seguito lavati in acqua per una notte. L'efficacia del trattamento viene valutata mediante analisi ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis). Come noto (Garbassi F. et al. "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 3, 1994), questa tecnica consente di valutare la composizione chimica della superficie dei materiali. Per l'analisi viene utilizzato uno strumento Perkin Elmer PHI 5500 ESCA System. Accanto ai campioni precedentemente descritti viene analizzato, come riferimento, un campione trattato mediante plasma e sottoposto solamente al contatto con la soluzione di PEI.
I dati evidenziano un notevole aumento della quantità di ossigeno presente sulla superficie a seguito del processo di modifica, come atteso dall'introduzione di acido ialuronico e dei suoi esteri. Al contrario, in assenza di EDC ed NHS, la composizione superficiale rimane simile a quella del riferimento. Inoltre, Tanalisi dettagliata del picco C1s evidenzia un'elevata quantità di legami C-O, in accordo con la struttura molecolare attesa. Gli spettri ESCA dei campioni 1 e 2 sono riportati nelle figure la e lb.
Esempio 2
Altri campioni preparati secondo il processo descritto nell'esempio 1 vengono immersi in acqua per due mesi. Viene ripetuta l'analisi ESCA. Non si osservano diminuzioni o alterazioni della concentrazione superficiale di ossigeno, a conferma della stabilità del legame tra polisaccaride e superficie.
Esempio 3
Un film di polietilene da imballaggio viene sottoposto a trattamento plasma ed immerso in EDC come descritto nell'esempio 1. Si preparano due campioni che vengono immersi nelle seguenti soluzioni di dimetilsolfossido (Fluka):
1) 1% di acido ialuronico esterificato al 75% con alcool benzilico (Fidia Advanced Biopolymers)
2) 1% di acido ialuronico esterificato al 75% con alcool benzilico, 0.02 g di l-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide, 0.02 g di N-idrossisuccinimmide.
Dopo 24 ore di lavaggio in dimetilsolfossido, i campioni vengono sottoposti ad analisi ESCA. Si ottengono i seguenti risultati:
Esempio 4
Un campione di acciaio 316, un tipo comunemente utilizzato per applicazioni biomediche, viene trattato mediante plasma di aria per 15 minuti, quindi posto a contatto con una soluzione di PEI allo 0.5% per 2 ore. Acido ialuronico viene legato alla superficie del materiale utilizzando la soluzione 2 dell'esempio 1. Il materiale viene quindi analizzato mediante analisi ESCA. Il picco Cls ottenuto dall'analisi è riportato nelle Figure 2: la Fig. 2a si riferisce al campione dopo esposizione alla soluzione di PEI, la Fig. 2b illustra il picco Cls del campione sottoposto alla modifica completa. In quest'ultimo caso è possibile osservare la tipica forma allargata, a molte componenti, caratteristica del picco Cls dei polisaccaridi (si veda, ad esempio, il già citato articolo di E. Ostenberg et al., Journal of Biomedicai Materials Research, 29, 741, 1995), che conferma la presenza di acido ialuronico in superficie.
Esempio 5
Alcune capsule Fetri per colture cellulari (Corning) vengono sottoposte al processo di modifica descritto nell'esempio 1 (3 capsule per ciascun trattamento). Le capsule così preparate ricevono 5 mL di sospensione cellulare (cellule fibroblastiche di tessuto connettivo di topo, L-929 in Minimum Essential Eagle's Medium addizionato del 10% di siero di vitello fetale, degli antibiotici penicillina, streptomicina e amfoteridna B e di L-glutamina, SPA, Milano), vengono poste in incubatore (Forma) a 37 °C e atmosfera al 5% di CO2 e 98% di umidità. Le interazioni tra le cellule e il supporto in polistirene trattato come riportato nell'esempio 1 sono valutate microscopicamente con microscopio ottico invertito a contrasto di fase (Leica) ad intervalli di tempo regolari. In particolare, viene analizzata l'eventuale capacità delle cellule di aderire ai supporti diversamente trattati e l'entità di tale adesione con riferimento ad un controllo costituito da una capsula Petri trattata solamente con plasma, in cui la capacità di adesione è massima. In questo esempio (derivante dalla media delle osservazioni condotte a 24 ore), il punteggio 5 si riferisce alla massima capacità di adesione, il punteggio 0 all'assenza di adesione. Si ottengono i seguenti risultati:
L'esperimento conferma la presenza di uno strato idrofilo saldamente legato in grado di impedire l'adesione cellulare.
Esempio 6:
Quattro capsule di Petri in polistirene vengono trattate secondo il processo di modifica descritto nell'esempio 1, utilizzando la soluzione 2 di acido ialuronico (tali campioni verranno definiti A). Un uguale numero di capsule viene trattato secondo il processo di ricopertura mediante acido ialuronico descritto nell'esempio 11 del brevetto US 5,409, o96 (tali campioni sono definiti B). Le capsule modificate vengono poste a contatto con una sospensione di cellule L-929, come descritto nell'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata come nell'esempio precedente e si ottengono i seguenti risultati:
Nelle Figure 3a e 3b sono riportate delle immagini, ottenute al microscopio ottico che evidenziano lo stato delle superfici al termine della prova. La Fig. 3a si riferisce al campione A, quella 3b al campione B. E' chiaramente evidente il diverso grado di resistenza all'adesione cellulare ottenuto nei due processi.
Esempio 7:
Quattro capsule di Petri in polistirene vengono trattate secondo il processo di modifica descritto nell'esempio 1, utilizzando le soluzioni di esteri di acido ialuronico 4 e 6 (tali campioni vengono definiti C e D rispettivamente). Un uguale numero di capsule viene trattato secondo il processo descritto nel brevetto US 5,409,696, utilizzando i medesimi esteri dell'acido ialuronico (tali campioni sono definiti E ed F). Le capsule modificate vengono poste a contatto con una sospensione di cellule L-929, come descritto nell'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata come nell'esempio precedente e si ottengono i seguenti risultati:
Nelle Figure 4a e 4b sono riportate delle immagini, ottenute al microscopio ottico, che evidenziano Io stato delle superfici al termine della prova. La Fig. 4a si riferisce al campione D, quella 4b al campione F. E' chiaramente evidente il diverso grado di resistenza all'adesione cellulare ottenuto nei due processi.
Esempio 8:
Una lastrina di Titanio (Aldrich) viene sottoposta al processo di modifica mediante plasma e trattamento con PEI descritto nell'esempio 4. La superficie così trattata viene fatta reagire con la soluzione 6 dell'esempio 1. Titanio non modificato e Titanio su cui è stato eseguito il processo di modifica (quattro campioni per ogni materiale) vengono posti a contatto con una sospensione di cellule L-929, come all'esempio precedente. L'adesione cellulare viene valutata dopo 24 ore, colorando le cellule con blu di toluidina ed osservando i campioni in coltura mediante un microscopio metallografico. I risultati delle osservazioni sono illustrati nelle Fig. 5a e 5b. La Fig. 5a si riferisce al Titanio non modificato, la Fig. 5b al Titanio modificato con l'estere dell'acido ialuronico secondo il presente processo. E' chiaro che le cellule si comportano in maniera differente sulle due superfici. Nel caso del materiale modificato, le cellule mantengono una morfologia rotondeggiante e non assumono l'aspetto "allargato" e piatto tipico delle cellule che hanno ben aderito al substrato, osservabile nel caso del materiale tal quale (Fig. 5a).
Esempio 9:
Il processo di modifica descritto nell'esempio 8 viene eseguito su un campione di vetro per microscopio. Vetro modificato, vetro normale ed una capsula di polistirene modificato mediante plasma (utilizzato come controllo con capacità di adesione massima) vengono posti a contatto con le cellule L-929. L'adesione cellulare viene valutata dopo 24 ore. Si ottengono i seguenti risultati:
Esempio 10
Il processo di modifica descritto nell'esempio 1 viene eseguito su due lenti intraoculari (Sanitaria Scaligera), utilizzando una soluzione allo 0.5% di acido ialuronico grado oftalmico (Fidia Advanced Biopolymers), 0.4% di EDC e 0.4% di NHS. Le lenti modificate ed un uguale numero di lenti non modificate vengono poste in capsule di Petri e messe a contatto con la sospensione di cellule L-929, come agli esempi precedenti. La resistenza all'adesione di cellule dei campioni è illustrata nelle figure 6 e 7. Si tratta di fotografie relative alla superfide delle lenti modificate secondo il presente processo (6a e 7a) e non modificate (6b e 7b). Dalle immagini risulta evidente la diversa capacità di inibire l'adesione cellulare delle due superfid.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di rendere disponibile un nuovo ed innovativo processo per la produzione di oggetti ricoperti con uno strato sottile di acido ialuronico o suoi derivati o altri polimeri legati chimicamente al substrato. Tale processo può trovare applicazione nella realizzazione di materiali e dispositivi con proprietà superficiali migliorate ed, in particolare, di materiali e dispositivi caratterizzati da superfici idrofile. Più in particolare, il processo può trovare impiego nella preparazione di materiali per applicazioni biomedicali e chirurgiche, in urologia, ortopedia, otorinolaringoiatria, gastroenterologia, oftalmologia, nel settore cardio-vascolare e in diagnostica. Tra le applicazioni biomedicali, si possono realizzare dispositivi utilizzabili in applicazioni paracorporee o extracorporee, come cateteri, sacche per sangue, tubicini, sonde, siringhe, strumenti chirurgici, contenitori, sistemi di filtrazione; per applicazioni protesiche e di impianto o in chirurgia si possono rivestire tendini artificiali, giunture, viti di fissaggio, valvole cardiache, protesi ossee e cardiovascolari, graft, cateteri venosi, lenti intraoculari, materiali per sostituzioni di tessuti soffici, ecc. Fra i dispositivi semipermanenti si possono rivestire lenti a contatto. Per la realizzazione di dispositivi complessi che simulano processi fisiologici, si possono ottenere reni artificiali, ossigenatoti di sangue, cuori artificiali, pancreas e fegato artificiali. Infine, in diagnostica si possono rivestire accessori di laboratorio, piastre per la coltivazione e/o rigenerazione di cellule e tessuti e come supporto di principi attivi quali peptidi, proteine e anticorpi.
Essendo l’invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell’invenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni:

Claims (41)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un processo per il rivestimento di oggetti, con acido ialuronico o un suo derivato, caratterizzato dalle seguenti fasi: - il trattamento del substrato mediante plasma; - l'immersione del substrato trattato in una soluzione contenente PEI; - la reazione tra il substrato modificato e l'acido ialuronico o un suo derivato in presenza di una carbodiimmide ed NHS.
  2. 2. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui il derivato è l'estere totale o parziale benzilico dell'acido ialuronico.
  3. 3. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui il derivato è l'estere totale o parziale etilico dell'acido ialuronico.
  4. 4. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui il substrato è trattato con plasma di ossigeno, di aria, di alcool, di acetone, di azoto, di argon e di loro miscele.
  5. 5. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui la reazione tra substrato modificato ed acido ialuronico o un suo derivato avviene in soluzione acquosa, in presenza di NHS e di 1-etil-3-(3-dimetilammino-propilcarbodiimmide).
  6. 6. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui la reazione tra il substrato modificato e l'acido ialuronico o un suo derivato avviene in solvente organico, in presenza di NHS e dicicloesilcarbodiimmide.
  7. 7. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui l'oggetto da rivestire è un catere.
  8. 8. Uso di un catetere preparato secondo la rivendicazione 1 in campo urologico.
  9. 9. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui l'oggetto da rivestire è una lente oculare.
  10. 10. Uso di una lente intraoculare preparata secondo la rivendicazione 1 in campo oftalmico.
  11. 11. Un processo per il rivestimento di oggetti con polimeri semisintetici, caratterizzato dalle seguenti fasi: - il trattamento del substrato mediante plasma - l'immersione del substrato trattato in una soluzione contenente PEI - la reazione tra il substrato modificato e il polimero in presenza di una carbodiimmide ed NHS.
  12. 12. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere di alcool polivalente di acido ialuronico.
  13. 13. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere interno di un polisaccaride acido.
  14. 14. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere della carbossimetilcellulosa.
  15. 15. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere della carbossimetilchitina.
  16. 16. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere del carbossimetilamido.
  17. 17. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere attivo di un polisaccaride carbossilico.
  18. 18. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere solfatato di acido ialuronico.
  19. 19. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere dell'acido alginico.
  20. 20. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere della chitina o del chitosano.
  21. 21. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui il polimero semisintetico è un estere dell'acido pectico o pectinico.
  22. 22. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui l'oggetto da rivestire segue il trattamento descritto nelle rivendicazioni 4-8.
  23. 23. Un processo secondo la rivendicazione 22, in cui la reazione tra substrato modificato ed il polimerico semisintetico avviene in soluzione acquosa, in presenza di NHS ed l-etil-3-(3-dimetilamminopropilcarbodiimmide).
  24. 24. Un processo secondo le rivendicazioni 22-23, in cui la reazione tra substrato modificato ed il polimerico semisintetico avviene in soluzione acquosa, in presenza di NHS ed dicicloesilcarbodiimmide.
  25. 25. Un processo secondo la rivendicazione 11, in cui l'oggetto da rivestire è costituito da materiale compatibile con i liquidi fisiologici.
  26. 26. Un processo secondo le rivendicazioni 1 e 11, in cui il substrato è in materiale polimerico.
  27. 27. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il substrato è in materiale metallico.
  28. 28. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il substrato è in Titanio o sue leghe.
  29. 29. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il substrato è acciaio.
  30. 30. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il substrato è una lega cromocobalto.
  31. 31. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il substrato è in materiale ceramico.
  32. 32. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui gli oggetti da rivestire sono cateteri, sacche per sangue, tubicini, sonde, siringhe, strumenti chirurgici, contenitori, sistemi di filtrazione, tendini artificiali, giunture, viti di fissaggio, valvole cardiache, protesi ossee e cardiovascolari, graft, cateteri venosi, lenti intraoculari, lenti a contatto, materiali per sostituzioni di tessuti soffici, reni artificiali, ossigenatoli di sangue, cuori artificiali, pancreas e fegato artificiali.
  33. 33. Un processo secondo le rivendicazioni precedenti, in cui gli oggetti da rivestire sono accessori di laboratorio, piastre per coltivazione e/o rigenerazione di cellule e tessuti e supporti di principi attivi quali, ad esempio, peptidi, proteine ed anticorpi.
  34. 34. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in chirurgia.
  35. 35. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in urologia.
  36. 36. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in ortopedia.
  37. 37. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in otorinolaringoiatria.
  38. 38. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in gastroenterologia.
  39. 39. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 in oftalmologia.
  40. 40. Uso di oggetti biomedicali preparati in accordo alle rivendicazioni 1-32 nel settore cardiovascolare.
  41. 41. Uso di oggetti biomedicali alla rivendicazione 33 in campo diagnostico.
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