ITPD970064A1 - Composti n-solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad attivita' anticoagulante e non-trombogenica e processo per la loro - Google Patents
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Description
Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale dai titolo "Composti N-solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad attività anticoagulante e non-trombogenica e processo per la loro preparazione",
OGGETTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive nuovi composti solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad attività anticoagulante e nontrombogenica per la preparazione di formulazioni farmaceutiche, di biomateriali e per il rivestimento di oggetti biomedicali ed il processo per la loro preparazione.
CAMPO DELL’INVENZIONE
L'eparina è il glicosamminoglicano solfatato con maggiore attività biologica. Sono ben conosciute le sue proprietà antitrombotica e anticoagulante. Infatti è usata nel trattamento di patologie cardiovascolari a rischio trombotico e ha dato notevoli contributi nel successo della chirurgia a cuore aperto.
La struttura dell'eparina non è interamente conosciuta.
L'eparina commerciale comprende uno spettro di 21 eparine (Nader et al., 1974, Biochem. Biophys; Res. Commun. 57:488), con peso molecolare compreso tra 3.000 e 37.500 Da, con attività anticoagulante variabile.
L'attività anticoagulante dell'eparina è dovuta alle sue caratteristiche strutturali, ad esempio, al grado di solfatazione, al grado di dissociazione, alla sequenza dei gruppi COO- e SO3", alla forma e alla grandezza della molecola. Questi fattori sono importanti per la formazione dei legami ionici responsabili dell'attività biologica dell'eparina (Stivala et al., 1967, Arch. Biochem. Biophys. 122:40).
A causa dell'alta densità di carica negativa, l'eparina ha una forte affinità per i cationi e la sua attività è pH dipendente.
In particolare, il gruppo N-solfatato del residuo glucosamminico ha un ruolo fondamentale nell'interazione con i fattori che regolano i processi coagulativi.
Una riduzione significativa dei gruppi N-solfatati riduce drasticamente le attività anticoagulante e antitrombotica.
Molti polisaccaridi naturali sona stati solfatati allo scopo di ottenere prodotti analoghi dell'eparina (Hoffman et al., 1982, Carbohydrate Res.
2:115; Kindness et al., 1980, Brit. J. Pharmac. 69:675; Horton et al., 1973, Carbohydrate Res. 30:349; Okada et al., 1979, Makromol. Chem.
180:813; Kikuchi et al., 1979, Nippon Kagaku Kaishi 1:127; Manzac et al., 1981, Proc. Third M.I.S.A.O. 5:504). Inoltre, gruppi solforici, carbossilici o solfonati sono stati attaccati a polimeri sintetici come il polistirene (Kanmaugue et al., 1985, Biomaterials, 6:297) e i poliuretani Gto et al., 1992, Biomaterials, 13:131).
Tuttavia, l'attività anticoagulante di questi materiali è molto più bassa rispetto a quella dell'eparina e dipende dal tipo di sostituente, dal tipo di legame, dal grado di sostituzione e dalla sequenza.
Sono note, infine, alcune reazioni chimiche di solfatazione di polisaccaridi (WO 88/00211; EP 0340628; Carbohydrate Research, 158.
183-190,1986) ma non sono stati ottenuti derivati che, oltre alle caratteristiche chimico-fisiche peculiari dei polisaccaridi, possedessero nuove caratteristiche, come ad esempio l'attività anticoagulante.
Nella domanda di brevetto della Richiedente No. PCT/EP95/01111 viene descritto un processo di solfatazione non selettivo deU'arìdo ialuronico e dei suoi derivati per ottenere composti ad attività antitrombotica.
La loro capacità di inattivare la trombina dipende dalla formazione di interazioni elettrostatiche dipendenti dalla densità di carica che aumenta in funzione del grado di solfatazione, mentre l'attività della eparina è conseguenza di una interazione diretta con l'antitrombina HI (T. W. Barrowdiffe et al., Journal of Pharmaceutical & Biomedicai Analysis, Voi. 7, No. 2, pp. 217-226, 1989; Peter D.J. Grootenhuiis et al., J. Am. Chem. Soc., 113, 2743-2747, 1991).
Nonostante il largo impiego dell'eparina, questa presenta effetti collaterali quali, ad esempio, effetti emorragici, che ne impediscono un uso indiscriminato o non monitorato da personale medico.
Inoltre, a causa delle sue caratteristiche chimico-fisiche, l'eparina non può essere usata come biomateriale ma semplicemente come strato di ricopertura di altri materiali e in quantità tali da non provocare sanguinamelo locale.
Infine, agendo direttamente sui fattori dèlia coagulazione, l'azione anticoagulante dell'eparina avviene in tempi molto rapidi e la durata di azione, dipendente dalla dose, è in genere altrettanto breve. Questi problemi ne limitano l’applicabilità in settori chirurgici, come ad esempio quello cardiovascolare, in cui può essere necessario rimpianto di dispositivi per i quali l'assenza di trombogenicità deve essere garantita per tempi sufficientemente lunghi.
La presente invenzione, invece, descrive un processo chimico che utilizza un prodotto di partenza ben caratterizzato, quale l'acido ialuronico, e permette la solfatazione selettiva del gruppo amminico della glucosammina o, anche, del gruppo ossidrilico in posizione 6, ottenendo nuovi derivati solfatati dell'acido ialuronico, con distribuzione di peso molecolare non alterata, ad attività anticoagulante paragonabile a quella dell'eparina.
Mentre la capacità dei polisaccaridi iper-soifatati di inattivare la trombina è conseguenza della formazione di interazioni elettrostatiche dipendenti dalla densità di carica, che aumenta in funzione del grado di solfatazione, i derivati N-solfatati descritti nella presente invenzione sembrano agire con meccanismo specifico, simile a quello dell'eparina, sui fattori della coagulazione.
Ulteriori vantaggi della presente invenzione sono rappresentati dalle caratteristiche chimico-fìsiche dei derivati N-solfatati, rispetto a quelle dei derivati iper-solfatati, che li rendono adatti per la preparazione di biomateriali da impiegare nel settore biomedico-sanitario e farmaceutico.
Inoltre, la possibilità di ottenere un composto ad attività anticoagulante e non-trombogenica operando una solfatazione selettiva solo dei gruppi amminici e dei gruppi ossidrilici in 6, riduce notevolmente i costi del processo rispetto alla preparazione di acido ialuronico con tutti i gruppi ossidrilici omogeneamente solfatati.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione descrive nuovi composti solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati, eventualmente salificati, ad attività anticoagulante e non-trombogenica, in cui le glucosammine risultano parzialmente N-solfatate o parzialmente N-solfatate e totalmente O-solfatate in posizione 6, per la preparazione di formulazioni farmaceutiche, di biomateriali biocompatibili e bioassorbibili con attività anticoagulante e per il rivestimento di oggetti biomedicali ed il processo per la loro preparazione.
Per derivato parzialmente 2-N-solfatato dell'acido ialuronico si intende un prodotto ottenuto in seguito alla reazione di solfatazione controllata del gruppo amminico della glucosammina dell'acido ialuronico, preventivamente N-de-acetilato in accordo alla procedura descritta da P. Shaklee (1984) Biochem. J. 217, 187-197. Schematicamente la reazione procede nel seguente modo:
Schema 1
Per derivati parzialmente 2-N-solfatati e 6-0- solfatati si intendono quei prodotti generati dalla reazione chimica illustrata nello schema 1, in cui, oltre al gruppo amminico della glucosammina, nel processo di solfatazione viene coinvolta totalmente o parzialmente la funzione ossidrilica primaria dello stesso residuo, secondo lo schema:
I derivati generati secondo gli schemi 1 e 2 possono essere impiegati come intermedi di reazione per la preparazione di composti, in accordo alla procedura descritta nel brevetto Europeo 0216453 Bl, in cui la funzione carbossilica del residuo glucuronico dell’acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato o parzialmente 2-N-solfatato e 6-0- solfatato, viene fatta reagire parzialmente o completamente con alcoli delle serie alifatica, aromatica, arilalifatica, dcloalifatica, eterociclica originando i rispettivi esteri parziali o totali:
Inoltre, é possibile impiegare i derivati sintetizzati secondo gli schemi 1 e 2 come intermedi per la preparazione di composti reticolati, in accordo alla procedura descritta nel brevetto Europeo 0341745 Bl, in cui una parte o la totalità dei gruppi carbossilid appartenenti al residuo D-glucuronico sono: i) fatti reagire, mediante l'impiego di agenti condensanti, con le funzioni alcoliche della stessa catena polisaccaridica o di altre catene, generando esteri interni (o lattonid) e esteri intermolecolari; ii) fatti reagire con poli-alcoli della serie alifatica, aromatica, arilalifatica , dcloalifatica, eteroddica, generando delle reticolazioni mediante catene spaziatrici.
I composti cosi ottenuti possono essere impiegati per la preparazione di biomateriali da applicare in area vascolare o, comunque, in tutti gli usi che implicano contatti con il sangue o con i tessuti corporei altamente vascolarizzati in cui, oltre alle caratteristiche di biocompatibilità e biodegradabilità, dovute all’impiego dei derivati esterei dell’acido ialuronico, sia necessaria la totale non trombogenicità del biomateriale usato.
Oltre alle suddette proprietà non-trombogenica e anticoagulante, e alle caratteristiche di biocompatibilità i derivati N-solfatati, di cui alla presente invenzione, possono anche essere impiegati vantaggiosamente come agenti antivirali (anche contro il virus dell'HIV), e antiinfiammatori, nei processi di crescita cellulare, nei sistemi di rilascio controllato dei farmaci e, più in generale, nella preparazione di composizioni farmaceutiche, in chirurgia interna, nella chirurgia os teoarticolare, in emodialisi, in cardiologia, in dermatologia, in oftalmologia, in otorinolaringoiatria, in odontologia, in ginecologia, in urologia, nella circolazione ed ossigenazione extra-corporea, nella prevenzione delle adesioni post-chirurgiche e, in particolare, nella prevenzione delle adesioni in seguito alla chirurgia endoscopia dei seni paranasali o alla chirurgia laparoscopica, negli impianti permanenti e biodegradabili, per il trattamento di infiammazioni, per accelerare la cicatrizzazione di ferite, ustioni, piaghe, ulcere della pelle.
Questi biopolimeri possono anche essere impiegati nei processi di rivestimento di oggetti utilizzati sia in campo medico sia in altri settori dell'industria, fornendo nuove caratteristiche biologiche alla superficie del materiale impiegato come supporto.
Gli oggetti che possono essere rivestiti sono ad esempio cateteri, tubicini, sonde, valvole cardiache, tendini artificiali, protesi ossee e cardovascolari, lenti a contatto, protesi di tessuto molle, ossigenatoli di sangue, reni, cuore, pancreas, fegato artificiali, sacche per sangue, siringhe, strumenti chirurgici, sistemi di filtrazione, strumenti da laboratorio, contenitori per colture e per la rigenerazione di cellule e tessuti, supporti per peptidi, proteine, anticorpi.
Il processo di rivestimento della superficie di tali oggetti, mediante la tecnica del Plasma Coating, è descritto nella domanda di brevetto internazionale W096/24392, depositata dallo stesso titolare della presente, e più in seguito illustrata in un esempio di preparazione.
I nuovi derivati N-solfatati possono essere resi disponibili in forma di gel, creme o unguenti o costituire biomateriali nelle forme di spugne, pellicole, fili, tamponi, tessuto non tessuto, microsfere, tubicini a seconda degli usi terapeutici cui sono destinati.
Infine, i composti solfatati ottenuti secondo il processo della presente invenzione possono essere utilizzati per la preparazione di sali con i metalli pesanti, dove per metalli pesanti si intendono gli elementi del 4°, 5°, 6° periodo della tavola periodica come, ad esempio, l'argento, il ferro, cobalto, il rame, lo zinco, l’arsenico, lo stronzio, lo zirconio, l’antimonio, l'oro, il cerio, il tungsteno, il selenio. Tali sali possono essere utilizzati in dermatologia, in oftalmologia, in odontostomatologia, in reumatologia, in urologia, in ginecologia, in chirurgia interna, come integratori alimentari, agenti anti-ossidanti, antireumatici, antitumorali, antiinfiammatori, analgesici, antiulcera. Il processo per la preparazione dei composti di cui alla presente domanda di brevetto consiste essenzialmente di due fasi, la prima delle quali é relativa alla N-de-acetilazione controllata del polisaccaride nativo, mentre la successiva è riferita alle reazioni di solfatazione specifica delle funzioni amminiche libere o ossidriliche primarie della glucosammina.
Frazioni di acido ialuronico di fonte biologica e fermentativa di peso molecolare compreso tra 5.000 Da e 5.000.000 Da, preferibilmente tra 50.000 Da e 300.000 Da, sono solubilizzati in idrazina idrossido di purezza non inferiore al 98%, in concentrazione compresa tra 1 e 50 mg/ml, preferibilmente tra il 5 e 25 mg/ml. Alla soluzione viene, quindi, aggiunta l'idrazina solfato in concentrazione peso/ volume variabile tra 0.1 e 3%, preferibilmente 1%.
La reazione viene condotta alle temperature comprese tra 40 e 90 °C, preferibilmente 60°C, sotto agitazione, per un tempo che é dipendente dal grado di N-de-acetilazione desiderato.
La seguente tabella 1 riporta la resa espressa dalla percentuale di gruppi amminid liberi, in funzione del tempo espresso in ore di reazione:
La reazione viene- quindi bloccata mediante precipitazione con un solvente polare,’ preferibilmente etanolo. Il precipitato, seccato parzialmente sotto vuoto, é trattato con una soluzione di addo iodico di molari tà compresa tra 0,1 e 1M, preferibilmente 0,5M e, infine, con addo iodidrico alla concentrazione di 57% (p/v). n pH della soluzione é mantenuto tra 5 e 7 mediante aggiunte di una soluzione di sodio acetato a 10% p/v.
La fase acquosa contenente il polisaccaride modificato é estratta per ripetuti trattamenti con dietiletere e quindi, dopo completa scomparsa del colore giallo, la soluzione viene trattata ancora con etanolo.
Il precipitato formatosi, dopo ulteriore essiccamento a 40°C, é solubilizzato in acqua ad una concentrazione compresa tra 10 e 40 mg/ml, preferibilmente 25 mg/ml, e la soluzione é fatta percolare attraverso una colonna contenente una resina a scambio ionico attivata con un tetralchilammonio idrossido, dove il residuo alchilico del'ammonio quaternario é costituito da una catena di atomi di carbonio compresa tra 1 e 4; preferibilmente viene impiegato il tetrabutilammonio idrossido.
Il percolato, rappresentato dal sale di ammonio quaternario del polisaccaride modificato, viene quindi liofilizzato. "
Preparazione del derivato parzialmente 2-N-soÌfatató: metodo A Il sale d'ammonio quaternario, preferibilmente di tetrabutìlammònio, del polisaccaride parzialmente N-de-acetilato, viene solubilizzato in un solvente apolare come dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide, N-metil-pirrolidòne, preferibilmente dimetilformammide (DMFA), alla concentrazione compresa tra 5 e 50 mg/ml, (preferibilmente 25 mg/ml).
Alla soluzione organica viene aggiunta una seconda soluzione ottenuta solubilizzando il complesso solfatante, costituito da dimetilformammide solfotriossido (DMFA-SO3), in DMFA, in concentrazione variabile tra 50 e 200 mg/ml e preferibilmente 100 mg/ml. La quantità di complesso da usare, espressa come moli di SO3, risulta sorprendentemente equivalente alle moli di gruppi amminici liberati attraverso la reazione di N-de-acetilazione.
La reazione di solfatazione procede a temperature comprese tra 0° e 20°C, preferibilmente a 4°C per un tempo non inferiore a 4 ore; e viene infine bloccata per aggiunta di acqua distillata fredda.
Una prima purificazione dal solvente di reazione é ottenuta precipitando l'addo ialuronico parzialmente 2-N-solfatato con etanolo e sottoponendo, quindi, il prodotto risolubilizzato a dialisi contro acqua distillata.
Infine, la soluzione viene liofilizzata e il prodotto solido ottenuto é sottoposto a caratterizzazione chimico-analitica per determinare il grado di N-solfatazione e il peso molecolare medio (Tabella 2).
Preparazione del derivato parzialmente 2-N-solfatato, 6-O-solfatato: metodo B
Il sale d'ammonio quaternario, preferibilmente di tetrabutilammonio, del polisaccaride parzialmente N-de-acetilato, viene solubilizzàto in un solvente apolare come dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide, N-metil-pirrolidonè, preferibilmente dimetilformammide (DMFA), alla concentrazione compresa tra 5 e 50 mg /mi, preferibilmente 30 mg/ mi.
Alla soluzione organica viene aggiunta un'altra soluzione ottenuta solubilizzando il complesso solfatante, costituito da dimetilformammide solfotriossidò (DMFA-S03), in DMFA, in concentrazione variabile tra 50 e 200 mg/ml e preferibilmente 100 mg/ mi. La quantità di complesso utilizzato, espressa come moli di SO3, risulta sorprendentemente equivalente alle moli di gruppi amminici liberi dopo la reazione di N-de-acetilazione:
La reazione di solfatazionè procede a temperature comprese tra 0° e 20°C, preferibilmente a 4°C- per 4 ore. Viene quindi aggiunta una soluzione preparata solubilizzando il complesso piridino-solfòtriòssido in dimetilsolfossido in quantità tale che il rapporto tra le moli di SO3 dell'agente solfatante e le moli di -CH2OH sia compréso tra 1,1 e 1,3. Quantità più elevate di reagente potrebbero favorire eventuali reazioni di sostituzione in altri gruppi alcoolici (secondari) della catena polisaccaridica.
La reazione procede, quindi, ulteriormente per almeno 16 ore e viene bloccata per aggiunta di acqua distillata fredda.
Tutte le fasi successive riguardanti la purificazione del polisaccaride modificato sono quelle descritte nel 'metodo A'.
La caratterizzazione analitica eseguita sui derivati ottenuti, conferma che il metodo di solfatazione porta sorprendentemente non solo a sostituire tutti i gruppi amminici ottenuti dalla parziale N-deacetilazione, ma anche alla completa sostituzione del gruppo alcolico primario del residuo glucosamminico dell'acido ialuronieo (Tabella^). -
11 'metodo B' permette, inoltre, variando le quantità molari del complesso piridin-S03 in funzione dei gruppi ossidrilici primari (rapporto molare compreso tra 0,1 e 1), di poter ottenere una serie di derivati parzialmente 2-N-solfatati e parzialmente 6-O-solfatati.
Attività biologica
I composti preparati come precedentemente descritto sono caratterizzati dal punto di vista biologico in modo tale da determinarne l'attività anticoagulante. Come prodotti di riferimento sono stati considerati i derivati solfatati del'acido ialuronico ottenuti secondo il metodo descritto nella domanda di brevetto PCT/EP95/01111 della Richiedente, dove i gruppi ossidrilid, primari e secondari, della catena polimerica vengono sostituiti con gruppi -SO3· in funzione della quantità di agente solfatante impiegata. Inoltre, come ulteriore prodotto di riferimento, viene impiegata l'eparina non-frazionata (Hep UF), il cui utilizzo come farmaco anticoagulante é da molti decenni largamente riconosduto.
E' stato quindi determinato il tempo di trombina (TT test) e il tempo di coagulazione del sangue intero (WBCT) per i seguenti composti:
La capacità dei derivati N-solfatati di aumentare il tempo di coagulazione del sangue viéné misurata mèdiante il tèst del tèmpo di trombina condótto utilizzando un coàgulometro.- Viene determinato il tempo necessario per trasformare il fibrinogeno in fibrina dopo aggiunta di trombina in un campione di sangue in presenza, però, del polimero usato come materiale di partenza. Oltre i 120 secondi la prova non è più significativa. Il tempo di coagulazióne viene' determinato semplicemente andando a vedere il tempo impiegato per coagulare un campione di sangue umano in presenza del materiale da testare. Un tempo superiore alle due ore non viene considerato.
I risultati dei tests sono riportati nella seguente tabella 4:
Sorprendentemente, appare chiaro come la modifica chimica coinvolgente il gruppo amminico del residuo glucosamminico della catena polisaccaridica, induca un notevole effetto sul tempo di coagulazione. Questo identico risultato può essere ottenuto solo modificando drasticamente la struttura chimica di HA, sostituendo cioè tutti gli ossidrili disponibili per unità, monomerica (quattro) con altrettanti gruppi solfonici. .
Dai dati risulta evidente che é sufficente un grado di solfatazione 0,25, derivante dalla preventiva N-de-acetilazione e successiva N-solfatazione, per agire in modo specifico con i fattori coinvolgenti la parte terminale della cascata coagulativa, inibendo quindi il processo di trasformazione del fibrinogeno in fibrina (attività anticoagulante). La presenza del gruppo solforico in posizione 6-0 del residuo glucosamminico, sembra non essere determinante per esplicare questa attività. Esso, tuttavia, in associazione con gruppi 2-N solfatati, può avere un ruolo determinante nell'inibizione del fattore Xa attraverso l'interazione con ΑΊΊΠ (attività antitrombotica) e nell'inibizione del fattore Villa (o di wWF) per regolare l'attivazione piastrinica e la proliferazione di esse.
.Caratterizzazione analitica
Tutti di derivati preparati e descritti nella presente invenzione sono stati caratterizzati sotto il profilo chimico-analitico. A tal proposito sono state applicate le seguenti metodologie analitiche:
- grado di solfatazione (% di zolfo): il prodotto, dopo completa combustione in ambiente ricco di ossigeno, viene analizzato in HPLC utilizzando la tecnica della cromatografìa ionica.
- percentuale di 2-N-solfatazione: viene determinata indirettamente mediante la misura dei gruppi solfonici totali presenti e la determinazione degli stessi dopo N-de-solfatazione del prodotto utilizzando il metodo descritto da Nagasawa (Carbohy. Res. 1977, 58, pag. 47-55). La differenza tra i due valori rappresenta la quantità di gruppi SO3" legati al gruppo amminico della glucosammina.
- percentuale di N-de-acetilazione: viene determinata con il metodo descritto da J. Riesenfeld (Analy. Bioch. 1990, voi; 188, pagg. 383-389).
- Peso molecolare medio: viene determinato mediante GPC, utilizzando un set di colonne Shadex B-803 e B-806, un rilevatore MALLS (muti-angle-laser-light-scattering) e un rivelatore RI (indice di rifrazione).
ESEMPI
Esempio 1
Prpparagione di addo ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui cali 5% dei gruppi N-acetilid sono sostituiti da gruppi solfato)
1.00 gr di HA ottenuto da creste di gallo di peso molecolare medio 181.000 Da, vengono solubilizzati in 50 ml di idrazina monoidrato insieme a 0,5 gr di idrazina solfato.
La reazione procede per 8 ore a 60°C mantenendo la soluzione sotto agitazione, ed é quindi bloccata dall'aggiunta di 100 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridotta.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 50 ml di acqua e 20 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 25 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasdato reagire, sotto continua agitazione, per arca 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 5 ml di una soluzione al 57% di addo iodidrico. Quest'ultitma operazione é preferibilmente condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiaccio. La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 30 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Infine, quest'ultima viene concentrata -a pressione ridotta e alla temperatura di 40°C- fino ad un volume di ca. 40 mi. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 20 ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta e quindi sottoposta a ciclo di liofilizzazione.
1,30 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 45 ml di dimetilformammide e alla soluzione, così ottenuta, vengono aggiunti 0,6 ml di soluzione ala concentrazione di 50 mg/ ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 5 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione ed é infine bloccata per aggiunta di 45 ml di acqua distillata fredda. Dopo aver neutralizzato la soluzione con NaOH 2 M, portandola a pH compresi tra 7,5 e 8, essa viene filtrata attraverso un gooch di porosità G2 e trattata con 250 ml di etanolo. Il precipitato formatosi, dopo esser stato lavato con almeno 150 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 50 ml di acqua distillata e quindi dializzato contro 50 volumi di acqua.
Infine, dopo liofilizzazione, il prodoto viene caraterizzato al fine di deterrminare la percentuale di gruppi amminici N-sostituiti e il peso molecolare medio.
Peso del prodotto liofilizzato: 0,72 gr; resa: 85 %
moli di S03'/moli HA (unità monomerica): 0,045
moli di gruppi -NH2 liberi /mole di HA: 0,052
% di de-N-acetilazione: 5,2%
% di ri-N-solfatazione: 4,5%
Resa reazione di N-solfatazione: 87%
Peso molecolare medio: 174.000 Da
Esempio 2
Preparazione di acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui ca. il 25% dei gruppi N-acetilici sono sostituiti da gruppi solfato)
1,2 gr di HA otenuto da creste di gallo di peso molecolare medio 181.000 Da, vengono solubilizzati in 60 ml di idrazina monoidrato insieme a 0,6 gr di idrazina solfato.
La reazione procede per 24 ore a 60°C mantenendo la soluzione soto agitazione, ed é quindi bloccata dall'aggiunta di 120 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridota.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 60 ml di acqua e 25 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 30 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasciato reagire, sotto continua agitazione, per circa 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 6 ml di una soluzione al 57% di addo iodidrico. Quest'ultitma operazione viene, preferibilmente, condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiacrio.
La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 40 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Quest'ultima viene, infine, concentrata, a pressione ridotta e alla temperatura di 40°C, fino ad un volume di ca. 50 mi. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 25 ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta e quindi sottoposta a ciclo di liofilizzazione.
1,65 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 55 ml di dimetilfonnammide e alla soluzione, così ottenuta, vengono aggiunti 3,0 ml di soluzione alla concentrazione di 50 mg/ ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 6 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione e, viene, infine, bloccata per aggiunta di 55 ml di acqua distillata fredda. Dopo aver neutralizzato la soluzione con NaOH 2 M, portandola a pH compresi tra 7,5 e 8, essa viene filtrata attraverso un gooch di porosità G2 e trattata con 300 ml di etanolo.
Il precipitato formatosi dopo essere stato lavato con almeno 150 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 50 ml di acqua distillata e quindi diefizzato contro 50 volumi di acqua. Infine, dopo liofilizzazione, il prodotto viene caratterizzato al fine di deterrminare la percentuale di gruppi amminici N-sostituiti e il peso molecolare medio.
Peso del prodotto liofilizzato: 0,98 gr; resa: 89 %
moli di SO 3"/moli HA (unità monomerica): 0,23
moli di gruppi -NH2 liberi/mole di HA: 0,24
% di de-N-acetilazione: 24 %
% di ri-N-solfatazione: 23 %
Resa reazione di N-solfatazione: 96 %
Peso molecolare medio: 161.000 Da
Esempio 3
Preparazione di acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui cali 25% dei gruppi N-acetilici sono sostituiti da gruppi solfato) e 6-0-solfatato
5.0 gr di HA ottenuto da fermentazione, di peso molecolare medio 195.000 Da, vengono solubilizzati in 250 ml di idrazina monoidrato insieme a 2,5 gr di idrazina solfato.
La reazione procede per 24 ore a 60°C mantenendo la soluzione sotto agitazione, e viene quindi bloccata dall'aggiunta di 500 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridotta.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 250 ml di acqua e 105 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 125 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasdato reagire, sotto continua agitazione, per drca 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 25 ml di una soluzione al 57% di acido iodidrico. Quest'ultima operazione viene, preferibilmente, condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiacdo.
La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 150 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Quest'ultima viene infine concentrata, sotto pressione ridotta e alla temperatura di 40°C, fino ad un volume di ca. 200 ml. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 10Ò ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta, e quindi sottoposta a ddo di liofilizzazione.
6,0 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 300 ml di dimetilformammide, e alla soluzione così ottenuta vengono aggiunti 13 ml di soluzione alla concentrazione di 50 mg/ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 6 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione.
Una seconda soluzione, costituita da 40 ml di complesso piridinsolfotriossido solubilizzato in dimetilsolfossido alla concentrazione di 50 mg/ml, viene aggiunta alla miscela di reazione.
Dopo circa 16 ore, vengono aggiunti 250 ml di acqua distillata fredda e in seguito alla neutralizzazione con NaOH 2 M, fino a pH 8, la soluzione viene filtrata attraverso un gooch di porosità G3 e trattata con 1.250 ml di etanolo.
Il precipitato formatosi, dopo esser stato lavato con almeno 500 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 250 ml di acqua distillata e quindi dializzato contro 50 volumi di acqua. Infine, dopo liofilizzazione, il prodotto viene caratterizzato al fine di determinare la percentuale di gruppi amminid N-sostituiti, il grado di 6-O-solfatazione e il peso molecolare medio
Peso del prodotto liofilizzato: 4,12 gr; resa: 82 %
moli di S03"/moli HA (unità monomerica): 1,24
moli di gruppi -NH2 liberi /mole di HA: 0,26
% di de-N-acetilazione: 26 %
% di ri-N-solfatazione: 24 %
% di O-solfatazione: 100 %
Peso molecolare medio: .000 Da
Esempio 4
Preparazione dell'estere benzilico di acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatato.
2,00 gr del derivato ottenuto nell'esempio 3 vengono solubilizzati in 100 mi di acqua distillata e la soluzione viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 40 ml di resina a scambio ionico attivata con tetrabutilammonio idrossido (forma TBA+). Dopo liofilizzazione dell’eluato vengono ottenuti 3,3 gr di prodotto.
Questi , dopo solubilizzazione in una miscela costituita da 130 ml di N-metil pirrolidone e 1,3 ml di acqua, vengono fatti reagire a 4°C con 0,29 mi di benzil bromuro. La reazione procede per 48 ore a 28°C, mantenendo la soluzione sotto agitazione e al riparo dalla luce, al termine della quale vegono aggiunti 300 ml di etile acetato.
Il precipiato formatosi, costituito essenzialmente dal polisaccaride modificato, viene lavato con 100 ml di acetone e quindi, dopo una fase di pre-essiccamento sotto vuoto a temperatura ambiente, viene trattato con 100 ml di una soluzione al 10% p/v di sodio cloruro.
Al termine del trattamento salino (che dura circa 1 ora), il prodotto viene lavato con 150 ml di acqua/acetone 20:80 ed infine con 100 ml di acetone.
Dopo essiccamento per 48 ore a 30°C, si ottengono: 0,92 gr; resa: 80% Caratterizzazione:
% di esterificazione: 96%
Esempio 5
Preparazione di acido ialuronico autoreticolato al 10%. parzialmente N-solfatato e O-solfatato.
2,00 gr del derivato ottenuto nell'esempio 3 vengono solubilizzati in 100 mi di acqua distillata e la soluzione viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 40 ml di resina a scambio ionico attivata con tetrabutilammonio idrossido (forma TBA+). Dopo liofilizzazione dell'eluato vengono ottenuti 3,3 gr di prodotto.
Questi, dopo solubilizzazione in ima miscela formata da 165 ml di N-metil pirrolidone (NMP) , 0,8 ml di acqua e vengono fatti reagire con una soluzione ottenuta solubilizzando 205 mg di 2-cloro-l-metil piridin ioduro in 8,2 ml di NMP. La reazione procede per 18 ore, a -20°C, al termine dei quali vengono aggiunti 165 ml di una soluzione acquosa di ammonio acetato al 3%.
La miscela é mantenuta in continua agitazione per circa 4 ore e quindi trattata con 650 ml di etanolo. B precipitato formatosi viene separato per filtrazione, lavato con etanolo e qundi seccato sotto vuoto per 24 ore.
Il prodotto viene quindi trattato con 60 ml di una soluzione al 3% di sodio cloruro in modo tale da favorire lo scambio ionico e infine riprecipitato aggiungendo alla soluzione 180 ml di etanolo. Dopo eliminazione del sovranatante il prodotto viene lavato almeno tre volte con 50 ml di etanolo ed infine, prima di essere definitivamente seccato a 30°C per 48 ore, viene trattato con 100 ml di acetone.
Si ottengono 0,97 gr di derivato solfatato e parzialmente autoreticolato. Esempio 6
Preparazione di un film di estere benzilico del'acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatàto.
Viene preparata una soluzione dell'estere benzilico del'acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatato in dimetilsolfossido alla concentrazione di 180 mg/ml.
Uno strato sottile di soluzione viene distribuito su una lastra di vetro; lo spessore dello strato di soluzione deve essere 10 volte maggiore rispetto allo spessore finale del film. La lastra di vetro viene immersa in etanolo il quale assorbe il dimetilsolfossido senza solubilizzare l'estere che diventa solido. Il film viene separato dalla lastra di vetro e ripetutamente lavato con etanolo, con acqua e poi ancora con etanolo. Il film ottenuto viene essiccato sotto pressione per 48 ore a 30° C.
Esempio 7
Preparazione del sale di argento del derivato deU'acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (25%) e 6-O-solfatato
0,50 gr di composto ottenuto secondo l'esempio 2, vengono solubilizzati in 25 ml di acqua distillata e la soluzione ottenuta viene fatta percolare attraverso una colonna pre-riempita con 16 cm3 di resina a scambio ionico forte in forma H+. L'eluato viene quindi raccolto e liofilizzato. L'intermedio in forma acida ottenuto dalla liofilizzazione, viene trattato con 20 ml di una soluzione 0,5 M di AgNO3 , per 60 minuti, mantenendo sotto agitazione e al riparo dalla luce.
Dopo aver eliminato per filtrazione la fase liquida, il prodotto viene abbondantemente lavato con 150 ml di acqua distillata ed infine con 50 ml di etanolo assoluto. In seguito all'essicamento sotto vuoto a 40°C del derivato dell'acido ialuronico solfatato, sale di argento, vengono ottenuti 0,649 gr (resa 95%).
Esempio 8
Rivestimento di una valvola cardiaca di poliuretano con acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (25%), e 6-O-solfatato
Una valvola cardiaca di poliuretano viene trattata con plasma di ossigeno prodotto da un generatore di radiofrequenze.
Le condizioni operative sono le seguenti: la pressione della camera di reazione viene regolata a 100 mtorr, la potenza del generatore di plasma è di 50 W, il flusso di ossigeno viene settato a 20 cm3/min e infine il tempo di trattamento risulta essere di 30 sec.
Il dispositivo trattato è quindi immerso in 250 ml di una soluzione allo 0,65% di polietilenimmina di peso molecolare 500.000, e mantenuto nel bagno per 90 minuti. Dopo abbondante lavaggio con acqua bidistillata, il materiale viene messo a contatto con 250 ml di una soluzione acquosa ottenuta solubilizzando 2,5 gr di derivato parzialmente 2-N-solfatato e 6-O-solfatato, ottenuto secondo la descrizione dell'esempio 2. Inoltre, vengono aggiunti in quantità stechiometrica rispetto ai gruppi carbossilici appartenenti al polisaccaride modificato, rispettivamente: 0,76 gr di N-idrossisuccinimide (NHS) e 1,23 gr di 3-dimetilamminopropil-l-etil carbodimmide (EDC). La reazione procede per circa 16 ore a temperatura ambiente.
Infine, il dispositivo ricoperto superficialmente con il derivato di acido ialuronico solfatato, dopo un abbondante lavaggio con acqua bidistillata viene asciugato in corrente di aria a flusso laminare.
Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'mvenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni:
Claims (3)
- RIVENDICAZIONI 1) Composti solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati in cui le glucosammine risultano parzialmente N-solfatate o parzialmente N-solfatate e totalmente o parzialmente O-solfatate in posizione 6.
- 2) Composti solfatati secondo la rivendicazione 1, in cui i derivati dell'acido ialuronico sono esteri totali o parziali con alcoli alifatid, aromatici, arilalifatid, cidoalifatid, eteroalifatici.
- 3) Composti solfatati secondo la rivendicazione 2, in cui i derivati dell'acido ialuronico sono scelti dal gruppo costituito da: - un estere totale dell'addo ialuronico con alcool benzilico; - un estere parziale dell’acido ialuronico in cui il 25% dei gruppi carbossilici sono esterificati con alcool benzilico; - un estere parziale dell'acido ialuronico in cui il 50% dei gruppi carbossilid sono esterificati con alcool benzilico; - un estere parziale dell'arido ialuronico in cui il 75% dei gruppi carbossilid sono esterificati con alcool benzilico; - un estere totale dell'arido ialuronico con alcool etilico; - un estere parziale dell'acido ialuronico in cui il 25% dei gruppi carbossilid sono esterificati con alcool etilico; - un estere parziale dell'acido ialuronico in cui il 50% dei gruppi carbossilid sono esterificati con alcool etilico; - un estere parziale dell'arido ialuronico in cui il 75% dei gruppi carbossilid sono esterificati con alcool etilico; - un estere dell'arido ialuronico in cui i gruppi carbossilid sono esterificati con alcool doderilico ad una percentuale compresa tra 5 e 100%; - un estere dell'acido ialuronico in cui i gruppi carbossilid sono esterificati con alcool esadecilico ad una percentuale compresa tra 5 e 100%; 4) Composti solfatati di cui alla rivendicazione 1, in cui l'acido ialuronico di partenza ha peso molecolare compreso tra 5.000 e 5.000.000 Da. 5) Composti solfatati di cui alla rivendicazione 4, in cui l'acido ialuronico di partenza ha peso molecolare compreso tra 50.000 e 300.000 Da. 6) Composti solfatati di cui alla rivendicazione 1, nei quali il grado di solfatazione per unità dimerica del gruppo amminico varia tra 1 e 70 % , preferibilmente tra 5 e 40 %, e del gruppo ossidrilico in posizione 6 tra 0 e 100 %. 7) Composti solfatati di cui alla rivendicazione 1, che presentano caratteristiche di biocompatibilità, ed aventi attività nontrombogenica, anticoagulante, antiinfiammatoria e antivirale. 8) Composizioni farmaceutiche contenenti i composti solfatati secondo le rivendicazioni da 1 a 7. 9) Materiali biomedicali costituiti dai composti solfatati secondo le rivendicazioni da 1 a 7 in forma di tubicini, garze, fili, gel, idrogel, pellicole, membrane, spugne, tessuto non tessuto, microsfere. 10) Oggetti biomedicali rivestiti con i composti solfatati di cui alle rivendicazioni da 1 a 7 quali bypass, cateteri venosi, shunt, cateteri, tubicini, sonde, valvole cardiache, tendini artificiali, protesi ossee e cardovascolari, lenti a contatto, protesi di tessuto molle, ossigenatori di sangue, reni, cuore, pancreas, fegato artificiali, sacche per sangue, siringhe, strumenti chirurgici, sistemi di filtrazione, strumenti da laboratorio, contenitori per colture e per la rigenerazione di cellule e tessuti, supporti per peptidi, proteine, anticorpi. 11) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni da 1 a 7, per la preparazione di composizioni farmaceutiche. 12) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7 per la preparazione di prodotti biomedicali. 13) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7, per il rivestimento di oggetti biomèdicali. 14) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7, in emodialisi, in cardiologia, nella circolazione e nella ossigenazione extracorporea, in dermatologia, in oftalmologia, in otorinolaringoiatria, in odontologia, in ginecologia, in urologia. 15) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7, in chirurgia, nella chirurgia osteoarticolare, nella prevenzione delle adesioni post-chirurgiche. 16) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7, nella prevenzione delle adesioni in seguito alla chirurgia endoscopica dei seni paranasali e alla chirurgia laparoscopica. 17) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni da 1 a 7 nelle preparazioni a rilascio controllato. 18) Uso dei composti solfatati secondo le rivendicazioni 1-7, per il trattamento di infiammazioni, come agenti antivirali e per accelerare la cicatrizzazione di ferite, ustioni, piaghe, ulcere della pelle. 19) Uso del'acido ialuronico parzialmente N-solfatato o parzialmente N-solfatato e totalmente o parzialmente O-solfatato ih posizione 6, per la preparazione di esteri parziali o totali con alcoolii della serie alifatica, aromatica, arilalifatica, cidoalifatica, eterociclica. 20) Uso dell'acido ialuronico parzialmente N-solfatato o parzialmente N-solfatato e totalmente o parzialmente O-solfatato in posizione 6, per la preparazione di composti reticolati in cui una parte o la totalità dei gruppi carbossilid del residuo D-glucuronico formano esteri interni o inter-molecolari con le funzioni alcoliche, rispettivamente, della stessa catena polisaccaridica o di altre catene, oppure, sono fatti reagire con polialcoli della serie alifatica, aromatica, arilalifatica, cidoalifatica, eterociclica, generando reticolazioni mediante catene spaziatrid. 21) Uso dei composti solfatati secondo la rivendicazione 1, per la preparazione di sali di metalli pesanti. 22) Uso dei composti solfatati secondo la rivendicazione 21, in cui i sali di metalli pesanti sono rappresentati dai sali di argento, cobalto, ferro, rame, zinco, arsenico, stronzio, zirconio, antimonio, oro, cerio, tungsteno, selenio. 23) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dalle seguenti fasi: a) N-de-acetilazione controllata in idrazina monoidrato dell'acido ialuronico o del suo derivato eseguita aggiungendo l'idrazina solfato alla soluzione del prodotto di partenza; b) preparazione del sale di ammonio quaternario del composto N-de-acetilato; c) N-solfatazione del sale di ammonio quaternario eseguita aggiungendo alla soluzione del sale in solvente apolare, la soluzione del complesso solfatante selettivo per il gruppo amminico; e, opzionalmente, d) Osolfatazione dell’ossidrile in posizione 6, eseguita per aggiunta di un'altra soluzione di complesso solfatante selettivo per il gruppo ossidrilico primario. 24) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la concentrazione della soluzione di acido ialuronico o dei suoi derivati in idrazina idrossido, è compresa tra 1 e 50 mg/ ml e, preferibilmente, tra 5 e 25 mg/ml. 25) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la concentrazione della soluzione di idrazina solfato è compresa tra 0,1 e 3% peso/ volume. 26) Processò di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la reazione di N-de-acetilazione viene condotta alla temperatura compresa tra 40 e 90 °C. 27) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la reazione di N-de-acetilazione viene bloccata mediante precipitazione con solvente polare. 28) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 27, in cui il solvente polare è l’etanolo. 29) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui il precipitato ottenuto dopo la reazione con idrazina solfato viene trattato con una soluzione di acido iodico di concentrazione compresa tra 0,1 e 1M e con acido iodidrico alla concentrazione del 57% (p/v), mantenendo il pH tra 5 e 7 per aggiunta di sodio acetato al 10% p/v. 30) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la preparazione del sale di ammonio quaternario, viene eseguita facendo percolare la soluzione del composto N-de-acetilato ad una concentrazione compresa tra 10 e , 40 mg/ml attraverso una colonna di resina a scambio ionico attivata con tetralchilammonio idrossido. 31) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui il residuo alchilico dell'ammonio quaternario è. costituito da una catena di atomi di carbonio compresa tra 1 e 4. 32) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui il tetralchilammonio idrossido è il tetrabutilammonio idrossido. 33) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la N-solfatazione del sale d’ammonio quaternario viene condotta aggiungendo alla soluzione del sale d'ammonio quaternario in solvente apolare, alla concentrazione compresa tra 5 e 50 mg /mi, una soluzione di un complesso solfatante in solvente apolare alla concentrazione compresa tra 50 e 200 mg/ ml, mantenendo la temperatura tra 0 e 20 °C per almeno 4 ore. 34) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 33, in cui il solvente apolare è scelto tra il gruppo consistente in dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide, N-metil-pirroli done. 35) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 33, in cui il complesso solfatante è il dimetilformammide solfotriossido. 36) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 33, in cui la quantità di complesso solfatante, espresso in moli di SO3 utilizzato, equivale alle moli di gruppi amminici liberi ottenuti dalla reazione di N-de-acetilazione. 37) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 23, in cui la O-solfatazione dell'ossidrile in posizione 6 viene eseguita aggiungendo alla miscela di reazione di cui al punto c), una soluzione di un altro complesso solfatante in solvente apolare, in quantità tale che il rapporto tra moli del gruppo solforico dell'agente solfatante e le moli dell'ossidrile in posizione 6 sia compreso tra 1,1 e 1,3 e alla temperatura compresa tra 0 e 20 °C. 38) Processo di preparazione dei composti solfatati secondo la rivendicazione 37, in cui la soluzione del complesso solfa tante è una soluzione di piridino-solfotriossido in dimetisolfossido.
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